NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP

Ngày nay, tiêu chảy là một căn bệnh rất phổ biến ở mọi lứa tuổi. Trẻ em dưới 5 tuổi
mắc bệnh tiêu chảy rất nguy hiểm có thể ảnh hưởng đến tính mạng, đặc biệt là từ 0 đến 2
tuổi. Còn đối với người lớn thì ít nguy hiểm hơn nhưng vẫn gây ảnh hưởng lớn đến sức
khỏe của người bệnh. Tác nhân gây nên bệnh tiêu chảy là vi khuẩn Esherichia coli (E.
coli). Có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn E. coli,
phổ biến nhất là kỹ thuật LAMP. Phương pháp này được dùng để phát hiện gen độc tố eae
gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
- 25 mẫu vi khuẩn được phân lập từ mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy do Bệnh
viện ở Tân Phú, Hồ Chí Minh Đa khoa – Khu công nghiệp Tân Bình cung cấp.
- Các vi khuẩn E. coli không gây bệnh là YTN1, YTN2 do Trường Đại học Y dược
thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
- Mồi nhân gen (5’-3’): SK1/SK2 là ký hiệu mồi nhân gen eae bằng kỹ thuật PCR
của vi khuẩn E. coli.
- Còn kỹ thuật LAMP, mồi nhân gen eae là: F3; B3; FIB; BIP.
Phương pháp
Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn: sau khi vi khuẩn được nuôi trong môi trường
LB trong 18 giờ với nhiệt độ 28oC, thu sinh khối. Chuyển vào ống eppendoft và trong 7
phút ly tâm 5000 vòng/phút, thu tế bào. Hòa tan tế bào trong 0,5 ml đệm TE, ly tâm thu tế
bào. Thêm 0.5 ml TE, 3 µl RN Ase, 2 µl lysozyme, trộn đều và để trong 30 phút ở nhiệt
độ phòng. Bổ sung 30 µl SDS 10%, 3 µl proteinase K trộn đều, ủ trong 60 phút ở 37 oC.
Thêm 180 µl 5 M NaCl, ủ trong 10 phút ở 65 oC, thu dịch nổi ở trên bằng cách ly tâm.
Dùng hỗn hợp Phenol: Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) chiết DNA hai lần, thu
pha trên bằng cách ly tâm. Trong cồn 70% ở -20oC. DNA genome được tủa trong 30 phút.
Thu tủa bằng cách ly tâm và sau đó làm khô, tiếp đến thêm 40 µl TE để hòa tan DNA
genome. Sau khi tách chiết trên gel 0,8% agarose, điện di kiểm tra sản phẩm DNA.
Phản ứng PCR: chúng tôi dựa theo trình tự đoạn gen eae trên genome của vi khuẩn
E. coli thiết kế cặp mồi, để có thể khuếch đại đoạn gen eae bằng kỹ thuật PCR.
Thành phần phản ứng PCR (25 µl)
Chu trình nhiệt: (1) ở 94oC biến tính DNA trong 4 phút. (2) Khuếch đại gen eae
trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước. Bước 1: ở 94 oC biến tính sợi khuôn DNA trong
30 giây. Bước 2: trong 40 giây, ở 45oC, mồi bắt cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng trên
sợi khuôn. Bước 3: ở 72oC tổng hợp kéo dài chuỗi trong 1 phút 50 giây. (3) Phản ứng kết
thúc trong 5 phút 30 giây ở 72oC để tạo sợi DNA hoàn chỉnh và ủ mẫu ở 22oC.