TCVN 11397:2016

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM – PHÁT HIỆN E. COLI O157:H7 –

PHƯƠNG PHÁP 8H
1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp phát hiện E. coli O157:H7 trong thực phẩm bằng phương pháp 8 h
được tiêu chuẩn này quy định.
Việc xác nhận giá trị sử dụng trên các sản phẩm thịt bò và rau diếp của phương pháp
này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm.

2. Nguyên tắc
Để thu được kết quả chỉ trong tổng thời gian thử nghiệm 8 giờ, phương pháp 8 h sử
dụng môi trường tăng sinh (môi trường 8 h) và bộ thử kết tủa miễn dịch dòng chảy phụ
nhanh. Các chất dinh dưỡng có sẵn và các yếu tố khác do môi trường 8 h cung cấp cần
thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhanh của E. coli O157:H7 đến mức phát hiện bằng
thiết bị này chỉ trong 8 giờ đồng hồ. Kháng thể có độ đặc hiệu cao đối với các kháng
nguyên E. coli O157:H7 được chứa sẵn trong bộ thử. Các kháng thể này được liên kết với
vàng keo (colloidal gold) và riêng rẽ với nền mẫu hỗ trợ đặc. Đặt vào cổng mẫu của dòng
chảy ban đầu qua thiết bị phần mẫu thử đã tăng sinh. Phức kháng nguyên-kháng thể-
nhiễm sắc thể được tạo thành do các kháng nguyên E. coli O157:H7 có mặt liên kết với
các kháng thể cộng hợp vàng. Phức này sẽ chảy qua màng dòng chảy phụ và sau đó liên
kết bởi kháng thể được giữ cố định trên màng tạo ra cộng hợp vàng (dạng kết tủa) tạo
thành một vạch nhìn thấy được là phản ứng dương tính. Vạch đối chứng xuất hiện phía
trên ô đọc kết quả sau khi kết thúc phép thử thì phép thử được xác nhận là hợp lệ. Phép
thử được xem là không có hiệu lực nếu không thấy vạch đối chứng.

3. Cách tiến hành

3.1. Chuẩn bị huyền phù mẫu thử
Đối với rau
Chuyển 50 g mẫu ra đã được cắt một cách vô trùng vào túi vô trùng. Bổ sung 50 ml
chất pha loãng đệm phosphat Butterfield (BPB), đóng nắp túi lại và lắc bằng tay trong
vòng 15 phút. Gạn lấy 25 ml, sau đó cho vào bình nón 500 ml có chứa sẵn 225 ml môi
trường 8 h. Nới lỏng nắp bình, lắc nhẹ để trộn và ủ ở nhiệt độ 42-43 oC trong vòng 8 giờ
trong tủ ấm. Cho vào ống nghiệm 5 ml môi trường. Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy
trong 10 phút ở nhiệt độ 100oC. Làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Đối với thịt nguyên liệu và thịt xay
Cho vào túi nhu động có chứa sẵn 225 ml môi trường 8 h khoảng 25,0 g (cân vô
trùng) phần mẫu thử. Trộn đều bằng cách bóp bằng tay và ủ ở nhiệt độ 42-43 oC trong tủ
ấm trong 8 giờ.
Đối với mẫu thử là khối thịt nguyên liệu hoặc khối thịt xay có khối lượng 375 g, cho
vào vật chứa vô trùng 375 g (cân vô trùng) phần mẫu thử có dung tích thích hợp. Bổ sung
môi trường 8 h đã làm ấm đến 42 oC ± 1oC. Trộn đều bằng cách bóp bằng tay và ủ trong tủ
ấm ở 42oC ± 1oC trong 12 giờ.
Đối với cả hai trường hợp nêu trên, chuyển 5 ml môi trường vào ống nghiệm sau khi
đã ủ xong. Đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy trong 10 phút ở nhiệt độ 100 oC. Làm nguội
đến nhiệt độ phòng.
3.2. Xác định
Mở túi chứa bộ thử E. coli O157:H7. Mỗi phép thử chỉ sử dụng một bộ thử. Dùng
pipet để chuyển 0,12 ml chủng cấy đã được xử lý nhiệt ở ống nghiệm đã chuẩn bị trong
mục 3.1, đưa mẫu vào cổng của bộ thử. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
3.3. Đọc kết quả
Ngay sau khi phát triển được 15 phút phải kiểm tra bộ thử.
Nếu trong ô đọc kết quả của bộ thử có 2 vạch khác nhau thì kết quả dương tính: một
vạch trong vùng phía dưới gần với vạch thử “T” và một vạch trong vùng phía trên gần với
vạch đối chứng “C”. Các vạch có màu đen tương phản trên nền trắng.
Nếu chỉ có một vạch duy nhất trong vùng phía trên (vùng đối chứng) trong ô đọc kết
quả thì kết quả âm tính.
Nếu không có vạch nào trong vùng phía trên (vùng đối chứng) của ô đọc kết quả thì
kết quả không hợp lệ.
3.4. Khẳng định kết quả
Phép thử dương tính giả định (xem mục 3.3) phải được khẳng định.
 Đối với mẫu thử là khối thịt nguyên liệu hoặc khối thịt xay có khối lượng 375
g
Cấy đĩa các chủng cấy tăng sinh trong môi trường 8 h vào môi trường
CHROMagarTM O157 và ủ trong tủ ấm ở 37oC ± 1oC trong 24 giờ ± 1 giờ. Ngoại trừ các
khuẩn lạc E. coli O157:H7 có màu tím hoa cà thì các vi khuẩn coliform khác sẽ có màu
xanh, màu xám hoặc không màu. Sau đó thực hiện phép thử khẳng định về mặt huyết
thanh học.
Nếu đáp ứng được ít nhất một trong các tiêu chí sau đây thì khuẩn lạc nghi ngờ được
khẳng định:
- Dương tính với phép thử sinh độc tố Shiga (ST);
- Dương tính với phép thử gen độc tố Shiga “stx”;
Được xác định về gen là “H7”.
Đối với mẫu thử là rau, thịt nguyên liệu và thịt xay
Chuẩn bị và dàn đều vào thạch HC và thạch BCM các dung dịch pha loãng thích
hợp từ chủng cấy tăng sinh trong môi trường 8 h. Các khuẩn lạc được phân lập từ thạch
HC âm tính với thuốc thử sorbitol và MUG cần được khẳng định về mặt huyết thanh học
với kháng huyết thanh O157 và H7.

4. Điểm nổi bật của phương pháp

- Thu được kết quả chỉ trong 8 giờ.
- Kết quả dễ nhận thấy nhờ vào sự xuất hiện của vạch đối chứng.
Nhược điểm:
- Tiêu tốn nhiều nguyên liệu.
- Quy trình phức tạp.
Đây là kỹ thuật nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện tương đối nhanh, chính xác vi
khuẩn E. coli O157:H7. Tuy phương pháp này chưa được phổ biến nhưng nó cũng mở ra
được tiềm năng ứng dụng nghiên cứu về y học và dược phẩm, vệ sinh môi trường, xét
nghiệm điểm chăm sóc… góp phần không nhỏ vào vào việc phòng chống, kiểm soát và
điều trị vi khuẩn E .coli O157:H7 gây bệnh tiêu chảy ở người.
Phần 5:
Một trong những hạn chế của các thử nghiệm sinh hoá là vi sinh vật phải phát triển
trên một vài môi trường nào đó và thời gian cần ít nhất là 12 - 24 giờ để đọc kết quả. Trên
thực tế, các chủng thử nghiệm có thể bị đột biến cho nên không thực hiện được chuyển
hoá bình thường như chủng chuẩn khác, ví dụ hầu hết các loài E.coli có khả năng sử dụng
lactose như 1 nguồn carbon, tuy nhiên những E.coli phân lập được lại không có khả năng
sử dụng lactose. Mặt khác, trong một số trường hợp nuôi cấy phân lập vi khuẩn có thể bị
thất bại do việc sử dụng kháng sinh để điều trị. Để khắc phục những nhược điểm này, các
kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, kháng thể và vật liệu di truyền của vi khuẩn là những
công cụ hữư hiệu nhất ngày càng được sử dụng rộng rãi. Và phương pháp 8H đã sử dụng
tốt kỹ thuật phát hiện kháng nguyên, kháng thể để khắc phục nhược điểm về thời gian của
thử nghiệm sinh hóa,cụ thể là kỹ thuật “thử nghiệm kết tủa”. Chính vì ưu điểm này mà
nhóm chúng em muốn phương pháp này phổ biến rộng rãi hơn trong tương lai. Cần
nghiên cứu về phương pháp này để tìm cách loại bỏ bớt thiết bị, tối giản quy trình thực
hiện nhằm tiết kiệm chi phí và dễ tiếp cận hơn.