Phương pháp phân tích vi sinh vật của nước

TCVN 6096 : 1995

NƯỚC UỐNG ĐÓNG CHAI

Tên chỉ tiêu Mức tối đa cho phép

1. Coliform tổng số / 100 ml 0

2. Coliform faecal / 100 ml 0

3. E.coli / 100 ml 0

4. Sulphite - Reducing Clostridia / 0

100 ml
0
5. Faecal streptococci / 100 ml

I. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM VI

KHUẨN COLIFORM, VI KHUẨN COLIFORM CHỊU NHIỆT VÀ
ESCHERICHIA COLI GIẢ ĐỊNH.
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NHIỀU ỐNG ( SỐ CÓ XÁC SUẤT CAO NHẤT )
TCVN 6187-2 : 1996
ISO 9308-2: 1990
Water quality - Detection and enumeration of organisms thermotolerant coliform organisms and
presumptive Escherichia coli. Part 2: Multiple tube (most probable number) method

1. Nguyên tắc
Cấy các phần mẫu thử, đã được pha loãng hoặc không pha loãng vào một dãy
ống nghiệm chứa một môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza.
Kiểm tra các ống thử sau 24 h và 48 h nuôi ở nhiệt độ hoặc 35 0C hoặc 370C; cấy
chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện đục kèm theo sinh khí vào một môi trường
khẳng định chọn lọc hơn và khi muốn tìm E.coli giả định cấy vào một môi
trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol.
Nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48 h ở nhiệt độ hoặc 35 0C hoặc
370C để phát hiện các vi khuẩn coliform, và ở 44 0C trong khoảng 24 h để phát
hiện các loại coliform chịu nhiệt và E.coli giả định.
Bằng các bảng thống kê, tính toán số xác xuất cao nhất của các dạng coliform,
coliform chịu nhiệt và E.coli giả định có thể có mặt trong 100 ml mẫu thử, từ số
các ống thử kết quả xác nhận dương tính.

Inoculate test portions, diluted or undiluted, into a series of test tubes containing
a lactose-containing liquid selective culture medium.

Examine the test tubes after 24 h and 48 h of incubation at either 350°C or

37°C; Transplant from each tube showing turbidity with gas production into a
more selective confirmatory medium and when looking for presumptive E.coli
inoculate a medium through which indole formation can be observed.

Incubate these confirmatory media for up to 48 h at either 350°C or 37°C for

coliform bacteria, and at 440°C for approximately 24 h for thermostable
coliforms and presumptive E.coli.
Using statistical tables, calculate the highest probability number of presumptive
coliforms, coliforms, and E.coli that may be present in 100 ml of the test
sample, from the number of test tubes with a positive confirmation.
2. Thiết bị đo
Tủ sấy hơi nóng để khử trùng khô và một nồi hấp áp lực.
Ngoài các thiết bị vô trùng sẵn, thiết bị thuỷ tinh và các trang bị khác cần được
khử trùng theo chỉ dẫn đã nêu trong ISO 8199.
Tủ ấm hoặc bể điều nhiệt, có thể điều chỉnh được ở nhiệt độ hoặc 35 0C ± 0.50C,
hoặc 370C ± 0.50C.
Tủ ấm hoặc bể điều nhiệt, có thể điều chỉnh được ở nhiệt độ hoặc 44 0C ±
0.250C, hoặc 44.50C ± 0.250C.
pH mét.

A steam oven for dry sterilization and an autoclave.

In addition to ready-to-use sterile equipment, glassware and other equipment

should be disinfected according to the instructions given in ISO 8199.

Incubator or bath, adjustable to either 350°C ± 0.5°C, or 37°C ± 0.5°C.

Incubator or bath, adjustable to either 440C ± 0.250C, or 44.50C ± 0.250C.

pH meter.
3. Phương pháp đo
- Chuẩn bị mẫu thử và các môi trường cấy
Để chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu và cấyvào môi trường phân lập
các phần mẫu thử, theo như các chỉ dẫn đã cho ở ISO 8199. Đối với các phần
mẫu thử có thể tích lớn hơn 5 ml, sử dụng các ống môi trường phân lập nồng độ
kép.

Preparation of test samples and culture media

To prepare the test sample, dilute the sample and inoculate the test portion
isolation medium, according to the instructions given in ISO 8199. For test
portions with a volume greater than 5 ml, use tube of dual concentration
isolation medium.
- Nuôi các ống thử
Nuôi các ống môi trường đã cấy mẫu trong 48 h ở nhiệt độ 35 0C ± 0.50C, hoặc
370C ± 0.50C.

Growing test tubes

Incubate the tubes of inoculated medium for 48 h at a temperature of 350°C ±
0.5°C, or 37°C ± 0.5°C.
- Kiểm tra các ống thử
Kiểm tra các ống mẫu lấy sau 18 ÷ 24 h nuôi ấmvà coi là có phản ứng dương
tính đối với các ống có biểu hiện đục do vi khuẩn sinh trưởng và sinh khí bên
trong các ống lộn ngược (ống Durham), cùng với việc tạo thành axit nếu trong
môi trường phân lập có chứa một chỉ thị pH.
Nuôi tiếp trong tủ ống những ống nghiệm chưa có bất kỳ dấu hiệu nào hoặc mọi
biến đổi nói trên và kiểm tra lại chúng sau 48 h để tìm phản ứng dương tính.

Check the test tubes

Examine the sample tubes taken after 18 24 h of incubation and consider a

positive reaction for tubes showing turbidity due to bacterial growth and gas
production inside upside-down tubes (Durham tubes), along with form acids if
the isolation medium contains a pH indicator.
Continue incubating in the tube the tubes that have not shown any of the above
signs or changes and retest them after 48 h for a positive reaction.
- Các phép thử khẳng định điều quan trọng cần lưu ý là các phản ứng dương
tính trong các ống môi trường phân lập thì chỉ là kết quả giả định về coliform.
Do đó cần phải tiến hành các phép thử xác nhận, tốt hơn là trên các chủng cấy
thuần khiết.
Confirmatory tests It is important to note that positive reactions in tubes of
isolation are presumptive results for coliform. It is therefore necessary to carry
out confirmatory tests, preferably on pure cultures.
- Cấy truyền, nuôi ấm và kiểm tra
Cấy truyền từ mỗi ống môi trường phân lập có kết quả dương tính vào một hoặc
một số ống môi trường khẳng định (5.4) tìm tính sinh khí và sinh indol.
Chú thích: - Nếu môi trường ức chế tối thiểu nhất (canh thanglactoza) được
dùng để phân lập, thì nên cấy truyền tiếp vào cả hai trong số các môi trường
khẳng định chọn lọc hơn (canh thang lục sáng- lactoza (mật) hoặc canh thang
EC) để khẳng định.

Inoculation, incubation and examination

Inoculate from each tube of positive isolation medium into one or more tubes of
confirmatory medium (5.4) for gas and indole production.
Note: - If the least inhibitory medium (lactose broth) is used for isolation,
further subcultures should be made to both of the more selective confirmatory
media (lactose green broth (bile). or EC broth) for confirmation.
- Vi khuẩn coliform
Để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn coliforrm chịu nhiệt, nuôi một ống môi
trường EC khác (5.4.1) ở nhiệt độ 440C trong 24 h và kiểm tra tính sinh khí.
Để khẳng định sự có mặt của E.coli giả định cấy vào ống trypton (5.4.2) để tạo
indol ở 440C trong vòng 24h. Sau đó thêm 0.2 ml ÷ 0.3 ml thuốc thử kovac
(5.5.1) vào ống nước trypton  (đã cấy mẫu): Việc xuất hiện một màu đỏ sau khi
lắc nhẹ chứng tỏ sự có mặt của indol._

coliform bacteria

To confirm the presence of heat-resistant coliform bacteria, grow another tube

of EC medium (5.4.1) at 440 °C for 24 h and check for gas production.
To confirm the presence of presumptive E.coli, inoculate a tryptone tube (5.4.2)
to generate indole at 440C within 24 h. Then add 0.2 ml ÷ 0.3 ml of kovac
reagent (5.5.1) to the tryptone water tube (inoculated): The appearance of a red
color after gentle shaking indicates the presence of indole
4. Thẩm định kết quả
Từ số ống môi trường phân lập và các phép thử khẳng định cho các kết quả
dương tính, tính toán, bằng cách tham khảo các bảng tra thống kê trong ISO
8199, số xác xuất cao nhất của vi khuẩn coliform chịu nhiệt và E.coli giả định
có trong 100 ml mẫu thử.
From the setup of the conduit environment and positive system testing to the
results, calculate, by reference to the tables listed in ISO 8199, the highest
provenance of heat-resistant coliform bacteria and presumptive E. coli present
in 100 ml of the test sample.
II. CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN LIÊN
CẦU PHÂN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC
Water quality – Detection and enumeration of faecal streptococci - Part 2: Method by
membrane filtration

TCVN 6189-2:1996

ISO 7899-2:1984

1. Nguyên tắc
1.1. Lọc, nuôi cấy và đếm

Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua
một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 mm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn.
Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự
sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5 – triphenyltetrazoli clorua liên
cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành formazan màu đỏ.

Sau khi nuôi cấy tất cả các khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc
màu hồng, các khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, hoặc trong suốt toàn bộ các khuẩn
lạc được đếm là liên cầu phân giả định.

Filtration, culture and counting

The streptococcal count is based on filtering a defined volume of a water

sample through a membrane filter with a pore size (0.45 mm) suitable for
retaining bacteria. The membrane filter is placed in a selective solid medium
containing sodium nitride (to prevent the growth of Gram-negative bacteria) and
2,3,5 - triphenyltetrazoli chloride streptococci which reduce the colorless dye to
red formazan.

After culturing all the colonies that have grown red, maroon or pink, colonies
either from the center, or throughout the entire colony are counted as
presumptive fecal streptococcus.

1.2. Khẳng định

Có thể thử khẳng định trên môi trường chọn lọc nữa nếu thấy cần.

Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt
độ 44oC. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin,
sản phẩm cuối cùng, 6,7 – dihidroxycoumarin sẽ kết hợp với ion sắt (III) cho
hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuyếch tán vào môi trường.

Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalaza đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên
môi trường khẳng định.

Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và phép thử catalaza âm tính
thì có thể coi là liên cầu phân.

Confirm

Confirmation on a selective medium can also be attempted if necessary.

The confirmation medium, asculin-nitride agar, was grown for 48 h at 44°C.

The streptococci grow in this medium and hydrolyze asculin, the end product,
6,7 - dihidroxycoumarin, which will combine with iron (III) ions to give a
yellow-brown to black compound and diffuse into the medium.

In addition, perform a catalase test on suspect colonies on confirmation

medium.

Colonies that give a positive asculin reaction and a negative catalase test can be
considered as mitotic streptococci

2. Thiết bị đo

- Thiết bị màng lọc.

- Màng lọc khử trùng với kích thước lỗ danh định 0,45 mm

Chất lượng màng lọc của các hãng và giữa các lô có thể khác nhau. Do đó, nên
kiểm tra chất lượng theo qui định của ISO 7704.

- Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 35oC ± 1oC hoặc 37oC ± 1oC.

- Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 44oC ± 0,5oC.

- Nồi hấp áp lực, có thể duy trì được nhiệt độ 121oC ± 1oC.

- Membrane equipment.

- Sterilization filter with nominal pore size 0.45 mm

Membrane quality can vary from brand to brand and from lot to lot. Therefore,
it is recommended to check the quality according to the provisions of ISO 7704.
- Incubator, capable of being maintained at 35 °C ± 1 °C or 37 °C ± 1 °C.

- Incubator, able to maintain the temperature at 44oC ± 0.5oC.

- Autoclave, can maintain temperature 121oC ± 1oC.

3. Phương pháp đo

- Xử lý mẫu

Các qui trình chung như việc xử lý mẫu nước và chuẩn bị các dung dịch pha
loãng sẽ được xây dựng thành các tiêu chuẩn trong thời gian tới.

Sample treatment

General procedures such as handling of water samples and preparation of

dilutions will be developed into standards in the near future.

- Lọc và nuôi cấy

Các qui định chung của kỹ thuật màng lọc sẽ được xây dựng thành tiêu chuẩn
trong thời gian tới.

Lọc một thể tích nước thích hợp.

Đặt màng lọc lên mặt thạch – KF streptococcus (6.2.1) hoặc thạch m-
enterococcus (6.2.2).

Nuôi các đĩa ở 35oC ± 1oC hoặc ở 37oC ± 1oC trong 44 giờ ± 4 giờ.

Filtration and culture

General regulations of membrane technology will be developed into standards

in the near future.

Filter an appropriate volume of water.

Place the filter on the agar – KF streptococcus (6.2.1) or m-enterococcus agar

(6.2.2).

Incubate the plates at 35oC ± 1oC or at 37oC ± 1oC for 44 hours ± 4 hours

- Đếm
Sau khi nuôi, đếm tất cả các khuẩn lạ đã mọc có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ
trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc. Các khuẩn lạc này được coi là liên cầu phân
giả định.

Chú thích – Đôi khi các vi khuẩn khác nhóm liên cầu khuẩn nhóm D có thể sinh
ra loại khuẩn lạc này. Việc nâng nhiệt độ ủ đến 44oC ± 0,5oC sau khi ủ giai đoạn
đầu ở 37oC ± 1oC trong 5 giờ ± 1 giờ có thể ngăn ngừa sự sinh trưởng của các
loại vi sinh vật này.

Count

After culture, count all foreign colonies that have grown red-brown or pink
from the center or the entire colony. These colonies are considered presumptive
fecal streptococci.

Note – Sometimes bacteria other than group D streptococcus can produce this
type of colony. Raising the incubation temperature to 44oC ± 0.5oC after initial
incubation at 37oC ± 1oC for 5 hours ± 1 hour can prevent the growth of these
microorganisms.

- Khẳng định

Cấy truyền mẫu đại diện của các khuẩn lạc điển hình lên đĩa môi trường thạch-
mật asculin nitrua (6.2.3).

Nuôi ở 44oC ± 0,5oC trong 48 giờ.

Xem xét tất cả các đĩa cho thấy các khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc
môi trường bao quanh có màu nâu hay đen như là loại cho phản ứng dương tính.

Confirm

Inoculate representative cultures of typical colonies onto a plate of asculin

nitride agar (6.2.3).

Incubate at 44oC ± 0.5oC for 48 hours.

Examine all plates showing brown to black colonies and/or brown or black
surroundings as positive.

- Phép thử catalaza

Nhỏ một giọt dung dịch oxi già (hidro peoxit) (6.3) lên các khuẩn lạc trên môi
trường thạch-mật asculin nitrua (6.2.3). Sự xuất hiện các bọt nhỏ của oxy chứng
tỏ các sinh vật catalaza dương tính. Chỉ có các khuẩn lạc catalaza âm tính mới
được coi là liên cầu phân.

Chú thích – Để loại trừ các sai lầm do phản ứng catalaza âm tính giả có thể xảy
ra trên môi trường thạch-mật asculin nitrua, phép thử này có thể lặp lại trên một
mẫu cấy truyền lên môi trường không chọn lọc khác.

catalase test

Add one drop of the hydrogen peroxide solution (6.3) to the colonies on asculin
nitride agar (6.2.3). The presence of small bubbles of oxygen indicates positive
catalase organisms. Only catalase-negative colonies are considered fecal
streptococci.

Note – To exclude possible false-negative catalase errors on asculin nitride agar,

this test may be repeated on a single inoculum on another non-selective
medium.

4. Thẩm định kết quả

Qui định chung về biểu thị kết quả và tính số vi khuẩn có trong mẫu sẽ được
xây dựng thành tiêu chuẩn trong thời gian tới.

General regulations on expressing results and calculating the number of bacteria

in the sample will be developed as a standard in the near future.

III. CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM SỐ BÀO TỬ VI

KHUẨN KỴ KHÍ KHỬ SUNPHIT (CLOSTRIDIA) -PHẦN 2 :
PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC TCVN 6191-2 : 1996
Water quality - Detection and enumeration of the spores of sulfite - reducing anaerobes
(clostridia) - Part 2: Method by membrane filtration

1. Nguyên tắc

 Lựa chọn các bào tử

Chọn lọc các bào tử trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian
đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng.

Lọc qua màng và nuôi cấy

Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn
(0,2 mm) được giữ lại trên màng lọc.
Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit),
tiếp theo ủ ở 37oC ± 1oC trong 20 h ± 4 h và 44 h ± 4 h và đếm các khuẩn lạc có
màu đen.

Selection of spores

Select spores in the sample by heating for a period sufficient to destroy the
trophic bacteria.

Membrane filtration and culture

Filter the water sample through a membrane filter with a pore size so that
bacterial spores (0.2 mm) are retained on the membrane.

Place the filter membrane on the specified selective culture medium (iron
sulphide agar), then incubate at 37°C ± 1°C for 20 h ± 4 h and 44 h ± 4 h and
count the black colonies.

2. Thiết bị đo

Bình thủy tinh (Erienmeyen Flask, bình đáy tròn hoặc bình nón) có dung tích 2
lít.

Ống thử 160 mm x 16 mm.

Pipet chia độ, có dung tích 10 ml có vạch chia 0,1 ml.

Pipet có dung tích 10 ml.

Bình dung tích 1 lít.

Bình hơi.

Nồi cách thủy.

Thiết bị lọc màng.

Màng lọc vô trùng có kích thước lỗ danh định 0,2 mm.

Chú thích - Chất lượng của màng lọc có thể khác nhau theo từng nhãn
hiệu thậm chí theo từng lô sản xuất, do đó nên kiểm tra chất lượng trên cơ sở
qui định của ISO 7704.

Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 37 ± 1 oC.

Đĩa petri.

Glass jar (Erienmeyen Flask, round bottom flask or conical flask) with a
capacity of 2 liters.

Test tube 160 mm x 16 mm.

Graduated pipette, of capacity 10 ml with 0.1 ml divisions.

Pipettes have a capacity of 10 ml.

1 liter capacity tank.

Gas bottle.

Water bath.

Membrane filter equipment.

The sterile membrane filter has a nominal pore size of 0.2 mm.

NOTE The quality of the filter can vary from brand to brand or even from
batch to production, so it is recommended to check the quality against the
requirements of ISO 7704.

Incubator, capable of being maintained at 37 ± 1 °C.

Petri dish.

3. Phương pháp đo

Xử lý mẫu

Theo TCVN 5993 - 1995 (ISO 5667/3). Chất lượng nước - Lấy mẫu - Hướng
dẫn bảo quản và xử lý mẫu và ISO 8199.

Chọn lọc các bào tử (kỹ thuật)

Trước khi thử, mẫu nước cần đun nóng trong nồi cách thủy ở 75 oC ± 5oC trong
15 phút kể từ lúc đạt được nhiệt độ trên. Cần định kỳ sử dụng một chai chứa
cùng một thể tích như mẫu thử để kiểm tra đối chứng nhằm kiểm tra thời gian
đun nóng cần thiết. Nhiệt độ của nước trong chai đối chứng có thể được ghi lại
bằng nhiệt kế.
Cấy mẫu và nuôi ấm

Tham khảo ISO 7704 về mô tả chung của kỹ thuật màng lọc.

Theo hướng dẫn của tài liệu trên, lọc một thể tích nước thích hợp. Đối với nước
ống, nước suối, và nước giếng, nước khoáng, nước biển và nước bề mặt, ít
nhiễm bẩn bởi clostridia thì lọc 100 ml; đối với nước bị ô nhiễm nặng hoặc
nước thải thì dùng một thể tích nhỏ hơn. Thể tích nước ít hơn 10 ml thì nên trộn
với 10 đến 100 ml nước hoặc dịch pha loãng đã khử trùng.

Điều chỉnh các dịch pha loãng sao cho các quả khuẩn lạc đen tách biệt ra và dễ
dàng đếm được.

Sau khi lọc, tháo màng bằng kẹp đã khử trùng và đặt úp lên đáy của đĩa petri,
đảm bảo sao cho không có bọt khí được tạo thành dưới màng lọc. Sau đó cẩn
thận rót 18 ml môi trường nuôi cấy đã hoàn toàn hóa lỏng trước đó đã được làm
nguội đến khoảng 50 oC qua màng lọc trong khi vẫn giữ kẹp thanh trùng. Sau
khi đã tạo được lớp môi trường, ủ kỵ khí hoặc dưới điều kiện khác mà đảm bảo
kỵ khí ở nhiệt độ 37 oC ± 1 oC  trong 20 h ± 4 h và 44 h ± 4 h . Nếu dùng tủ ấm
hoặc bình kỵ khí thì màng lọc có thể đặt lên bề mặt của thạch với mặt đếm để
hướng lên trên.

Sample treatment

According to TCVN 5993 - 1995 (ISO 5667/3). Water quality - Sampling -

Guidelines for storage and handling of samples and ISO 8199.

Selection of spores (engineering)

Before testing, the water sample should be heated in a water bath at 75 °C ± 5

°C for 15 minutes from the time the above temperature is reached. It is
necessary to periodically use a bottle containing the same volume as the test
sample for control purposes to check the required heating time. The temperature
of the water in the control bottle can be recorded with a thermometer.

Sample culture and incubation

Refer to ISO 7704 for a general description of membrane technology.

According to the instructions of the above document, filter an appropriate

volume of water. For tap water, spring water, and well water, mineral water,
seawater and surface water, less contaminated by clostridia, filter 100 ml; For
heavily contaminated water or wastewater, use a smaller volume. Water volume
less than 10 ml should be mixed with 10 to 100 ml of water or disinfected
diluent.

Adjust the diluents so that the black colonies are separated and easily counted.

After filtration, remove the membrane with sterilized forceps and place it face
down on the bottom of the petri dish, making sure that no air bubbles are
formed under the membrane. Then carefully pour 18 ml of the previously
cooled completely liquefied culture medium to about 50 °C through the
membrane filter while keeping the tongs sterile. After the medium has been
formed, incubate anaerobically or under other conditions that are anaerobic at
37 °C ± 1 °C for 20 h ± 4 h and 44 h ± 4 h. If an incubator or anaerobic flask is
used, the filter can be placed on the surface of the agar with the counter facing
up.

4. Thẩm định kết quả

Đếm tất cả các khuẩn lạc đen sau khi ủ 20 h ± 4 h và 44 h ± 4 h.

Count all black colonies after incubation for 20 h ± 4 h and 44 h ± 4 h.