BÀI 2: XÁC ĐỊNH COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MPN

Chương 1. Tổng quan
Coliforms được xem là những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số
lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh
vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms
trong thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng
rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lượng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh
đang được tranh cải về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không được
sự thống nhất trong các hội đồng hoa học.
Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, hình que, là nhóm những trực khuẩn
đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng
sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong vòng 24 giờ, không sinh bào tử,
chứ β−¿ galactosidase.
Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm. Có
những nghiên cứu cho thấy chúng phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và cao đến 50oC.
Trong thực phẩm chúng phát triển rất chậm ở 5oC, cũng có tài liệu ghi nhận sự phát
triển của chúng ở 3 – 6oC
Ngưỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9. Chúng phát triển tốt trên
môi trường thạch, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 – 16 giờ ở 37oC, phát triển
tốt ở nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp.
Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với 1 loài duy nhất là E.coli,
Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E. aerobacter và E.cloacae).
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E.coli giả định) là coliforms chịu nhiệt
có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong môi trường Trypton.
Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và các động
vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến,
bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân
trong mẫu môi trường.
Chương 2. Cách tiến hành
 1, phương pháp MPN (Most Probable Number)
Phương pháp MPN (phương pháp có ố xác suất cao nhất; số tối khả) còn được
gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí
nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng
này được lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống
nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm
định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục,…),
ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật
được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số
MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng.
 Nguyên tắc
Số lượng E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác
định bằng phương pháp MPN. Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha
loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần); 3 mẫu có độ
pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong oonga nghiệm chứa môi trường thích hợp
có ông bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 ống lặp lại. Theo dỗi sự sinh
hơi và đổi màu để tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương
tính. Ghi nhận số ông nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và
được vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong
1ml mẫu ban đầu.
 Môi trường và hóa chất
Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB
Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)
Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC)
Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa Durham úp
ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống
Durham.
2, Tiến hành thí nghiệm
Sơ đồ quy trình
 Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,…
(hút 1ml mẫu + 9ml nước)

Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm chứa môi trường LSB, mỗi
nồng độ lặp lại 3 ống, ủ 37oC trong 24 giờ.

Ghi nhận các ống LSB dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng; hiện tượng
(ống Durham nổi, ống có bột khí > ¼ ống, bị đục.

Cấy vào ống môi trường BGBL, ủ ở Cấy vào ống môi trường EC, ủ ở 37oC
37oC trong 24 giờ. trong 24 giờ.

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng. Tính Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng. Tính
kết quả bằng cách tra bảng Mac Crady kết quả bằng cách tra bảng Mac Crady

Coliforms Coliforms chịu nhiệt

Thuyết minh quy trình

Bước 1: Chuẩn bị mẫu pha loãng có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
Bước 2: Chuyển 1 ml dung dịch mẫu 10 -1, 10-2, 10-3 vào ống nghiệm chứa môi trường
LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3 ống, ủ trong 37oC trong 24 giờ.
Bước 3: Ghi nhận các ống LSB dương tính (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng có hiện
tượng như ống Durham nổi, ống có bột khí, bị đục.
Bước 4: Cấy các dịch mẫu LSB dương tính vào các ống chứa môi trường BGBL và
môi trường EC ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Bước 5: Ghi nhận lại số ống dương tính ở mỗi độ pha loãng. Tính kết quả bằng cách
tra bảng Mac Crady.