BÀI BÁO CÁO THỰC TẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH

Nguyễn Ngọc Vân Anh – 18180138

Nhóm 19 – lớp 1
GVHD : Mai Lê Hương Xuân
I. Định lượng tổng số Coliforms (phương pháp đếm khuẩn lạc).
1. Tổng quan
Coliforms là trực khuẩn gram âm, hình que, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy
ý. Chúng có khả năng lên men Lactose sinh acid và sinh hơi trong khoảng 37°C trong
24-48 giờ. Chúng thường được sử dụng như là một chỉ số về chất lượng vệ sinh của
thực phẩm và nước. Coliforms có thể được tìm thấy trong môi trường nước, trong đất
và trên thảm thực vật, chúng có mặt phổ biến với số lượng lớn trong phân của động vật
máu nóng. Mặc dù bản thân coliforms không phải là nguyên nhân gây bệnh nghiêm
trọng, chúng rất dễ nuôi cấy và sự hiện diện của chúng được sử dụng để chỉ ra rằng
các sinh vật gây bệnh khác có nguồn gốc phân có thể tồn tại. Các mầm bệnh này bao
gồm vi khuẩn gây bệnh, vi rút hoặc động vật nguyên sinh và nhiều ký sinh trùng đa bào.
Quy trình Coliform được thực hiện trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
2. Nguyên tắc phương pháp đếm khuẩn lạc
Sử dụng môi trường chọn lọc VRB chứa lactose, muối mật ức chế vi khuẩn gram
dương, chất chỉ thị như Crystal violet và Nutrial red, cấy một lượng mẫu đã được đồng
nhất hóa lên môi trường. Dưới áp lực chọn lọc của môi trường, chọn và đếm những
khuẩn lạc đặc trưng có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật. Việc khẳng định
lại sự hiện diện của Coliforms tổng bằng cách chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng đem nuôi cấy
sang môi trường BGBL (môi trường tổng hợp không chọn lọc giúp vi khuẩn hồi phục trở
lại) và quan sát hiện tượng sinh hơi (trong chuông Durham). Từ đó tính được tỉ lệ xác
nhận R và tổng số Coliforms (cfu/g).
3. Quy trình

Cấy 1ml mẫu đã pha Đổ vào 10-15ml VRB đã

Chuẩn bị dịch đồng nhất,
pha loãng mẫu theo các
nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 và
10-4
loãng 10-3 và 10-4 vào đĩa
petri, cấy 2 đĩa / nồng độ
đun tan và làm nguội đến
45° C -> Chờ đông đặc ->
đổ thêm khoảng 5ml lên
bề mặt -> chờ đông đặc

Chọn ra 5 khuẩn lạc đã

Chọn và đếm các khuẩn Lật ngược đĩa và ủ ở 37.0
đếm cấy sang môi trường
lạc có màu đỏ đến đỏ ± 0.5°C trong 24 giờ
BGBL
đậm, có quầng tủa muối
mật, đường kính ≥ 0.5mm

Tỉ lệ xác nhận R
Ủ ở 37.0 ± 0.5°C Tổng số coliforms (cfu/g)
trong 24 giờ R = Số KL sinh hơi trong BLBG (C)
Số KL đã cấy N
C= xR
nVf
4. Kết quả - giải thích
- Số khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật, đường kính ≥ 0.5mm
+ Đĩa 10-3 (1) có 67 khuẩn lạc.
+ Đĩa 10-3 (2) có 55 khuẩn lạc.
+ Đĩa 10-4 (1) có 9 khuẩn lạc.
+ Đĩa 10-3 (2) có 3 khuẩn lạc.
- Số ống sinh hơi trên môi trường BGBL: 1 ống
Vậy tỉ lệ xác nhận R

Số KL sinh hơi trong BGBL 1

R= =
Số KL đã cấy 5
𝑁 𝑁 67+55+9+3 1
C= = ×R= × = 1.2 × 104 (cfu/g)
𝑛𝑉𝑓 𝑛1𝑉1𝑓1+𝑛2𝑉2𝑓2 2×1×10−3 +2×1×10−4 5

Khuẩn lạc có màu đỏ đến màu đỏ đậm do quá trình lên men lactose dẫn đến sự axit
hóa môi trường, được thể hiện bằng màu đỏ của chỉ thị pH (màu đỏ trung tính) và kết
tủa muối mật xung quanh các khuẩn lạc.
Ống đối chứng không sinh hơi có thể là do thao tác thực hiện có sai sót (que cấy còn
nóng làm chết, khi lấy sinh khối không lấy được), khi chọn khuẩn lạc trên đĩa đối chứng
đã chọn sai khuẩn lạc.

5. Kết luận
Tổng số Coliforms/g trong mẫu là 1.2×104 (cfu/g).

II. Định tính E.coli giả định

1. Tổng quan
E.coli giả định là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 44.0 ±
0.5°C trong 24 giờ trong môi trường canh tryptone.

2. Nguyên tắc
- Sử dụng môi trường LSB có chứa lauryl sulphate có khả năng ức chế các vi sinh vật
không phải là Coliforms giúp tăng sinh Coliforms trong mẫu.
- Chọn lọc E.coli giả định bằng cách cấy các ống có sinh hơi sang môi trường EC broth
và ủ ở nhiệt độ 44.0 ± 0.5°C trong 24 giờ. Trong EC broth có muối mật số 3 có khả
năng ức chế các vi khuẩn gram (+) còn sót lại sau khi đã chọn lọc ở bước tăng sinh
E.coli giả định trong môi trường LSB đôi.
- Việc khẳng định lại sự hiện diện của E.coli giả định bằng cách thử phản ứng Indol cho
kết quả dương tính.
3. Quy trình
Cấy 1g (10ml của 10-3) ủ ở 37.0 ± 0.5°C Chọn các ống sinh hơi cấy
mẫu vào 10ml môi trong 24 giờ sang ống chứa 5ml EC broth.
trường LSB nồng độ Mẫu không sinh hơi là âm
đậm đặc gấp đôi tính với E.coli

ủ ở 44.0 ± 0.5°C Chọn các ống sinh hơi cấy ủ ở 44.0 ± 0.5°C
trong 24 giờ sang ống 5ml canh trong 24 giờ
tryptone. Mẫu không sinh
hơi là âm tính với E.coli

Thử phản ứng indol Kết luận: phát hiên (hoặc

E.coli giả định sẽ có biểu không phát hiện) E.coli giả
hiện indol (+) định/g

4. Kết quả - giải thích

Môi trường Hiện tượng
LSB đôi Môi trường đục, có sinh hơi trong chuông Durham
EC broth Môi trường đục, có sinh hơi trong chuông Durham
Canh Trypton Có vòng màu đỏ trên môi trường, dương tính

Coliforms sử dụng đường Lactose trong môi trường LSB để sinh hơi.
Trong EC broth có muối mật số 3 có khả năng ức chế các vi khuẩn gram (+) còn sót lại
sau khi đã chọn lọc ở bước tăng sinh E.coli giả định trong môi trường LSB đôi.
Trong canh trypton – môi trường giàu tryptophan, tryptophanase của E.coli giả định sẽ
thủy phân tryptophan thành indol. Để phát hiện indol, dùng thuốc thử Kovac có chứa p-
dimethylaminobenzaldehyde. Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối
dimethyl ammonium có màu đỏ, khi cho thuốc thử Kovac vào ta sẽ thấy có vòng màu
đỏ trên bề mặt môi trường.

5. Kết luận
Phát hiện E.coli giả định trong mẫu thịt tươi.
III. Định lượng Staphylococcus aureus
1. Tổng quan
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có
thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và
sinh acid từ mannitol, sucrose. Có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến
15% NaCl. S.aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người
thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến
2. Nguyên tắc định lượng S.aureus
- Dùng BPA là môi trường chọn lọc để phát hiện và đếm số S.aureus. Khuẩn lạc đặc
trưng có dạng tròn, lồi, đen bóng, có quầng đục và quầng trong bao quanh. Trong BPA
có LiCl giúp ức chế các quần thể vi khuẩn khác trừ S.aureus. Natri pyruvate và L-lysine
kích thích sự tăng trưởng của S.aureus. Nấm men cung cấp phức hệ vitamin B kích
thích tăng trưởng.
- Sử dụng TSA là môi trường giàu dinh dưỡng, giúp tăng sinh không chọn lọc để hồi
phục vi khuẩn. Trong TSA có trypton và pepton là nguồn cung cấp dinh dưỡng giúp cho
vi sinh vật tăng sinh trở lại một cách tối ưu.
- Việc khẳng định lại dự hiện diện S.aureus trong mẫu bằng cách kiểm tra dương tính
Coagulase với phản ứng đông tụ huyết tương.
3. Quy trình

Trải 0.1ml dung dịch ủ ngược đĩa ở Đếm số khuẩn lạc

mẫu đã pha loãng ở 37.0 ± 0.5°C đặc trưng (N)
nồng độ 10-3 lên 2 đĩa trong 48 giờ
Baird Parker Agar
(BPA)

Cấy chuyển vào ống ủ ở 37.0 ± Cấy 5 khuẩn lạc

chứa 0,3 ml huyết 0.5°C qua đêm đặc trưng lên môi
tương trường TSA

ủ ở 37.0 ± 0.5°C và Quan sát, xác Tính kết quả, số

theo dõi sau 2,3,6,8 định tỉ lệ dương S.aureus (cfu/g)
giờ. Nếu không có tính R 𝑁
biểu hiện ngưng kết S= ×R
𝑛𝑉𝑓
sẽ ủ tiếp trong 24 giờ
4. Kết quả - giải thích
- Môi trường BPA xuất hiện 1 khuẩn lạc đặc trưng => N = 1
- Khi cấy vào huyết tương có hiện tượng đông tụ => R = 1

𝑁 1
S= ×R= × 1 = 5×103 (cfu/g).
𝑛𝑉𝑓 2×0.1×10−3

Trên môi trường BPA, khuẩn lạc đặc trưng có dạng tròn, lồi, đen bóng do (do khả năng
khử potassium tellurite K2TeO3 tạo hợp chất màu đen), vầng đục xung quanh khuẩn lạc
do enzyme lipase phân giải lipid trong cao thịt của môi trường, và khả năng thủy phân
lòng đỏ trứng của lethinase tạo nên quầng trong bao quanh.
S.aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme
coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S.aureus, là tiêu chuẩn để phân
biệt S.aureus với các tụ cầu khác. Huyết tương + coagulase -> Khối Fibrin dẫn đến hiện
tượng đông tụ.

5. Kết luận
Tổng số S.aureus/g trong mẫu là 5×103 (cfu/g).

IV. Định tính Salmonella

1. Tổng quan
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi khuẩn
hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, sinh sống trong đường
ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông
rung hình roi. Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua. Salmonella không
lên men lactose (trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol,
mannitol và glucose.
Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động vật
máu nóng, và trong môi trường Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn, phó
thương hàn, nhiễm trùng máu và ngộ độc thực phẩm. Đặc biệt là qua trứng và thịt gia
cầm.
2. Nguyên tắc định tính Salmonella
- Hồi phục Salmonella: dùng môi trường BPW là môi trường tăng sinh không chọn lọc
có chứa pepton nguồn nitơ, cacbon, vitamin khoáng vật,… Giúp cho vi sinh vật tăng
trưởng trở lại sau quá trình bảo quản thịt.
- Chọn lọc và tăng sinh Salmonella bằng môi trường RV (Rapparport Vasiliadis broth).
Đây là môi trường chọn lọc cực mạnh, giúp ức chế vi sinh vật khác, chọn lọc
Salmonella. Trong môi trường RV có chứa Malachite green oxalate (chất ức chế mạnh)
giúp ức chế vi sinh khác trừ Salmonella, MgCl2 tăng áp lực thẩm thấu môi trường,
Trypton là nguồn dinh dưỡng kết hợp nhiều dưỡng chất, giúp tăng sinh Salmonella.
- Phân lập và nhận diện khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella bằng môi trường XLD,
khuẩn lạc trong suốt, có hoặc không có tâm đen.
- Hồi phục vi sinh vật để thử nghiệm sinh hóa bằng môi trường BHI môi trường tăng
sinh không chọn lọc, giúp cho vi khuẩn khỏe lại để thể đầy đủ đặc tính Salmonella.
3. Quy trình

Cân 25g mẫu + 225g ủ 37.0 ± 0.5°C Chuyển 0,1ml canh khuẩn
BPW, đồng nhất trong 16 -24 giờ sang ống chứa 10ml môi
trường RV

ủ 37.0 ± 0.5°C Cấy phân lập sang ủ 42.0 ± 0.2°C trong

trong khoảng 24 môi trường XLD khoảng 24 giờ
giờ

Chọn khuẩn lạc đặc ủ 37.0 ± 0.5°C Cấy chuyển vào môi trường thử
trưng, trong suốt, có hay trong khoảng 3 nghiệm sinh hóa: KIA, Manitol
không có tâm đen cấy giờ Phenol red broth, Urea broth, lysine
sang ống chưa 5ml BHI decarboxylase broth, canh trypton

Kết luận: phát hiện
(hoặc không phát hiện)
salmonella/25g
Biểu hiện của Salmonella ủ 37.0 ± 0.5°C
trong khoảng 24
KIA: Trên đỏ, sâu vàng
giờ
/H2S(+)/ gas(+); Urea(-);
Manitol(+); Indol (-); LDC (+)
4. Kết quả - giải thích
Môi trường Hiện tượng của mẫu
BPW Môi trường đục => có tăng trưởng sinh khối
RV Môi trường hơi đục => có tăng trưởng sinh khối
XLD Khuẩn lạc trong suốt, 1 số có tâm đen, 1 số không có
tâm đen
BHI Môi trường hơi đục => có tăng trưởng sinh khối
KIA Không có hiện tượng gì, môi trường có màu như cũ =>
âm tính
Không sinh hơi => âm tính với H2S
Manitol phenol red broth Môi trường có màu vàng => Dương tính
Urea broth Môi trường không đổi màu => âm tính
LDC Môi trường đục, có màu tím => dương tính
Canh trypton Không có hiện tượng gì => âm tính

- Khuẩn lạc có tâm đen do môi trường XLD có Ferric ammonium citrate sodium
thiosulfate H2S kết hợp với Fe2+ tạo tủa FeS có màu đen. Trong XLD có nguồn đường
xylose, lactose sucrose, Salmonella sử dụng đường xylose làm axit hóa môi trường
chứa chất chỉ thị pH hóa màu vàng, sau khi sử dụng hết lượng đường xylose,
Salmonella chuyển sang sử dụng L-lysine có trong môi trường XLD làm kiềm hóa môi
trường, nên môi trường có chuyển sang màu đỏ. Vì vậy, quan sát khuẩn lạc ta thấy
khuẩn lạc suốt, có tâm đen xung quanh khu vực khuẩn lạc môi trường có màu đỏ.
- Môi trường KIA là môi trường thạch nghiêng để thử nghiệm khả lên men glucose, khả
sinh khí sinh H2S. Phần nghiêng bề mặt hiếu khí, vi khuẩn sử dụng glucose làm acid
hóa môi trường, môi trường hóa vàng do chất chỉ thị màu pH. Do Glucose rất ít nên khi
hết vi khuẩn dùng nguồn peptone làm sinh NH3, làm kiềm hóa môi trường, nên môi
trường chuyển sang màu đỏ. Phần thạch sâu vẫn có màu vàng do môi trường kỵ khí
thiếu O2 để phân giải peptone, Salmonella sinh H2S từ Soldium thiosulfate phản ứng
với Ammonium ferrous (II) citrate tạo tủa màu đen, sinh gas làm nứt thạch. Nhưng
không có các hiện tượng trên => mẫu âm tính với phản ứng trên.
-Môi trường Mannitol phenol red broth để thử nghiệm khả lên men đường mannitol của
Salmonella. Salmonella sử dụng nguồn carbohydrat làm sinh acid nên môi trường có
màu vàng => có hiện tượng trên nên kết quả dương tính
- Môi trường LDC là môi trường dùng để thử khả năng tiết enzyme Lysine
Decarboxylase của Salmonella. Khi vi khuẩn sử dụng dextrose (trong môi trường) làm
sinh acid, pH giảm, màu từ tím chuyển sang vàng. Nhưng sau khi hết dextrose, vi
khuẩn sử dụng peptone, sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, nên môi trường lại chuyển
sang màu tím. Vì vậy, khi ống nghiệm có màu tím do đã kiềm hóa hoàn toàn và đục do
có sinh khối chứng tỏ đã trải qua quá trình trên => dương tính
- Salmonella không có khả sinh indol, không có khả thủy phân urea sinh NH3 nên cho
phản ứng với Urea broth âm (-) tính, phản ứng indol âm (-) tính.
5. Kết luận:
Không đủ cơ sở để xác định có Salmonella trong mẫu thịt tươi hay không.
V. Kết luận chung:
Mẫu thịt tươi nhiễm chủng vi sinh vật: Coliforms, E.coli giả định, Staphylococcus
Aureus.