TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG

TP HCM
PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI :ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS BẰNG PHƯƠNG

PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN

1
 NHÓM 12
Huỳnh Gia Phát – 2022210138
Huỳnh Phùng Thanh Vũ – 2022210070
Huỳnh Khả Duy – 2022210038
Lê Vỹ Khang - 2022218236
Võ Hoàng Nguyên-2005217994

2
I.Tổng quan về Bacillus
cereus

3
 Kỵ khí tùy ý

Trực khuẩn Bắt màu gram dương

Bacillus cereus
Dễ tạo bào tử
Dễ sinh độc tố

Liều lượng gây ngộ độc 106-108 tế bào/g

4
II. Phân Tích Bacillus cereus

7
Thịt sống và thịt gia cầm Ngũ cốc

Nguồn nhiễm

Rau củ Môi trường đất

5
 Độc tố chủ yếu
Diarrhoeal toxin Emetic toxin

Gây tiêu chảy, sốt Gây buồn nôn, đau bụng

Không bền nhiệt Bền nhiệt

Thời gian ủ bệnh từ 8-16 giờ Thời gian ủ bệnh từ 1-5 giờ
6
 Phạm vi áp dụng

• Phương pháp được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 ( ISO 7932:2004)
• Phương pháp này áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người, thức ăn chăn nuôi,
các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.

Nguyên tắc

• Cấy một lượng mẫu qui định lên bề mặt môi trường nuôi cấy đặc đựng trong các đĩa petri
• Pha loãng theo tỉ lệ 1:9 ( 1 mẫu - 9 SPW )
• Ủ trong điều kiện hiếu khí 30oC/18-48h
• Tính số lượng B.Cereus trong 1ml hoặc 1g mẫu

8
 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

• Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
• Tủ ấm
• Nồi cách thủy
• pH mét
• Đĩa Petri
• Pipet chia vạch
• Dụng cụ dàn mẫu

9
 Môi trường và hóa chất
Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW ( Saline Peptone Water ) Pha loãng mẫu

MYP agar base ( Mannitol- Egg Yolk-

Polymixin )
Polymixin B Nuôi cấy B. cereus

Egg Yolk

Blood agar base

Khẳng định B. cereus giả định
Sheep blood

HCL và NaOH 10% Chỉnh pH

10
Môi Trường MYP

Thành Phần Hàm Lượng Vai trò

Mannitol 10 g/l Phân biệt Bacillus cereus dựa trên khả năng
phân giải mannitol

Peptone 10 g/l Cung cấp nguồn nitơ và cacbon cho vi sinh

vật.

Sodium chloride 5 g/l Điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường.

Agar 15 g/l Tạo thành dạng rắn cho môi trường

Egg yolk emulsion 100 ml/l Là một nguồn dinh dưỡng và chất béo cho vi
sinh vật.
Polymyxin B sulphate 0.3 mg/l Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn Gram
âm

11
 Cân 10g hoặc 10ml + 90ml SPW

Quy trình phân tích Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60s

Dịch mẫu [10-1] Pha Loãng Dịch mẫu [10-2]

MYP MYP MYP MYP

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch.
Ủ 30oC/24h

Đếm khuẩn lạc

Khẳng định B. cereus giả định trên MT thạch máu cừu bằng phản ứng Haemolysin
Ủ 30oC/24h

Tính và biểu thị kết quả

12
Các bước tiến hành
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Bước 2. Pha loãng mẫu
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Bước 5. Đọc kết quả

13
 Căn chính xác 10g đối với mẫu rắn

Đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lòng của phần mẫu
BƯỚC 1. CHUẨN thử đại diện, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác).

BỊ MẪU VÀ
HUYỀN PHÙ BAN Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép +
5% ) vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
ĐẦU
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu
trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2 – 3 phút

14
Bước 1. Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để

Để vi sinh vật không bị
pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được
tổn thương do thay đổi
làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung
nhiệt , thì nhiệt độ của
dịch pha loãng thích hợp.
dịch pha loãng trong
suốt quá trình thao tác
luôn phải giữ xấp xỉ Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng
bằng nhiệt độ phòng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật
lắng xuống.
15
 Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền
phù ban đầu với sai số +5% cho vào
một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha
loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích
hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để
thu được dung dịch pha loãng 10-2(đối với các
loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được
dung dịch pha loãng là 10-1). Nếu cần, lặp lại
thao tác trên để có được dung dịch pha loãng
10-3, 10-4, 10-5....cho đến khi thu được lượng vi
khuẩn thích hợp.
16
Bước 3. Cấy và ủ mẫu

• Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui
trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo. Sử dụng 2 nồng độ pha
loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri.
• Dùng que cấy trái trái đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một
que trãi vô trùng cho mỗi đĩa. Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng để
chất cây bám vào thạch. Lật úp đĩa và ủ 30°C/24 giờ.

17
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để
khẳng định
• Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới
150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc
B.cereus giả định là các khuẩn lạc
lớn, màu hồng, được bao quanh bởi
một vòng kết tủa. Đếm các khuẩn
lạc B. cereus giả định trên những
đĩa có số đếm phù hợp.
• Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu
trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc thì
lấy tất cả các khuẩn lạc giả định
có mặt. Cấy ria, cấy đâm sâu
hoặc chấm các khuẩn lạc đã
chọn lên mặt thạch máu cừu, ủ
ở 30°C trong 24 giờ. Đọc kết
quả.
18
 Bước 5. Đọc Kết
Quả

Khuẩn lạc của B. cereus môi trường thạch MYP

Dẹt, đường kính 2–3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.

19
 Tính kết quả

B.Cereus giả định trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức:

𝚺𝑪
𝑽 × (𝒏 𝟏 + 𝟎 , 𝟏 × 𝒏 𝟐 ) × 𝒅(CFU/g hay CFU/ml)
𝑿=

Trong đó:
C: Tổng số các khuẩn lạc nấm men, nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp nhau
V: Thể tích dịch được cấy trên mỗi đĩa (ml)

n1 : Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại

n2 : Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại

d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại

21
 Ví dụ giả
định
Độ pha loãng
52 15
Số Khuẩn Lạc
48 26

Dựa vào bảng kết quả phía trên ta có

𝛴𝐶
𝑋=
𝑉 × (𝑛 1+ 0 , 1 × 𝑛 2) × 𝑑

= 6409 = 6.4.

22
 Ví dụ giả
(*) Theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT
định
Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật
(Trong 1g hoặc 1 ml sản
phẩm)

Sữa dạng bột B.Cereus 10²

Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật

(Trong 1g hoặc 1 ml sản
phẩm)
Sữa dạng bột B.Cereus 6,4x103 CFU/g có trong mẫu
kiểm nghiệm

Lô hàng không đạt yêu cầu

23
 Câu hỏi ôn tập

Câu hỏi: Môi trường muối cấy của Bacillus cereus?

A. PCA

B. MYP

C.SPW

D. DRBC
Đáp án: B
Câu hỏi: Các bước tiến hành nuôi cấy Bacillus cereus?
A. Pha loãng mẫu – Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu
– Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả

B. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu
– Đọc kết quả – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

C. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Pha loãng mẫu – Cấy và ủ mẫu
– Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả

D. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu
– Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả

Đáp án: C
 Câu hỏi: Quá trình ủ mẫu của B.cereus ở điều kiện nhiệt độ là bao nhiêu?

A. 30°C

B. 40°C

C. 10°C

D. 15°C

Đáp án: A
Câu hỏi: Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để định lượng
Bacillus cereus bằng cách nào?

A. Đếm số lượng khuẩn trên một bề mặt cấy sau khi chúng đã phân tán đều.
B. Sử dụng phép đo hấp thụ ánh sáng để xác định nồng độ vi khuẩn.
C. Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử.
D. Xác định sự thay đổi màu sắc khi vi khuẩn phát triển trên môi trường agar.

Đáp án: A
Câu hỏi: Bacillus cereus là một loại vi khuẩn gram dương, có khả năng
gây ra nhiều bệnh trên con người. Chọn câu trả lời đúng liên quan đến
tính chất của Bacillus cereus?

A. Bacillus cereus là vi khuẩn gram âm.

B. Bacillus cereus có khả năng tạo nên bào tử chịu nhiệt độ cao.

C. Bacillus cereus là vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm trùng ruột.

D. Bacillus cereus không thể tồn tại trong môi trường oxh.

Đáp án: B