Vi nang hóa tế bào L.

acidophilus tạo nguyên liệu probiotic

Mục tiêu học tập:
1. Trình bày và thao tác được các giai đoạn chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, nuôi
cấy thu sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.
2. Thực hiện được một số phép thử xác định đặc tính probiotic của L. acidophilus.
3. Trình bày và thao tác được quá trình vi nang hóa tế bào L. acidophilus tạo nguyên
liệu probiotic, các tính chất của vi nang tạo được.

1. Nguyên lý tạo sản phẩm và đặc điểm sản phẩm

Lactobacillus acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lactic (LAB – lactic acid bacteria)
có khả năng tạo ra acid lactic, do đó được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm để
sản xuất các sản phẩm lên men như sữa chua, đồ muối chua. L. acidophilus cũng được
tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và 1 số động vật, do đó thuộc nhóm vi sinh vật
phổ biến được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm men tiêu hóa vi sinh hay
còn gọi là chế phẩm probiotic.
Sinh khối L. acidophilus dạng tự do trong các chế phẩm probiotic thường dễ bị
ảnh hưởng bởi các điều kiện trong đường tiêu hóa, do đó không phát huy được hết tác
dụng điều trị. Để giải quyết vấn đề trên, vi nang hóa (hay cố định tế bào) L.
acidophilus nhờ hệ gel alginate là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất trong sản
xuất chế phẩm probiotic.
Vi nang tạo thành cần đồng đều về mặt kích thước, phải chứa đủ lượng tế bào
L. acidophilus cần thiết. Đồng thời vi nang phải bảo vệ được vi sinh vật ở pH acid,
nhưng cần có khả năng giải phóng vi sinh vật ở pH ruột non.
Bán thành phẩm vi nang chứa tế bào vi khuẩn cần phải đồng đều về kích thước,
có chứa vi sinh vật và bảo vệ được đa phần vi sinh vật ở pH acid, rã trong môi trường
pH ruột non giải phóng tế bào VSV còn sống để phát huy tác dụng trong hệ tiêu hóa.
2. Đặc điểm nguyên vật liệu
2.1. Chủng giống
L. acidophilus hoặc L. casei phân lập từ chế phẩm trên thị trường được sử dụng
làm nguyên liệu tạo chế phẩm probiotic
B. subtilis ATCC, E. coli ATCC, S. aureus ATCC là các chủng kiểm định để
đánh giá đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic
2.2. Nguyên vật liệu

1
 - Các nguyên liệu hoá chất sử dụng để pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật: natri
alginat, calci clorid, HCl, glucose, cao ngô, cao thịt, pepton, cao nấm men, tween,
(NH4)2SO4, KH2PO4, MnSO4, MgSO4, FeSO4, amoni citrat, natri acetat, thạch
- Các hoá chất sử dụng trong xác định đặc tính probiotic của vi sinh vật: Đệm
phosphate pH 6,8; dung dịch HCl pH 1,2, thuốc thử Uffelmann (20 ml dung dịch
FeCl3 nhỏ thêm 3 giọt phenol)
- Các hoá chất phụ trợ trong bài thực tập: ethanol 70° để tiệt trùng, cồn đốt,
nước cất, dầu soi kính hiển vi, thuốc nhuộm xanh methylen, đỏ fuchsin.
- Môi trường MRS lỏng (g/100ml)
Glucose 2,0
Cao ngô/cao nấm men 0,5
Pepton 1,0
Cao thịt 1,0
K2HPO4 0,2
Amoni citrate 0,2
Natri acetat 0,5
MnSO4.H2O 0,004
MgSO4.7H2O 0,02
Tween 80 0,1
Nước RO vđ 100ml
pH sau tiệt trùng 5,7 – 6,0
- Môi trường LB (g/100ml)
Pepton 1,0
Cao thịt 0,5
NaCl 0,5
Thạch 2,5
Nước 100ml
3. Thiết bị, dụng cụ
- Cân kỹ thuật, tủ ấm 37°C, tủ CO2, buồng cấy vô khuẩn, tủ sấy, máy lắc ổn
nhiệt, nồi hấp tiệt trùng, thiết bị lên men, máy ly tâm, máy lọc hút chân không, nồi
đun cách thuỷ, lò vi sóng, bếp điện, kính hiển vi, máy đo độ nóng chảy, máy xác định
hàm ẩm...
- Bình nón các cỡ, bình định mức các cỡ, petri, pipet bấm các loại, ống đong,
cốc có mỏ các loại, ống nghiệm, buret 50ml, nút bông gạc, đèn cồn, đũa thuỷ tinh,
phễu thủy tinh, phễu sứ xốp, giấy lọc, giấy đo pH, kẹp gỗ, giá đựng ống nghiệm, giá
đỡ buret, lam và lamel soi kính, que cấy, ống mao quản...
2
4. Quy trình tạo nguyên liệu probiotic bằng phương pháp vi nang hóa
4.1. Chuẩn bị ống giống vi sinh vật
Ống giống L. acidophilus hoặc L. casei đã được chuẩn bị trước.
4.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị môi trường MRS lỏng để nhân giống và lên men theo công thức ở mục
2.2. Cân, hòa tan hoặc phân tán đều các thành phần, điều chỉnh đến thể tích mong
muốn, chia đều vào các dụng cụ thích hợp, nút bông. Tiến hành khử trùng các môi
trường ở 110°C - 115°C trong 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn, để nguội và sử dụng.
4.3. Nhân giống vi sinh vật
Chuẩn bị các ống nhân giống chứa 10 ml môi trường MRS lỏng. Tiến hành cấy 1
ml từ ống giống vi sinh vật vào các ống nhân giống trong tủ cấy vô trùng. Nuôi trong
tủ ấm CO2 ở 37°C trong thời gian 24h.
4.4. Lên men thu sinh khối
Chuẩn bị các bình lên men chứa 90 ml môi trường MRS lỏng. Tiến hành cấy
giống vào các bình lên men từ các ống nhân giống đã chuẩn bị sẵn (tỷ lệ giống cấy là
5 - 10%). Nuôi trong tủ ấm CO2 ở 37°C trong thời gian 24h.
4.5. Vi nang hóa tế bào vi sinh vật tạo nguyên liệu probiotic
Ly tâm dịch lên men 4000v/ph trong 10 phút để thu sinh khối. Trộn sinh khối
với 20ml dịch natri alginat 4% đã hấp tiệt trùng. Khuấy từ cho đồng nhất. Nhỏ hỗn
dịch natri alginat – tế bào vi sinh vật vào dung dịch CaCl2 2% đã hấp tiệt trùng để tạo
thành vi nang. Tiếp tục ngâm vi nang trong dung dịch CaCl2 2% trong 20 – 30
phút.Quan sát hiện tượng, mô tả hình thái vi nang tại các thời điểm, vẽ và giải thích
trong báo cáo.
5. Xác định một số đặc tính probiotic của vi sinh vật
5. 1. Đặc điểm hô hấp của vi sinh vật:
Quan sát vị trí của tế bào trong ống nhân giống và bình lên men sau 24h, mô tả
và vẽ vào báo cáo
5.2. Khả năng sinh acid lactic:
Định tính acid lactic có trong ống nhân giống hoặc bình lên men sau 24h nhờ
phản ứng với thuốc thử Uffelmann. Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann vào
dịch nuôi cấy vi sinh vật, quan sát sự chuyển màu của dung dịch. Mô tả hiện tượng và
giải thích vào báo cáo
5.3. Khả năng sinh bacteriocin:
Chuẩn bị môi trường LB theo công thức ở mục 2.2. Cân, hòa tan hoặc phân tán
đều các thành phần, điều chỉnh đến thể tích mong muốn, chia đều vào các dụng cụ
thích hợp, nút bông. Tiến hành khử trùng môi trường ở 110°C - 115°C trong 20 phút.
3
 Sau khi khử trùng, khi môi trường còn ấm (khoảng 45-50°C), đổ 3ml hỗn dịch
vi khuẩn kiểm định (B. subtilis, E. coli, S. aureus) đã chuẩn bị sẵn vào bình nón chứa
50ml môi trường LB, lắc tròn nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong môi trường, rót hỗn
dịch môi trường LB có chứa vi khuẩn kiểm định vào các đĩa petri đã hấp tiệt trùng (16
ml môi trường/đĩa). Để nguội cho thạch đông lại. Khi thạch đã đông, dùng thanh đột
lỗ tạo các giếng trên môi trường thạch trong đĩa petri (Khoảng 6 giếng/1 hộp petri).
Dùng micropipet nhỏ 50 µl dịch trong ống nhân giống hoặc bình lên men vào
mỗi giếng thạch. Các đĩa petri đã nhỏ mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ
cho vi khuẩn kiểm định phát triển. Sau thời gian ủ quan sát các petri, mô tả và vẽ vào
báo cáo, giải thích.
6. Đánh giá đặc tính của vi nang
Cho 2g vi nang vào 20ml môi trường mô phỏng dịch dạ dày (có pH 1,2), lắc
trong 15 – 20 phút. Quan sát hiện tượng. Làm tiêu bản soi dưới kính hiển vi. Mô tả và
giải thích trong báo cáo.
Cho 2g vi nang vào 20ml môi trường mô phỏng dịch ruột (đêm phosphat có pH
6,8), lắc trong 15 – 20 phút. Quan sát hiện tượng. Làm tiêu bản soi dưới kính hiển vi.
Mô tả và giải thích trong báo cáo.