BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

THỰC HÀNH KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

BÁO CÁO CÁ NHÂN

QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN CÁC CHỈ TIÊU

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Dung

Lớp: DHSH17B
GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang
Môn: Kỹ thuật phân tích vi sinh vật

Thành phố Hồ Chí Minh,ngày 26 tháng 03 năm 2024

MỤC LỤC
1. MẪU LỎNG...............................................................................................................................3
1.1 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí........................................................................................3
a. Mục tiêu.............................................................................................................................3
b. Kế hoạch.............................................................................................................................3
1.2 Chỉ tiêu định lượng Coliform tổng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.........................3
a. Mục tiêu..............................................................................................................................3
b. Kế hoạch.............................................................................................................................4
1.3 Chỉ tiêu định tính Staphylococcus aureus phương pháp đếm khuẩn lạc.......................4
a. Mục tiêu..............................................................................................................................4
b. Kế hoạch.............................................................................................................................5
2. MẪU RẮN..................................................................................................................................5
2.1 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí........................................................................................5
a. Mục tiêu..............................................................................................................................5
b. Kế hoạch.............................................................................................................................6
2.2 Chỉ tiêu định lượng Bacilus cereus giả định trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc
ở 30 ͦC.........................................................................................................................................6
a. Mục tiêu..............................................................................................................................6
b. Kế hoạch.............................................................................................................................6
2.3 Chỉ tiêu định lượng nấm men, nấm mốc...........................................................................7
a. Mục tiêu..............................................................................................................................7
b. Kế hoạch.............................................................................................................................7
3. MẪU NÔNG NGHIỆP..............................................................................................................8
a. Mục tiêu..................................................................................................................................8
b. Kế hoạch.................................................................................................................................8
4. RỦI RO.......................................................................................................................................9
1. MẪU LỎNG
1.1 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí
a. Mục tiêu
Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí trong mẫu nước mía bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc bằng kỹ thuật cấy bề mặt dựa theo TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2:2013).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Sấy tiệt trùng đĩa petri, ống nghiệm.
1 hóa chất, - Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất cần thiết T03.08
dụng cụ - Mẫu nước mía
Cân 2.35g PCA, pha 2,35g PCA với 100ml
Chuẩn bị
2 nước cất. Hấp tiệt trùng môi trường. Đổ môi T03.08
môi trường
trường vào đĩa petri.
Pha loãng Pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân liên
3 T03.08
mẫu tiếp tới 10-4, 10-5, 10-6
Hút 0,1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-
5
,10-6 vào đĩa thạch PCA (mỗi nồng độ 2 đĩa).
4 Cấy trải T03.08
Dùng que cấy trải đều đến khi bề mặt thạch
khô.
5 Ủ đĩa Ủ trong tủ ấm ở 30 ͦ C trong 72±3h. T03.08
Kiểm tra Kiểm tra sau 24h và 72 h
6 T03.08
mẫu
Đếm Đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa thạch, ghi
7 T03.08
khuẩn lạc chú số liệu và chụp ảnh.
Tính toán Tính toán khuẩn lạc
8 T03.08
kết quả
9 Dọn dẹp Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình Nhà
10
cáo thực hiện. riêng
c. Rủi ro

1.2 Chỉ tiêu định lượng Coliform tổng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
a. Mục tiêu
Định lượng Coliform tổng số và E.Coli có trong mẫu nước mía dựa theo TCVN
6846:2007 (ISO 7251:2005).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Sấy tiệt trùng ống nghiệm.
1 hóa chất, - Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất cần thiết T03.08
dụng cụ - Mẫu nước mía
- Pha môi trường BGBL, bơm 7ml môi trường
Chuẩn bị vào mỗi ống nghiệm, thêm ống Durham vào ống
2 T03.08
môi trường nghiệm.
- Hấp tiệt trùng 15 phút ở 121 ͦ C
Chuẩn bị Mẫu sau khi chuẩn bị cho ra cốc Becher.
và pha - Sử dụng micropipette và đèn cồn để pha loãng
3 T03.08
loãng mẫu thập phân mẫu trong ống nghiệm mix từ từ mẫu
thập phân đến nồng độ 10-6, 10-7, 10-8.
Cho mẫu Hút 2 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6, 10-
7
4 vào môi ,10-8 vào ống môi trường (cứ 3 ống một nồng T03.08
trường độ).
5 Ủ Ủ trong tủ ấm ở 37 ͦ C trong 24±2h. T03.08
Kiểm tra Kiểm tra sau 24h, ống Durham có sinh hơi chưa
6 T03.08
mẫu lần 1 (nếu chưa tiếp tục ủ).
Sau 24h kiểm tra ống, nếu ống Durham sinh hơi
Kiểm tra
7  dương tính, có Coliform tổng. Nếu không có T03.08
mẫu lần 2
 âm tính và thực hiện lại thí nghiệm.
Chuẩn bị Pha môi trường EC, phân phối vào ống nghiệm có
8 môi trường ống Durham. T03.08
EC
Cấy mẫu Hút 1ml dịch cấy vào canh thang EC
9 T03.08
sang EC
Ủ và quan Ủ trong tủ ấm ở 44 ͦ C trong 24±2h.
10 T03.08
sát Quan sát sự sinh khí trong canh thang EC.
11 Dọn dẹp Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình thực Nhà
12
cáo hiện. riêng
1.3 Chỉ tiêu định tính Staphylococcus aureus phương pháp đếm khuẩn lạc
a. Mục tiêu
Định tính Staphylococcus aureus trong mẫu nước mía trên môi trường Baird-Parker dựa
theo TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-2 : 1999).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
- Hấp tiệt trùng đĩa petri, ống nghiệm, nước muối
Chuẩn bị
sinh lý.
1 hóa chất, T03.08
- Chuẩn bị dụng cụ và các hóa chất cần thiết.
dụng cụ
- Mẫu nước mía
- Pha môi trường BPA, hấp tiệt trùng 15 phút ở
121 ͦ C. Khi nhiệt độ bình môi trường giảm còn
Chuẩn bị
2 45-50 ͦ C thì bổ sung 5ml nhũ tương lòng đỏ trứng T03.08
môi trường
(tỉ lệ 7 trứng:3 nước muối sinh lý).
- Đổ đĩa môi trường vào đĩa petri.
Chuẩn bị Lấy 1 ml dịch huyền phù ban đầu cho vào ống
và pha nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn.
3 T03.08
loãng mẫu Hút lên xuống 10 lần để có dịch pha loãng mẫu có
thập phân nồng độ pha loãng là 10-2
Hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-
5
4 Cấy trải ,10-6 vào đĩa môi trường (cứ 2 đĩa một nồng độ). T03.08
Dùng que cấy trải đến khi bề mặt thạch khô
5 Ủ đĩa Gói đĩa và ủ ở 37 ͦ C trong 24-48h. T03.08
Kiểm tra Kiểm tra hình thái khuẩn lạc
6 T03.08
khuẩn lạc
Nhuộm Nhuộm Gram khuẩn lạc
Gram và Soi khuẩn lạc dưới kính hiển vi xem hỉnh thái vi
7 T03.08
soi khuẩn thể S.aureus.
lạc
Đọc kết Xác định sự xuất hiện của S.aureus.
8 T03.08
quả Chụp ảnh
9 Dọn dẹp Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình thực Nhà
10
cáo hiện. riêng

2. MẪU RẮN
2.1 Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí
a. Mục tiêu
Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu bánh mì bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc dựa theo TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Sấy tiệt trùng đĩa petri, nước muối sinh lý.
1 hóa chất, - Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất cần thiết. T03.08
dụng cụ - Mẫu bánh mì
Cân 2.35g PCA, pha 2,35g PCA với 100ml nước
Chuẩn bị
2 cất. Hấp tiệt trùng môi trường. Đổ môi trường T03.08
môi trường
vào đĩa petri.
Đồng nhất Cân 1g mẫu bánh mì bỏ vào túi dập mẫu, thêm
3 T03.08
mẫu 9ml nước muối sinh lý và để vào máy dập mẫu.
Pha loãng Pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân liên tiếp
4 T03.08
mẫu tới 10-4, 10-5, 10-6
Hút 0,1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-5,10-
6
4 Cấy trải vào đĩa thạch PCA (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng T03.08
que cấy trải đều đến khi bề mặt thạch khô.
5 Ủ đĩa Ủ ở nhiệt độ phòng (38℃) từ 2 đến 5 ngày. T03.08
Kiểm tra Kiểm tra sau 24h và 72h
6 T03.08
mẫu lần 1
Đếm Đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa thạch, ghi
7 T03.08
khuẩn lạc chú số liệu và chụp ảnh.
Tính toán Tính toán tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong
8 T03.08
kết quả mẫu.
9 Dọn dẹp Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình thực Nhà
10
cáo hiện. riêng
2.2 Chỉ tiêu định lượng Bacilus cereus giả định trên đĩa thạch – Kỹ thuật đếm
khuẩn lạc ở 30 ͦC
a. Mục tiêu
Định lượng Bacilus cereus có trong mẫu bánh mì bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc dựa theo
TCVN 4992:2005 (ISO 7932:2004).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất cần thiết .Sấy tiệt
1 hóa chất, trùng đĩa petri, ống nghiệm, nước muối sinh lý. T03.08
dụng cụ - Mẫu bánh mì.
2 Chuẩn bị - Pha môi trường cơ bản MYP, hấp tiệt trùng môi T03.08
 trường. Khi nhiệt độ bình môi trường giảm còn 45-
môi 50 ͦ C thì bổ sung 5ml nhũ tương lòng đỏ trứng (tỉ
trường lệ 7 trứng:3 nước muối sinh lý). Đổ môi trường
vào đĩa petri.
Đồng Cân 1g mẫu bánh mì bỏ vào túi dập mẫu, thêm
3 T03.08
nhất mẫu 9ml nước muối sinh lý và để vào máy dập mẫu.
Pha loãng Pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân liên tiếp tới
4 T03.08
mẫu 10-4, 10-5, 10-6
Hút 0,1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-5,10-6
5 Cấy trải vào đĩa thạch MYP (mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que T03.08
cấy trải đều đến khi bề mặt thạch khô.
6 Ủ đĩa Ủ trong tủ ấm ở 38 ͦ C trong 24h. T03.08
Kiểm tra Kiểm tra sau 24h có khuẩn lạc mọc trên môi
7 T03.08
mẫu trường chưa.
Nhuộm Nhuộm Gram khuẩn lạc
Gram và Soi khuẩn lạc dưới kính hiển vi xem hỉnh thái vi
8 T03.08
soi khuẩn thể Bacilus cereus để xác định Bacilus cereus.
lạc
Đọc kết Đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa thạch, ghi chú
9 T03.08
quả số liệu và chụp ảnh kết quả.
10 Dọn dẹp - Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ. T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình thực Nhà
11
cáo hiện. riêng
2.3 Chỉ tiêu định lượng nấm men, nấm mốc
a. Mục tiêu
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc có trong 1g mẫu bánh mì bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc dựa theo TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2018).
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất cần thiết. Sấy
T03.0
1 hóa chất, tiệt trùng đĩa petri, nước muối sinh lý.
8
dụng cụ - Mẫu bánh mì
Cân 3,16g DRBC, pha 3,16g DRBC với 100ml
Chuẩn bị T03.0
2 nước cất. Hấp tiệt trùng môi trường. Đổ môi
môi trường 8
trường vào đĩa petri.
Pha loãng Pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân liên tiếp T03.0
4
mẫu tới 10-2, 10-3, 10-4 8
4 Cấy trải Hút 0,1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-2, 10- T03.0
 3
,10-4 vào đĩa thạch DRBC (mỗi nồng độ 2 đĩa).
8
Dùng que cấy trải đều đến khi bề mặt thạch khô.
Ủ ở nhiệt độ phòng (38℃) từ 2 đến 5 ngày. T03.0
5 Ủ đĩa
8
Kiểm tra Kiểm tra sau 2 ngày và 5 ngày. T03.0
6
mẫu 8
Đếm Đếm số khuẩn lạc mọc trên từng đĩa thạch, ghi T03.0
7
khuẩn lạc chú số liệu và chụp ảnh. 8
Tính toán Tính toán tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong T03.0
8
kết quả mẫu. 8
Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.0
9 Dọn dẹp
8
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình thực Nhà
10
cáo hiện. riêng

3. MẪU NÔNG NGHIỆP

a. Mục tiêu
Định lượng vi sinh vật phân giải cellulose có trong sản phẩm, chế phẩm vi sinh xử lí chất
thải hữu cơ Emzeo dựa theo TCVN 6168:2002.
b. Kế hoạch
Các bước thực hiện Địa Thời
STT Nội dung
điểm gian
Chuẩn bị - Sấy tiệt trùng đĩa petri, ống nghiệm.
1 hóa chất, - Chuẩn bị dụng cụ và các hóa chất cần thiết. T03.08
dụng cụ
Chuẩn bị Chế phẩm vi sinh xử lí chất thải hữu cơ Emzeo Cửa
2
mẫu hàng
Chuẩn bị Pha môi trường Ken Knight, hấp tiệt trùng môi
3 T03.08
môi trường trường và đổ vào đĩa petri.
Cân 1 g mẫu và cho vào bình chứa 90 ml dịch
pha loãng NaCl 0.85% đã chuẩn bị sẵn. Khuấy
Đồng nhất
4 đều cho vi sinh vật trong dung dịch phân bố T03.08
mẫu
đồng đều trong thời gian không quá 15 phút,
gạn được dung dịch huyền phù ban đầu.
Lấy 1 ml dịch huyền phù ban đầu cho vào ống
nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý. Hút lên
Pha loãng xuống 10 lần để có dịch pha loãng mẫu có
5 T03.08
mẫu nồng độ pha loãng là 10-2 . Pha loãng mẫu đến
nồng độ 10-6.
 Hút 0,1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-4, 10-
5
,10-6 vào đĩa thạch môi trường Ken Knight
6 Cấy trải T03.08
(mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que cấy trải đều đến
khi bề mặt thạch khô.
Sau khi khuẩn lạc phát triển, để đĩa petri vào tủ
7 Ủ đĩa lạnh 12h. Sau đó cho vào tủ ấm 40 ͦ C trong 6h. T03.08
Cân, pha thuốc thử Lugol
Sử dụng
Thêm vào mỗi đĩa 5ml thuốc thử Lugol, dàn
8 thuốc thử T03.08
đều khắp mặt thachj trong 15 phút, gạn đi hết
Lugol
thuốc thử.
Đọc kết Đếm số khuẩn lạc trong đĩa petri tạo vòng phân
9 T03.08
quả giải xenlulo bao quanh khuẩn lạc
Tính toán Tính toán số lượng vi sinh vật
10 T03.08
kết quả
11 Dọn dẹp - Hấp bỏ môi trường, vệ sinh dụng cụ T03.08
Viết báo Trình bày kết quả, báo cáo chi tiết quá trình Nhà
12
cáo thực hiện. riêng

4. RỦI RO
- Thiếu hóa chất và môi trường (có thể thay thế bằng môi trường khác tuy nhiên nếu
không phù hợp thì vi sinh vật sẽ không thể phát triển bình thường được nên sẽ dẫn đến
sai sót trong kiểm nghiệm kết quả).
- Môi trường thạch không đông, môi trường thiếu dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển. Do
không đo lường chính xác tỉ lệ thành phần môi trường.
- Môi trường bị nhiễm vi sinh vật khác dẫn đến sự phát triển của khuẩn lạc không mong
muốn, có thể do dụng cụ pha môi trường không được làm sạch kĩ trước khi sử dụng từ đó
gây nhiễm môi trường do các chất cặn có trong dụng cụ.
- Quá trình cấy chưa chuẩn dẫn đến tạp nhiễm các vi sinh vật khác.
- Số lượng khuẩn lạc mọc quá dày hoặc quá ít dẫn đến việc khó quan sát hình thái khuẩn
lạc và đọc kết quả. Do lựa chọn nồng độ mẫu chưa thích hợp hoặc lấy sinh khối quá
nhiều làm cho khuẩn lạc mọc quá dày không đếm được.
- Không mọc khuẩn lạc do không để nguội que cấy, que cấy quá nóng sẽ làm chết vi sinh
vật.
- Vi khuẩn bắt sai màu thuốc nhuộm làm kết quả không chính xác do tẩy cồn quá lâu hoặc
quá ít.
- Xuất hiện hiện tượng dương tính giả.