Vietnam National University of Agriculture

FACULTY OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY (FST)

Thực hành
Học phần: An toàn thực phẩm
Thời lượng: 8 tiết
 Nội dung thực hành

Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau

Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau
Tồn dư Nitrat trên rau quả?
Phân bón hóa học (NPK)
Sự tạo thành nitrat (NO3-)
và nitrit (NO2-) là một quá Nguyên nhân?
trình chuyển hoá nitơ tự Nguồn đất, Nguồn nước
nhiên trong cây trồng (nước thải sinh hoạt,
Cấp tính: 1-4g/ngày nước thải CN)
Mãn tính: tích lũy thời
Chỉ tiêu đánh gian dài
giá mức độ Methemoglobin trong
sạch của thực (NO3 -) oxy hóa máu (Fe2+ -> Fe3+)
phẩm thành (NO2-)
Acid amin bậc 2,3 ->
Mức chấp nhận: nitrosamin -> ung thư
500mg/kg sản phẩm
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau

Định lượng nitrat bằng so màu axit disunfophenic

Ion NO3 phản ứng với axit disunfophenic tạo thành trinitrophenol màu
vàng có cường độ màu tương quan thuận với nồng độ nitrat

C6H3(HSO3)2OH + 3HNO3  C6H2(OH)(NO2)3 + 2H2SO4 + H 2O

Axit disunfophenic Trinitrophenol (màu vàng)

Xác định NO3- bằng cách đo cường độ màu vàng bằng quang phổ kế tại
bước sóng 420 – 460nm (kính lọc màu xanh). Phương pháp này có độ
nhạy rất cao đến 0,001ppm.
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau
Cách tiến hành: 1. Xây dựng phương trình đường chuẩn
Cốc 1 Cốc 2 Cốc 3 Cốc 4 Cốc 5 Cốc 6

V KNO3 0 5 10 15 20 25
0.01mg/ml
(ml)

V H2O (ml) 25 20 15 10 5 0

V dd (ml) 25 25 25 25 25 25

Nồng độ 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

(mg/ml)
V1.C1 = V2.C2
5.0.01=25.C2
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau
Cách tiến hành: 1. Xây dựng phương trình đường chuẩn
Cô cạn dung dịch bằng bếp điện đến khi
còn 1 giọt. Thêm 1ml ax disunfophenic
láng đều bề mặt cặn. Thêm 25 – 30 ml
nước cất, trung hoà bằng NaOH 10% đến
pH 7,5 – 8 đến khi chuyển màu vàng thì
dừng lại  lên thể tích 50ml  Đo màu ở
máy quang phổ tại bước sóng 420 nm
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau
Cách tiến hành: 2. Tiến hành phân tích mẫu
Mẫu  Rửa sạch  Để ráo nước  Thái nhỏ  Trộn đều  Cân (4 –
7g tuỳ thuộc vào mẫu)  Cho mẫu vào bình tam giác 250ml  Thêm
75ml nước cất vào bình  Đun sôi bằng bếp điện (1 phút)  Để nguội
 Lọc lấy dịch (bằng giấy lọc hoặc bằng bông)  Lên thể tích 100ml
 Hút 10ml vào cốc thuỷ tinh 100ml  cô cạn (còn 1 – 2 giọt nhưng
không cháy mẫu)  Để nguội  Thêm vào cốc 1ml axit disunfophenic
 cho 25 – 30ml nước cất  trung hoà bằng NaOH 10% đến pH 7,5 –
8  đến khi chuyển màu vàng thì dừng lại  lên thể tích 50ml  Đo
màu ở máy quang phổ tại bước sóng 420 nm
 Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-)
trên rau
Cách sử dụng máy đo quang phổ UV-Vis
https://www.youtube.com/watch?v=4uvXTP-Fu7Q
Bài 1: Xác định dư lượng nitrat (NO3-) trên rau
Cách tiến hành: 3. Tính kết quả
Quy về mg NO3-/1kg nguyên liệu tự nhiên
+ X: Nồng độ nitrat tính được từ phương trình đường chuẩn bằng việc
thay OD mẫu vào giá trị Y
+ V1: Thể tích dung dịch trích để so màu (ml)
+ V: Tổng thể tích rút ra từ mẫu (ml) X . V . 1000
NO3- mg/kg = V1 . P
+ P: Khối lượng mẫu (g)
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
1. Xác định sự có mặt của TBVTV lân hữu cơ (Wofatox)
Wofatox còn được gọi là Parathion Metyl, không bền vững ở
môi trường kiềm NaOH và sẽ thủy phân thành Natri
paranitrophenolat và Natri Dimetyl-O-Thiophosphat.
Chất Natri paranitrophenolat là một chất có màu vàng rơm,
nhận dạng dễ dàng.
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Cách tiến hành:
1. Chiết xuất thuốc BVTV ra khỏi sản phẩm
- Chiết xuất Wofatox bằng cồn etylic 90-100o kết hợp với việc ma sát,
cọ rửa bằng bông, xối rửa bằng bình tia dung môi.
- Lấy mẫu trong lô có nghi vấn có thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ. (Ví dụ
tiến hành thí nghiệm với mẫu là dưa chuột). Đặt dưa chuột trong lòng
phễu trên bình tam giác. Dung bình tia đựng cồn phun ướt nửa trên
của mẫu. Dùng bông lau lần lượt từng phần từ trái qua phải, từ trên
xuống dưới. Xoay mẫu 180o và tiến hành tương tự.
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Cách tiến hành:
2. Làm đậm đặc thuốc trong dung môi
Nếu nồng độ thuốc trong dung môi nhỏ, ta phải làm đậm đặc bằng
cách cô cách thủy ở nơi thoáng gió, trong tủ hút.
3. Tiến hành
Lấy 3ml dung dịch mẫu kiểm tra vào ống nghiệm. Thêm 3ml NaOH
1N, Lắc đều, dung dịch sẽ có màu vàng rơm đậm hay nhạt tùy theo
nồng độ Wofatox có trong nồng độ dung dịch.
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Đánh giá kết quả:
+ Nếu thấy dung dịch có màu vàng rơm xuất hiện: Sản phẩm có
Wofatox, thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ.
+ Nếu dung dịch không có màu vàng rơm xuất hiện: sản phẩm không
có dư lượng thuốc Wofatox thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ.
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
2. Xác định sự có mặt của hàn the trong thực phẩm
Hàn the: là một hợp chất hoá học hay được gọi là Borax một
loại muối rắn màu trắng đục, không mùi, không vị, dễ tan trong
nước, có khả năng diệt khuẩn và nấm.
https://tiennghich.mobi/cong-thuc-hoa-hoc-
cua-han-the/
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
2. Xác định sự có mặt của hàn the trong thực phẩm
Hàn the có phản ứng kiềm với phenolphtalein cho
dung dịch màu hồng. Nếu cho dung dịch này tác
dụng với dung dịch Glyxerin trung tính, dung dịch sẽ
chuyển thành axit, sẽ mất màu hồng, trở thành
không màu(phản ứng axit với phenoiphtalein do tạo
thành axit glyxero boric có tính axit)
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Cách tiến hành:
- Lấy 15-20g sản phẩm, thái nhỏ 3-5mm, ngâm trong 20-25ml nước cất
đã đun sôi.
- Sau 15-20 phút gạn lấy nước và đun sôi lại
- Lọc lấy 5ml nước trong cho vào ống nghiệm
- Nhỏ vào ống nghiệm 2-3 giọt phenolphtalin1% rồi lắc đều
Bài 2: Xác định dư lượng các hoá chất sử dụng trong quá trình
sản xuất, chế biến nông sản thực phẩm
Đánh giá kết quả:
- Nếu có màu hồng xuất hiện nhỏ tiếp 2-3 giọt glyxerin trung tính, màu
hồng sẽ mất đi thành không màu => sản phẩm có hàn the
- Nếu không có màu hồng xuất hiện => sản phẩm không có hàn the.

https://kingtestvn.com/test-han-the-bk04.html (Thử hàn the bằng test

kit)
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm

1.Chỉ tiêu Coliforms tổng số:

Coliforms là trực khuẩn Gram(-) không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ
khí tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh axit (sinh hơi) ở 370C
trong 24- 48h.
- Nhóm coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột
người, động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số
lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các mẫu
môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh
vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số coliforms
của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây
bệnh khác cũng cao.
- Nhóm coliforms gồm 4 giống là: Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella, Enterobacter.
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm

1.2. Định lượng coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường VRBL
Nguyên tắc:
- Quá trình lên men lactose dẫn đến kết quả axit hóa môi trường, được thể hiện
bằng màu đỏ của chỉ thị pH (màu đỏ trung tính) và kết tủa muối mật xung quanh
các khuẩn lạc.
- Sự hiện diện đồng thời của muối tinh thể tím và muối mật ức chế vi khuẩn
Gram dương
- Mẫu được đồng nhất được cấy một lượng thích hợp trên môi trường thạch
chọn lọc chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men và sinh axit sau khi nuôi ở 37 độ
C trong 48h.
- Trên môi trường này, khuẩn lạc coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường
kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật.
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm
1.2. Định lượng coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường VRBL
- Đồng nhất mẫu: tạo sự đồng đều về mật độ coliform ở tất cả các
điểm trên mẫu
+ Cắt nhỏ, trộn đều: dao, thớt
+ Giã nhỏ, trộn đều: chày, cối sứ
+ Xay, nghiền, trộn đều: máy xay, máy nghiền
- Pha loãng mẫu: làm giảm nồng độ coliform trong mẫu, tạo điều
kiện cho quá trình đếm
- 10-2 10-3 lặp lại 3 lần
- Cấy mẫu: hút 1ml mẫu vào đĩa petri
- Chuẩn bị môi trường VRBL: 250ml/nhóm
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm

•Đối với mẫu chất lỏng: dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào
ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được
nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp
1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng
tạo độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết
•Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10 g mẫu, sau đó cho vào 90 ml
dung dịch pha loãng tạo nồng độ pha loãng 10-1. Và tiếp tục pha
loãng tương tự như mẫu nước
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm

2. Định lượng coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường VRBL

• Chuyển 1ml mẫu đã pha loãng vào đĩa Petri.

• Bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRBL ở 450C
• Xoay đĩa – để mẫu và môi trường hòa đều vào nhau
• Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C
trong 24-48h.
• Đếm số khuẩn lạc có đặc điểm của khuẩn lạc coliforms.
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm
2. Chỉ tiêu tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí
• Plate count agar (PCA) là hoá chất được sử dụng cho xác định tổng số lượng vi
khuẩn hiếu khí sống trong mẫu.
• Đây không phải là dạng môi trường chọn lọc.
• Đĩa được ủ ở 20 hoặc 30°C trong ba ngày.
• Sau khi ủ, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa, con số này nên nằm
trong khoảng 25-250 là thích hợp nhất để đưa ra kết quả chính xác.
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm
3. Chỉ tiêu tổng số nấm men và nấm mốc
• Hiện nay các phương pháp thạch kháng sinh đã thay thế phương pháp thạch axít truyền
thống trước đây cho việc đếm nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm từ sữa. Việc sử
dụng kháng sinh tốt hơn axít trong việc ức chế vi khuẩn dẫn đến cải thiện khả năng thu hồi
những tế bào nấm bị tổn thương (nhạy cảm với axít), kiểm soát vi khuẩn tốt hơn và ít ảnh
hưởng trong khi đếm từ các mảnh thực phẩm bị tủa.
• YGC Agar (Yeast Glucose Chloramphenicol Agar) được khuyến cáo bởi APHA và Liên đoàn
sữa quốc tế. Yeast Glucose Chloramphenicol Agar là một môi trường dinh dưỡng mà ức chế
sự sinh trưởng của các sinh vật không phải nấm men và nấm mốc do sự có mặt của
chloramphenicol.
• Chiết xuất nấm men cung cấp những chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng.
Glucose là nguồn cung cấp nguyên tố các-bon cho sinh vật phát triển. Chloramphenicol ức
chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Sau khi ủ ở 25°C, khuẩn lạc được đếm là khuẩn lạc của
nấm men được phân biệt với nấm mốc bởi hình thái của chúng.
Bài 3: Xác định các chỉ tiêu vi sinh trong một số loại thực phẩm
3. Tính kết quả
Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, tính mật độ của coliforms theo công
thức sau:
N
A(CFU/g hay CFU/ml) = R
n1.v.f1 + …..+ ni .v.fi
Trong đó :
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
ni:số đĩa có khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R: tỷ lệ khẳng định (R=0.9 đ/v VRBL; R=1 đ/v PCA và YGC)
Môi trường YGC (Tổng số Plate Count Agar PCA (Tổng
nấm men và nấm mốc) số lượng vi khuẩn hiếu khí)
Thành phần G / Lít Thành phần G/L
Yeast extract Peptone 5
5
(Cao nấm men)
Glucose 20 Yeast Extract
2
(Cao nấm men)
Chloramphenicol 0.1
Glucose 1
Agar 20
Agar 20
 Môi trường VRBL (Coliforms tổng số)

Thành phần G/L

Peptone 7
Yeast Extract (Cao nấm men) 3
Lactose 10
Đỏ trung tính 0.03
Tím tinh thể 0.002
Bile salts (muối mật) 1.5
NaCl 5
Agar 20