Đại học công thương Tp.

Hồ Chí Minh
Khoa Công nghệ Thực phẩm

ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCUS AUREUS BẰNG

PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC
Nhóm 9
GVHD: Đinh Thị Hải Thuận
 1 3
Tổng quan NỘ Quy trình
ID định lượng
UN
G

2 4
Môi trường- Tính toán
hóa chất
1.TỔNG QUAN VỀ STAPHYLOCOCUS
AUREUS.
 ĐẶC ĐIỂM
Có khả năng lên men và
Cầu khuẩn gram dương, sinh sucrose, mannitol và
đường kính 0,5-1,5 µm. sinh sắc tố vàng.
Không sinh bào tử. S. aureus phát triển hiếu
khí hoặc yếm khí ở nhiệt
độ 18-40⁰C.
 Tạo độc tố Enterotoxin bền
nhiệt.
Tụ cầu thường tụ tập thành đám
nhỏ như những chùm nho
 Nguy cơ lây nhiễm
-Từ tay người chế biến, bảo quản không thích hợp.
-Thực phẩm có nguy cơ cao: thịt và sản phẩm thịt, gia
cầm, trứng và sản phẩm từ trứng, sữa và sản phẩm sữa,
thủy sản,...
-S.aureus phân bố khắp mọi nơi như: da, mũi, tóc và
lông của các động vật máu nóng.
Khả năng lây bệnh
 Triệu chứng
-Bụng quặn đau, nôn mửa dữ dội,
tiêu chảy, mệt mỏi,…
-Thời gian ủ bệnh nhanh, khoảng 1-2
ngày là khỏi.
-Tử vong chủ yếu là ở các bệnh nhân
là trẻ em bị suy dinh dưỡng, người già
mắc bệnh mãn tính kèm theo.
 Quy trình định lượng
Staphylococus aureus
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
 PHẠM VI ÁP DỤNG
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 -1: 2005 (ISO 6888-1:1999)
dùng để định lượng S.aureus cho tất cả các loại thực phẩm.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện và định lượng S.aureus
trong phụ gia thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

Phương pháp này thích hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên 100 tế bào
S. aureus trên gram.
 Phương pháp đếm khuẩn lạc là gì?
Phương pháp đếm khuẩn lạc được
dùng để ước tính số lượng vi khuẩn
hoặc tế bào nấm trong 1 mẫu thử
nghiệm nhất định.
Là phương pháp được áp dụng
phổ biến trong nghiên cứu và kiểm Đếm khuẩn lạc thủ công
nghiệm vi sinh vật, thực phẩm,…
Có 2 phương pháp đếm khuẩn lạc:
thủ công và tự động.

Máy đếm khuẩn lạc tự động SphereFlash

 Nguyên Tắc
-Cấy lên bề mặt của môi trường, chọn lọc một lượng mẫu quy định
(sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù)
-Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 37°C và kiếm tra sau 24h hoặc
48h.
-Tính số lượng S.aureus trong 1ml hoặc 1g mẫu từ những khuẩn lạc
điển hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau
và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.
 Môi trường và hóa chất Mục đích

Dung dịch Saline Peptone water(SPW) Dung dịch dùng để pha loãng mẫu

Môi trường chọn lọc để nuôi cấy

Môi trường Baid-Parker Agar(BPA)
S. aureus

Egg yolk tellurite emulsion Môi trường chọn lọc để nuôi cấy
(Nhũ tương long đỏ trứng) S. aureus

Môi trường Tryticase Say Agar (TSA) Bảo quản và phục hồi vsv trong quá trình nuôi cấy

Brain heart broth(BHI) Bảo quản và phục hồi vsv trong quá trình nuôi cấy

Huyết tương thỏ đông khô Khẳng định S. aureus

HCl và NAOH 10% Chỉnh pH của môi trường

 Môi trường
Baid-Parker Agar
(BPA)
 Tryptone Nguồn carbon và nitơ

Cao thịt bò Nguồn Carbon và nito

Cung cấp các vitamin B, kích thích

Cao nấm men
sinh trưởng vi khuẩn

Natri pyruvat Kích thích sinh trưởng của S. aureus

Glycine Kích thích sinh trưởng của S. asssureus

Lithium Chloride Tính chọn lọc của môi trường

Tác nhân làm đông cứng

 Môi trường
Brain heart broth
(BHI)
 Cung cấp nito, vitamin, khoáng chất, acid amin cần thiết cho sự phát triển
Tryptone
của hầu hết các vsv.

Cung cấp nito, vitamin, khoáng chất, acid amin cần thiết cho sự phát triển
Bột não bò
của hầu hết các vsv.

Cung cấp nito, vitamin, khoáng chất, acid amin cần thiết cho sự phát triển
Bột tim bò
của hầu hết các vsv.

Natri clorua Duy trì sự cân bằng thẩm thấu

Glucoza Nguồn năng lượng Cacbon

Natri hydro
Duy trì hoạt động đệm của môi trường
phosphate
 Môi trường
Egg yolk tellurite emullsion
(Nhũ tương lòng đỏ trứng)
 Môi trường cơ bản Mục đích

Phân biệt S. aureus dương tính với

Nhũ tương lòng đỏ trứng
coagulase dựa trên lòng đỏ trứng

Ức chế sự sinh trưởng của các vsv

Dung dịch Kali tellurite 3,5% vô
khác, tạo vòng sáng cho khuẩn lạc
trùng
không điển hình.
 Môi trường SPW

NaCl Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các a.a

Peptone chuỗi dài, vitamin và các chất dinh dưỡng cần
thiết khác

Nước cất Pha môi trường

 Môi trường Tryticase Say Agar

(TSA)

Pancreatic Digest of Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi cung cấp nito
Casein hữu cơ, đặc biệt amino acid và các peptine chuỗi dài

NaCl Duy trì cân bằng, áp suất thẩm thấu

Làm cho môi trường giàu dinh dưỡng bởi cung cấp nito
Say peptone
hữu cơ, đặc biệt amino acid và các peptine chuỗi dài

Agar Làm cứng môi trường

 Quy trình phân tích
Staphylococus aureus
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
 Quy trình định lượng Staphylococus aureus

Chuẩn bị mẫu Phân lập trên môi trường

Quan sát và đếm số khuẩn
chọn lọc
Đồng nhất, lạc
Cấy trải trên đĩa thạch
pha loãng theo BPA, ủ ở 37±1°C; 24-48h
nồng độ

Điển hình Không điển hình

 Khẳng định Thử nghiệm ngưng kết Tính toán
Khuẩn lạc coagulase
Cấy khuẩn lạc điển Tính tỷ lệ khuẩn lạc điển
điển hình hình phản ứng coagulase(+)
hình vào canh BHI.
trên tổng số khuẩn lạc điển
hình thử nghiệm

Khẳng định Tính toán

Khuẩn lạc Thử nghiệm ngưng kết

không Cấy khuẩn lạc không coagulase Tính tỷ lệ khuẩn lạc không điển
điển hình vào canh hình phản ứng coagulase(+)
điển hình
BHI. trên tổng số khuẩn lạc không
điển hình thử nghiệm
 Mật độ
Staphylococcus aureus trung
bình(CFU/g hay CFU/ ml)
 Các bước tiến hành
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu.
Cân chính xác 10g/25g
mẫu (mẫu rắn) hoặc 10ml/25ml
mẫu (mẫu lỏng) (sai số cho phép
±5%) vào túi nhựa vô trùng hoặc
bình tam giác

Thêm 90ml dung dịch pha

loãng SPW vô trùng vào túi
nhựa hoặc bình tam giác

Dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2-3 phút.
 Bước 2:Pha loãng mẫu.

1ml SPW 1ml SPW 1ml SPW 1ml SPW

9ml 9ml 9ml 9ml 9ml

SPW SPW SPW SPW SPW
Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc
Hút 0,1 ml dung dịch mẫu ở các nồng
ađộ pha loãng vào đĩa môi trường BPA
BPA
(mỗi nồng độ lặp lại 2 lần)

Dùng que trang trải đều dịch mẫu trên

mặt thạch

Lật ngược các đĩa đã cấy, ủ ở 37 ± 1º C

trong 24 ± 3h hoặc 48 ± 4h.
 Bước 4: Quan sát đếm khuẩn lạc.
Sau 24 ± 3h, tiến hành đếm số khuẩn lạc S.aureus điển hình và không điển hình trên môi trường thạch BPA.

Sau 48h ± 4h, khuẩn lạc S.aureus dương

tính, màu đen, sáng và lồi, quanh khuẩn
Sau 24 giờ lạc có vùng đục mờ hẹp.
Khuẩn lạc điển hình có màu đen, sáng,
lồi, mỗi khuẩn lạc có vầng sáng bao
quanh. Những khuẩn lạc được đánh
dấu trên mặt sau đĩa và tiếp tục ủ thêm
24h.
Khuẩn lạc không điển hình thì không
tạo vầng sáng và vùng đục bao quanh
khuẩn lạc.
Bước 5: Phục hồi

BPA

Cấy 5 khuẩn lạc điển

5ml
hình và 5 khuẩn lạc
không điển hình. BHI

Ủ ở 37 ± 1°C trong 24 giờ

Bước 6: Khẳng định Staphylococus aureus bằng phản ứng đông tụ huyết
Nguyên tắc: Thử nghiệm khả năng của một số sinh vật làm đông tụ huyết tương bởi hoạt động của enzyme
tương
coagulase. Coagulase được S. aureus tiết ra bên ngoài tế bào và chúng cũng dễ dàng bất hoạt bởi các protease.
Coagulase là enzyme đóng vai trò đông tụ huyết tương, kết hợp với các cấu tử trong huyết tương thành từng khối
hay từng cục ( khối Fibrin).
Chứa
0
huyết ,3ml
tươn
thỏ g

Hút 0,1ml dịch Ủ ở 37 ± 1 º C

nuôi cấy BHI

Kích thước: 10mm x 75mm

Kiểm tra sự đông tụ của huyết tương sau 2,4,6,8 giờ.

Phản ứng được coi là dương tính khi thể tích đông tụ chiếm ¾.
 Tính kết quả
Mật độ S.aureus trong mẫu được tính như sau :

Mật độ
(CFU/g hay CFU/ml) =
 Sản phẩm:
Ví dụ Trứng tươi

Số phản
Độ pha Số khuẩn lạc thử nghiệm phản ứng ứng
loãng coagulase coagulase
(+)

28 5 5 5/5

45 5 2 2/5

8 5 5 5/5

14 5 1 1/5
Ví dụ
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml)
Kết luận
Phương pháp định lượng S.aureus có phản ứng với coagulase trên đĩa thạch
trong các sản phẩm dùng cho người hay thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số
khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môi trường thạch Baird Parker).
Thông qua việc định lượng S.aureus từ đó nâng khả năng kiểm soát, xác định
S.aureus có trong thực phẩm hay không nhằm đảm bảo sự an toàn của người
tiêu dùng thực phẩm.
Câu hỏi trắc nghiệm
1.Bệnh nào sau đây liên quan đến S.aureus ?
a. Bệnh lao
b. Tiểu đường
c. Nhiễm trùng da
d. Đau cơ
2.Điều nào sau đây mô tả sự sắp xếp của tế
bào Staphylococcus Aureus dưới kính hiển vi?
a) Dây chuyền
b) Chùm nho
c) Cặp
d) Khối vuông
3.Nguồn lây nhiễm của S.aureus là từ đâu?
a. da
b. máu
c. hô hấp
d. tất cả các ý trên
4.S.aureus nuôi cấy trên môi trường?
1. Môi trường BHI
2. Môi trường TBX
3. Môi trường BPA
4. Môi trường DR18
5.Vai trò của môi trường Brain heart broth
(BHI) trong phương pháp này là gì?
A. Bảo quản vi sinh vật trong quá trình nuôi
cấy.
B. Khẳng định S.aureus
C. Phục hồi vi sinh vật trong quá trình nuôi
cấy.
D. Cả A và C đều đúng
6. Huyết tương thỏ dùng để làm gì?
A. Dùng để khẳng định S.aureus
B. Làm rắn môi trường
C. Dung dịch đẳng trương dùng để pha loãng
mẫu
D. Bảo quản vi sinh vật trong quá trình nuôi
cấy
7. Ở bước quan sát và đếm khuẩn lạc thì:
A. Chỉ đếm khuẩn lạc điển hình
B. Chỉ đếm khuẩn lạc không điển hình
C. Cả A và B đều đúng
D. Cả A và B đều sai
8.Khuẩn lạc S. aureus điển hình có đường
kính là bao nhiêu?
A. 1÷1,5mm
B. 1÷2mm
C. 1,5÷2,0mm
D. 2÷4 mm
9. Định lượng Staphylococcus aureus được
thực hiện bằng phương pháp cấy nào :
A. Cấy trang
B. Cấy ria
C. Cấy hộp trải
D. Cả A, B, C
10.Chọn phát biểu đúng:
A. Ở bước quan sát và đếm số khuẩn lạc,Khuẩn lạc S. aureus diển hình
có đường kính 1÷1,5mm, màu đen sáng, lồi.Mỗi khuẩn lạc không có
đường kính bao quanh
B. Ở bước quan sát và đếm số khuẩn lạc, những khuẩn lạc không điển
hình thì tạo vầng sáng bao quanh và tạo vùng đục bao quanh mỗi khuẩn
lạc
C. Ở bước quan sát và đếm số khuẩn lạc ,Khuẩn lạc S. aureus điển hình
có đường kính 1÷1,5mm, màu đen sáng, lồi. Mỗi khuẩn lạc có vầng
sáng rộng 1÷2mm bao quanh.
D. Ở bước quan sát và đếm số khuẩn lạc, những khuẩn lạc không điển
hình thì không tạo vầng sáng bao quanh và tạo vùng đục bao quanh mỗi
khuẩn lạc
11.Thử nghiệm khả năng của một số sinh vật
làm đông tụ huyết tương bởi hoạt động của
enzyme nào?
A. Urease
B. Coagulase
C. Trypsin
D. Arginase
 12. Mục đích của môi trường TSA là gì?
A. Dung dịch đẳng trương dùng để pha loãng
mẫu
B. Bảo quản vi sinh vật trong quá trình nuôi
cấy
C. Phục hồi vi sinh vật trong quá trình nuôi
cấy
D. Cả B và C
13. Mục đích của việc pha loãng mẫu
A. Xác định số khuẩn lạc có trong môi trường
để tính kết quả
B.Làm giảm mật độ vi sinh vật trong mẫu đến
ngưỡng có thể đếm dư
C.Làm tăng mật độ vi sinh vật trong mẫu
D.Để mẫu không bị hư hỏng
14.Phát biểu nào sao đây đúng?
A.S. aureus là cầu khuẩn gram dương, sinh bào tử,
không di động, có khả năng đông tụ huyết tương
B.S. aureus là cầu khuẩn gram âm , không sinh bào tử,
không di động, không có khả năng đông tụ huyết tương
C.S. aureus là cầu khuẩn gram âm , sinh bào tử, di
động, có khả năng đông tụ huyết tương
D.S. aureus là cầu khuẩn gram dương, không sinh bào
tử, không di động, có khả năng đông tụ huyết tương
15. Quá trình định lượng diễn ra theo bao
nhiêu bước ?
A. 6 bước
B. 7 bước
C. 4 bước
D. 5 bước
Câu 16. Dung dịch SPW được dùng để làm gì?
A.Dung dịch dùng để đồng nhất mẫu
B.Dung dịch dùng để pha loãng mẫu
C.Bảo quản và phục hồi vi sinh
D. Cả 3 ý trên đều đúng
Câu 17. Có mấy dạng môi trường chính?
A. 2
B. 3
C. 1
D. 4
18.Môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh
vật phải như thế nào?
A.Không cần phải vô trùng
B.Không cần phải vô trùng và không chứa các
chất độc hại đối với vi sinh vật
C.Hoàn toàn vô trùng và không chứa chất độc
hại đối với vi sinh vật
D.Cả 3 ý trên đều sai
19. Phương pháp định lượng S. aureus áp
dụng theo tiêu chuẩn nào?
A TCVN 4830-1:2005
B TCVN 8430-1:2005
C TCVN 3480-1:2005
D TCVN 4803-1:2005
20.Mục đích của HCl và NaOH 10% là gì?
A. Phục hồi
B. Khẳng định S.aureus
C. Chỉnh pH môi trường
D. Pha loãng mẫu
21. Phản ứng được coi là dương tính khi thể
tích đông tụ chiếm:
A. 5/4
B. 2/4
C. 3/4
D. 1/3
22. Trong quy trình định lượng Staphylococus
aureus ủ các đĩa trong điều kiện:
A. Kỵ khí ở 37°C
B. Hiếu khí ở 30°C
C. Hiếu khí ở 37°C
D. Kỵ khí ở 30°C
Câu 23. Chọn đáp án đúng về S. aureus?
A.Là cầu khuẩn gram âm, thường đứng thành
chùm,di động
B.Là cầu khuẩn gram dương, thường đứng thành
chùm, di động
C.Là cầu khuẩn gram dương, thường đứng thành
chùm, không di động
D.Là cầu khuẩn gram âm, thường đứng thành
chùm và không di động
24. Các chủng sinh độc tố ruột của S. aureus
tạo ra bao nhiêu loại độc tố khác nhau?
A. 5
B. 6
C. 7
D. 8
25.Phương pháp định lượng S. aureus thích
hợp để phân tích mẫu dự kiến chứa trên:
A. 100 tế bào S. aureus trên 1gam
B. 50 tế bào S. aureus trên 1gam
C. 70 tế bào S. aureus trên 1gam
D. 150 tế bào S. aureus trên 1gam
26. Nhận định nào sau đây đúng?
A. S. aureus không có khả năng lên men và sinh
sucrose, mannitol và sắc tố vàng
B. S. aureus sinh độc tố đường ruột enterotoxin
C. S. aureus phát triển tốt trong môi trường có
nồng độ thấp
D. S. aureus lên men và phân giải đường tạo mùi
vị khó chịu cho sản phẩm
27. Hội chứng sốc nhiễm khuẩn liên quan tới
Staphylococcus. Chọn câu sai:
A. Sốt cao
B. Tiêu chảy
C. Đau cơ
D. Tăng huyết áp
28. Ngộ độc thức ăn do độc tố ruột
Staphylococcus. Chọn câu sai:
A. Thời gian ủ bệnh ngắn
B. Tiêu chảy dữ dội
C. Hồi phục nhanh
D. Sốt cao
29. Thực phẩm có nguy cơ cao ngộ độc thực
phẩm do S. aureus
A. thịt và sản phẩm thịt, gia cầm
B. Trứng và sản phẩm từ trứng
C. Sữa và sản phẩm sữa
D. Cả 3 câu trên
30. Độc tố nào giúp S.aureus gây chết và hoại
tử da
A. Độc tố sinh mủ
B. Độc tố gây sốc
C. Độc tố gây bong da
D. Alphatoxin