BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG

Đề tài:Phân tích tổng số vi sinh

vật hiếu khí bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc
GVHD: Đinh Thị Hải
Thuận

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 1

 Thành viên nhóm 5
Tên Mã số sinh viên
Giang Nhật Anh 2005217858
Nguyễn Quốc Bảo 2005217873
Nguyễn Chí Cường 2005220449
Chu Xuân Quý 2005218030

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 2

 Nội dung trình bày
01. Tổng quan về phương pháp

02. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

03. Quy trình phân tích

04. Tính Kết Quả

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 3

 01.
TỔNG QUAN
VỀ PHƯƠNG
PHÁP
04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 4
 1.1 Cơ sở lý thuyết
-Dựa vào sự tăng trưởng của vi sinh vật hiếu khí
thành khuẩn lạc trong điều kiện oxi phân tử

-Biểu thị mức độ vệ sinh của mẫu thực phẩm

-Đơn vị hình thành khuẩn lạc: CFU/g hoặc CFU/ml

(Colony forms unit)

-Được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 5

 1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc
-Dùng để xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu
-Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch phát triển hình thành các khuẩn lạc
từ một hoặc một số vi khuẩn ban đầu
-Khuẩn lạc này có thể được thấy và đếm bằng mắt thường hoặc
kính hiển vi
Hạn chế: -Các đơn vị hình thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, một
chuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào
-Không tính được tế bào chết, cần phải cân nhắc kỹ khi bạn cần
mật độ tế bào trong mẫu ban đầu

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 6

 1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương Phương
pháp đếm pháp đếm
thủ công tự động

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 7

 1.2.1 Phương pháp đếm thủ công
• Mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích được đếm một
lần.
• Để kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa petri lên một lưới
ô và đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô, đánh dấu khuẩn lạc đếm được ở
đằng sau của đĩa petri.
• Để chính xác, mỗi mẫu thử nghiệm cần nuôi cấy ít nhất 3 đĩa và lượng
khuẩn lạc thích hợp là 15 _ 300 khuẩn lạc.
• Các đĩa có quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không thích hợp và cần
pha loãng và cấy lại mẫu.

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 8

 1.2.2 Phương pháp đếm tự động
• Đếm khuẩn lạc thủ công mất rất nhiều thời gian và có thể mắc sai số.

• Để cải thiện, hiện nay các phòng lab đã trang bị thêm các thiết bị đếm khuẩn lạc tự
động.

• Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động là máy đếm sẽ chụp một ảnh của
đĩa, sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc có trên đĩa.

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 9

 02.
Môi trường, hóa
chất và dụng cụ,
04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 10
 2.1 Môi trường và hóa chất
Môi trường – Hoá chất Mục đích

Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu

Plate count Agar (PCA) Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

HCL 10%
Chỉnh pH
NAOH 10%

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 11

 2.1.1 Môi trường cấy.
-Môi trường PCA
Thành phần:
Khối lượng/ thể
Thành phần Vai trò
tích

Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát

Pepton từ casein 5,0 g
triển, sinh trưởng của VSV

Cao nấm men 2,5 g Cung cấp nguồn dinh dưỡng cho VSV
Glucoza, dạng khan
1,0 g
(C6H12O6)
Thạch 9 g đến 18 g Làm đông tụ môi trường
Nước 1 000 ml
TCVN
Dựa trên TCVN 4884 : 2015

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 12

 2.1.1 Môi trường cấy.
-Môi trường PCA
Các bước pha: Hòa tan peptone, glucoza,
cao nấm men vào nước

Thêm thạch, khuấy tan

thạch

Chỉnh pH sao cho sau khử

trùng ở mức 7.00.2

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 13

 2.1.2 Dung dịch pha loãng.
-Dung dịch nước muối SPW

-Thành phần

Peptone 1.0g
NaCl 8.5g
Nước 1000ml

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 14

2.2 Các thiết bị, dụng cụ.

Tủ ấm

Tủ sấy
Nồi hấp tiệt trùng

Máy đếm khuẩn lạc

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 15

2.2 Các thiết bị, dụng cụ.

Ống nghiệm và bình

Đĩa petri tam giác Micropipet

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 16

 03.
Quy trình phân
tích
04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 17
3.1 Sơ đồ qui trình phân tích
Mẫu

Đồng nhất

Pha loãng mẫu

Cấy mẫu

Ủ
(30C trong 726h)

Đếm khuẩn lạc

(15  n  300)

Tính kết quả

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 18
3.2 Các bước tiến hành phân tích
Bước 2: Pha loãng mẫu

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 19

3.2 Các bước tiến hành phân tích
Bước 3: Cấy, ủ mẫu
- Rót vào mỗi đĩa petri khoảng từ 12-15 ml môi trường PCA ở 44 0C
đến 470C.
- Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa petri
để cho hỗn hợp đông đặc.

- Sử dụng 1 đĩa petri đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml
dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri, thêm 12-15 ml môi trường
PCA và nuôi ủ cùng điều kiện

-Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 30 ± 10C trong 72 ± 3

giờ.
*Lưu ý: không xếp quá sáu đĩa và các đĩa cần được tách khỏi nhau,
cách xa thành, nóc tủ.

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 20

3.2 Các bước tiến hành phân tích
Bước 1: chuẩn bị mẫu

Cân 10g mẫu rắn hoặc 10ml mẫu lỏng

Cho vào túi dập vô trùng hoặc bình tam

giác vô trùng

Dập mẫu 1 phút (thu được huyền phù ban

đầu

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 21

 3.3 Thu nhận kết quả
Kết quả thu
nhận được

Lượng khuẩn
lạc

- Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 300 khuẩn lạc/đĩa để đếm
- Sử dụng máy đếm nếu cần thiết
- Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn ¼ đĩa
mọc dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc còn lại và tính số tương ứng cho cả
đĩa. Nếu quá ¼ đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa đó và không đếm.

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 22

 04.

Tính Kết Quả

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 23

 4.1 Công thức tính kết quả
Tính số lượng khuẩn lạc vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên
tiếp
(CFU/g hay CFU/ml)
Trong đó
• N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu.
• : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp và
trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc.
• V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit.
• Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất, thứ hai được giữ lại
• d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại.
04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 24
 4.1 Công thức tính kết quả
Trường hợp có hai dĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc
(CFU/g hay CFU/ml)
Trong đó
• N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu.
• : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đãi.
• V: Thể tích dịch cấy đĩa cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
• n: Số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2).
• d: Độ pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất
đã được cấy hoặc được giữ lại
• d=1 khi sản phẩm dạng lỏng
04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 25
4.2 Ví dụ phân tích định lượng vi sinh vật
hiếu khí
Cho mẫu nước mắm có kết quả phân tích TSVSVHK như sau :

Nồng độ pha
loãng
Đĩa 1 127 28
Đĩa 2 162 31

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 26

4.2 Ví dụ phân tích định lượng vi sinh vật
hiếu khí
Mật độ vi sinh vật hiếu khí của mẫu:

A = = 1.6×(CFU/ml)
Dựa vào Quyết Định số 46/2007/QĐ-BYT Phần 6: GIỚI HẠN VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM, MỤC 6.8

 Mẫu nước mắm không đạt chỉ tiêu TSVSVHK

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 27

4.2 Ví dụ phân tích định lượng vi sinh vật
hiếu khí
Cho mẫu nước mắm có kết quả phân tích TSVSVHK như sau :

Nồng độ pha
loãng
Đĩa 1 92 16
Đĩa 2 67 17

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 28

4.2 Ví dụ phân tích định lượng vi sinh vật
hiếu khí
Mật độ vi sinh vật hiếu khí của mẫu:

A = = 8.7×(CFU/ml)
Dựa vào Quyết Định số 46/2007/QĐ-BYT Phần 6: GIỚI HẠN VI SINH VẬT
TRONG THỰC PHẨM, MỤC 6.8

 Mẫu nước mắm đạt chỉ tiêu TSVSVHK

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 29

 Câu hỏi trắc nghiệm

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 30

Câu 1: Trường hợp nào sau đây sử dụng công thức
A. Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại nhiều hơn 15ml
B. Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa ít hơn 15ml
C. Có 2 đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc
D. Tổng số khuẩn lạc đếm được nhiều hơn 15

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 31

Câu 2. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ở nhiệt độ bao
nhiêu?
A. 38oC
B. 30oC
C. 22oC
D. 15oC

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 32

Câu 3: Nếu tổng số khuẩn lạc N tính được là
129870 CFU/g thì đâu là kết quả làm tròn đúng?
A. 1,2×106CFU/g

B. 1,2×105 CFU/g

C. 1,3×106 CFU/g

D. 1,3×105 CFU/g

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 33

Câu 4. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc ở thời gian bao lâu?
A. 30 giờ
B. 50 giờ
C. 70 giờ
D. 72 giờ

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 34

 Câu 5: Nếu khuẩn lạc mọc lan rộng nhiều hơn ¼ đĩa
thì chúng ta phải?
A. Loại bỏ đĩa đó và không đếm

B. Đếm các khuẩn lạc còn lại trong đĩa và tính số lượng
tương ứng trên cả đĩa

C. Đếm tất cả khuẩn lạc có trong đĩa và tính số tương

ứng trên cả đĩa

D. Tất cả đều sai

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 35

Câu 6. Tổng số vi sinh vật hiếu khí có thể gồm:

A. Vi sinh vật gây bệnh

B. Vi sinh vật không gây bệnh

C. Cả 2 đáp án trên đều đúng

D. Cả 2 đáp án trên đều sai

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 36

Câu 7. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc là phương pháp?

A. Định tính

B. Định lượng

C. Cả 2 đáp án trên đều đúng

D. Cả 2 đáp án trên đều sai

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 37

Câu 8. Ở bước chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu thì đâu là ý đúng
A. Cân 25g hoặc 25ml mẫu thử + 90ml dd SPW
B. Cân 10g hoặc 10 ml mẫu thử + 90ml dd SPW
C. Cân 10g hoặc 10 ml mẫu thử + 225ml dd SPW
D. Tất cả đều sai

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 38

Câu 29. Một số vi sinh vật thực hiện quá trình hô hấp hiếu khí ở điều
kiện?

A. Có oxi phân tử
B. Có oxi nguyên tử
C. Không có oxi nguyên tử

D. Có khí CO2

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 39

Câu 10. Cách xác định vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp nào trong
các phương pháp sau?

A. Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường acid

B. Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường bazo
C. Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng

D. Cả a và b đều đúng

04/23/2024 TP. Hồ Chí Minh 40

04/23/2024 41