BÁ O CÁ O THÍ NGHIỆ M VI SINH VẬ T

Giá o viên hướ ng dẫ n: Lã Thị Quỳnh Như, Phạ m Tuấ n Anh, Bù i Thị Kim Hoa

Họ và tên sinh viên: Đinh Thị Việt Chinh

MSSV: 20190312

Lớ p: Kĩ thuậ t sinh họ c 01 - K64

I. Tên bài thí nghiệm:BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP
GIEO CẤY VI SINH VẬT.

I.1. Mô i trườ ng dinh dưỡ ng:

I.1.1. Khái niệm:

- Môi trường dinh dưỡng là mộ t hỗ n hợ p thứ c ă n cầ n thiết cho sự phá t triển củ a vi sinh
vậ t.

- Mô i trườ ng dinh dưỡ ng cầ n có cá c nguyên tố tạ o chấ t số ng như cacbon, hydro, nito,

oxy,... và cá c nguyên tố đa lượng khá c như photpho, lưu huỳnh, kali, canxi, sắ t,..., mộ t và i
nguyên tố vi lượng như mangan, đồng, natri, clo, kẽm,...

Nguồn Cacbon Nguồn Nito Nguồn khoáng, vitamin

- Vô cơ: CO2 - Vô cơ: N2 (vi sinh vậ t cố - Chủ yếu ở dạ ng muố i

định đạ m), NH4+, NO3- ,..
- Hữ u cơ: Glucoza,...
- Hữ u cơ: cá c chấ t đạ m,
- Ngoà i ra, vi sinh vậ t tự
pepton, axitmin,...
dưỡ ng cò n hấ p thu rượ u,
axit hữ u cơ và cá c hợ p chấ t
khá c.

- Mô i trườ ng dinh dưỡ ng cầ n phả i đả m bả o tuyệt đố i vô trù ng để trá nh nhiễm tạ p trong

quá trình nuô i cấ y, phâ n lậ p. Và cầ n phả i câ n đố i về thà nh phầ n, độ ẩ m, độ pH, độ nhớ t,
á p suấ t thẩ m thấ u tố i ưu,...

I.1.2. Phân loại môi trường dinh dưỡng:

* Phân loại theo thành phần: gồ m 03 loạ i

- Mô i trườ ng tự nhiên (mô i trườ ng vi sinh vậ t tự nhiên) đượ c chế tạ o từ cá c sả n phẩ m

có nguồ n gố c độ ng, thự c vậ t như thịt, trứ ng, sữ a, nướ c chiết nấ m men, nướ c quả , mạ ch
nha,.… Thà nh phầ n hó a họ c củ a nhữ ng mô i trườ ng nà y phứ c tạ p và khô ng đượ c xá c
định cụ thể như: cao thịt bò , pepton, cao nấ m men (pepton là dịch thuỷ phâ n mộ t phầ n
củ a thịt bò , cazêin, bộ t đậ u tương… dù ng là m nguồ n cacbon, nă ng lượ ng và nitơ. Cao
thịt bò chứ a cá c axit amin, peptit, nuclêô tit, axit hữ u cơ, vitamin và mộ t số chấ t khoá ng.
Cao nấ m men là nguồ n phong phú cá c vitamin nhó m B cũ ng như nguồ n nitơ và cacbon).
Nó phụ thuộ c và o thà nh phầ n nguyên liệu và các điều kiện tiến hà nh chế tạ o mô i
trườ ng. Ngườ i ta sử dụ ng chú ng để nuô i cấy vi sinh vậ t, tích lũ y sinh khố i, giữ cá c giố ng
thuầ n sạ ch, các mụ c đích dự đoá n, chú ng khô ng lợ i cho việc nghiên cứ u sinh lý hoặ c cá c
quá trình trao đổ i chấ t.

- Mô i trườ ng tổ ng hợ p (mô i trườ ng vi sinh vậ t tổ ng hợ p)đượ c chế tạ o từ cá c hợ p chấ t

hó a họ c hữ u cơ và vô cơ vớ i nồ ng độ định trướ c mộ t cá ch chính xá c. Tù y theo bộ cá c
cấ u tử , mô i trườ ng tổ ng hợ p có thể phứ c tạ p (mô i trườ ng nuô i cấy vi khuẩ n lactic) hay
tương đố i đơn giả n (mô i trườ ng cho cá c vi khuẩ n tự dưỡ ng). Ngườ i ta dù ng chủ ng để
nghiên cứ u sự trao đổ i chấ t, quy luậ t phá t triển hay sinh tổ ng hợ p mộ t chấ t nà o đó (VD:
axit amin). Trong thự c hà nh thườ ng sử dụ ng mô i trườ ng tổ ng hợ p Sapek để nuô i cấy
nấ m mố c. Nhiều vi khuẩ n hoá dưỡ ng dị dưỡ ng có thể sinh trưở ng trong mô i trườ ng
chứ a glucose là nguồ n cacbon và muố i amô n là nguồ n nitơ.

- Mô i trườ ng bá n tổ ng hợ p (mô i trườ ng vi sinh vậ t bá n tổ ng hợ p) là mô i trườ ng chung

giữ a hai loạ i trên, trong đó có mộ t số chấ t tự nhiên khô ng xá c định đượ c thà nh phầ n và
số lượ ng như pepton, cao thịt, cao nấ m men và cá c chấ t hoá họ c đã biết thà nh phầ n và
số lượ ng…

* Phân loại theo mục đích sử dụng: gồ m 03 loạ i

- Mô i trườ ng phổ dụ ng (mô i trườ ng cơ sở hay mô i trườ ng chuẩ n): là mô i trườ ng thích
hợ p nuô i cấy nhiều loạ i vi sinh vậ t như mô i trườ ng thịt pepton, mô i trườ ng nướ c mạ ch
nha.

- Mô i trườ ng riêng biệt hay mô i trườ ng chọ n lọ c: đả m bả o sự phá t triển ưu thế củ a mộ t

loà i hay mộ t nhó m vi sinh vậ t nà o đó , ít thuậ n lợ i hoặ c hoà n toà n bấ t lợ i đố i vớ i sự phá t
triển củ a cá c vi sinh vậ t khá c. Cá c mô i trườ ng chọ n lọ c chủ yếu đượ c dù ng để phâ n lậ p
vi sinh vậ t từ cá c mô i trườ ng sinh số ng tự nhiên củ a chú ng hoặ c đượ c dù ng để nuô i cấ y
tích lũ y. VD: mô i trườ ng tinh bộ t –ammoniac dù ng để nuô i cấy xạ khuẩ n.

- Mô i trườ ng chuẩ n đoá n phâ n biệt (mô i trườ ng chỉ thị): cho phép phâ n biệt khá nhanh
chó ng mộ t loà i vi sinh vậ t nà y vớ i loà i khá c và xá c định nhữ ng giố ng thuầ n khiết trên cơ
sở nghiên cứ u nhữ ng tính chấ t sinh hó a củ a chú ng. Các mô i trườ ng chỉ thị đượ c ứ ng
dụ ng trong vi khuẩ n họ c lâ m sà ng, trong nghiên cứ u di truyền họ c và trong việc định
tên vi sinh vậ t. Thô ng thườ ng trong cá c mô i trườ ng nà y ngườ i ta cho và o mộ t số thà nh
phầ n chỉ thị mà u và nhờ sự thay đổ i củ a chấ t đó mà ngườ i ta có thể xác định đượ c từ ng
loà i vi sinh vậ t.

VD: Trong quá trình số ng, vi sinh vậ t thườ ng tiết ra mộ t loạ i enzyme nhấ t định. Dướ i tá c
dụ ng củ a cá c enzyme nà y các hợ p chấ t hữ u cơ phứ c tạ p có trong mô i trườ ng bị phâ n
hủ y thà nh cá c dạ ng đơn giả n hơn như axit và muố i củ a chú ng. Cá c chấ t nà y là m thay đổ i
độ pH củ a mô i trườ ng, do đó dẫ n đến sự thay đổ i mà u củ a chấ t chỉ thị mà u.

* Phân loại theo tính chất lý học: gồ m 02 loạ i

Tù y theo độ chắ c cứ ng củ a mô i trườ ng ngườ i ta phâ n biệt mô i trườ ng lỏ ng, đặ c, xố p.

- Mô i trườ ng lỏ ng là mô i trườ ng thứ c ă n dướ i dạ ng dung dịch dù ng để phá t hiện cá c đặ c

điểm sinh lý - sinh hó a củ a vi sinh vậ t, tích lũ y sinh khố i hoặ c sả n phẩ m trao đổ i chấ t, để
giữ và bả o quả n các loạ i vi sinh khô ng phá t triển trên mô i trườ ng đặ c.

- Mô i trườ ng đặ c là mô i trườ ng lỏ ng có thêm cá c chấ t đô ng dính, đượ c ứ ng dụ ng để tá ch

cá c giố ng thuầ n khiết (nhậ n từ ng khuẩ n lạ c riêng biệt, nghiên cứ u định tên, xá c định
hình thá i khuẩ n lạ c, đặ c điểm sinh trưở ng), để giữ giố ng. Để là m đô ng mô i trườ ng ngườ i
ta dụ ng thạ ch, gelatine và silica-gel.

Cá c chấ t nà y khô ng là m thay đổ i thà nh phầ n mô i trườ ng, đồ ng thờ i đả m bả o độ trong

suet củ a mô i trườ ng.

Thạ ch là mộ t loạ i polysaccarit phứ c tạ p có độ bền vữ ng cao, nhậ n từ mộ t số loạ i tả o

biển họ Floridae. Hầ u hết vi sinh vậ t khô ng sử dụ ng nó là m cơ chấ t dinh dưỡ ng. Trong
nướ c, thạ ch tạ o thà nh dạ ng gel, chả y ở 100oC và đô ng ở gầ n 40oC. Thạ ch có tính trung
tính, khô ng là m thay đổ i pH củ a mô i trườ ng song nó bị ả nh hưở ng pH mô i trườ ng. Ở
nhữ ng mô i trườ ng có độ axit pH thấ p thạ ch khó đô ng đặ c hơn hơn bở i nó bị thủ y phâ n
từ ng phầ n. Thạ ch thườ ng đượ c bổ sung và o mô i trườ ng vớ i số lượ ng 1,5 –2%. Trong
trườ ng hợ p cầ n thiết có thể nâ ng nồ ng độ thạ ch lên 3%.

Gelatin là loạ i protein nhậ n đượ c khi ninh xương và sụ n củ a độ ng vậ t dễ bị vi sinh vậ t

sử dụ ng nên dễ vữ a hơn so vớ i thạ ch. Mặ t khá c gelatine dễ là m ả nh hưở ng tớ i pH mô i
trườ ng nên ít đượ c sử dụ ng hơn thạ ch. Nhiệt độ nó ng chả y củ a gelatine 25-27oC và
đô ng đặ c ở 18-20oC. Thườ ng để thu nhậ n nhữ ng khuẩ n lạ c lớ n trong phâ n loạ i nấ m
men.

Bả n silica-gel đượ c dù ng là m chấ t nền đặ c cho cá c mô i trườ ng tổ ng hợ p có thà nh phầ n

xá c định chặ t chẽ bở i vì nó có bả n chấ t vô cơ.

Mô i trườ ng xố p đượ c ứ ng dụ ng trong vi sinh vậ t họ c cô ng nghiệp. Thuộ c loạ i nà y có kê

nấ u nhừ , cá m, cá t thạ ch anh thấ m dung dịch dinh dưỡ ng.

I.2. Các phương phá p gieo cấ y vi sinh vậ t

I.2.1. Định nghĩa gieo cấ y vi sinh vậ t:

- Gieo cấ y vi sinh vậ t là quá trình đưa vậ t liệu nghiên cứ u và o mô i trườ ng thứ c ă n vớ i

mụ c đích phá t hiện cá c loạ i vi sinh vậ t có mặ t trong đó và thu nhậ n cá c canh trườ ng cầ n
thiết cho nghiên cứ u.

- Cấ y chuyền là quá trình chuyển cá c canh trườ ng VSV từ mô i trườ ng nà y sang mô i

trườ ng khá c để nhậ n giố ng và giữ giố ng.

- Khi gieo cấy cầ n đả m bả o vô trù ng tuyệt đố i bằ ng cá ch thao tá c xung quanh ngọ n lử a

đèn cồ n hoặ c trong các tủ cấy vô trù ng.

I.2.2. Một số phương pháp gieo cấy

* Một số cách gieo cấy được thực hiện trong bài thí nghiệm:

- Cấ y chuyền từ ố ng nghiệm nà y sang ố ng nghiệm khá c, hoặ c từ hộ p peptri sang ố ng

nghiệm, từ mô i trườ ng rắ n sang mô i trườ ng lỏ ng/rắ n.

- Gieo cấ y trên thạ ch nghiêng theo cá ch cấ y cạ n dầ n.

- Dù ng que cấy đâ m sâ u trên thạ ch đứ ng.

- Cấy trên thạ ch hộ p.

II. Mục đích thí nghiệm:

- Hiểu đượ c thế nà o là mô i trườ ng dinh dưỡ ng, cá c loạ i mô i trườ ng dinh dưỡ ng.

- Biết cách chuẩ n bị dụ ng cụ cho quá trình nuô i cấ y.

- Cá ch pha chế mộ t loạ i mô i trườ ng dinh dưỡ ng - bà i thí nghiệm yêu cầ u pha chế mô i
trườ ng Crapeck.

- Biết cách gieo cấ y vi sinh vậ t

- Biết cách bao gó i đĩa petri, ố ng nghiệm và vô khuẩ n chú ng trướ c khi gieo cấ y.

III. Phương pháp thí nghiệm:

III.1. Cá ch là m mô i trườ ng Crapeck

* Pha chế môi trường dinh dưỡng:

- Nồng độ của môi trường Crapeck như sau:

Hóa chất Nồng độ - g/l Dụng cụ

Saccharose 30 Câ n
 KH2PO4 1 Câ n

NaNO3 2 Câ n

MgSO4.7H2O8,9 0.5 Câ n

KCl 0.5 Câ n

FeSO4.7H2O 0.01 Câ n

H2O 1l Cố c đong
- Yêu cầu PTN đưa ra chỉ pha 300ml dung dịch môi trường dinh dưỡng nên lượng hóa chất sẽ được lấy như
sau - cân hóa chất trên cân điện tử:

Hóa chất Lượng lấy

Saccharose 9g

NaNO3 0.6 g

KH2PO4 0.3 g

MgSO4.7H2O 0.15 g

KCl 0.15 g

FeSO4 1% 0.3ml dung dịch FeSO4

H2O 1l

- Do câ n khô ng câ n đượ c 0.000 nên ta thay FeSO4.7H2O bằ ng FeSO4 1% (1g/100ml)

-> 0.003g FeSO4.7H2O tương đương vớ i 0.3ml FeSO4 1%

( Do lượ ng FeSO4 nồ ng độ quá ít nên có thể pha dung dịch rồ i dù ng pipet thủ y tinh hú t
0.3ml dung dịch FeSO4 1% để cho và o mô i trườ ng dinh dưỡ ng ).

* Phân phối môi trường:

- Câ n và lấ y đủ lượ ng hó a chấ t cho và o cố c thủ y tinh. Sau đó cho mộ t lượ ng nướ c cấ t

nhỏ hơn 300ml để hò a tan hoà n toà n cá c hó a chấ t trên. Rồ i cho thêm nướ c cấ t để định
mứ c lên 300ml dung dịch mô i trườ ng dinh dưỡ ng.

- Sau đó , chia dung dịch ra thà nh 2 phầ n: Ró t 50ml dung dịch trên ra mộ t cố c thủ y tinh
khá c. Lượ ng cò n lạ i 250ml cho thêm 2% agar - 5g, khuấ y đều và đun trên bếp đến khi
hỗ n hợ p sô i. Chú ý trá nh để trà n dung dịch sẽ là m thay đổ i nồ ng độ và mấ t mô i trườ ng
dinh dưỡ ng.
- Trong khi đợ i hỗ n hợ p sô i. Lấ y cố c thủ y tinh đự ng 50ml dung dịch mô i trườ ng dinh
dưỡ ng vừ a chia, tiếp tụ c chia đều và o 6 ố ng nghiệm, mỗ i ố ng khoả ng 3-5ml mô i trườ ng
để là m mô i trườ ng lỏ ng.

- Sau khi hỗ n hợ p chứ agar sô i, để nguộ i bớ t, trá nh để nguộ i quá sẽ là m đô ng cứ ng mô i

trườ ng. Tiếp tụ c ró t mô i trườ ng chứ a agar và o 12 ố ng nghiệm sao cho:

+ Thạ ch nghiêng: 6 ố ng nghiệm, mỗ i ố ng chứ a khoả ng 6ml mô i trườ ng, có chiều cao mô i
trườ ng cao bằ ng 1/4 chiều cao ố ng nghiệm.

+ Thạ ch đứ ng: 6 ố ng nghiệm, mỗ i ố ng chứ a khoả ng 10ml mô i trườ ng, có chiều cao mô i
trườ ng cao bằ ng 1/3 chiều cao ố ng nghiệm.

-Lượ ng cò n lạ i chú ng ta đổ hết và o bình tam giá c.

* Khử trùng môi trường:

- Sau khi chuẩn bị xong 18 ống nghiệm, đem khử trùng bằng hơi nước bão hòa dưới áp suất
cao trong nồi hấp thanh trùng (nồi hấp áp lực).

* Bảo quản và kiểm tra môi trường:

- Sau khi khử khuẩn môi trường, chúng ta tiến hành rót môi trường từ bình tam giác ra các
hộp peptri. Khi rót thực hiện xung quanh đèn cồn bán kính 20cm và mở 1/3 nắp hộp peptri.
Sau khi rót xong không đóng nắp hộp lại ngay tránh hơi nước tụ lại trên nắp hộp làm mờ nắp
hộp.

- Lấy các ống nghiệm thuộc thạch nghiêng đem nằm nghiêng sao cho môi trường cách mép
ống nghiệm khoảng 1.5-2cm và giữ ống nghiệm không dịch chuyển chờ môi trường đông lại.

III.2. Gieo cấy vi sinh vật

* Các bước cần thiết cho gieo cấy vi sinh vật như sau:

- Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng cho phép vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt nhất

- Khử trùng môi trường để loại bỏ tất cả các thể sống trong môi trường

- Cấy vi sinh vật vào môi trường

* Các loại bình nuôi được sử dụng trong bài thí nghiệm: đĩa peptri, ống nghiệm

* Môi trường nuôi cấy theo thành phần: Môi trường tổng hợp

* Môi trường nuôi cấy theo tính chất lý học: Lỏng và rắn

* Lưu ý khi cấy truyền vi sinh vật: Phải khử khuẩn môi trường xung quanh khu vực cấy
20cm hoặc cấy trong tủ cấy. Khử khuẩn tay và dụng cụ cấy trước khi lấy vi sinh vật. Khi
thực hiện các nút bông không chạm nhau, khi mở nút bông cần hơ nóng miệng
ống nghiệm trước, khi thực hiện xong cũng cần hơ nóng miệng ống nghiệm 1 lần
nữatrước khi nút nút bông.
IV. Kết quả:

* Hình ảnh nuôi cấy:

- Vi sinh đã đượ c cấ y truyền.

- Tuy nhiên trong hộ p petri chưa quan sá t thấ y hiện tượ ng nhiễm tạ p và phá t triển củ a
vi sinh vậ t.

* Một số chú ý trong khi làm thí nghiệm:

- Dụ ng cụ bao gó i phả i đả m bả o sạ ch và khô .

- Bao gó i phả i thậ t kín và cẩ n thậ n để đả m bả o khi khử trù ng vẫ n đả m bả o sự vô trù ng

trong lớ p giấ y gó i và thá o giấ y gó i dễ dà ng.

- Đầ u nú t bô ng khô ng thấ m nướ c trò n và độ chặ t vừ a phả i.

- Trướ c và sau khi sử dụ ng que cấy đều phả i khử trù ng trong ngọ n lử a đèn cồ n. Để que
cấ y nguộ i mớ i tiến hà nh lấ y VSV để trá nh là m chết VSV.

- Khi mở hộ p petri để cấ y truyền chỉ mở 1/3 hộ p, khô ng đượ c mở hết nắ p hộ p trá nh

nhiễm tạ p.
V. Thảo luận:

V.1. Vì sao sử dụ ng agar mà khô ng dù ng gelatine:

- Gelatine tan chả y ở nhiệt độ 37 độ C, ngoà i ra nhiều VSV có thể phâ n hủ y gelatine để
là m lỏ ng mô i trườ ng.

- Agar đô ng đặ c tố t ở nhiệt độ dướ i 40 độ C, và khô ng bị VSV phâ n giả i là m biến tính.

V.2. Vì sao trên hộ p petri có thể xả y ra hiện tượ ng nhiễm tạ p:

- Trên hộ p peptri có hiện tượ ng nhiễm nấ m mố c, mụ c đích cấy chuyền ban đầ u chỉ cấ y
vi khuẩ n mang beta-glucan.

- Hiện vẫ n chưa giả i thích đượ c lí do!