CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả năng hòa tan K được phân lập từ đất
vùng rễ cây Bưởi được lấy từ tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
3.2. Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện: Từ 06/2022 đến 11/2022.
Địa điểm: Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương - KCN Sóng
Thần 1, Dĩ An, Bình Dương.
3.3. Vật liệu
Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, becher, erlen, giá ống nghiệm, đèn cồn…
Thiết bị: Microwave, cân điện tử, máy lắc, tủ sấy…
Hóa chất: Mica, Ca3(PO4)2, agar, cao nấm men và các hóa chất thông thường của
phòng thí nghiệm vi sinh.
3.4. Môi trường nghiên cứu
Môi trường thạch Aleksandrov [TK]
Glucose 5g
MgSO4.7H2O 0,5 g
CaCO3 0,1 g
FeCl3 0,006 g
Ca3(PO4)2 2g
Bột mica 3g
Agar 20 g
Nước đủ 1 lít
Công dụng: Môi trường được sử dụng để xác định khả năng hòa tan K của
Potassium Solubilizing Bacteria (KSB).
Cách chuẩn bị môi trường: Đầu tiên cân đúng khối lượng các hóa chất MgSO4,
CaCO3, FeCl3, Ca3(PO4)3 vào 500 ml nước rồi khuấy cho tan hoàn toàn. Tiếp theo, cân
các chất glucose và bột mica, định mức cho đủ 1 lít nước. Cuối cùng, thêm agar và khuấy
kỹ đều. Đun và khuấy đều liên tục trên bếp cho đến khi agar tan hoàn toàn. Sau đó, phân
đều vào các erlen 500 ml, mỗi chai erlen chứa khoảng 250 ml môi trường và hấp khử
trùng ở 121oC trong 15 phút.
Môi trường thạch Luria Bertani (LB) [TK]
Peptone 10 g
Cao nấm men 5g
NaCl 10 g
Agar 25 g
Nước đủ 1 lít

Công dụng: Dùng để nuôi cấy tăng sinh trên thạch nghiêng và bảo quản các giống

vi khuẩn.

Cách chuẩn bị: Chuẩn bị 900 ml nước, sau đó cân chính xác khối lượng các hóa
chất cho vào và khuấy đều đến khi tan hoàn toàn. Bổ sung nước cho đủ 1 lít, sau đó thêm
agar. Đun và khuấy kỹ đều liên tục trên bếp cho agar tan hoàn toàn. Chia đều vào các ống
nghiệm hoặc các erlen 500ml, mỗi chai erlen chứa khoảng 250 ml môi trường và hấp khử
trùng ở 121oC trong 15 phút.
Môi trường dịch chiết từ thực vật [lí do chọn] [TK]
Dịch chiết thực vật 100 g
Nước 1000 ml
pH 7,0
Các loại thực vật được sử dụng gồm:
Bắp Cải Xanh (Brassica oleracea L.)
Dưa Leo (Cucumis sativus)
Súp Lơ (Brassica oleracea)
Cải Xanh (Brassica juncea)
Xà Lách Bẹ (Lactuca sativa)
Công dụng: Là môi trường tự nhiên để nuôi cấy vi khuẩn.
Cách chuẩn bị môi trường dịch chiết: Các loại nguyên liệu được mang đi rửa sạch
và cắt nhỏ. Sau đó, cân 100 g nguyên liệu, thêm 1000 ml nước, đun sôi 30 phút. Sau đó,
lọc lấy dịch trong và định mức đủ 1000 ml. Điều chỉnh các môi trường dịch chiết từ thực
vật về pH 7,0 bằng H2SO4 0,1 N và NaOH 0,1 N. Hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
3.5. Phương pháp
3.5.1. Phương pháp lấy và bảo quản mẫu đất (TCVN 7538-2:2005) [TK]
Để lấy mẫu đất, dùng các dụng cụ sạch đã được vệ sinh qua cồn như xẻng và dao.
Các dụng cụ lấy mẫu không được làm bằng kim loại mạ kẽm, đồng thau hoặc đồng.
Các bước lấy mẫu đất: Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 5 – 10 cm trên cùng vì lớp này
có thể bị xâm nhiễm bởi vi sinh vật bên trong. Sau đó, lấy những tảng nguyên vẹn theo
độ sâu của lớp đất bao quanh rễ khoảng 0,8 – 10 mm. Lấy 3 điểm như vậy và trộn lại với
nhau.
Đất được cho vào một túi nylon vô trùng có đánh dấu các ký hiệu ở mỗi túi. Với
mỗi mẫu đất được dán nhãn ghi rõ ngày tháng lấy mẫu, họ và tên người lấy và đặc điểm
chỗ lấy mẫu (tọa độ, thời gian, địa điểm…). Giữ các mẫu ở điều kiện lạnh cho đến khi
phân lập.
3.5.2. Phương pháp phân lập KSB [TK]
Phân lập vi khuẩn hòa tan K trong đất bằng phương pháp pha loãng tới hạn và trải
mẫu trên môi trường thạch Aleksandrov. Cân 10 g đất và pha loãng với 90 ml nước muối
sinh lý vô trùng rồi lắc khoảng 20 – 30 phút, tốc độ 200 vòng/phút với nhiệt độ khoảng
30oC đến 32oC. Sau đó tiến hành pha loãng 10-2, 10-3, 10-4… Hút 0,1 ml dịch pha loãng
cho vào đĩa môi trường rồi trải đều. Mỗi nồng độ được trải trên 3 đĩa, các đĩa ủ ở nhiệt độ
khoảng 30oC đến 32oC trong 5 ngày. Sau đó, lấy ra quan sát các đặc điểm khuẩn lạc.
Chọn những khuẩn lạc có tạo vòng hòa tan K.
Để tạo được dòng thuần, thực hiện các thao tác cấy ria cho đến khi tất cả khuẩn lạc
trên môi trường là đồng nhất. Đồng nhất là khi khuẩn lạc đơn của dòng thuần chỉ tạo ra
một loại khuẩn lạc duy nhất trên bề mặt môi trường. Môi trường thạch LB được sử dụng
để làm thuần vi khuẩn. Từ nhóm thuần, những dòng khuẩn lạc có hình thái khác nhau từ
cùng một mẫu đất sẽ được cấy chuyền sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng LB để
giữ giống và bảo quản ở điều kiện lạnh.
3.5.3. Phương pháp bảo quản giống trên thạch nghiêng [TK]
 Việc lưu trữ giống để phục vụ cho công việc nghiên cứu và làm thí nghiệm sau này
rất quan trọng. Có nhiều cách giữ giống vi sinh vật như phương pháp giữ giống truyền
thống bằng cách cấy chuyền vi khuẩn trên các ống nghiệm chứa môi trường thạch
nghiêng được áp dụng phổ biến và đơn giản.
Đầu tiên dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối khuẩn lạc thuần cấy ria trên mặt
thạch nghiêng theo kiểu zigzag, ủ nhiệt độ từ 30oC đến 32oC trong 2 ngày.
Bảo quản vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ từ 4℃ đến 8℃. Tiến
hành cấy chuyền sang ống nghiệm mới sau 2 tháng bảo quản.
3.5.4. Phương pháp xác định khả năng hòa tan K trên môi trường thạch [TK]
Sử dụng que cấy móc để lấy ít sinh khối từ ống nghiệm giống thạch nghiêng 2 ngày
tuổi để cấy chấm điểm trên đĩa có môi trường thạch Aleksandrov. Mỗi đĩa lấy 3 điểm. Ủ
đĩa ở từ 30oC đến 32oC khoảng 3 – 4 ngày. Môi trường này có chứa mica, với thành phần
chủ yếu là Potassium, Aluminum, Silica (có màu trắng) và không tan làm môi trường có
màu trắng sữa và đục.
Sau khi ủ, làm ngập đĩa với thuốc thử Congo red và để yên trong 2 phút để làm hiện
vùng hòa tan được hình thành xung quanh các khuẩn lạc. Chủng vi khuẩn có SI
(Solubility Index) cao sẽ có mối tương quan với khả năng hòa tan K cao. Khả năng hòa
tan K sẽ được xác định theo công thức 3.1. Chủng vi sinh nào có SI cao sẽ tương ứng với
khả năng hòa tan K cao.
Đường kính vùng hòa tan ( cm ) −Đường kính vùng tăng trưởng(cm)
SI = (3.1)
Đường kính vùng tăng trưởng( cm)

Trong đó:
SI: Chỉ số hòa tan.
 Hình 3.1. Cách đo đường kính vùng phân giải và đường kính vùng tăng trưởng của vi
khuẩn hòa tan K.
Chú thích:
Đường kính vùng tăng trưởng của vi khuẩn,
Đường kính vùng phân giải.
3.5.5. Phương pháp định danh sinh học phân tử theo phương pháp MALDI–TOF
[TK]
Maldi Biotyper sử dụng công nghệ khối phổ protein-MALDI-TOF (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization-Time of Flight) định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử.
Mục tiêu là so sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật chưa biết với cơ sở
dữ liệu có sẵn trước đó. Các bước để thực hiện phương pháp MALDI–TOF:
Đầu tiên, lấy ít khuẩn lạc đã được làm thuần lên đĩa MBR và bổ sung matrix, đưa
đĩa MBR có matrix vào máy và khai báo thông tin. Thu phổ MALDI–TOF MS, so sánh
phổ thu được với dữ liệu thư viện và cho được kết quả định danh. Lưu trữ và xuất kết
quả.
3.5.6. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng [TK]
Cấy chuyền giống vào môi trường thạch nghiêng LB ủ khoảng nhiệt độ từ 30oC đến
32oC trong hai ngày. Sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối từ ống nghiệm thạch
nghiêng LB cho vào erlen 50 ml có chứa 20 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc với tốc
độ 200 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ từ 30oC đến 32oC để thu canh trường tăng sinh
cấp 1. Sau đó, hút 1 ml canh trường ở erlen mới thu được sang erlen chứa môi trường
khảo sát và nuôi cấy ở điều kiện tương tự. Canh trường cấp 2 thu được được xác định mật
độ tế bào bằng kỹ thuật trải đĩa.
3.5.7. Phương pháp đếm mật độ tế bào bằng kỹ thuật trải đĩa [TK]
Tiến hành hút một thể tích xác định mẫu vi sinh vật lên môi trường thạch trong đĩa
petri. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện khuẩn lạc và có
thể quan sát được bằng mắt thường. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được trên đĩa, thể tích
mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, từ đó có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo
sát ban đầu.
Cách thực hiện mẫu canh trường được pha loãng bằng nước muối sinh lý vô trùng
để thành dãy các nồng độ thập phân (1/10, 1/100, 1/1000...). Sau đó cấy 0,1 ml mẫu đã
pha loãng vào môi trường thạch LB, dùng que trang trải đều mẫu lên bề mặt môi trường
thạch LB cho đến khi khô, lật ngược đĩa petri và mang đi ủ ở nhiệt độ từ 30 oC đến 32oC
sau khoảng 24 – 72 giờ, quan sát và đếm khuẩn lạc. Mỗi nồng độ pha loãng được trải trên
3 đĩa. Mật độ tế bào sẽ giảm dần theo độ pha loãng. Số lượng khuẩn lạc thích hợp trong
khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Kết quả được xác định theo công thức 3.2.

(3.2)

Trong đó:
CFU (Colony forming unit): Đơn vị hình thành khuẩn lạc,
N: Số CFU tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu canh trường,
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri đã chọn (các đĩa có số khuẩn lạc
nằm trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa),
ni: Số đĩa petri đã chọn tại độ pha loãng thứ i,
di: Hệ số pha loãng thứ i,
v: Thể tích mẫu (ml) ở độ pha loãng thứ i cấy vào mỗi đĩa,
 Kết quả được trình bày dưới dạng x,y.10z CFU/ml hoặc CFU/g mẫu.
3.5.8. Phương pháp xác định hiệu quả hòa tan K trên đĩa thạch bằng cách cấy điểm
từ huyền phù vi khuẩn [TK]
Phương pháp này xác định hiệu quả hòa tan K của vi khuẩn có trong mẫu lỏng hoặc
rắn. Pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý. Dùng micropipet hút 10 µl mẫu đã được pha
loãng cấy tại một điểm trên đĩa petri chứa môi trường Aleksandrov, mỗi đĩa cấy 3 điểm.
Thao tác cấy phải nhẹ nhàng, tránh để dịch huyền phù loang rộng. Ủ ở nhiệt độ từ 30oC
đến 32oC từ 3 - 4 ngày. Sau khi ủ, thêm thuốc thử Congo red 2%, để yên trong 2 phút,
tiến hành quan sát vùng phân giải được tạo thành và đo đường kính vùng phân giải bằng
đơn vị cm. Đối chứng là dịch lọc mẫu huyền phù đã pha loãng không chứa tế bào vi
khuẩn. Hiệu quả hòa tan kí hiệu SE (Solubility Effective) được tính theo công thức 3.3.

(3.3)

Trong đó:

SE: Hiệu quả hòa tan,

Dthử thật: Đường kính của vùng phân giải K của mẫu thử (cm),

Dđối chứng: Đường kính của vùng phân giải K của mẫu đối chứng (cm),

dthử thật: Đường kính vùng tăng trưởng vi khuẩn của mẫu thử (cm).

3.5.9. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và SPSS 20.0
bằng phép thử Duncan với mức ý nghĩa p < 0,05. Kết quả được biểu diễn ở dạng trung
bình của các lần lặp lại.
3.6. Bố trí thí nghiệm
3.6.1. Phân lập và đánh giá sự đa dạng của KSB trong đất vùng rễ cây Bưởi
Từ các mẫu đất đã thu được, tiến hành phân lập theo Mục 3.5.2. Sau khi ủ, quan sát
và lựa chọn các khuẩn lạc tạo được vòng hòa tan. Tiến hành chọn các khuẩn lạc có vòng
hòa tan để ria trên môi trường thạch LB để làm thuần. Sau đó, tiến hành bảo quản giống
trên thạch nghiêng được trình bày ở Mục 3.5.3. Các dòng khuẩn lạc thuần sẽ được ghi
nhận các đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch LB.
Từ những dòng khuẩn lạc đã được làm thuần, kiểm tra khả năng hòa tan K trên môi
trường Aleksandrov và lặp lại 3 lần để xác định khả năng hòa tan K theo Mục 3.5.4. Dựa
trên số lượng dòng có khả năng hòa tan cũng như đặc điểm hình thái để đánh giá sự đa
dạng của KSB trong đất vùng rễ cây Bưởi.
3.6.2. Định danh KSB
Các dòng khuẩn lạc có khả năng hòa tan K cao, gửi mẫu đến Trung tâm Khoa học
và Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh) để định danh bằng sinh học phân tử dựa trên quy tắc ở Mục 3.3.5.
3.6.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy
Sau khi sàng lọc giống vi khuẩn từ thí nghiệm 1 theo phương pháp 3.5.4, các chủng
KSB được chọn lọc từ thí nghiệm 1 được nuôi cấy lỏng trong môi trường LB theo mục
3.5.6. Tiến hành cấy 1 ml canh trường từ erlen m ới thu được vào erlen chứa các loại môi
trường khác nhau như dịch chiết Bắp Cải Xanh, Dưa Leo, Súp Lơ, Cải Xanh và Xà Lách
Bẹ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Môi trường thích hợp để nuôi c ấy là môi trường cho
mật độ tế bào đếm được cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy theo phương pháp 3.5.7.
3.6.4. Chọn nguồn C bổ sung để nuôi cấy [TK]
Chủng KSB có SI cao nhất được chọn từ thí nghiệm ở mục 3.6.1 để nghiên cứu điều
kiện tăng sinh. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh lỏng chủng KBS theo Mục 3.5.6. Sử dụng
môi trường LB để nuôi cấy tăng sinh cấp 1. Sau đó hút 1 ml canh trường cấp 1 mới thu
cho vào môi trường đã được chọn lọc ở Mục 3.6.3. và bổ sung các nguồn C khác nhau
như rỉ đường, fructose, maltose và saccharose với nồng độ là 0,5%. Với mẫu đối chứng là
môi trường được chọn lọc ở Mục 3.6.3. để nuôi cấy và không được bổ sung nguồn C. Thí
nghiệm lặp lại 3 lần. Nguồn C thích hợp để nuôi cấy chủng KSB chọn lọc là nguồn C cho
mật độ tế bào đếm được theo Mục 3.5.7 cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy.
3.6.5. Xác định nồng độ C bổ sung để nuôi cấy [TK]
 Sau khi chọn được nguồn C hữu cơ thích hợp để nuôi cấy ở Mục 3.6.4 sau đó tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nguồn C với sự thay đổi nồng độ nguồn C được
chọn là 0,25%, 0,75%, 1% và 1,25% để nuôi cấy chủng KSB chọn lọc. Và mẫu đối chứng
là không bổ sung nguồn C. Thí nghiệm có 5 nghiệm thức mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Sau khi nuôi cấy tiến hành thu kết quả theo Mục 3.5.7.
3.6.6. Chọn nguồn N hữu cơ bổ sung để nuôi cấy
Bổ sung các nguồn N hữu cơ khác nhau vào môi trường được chọn lọc của Mục
3.6.3. để nuôi cấy chủng KSB đã được chọn lọc. Các nguồn N hữu cơ được khảo sát bao
gồm cao thịt, cao nấm men, chiết men và peptone với nồng độ bổ sung ban đầu là 0,1%.
Mẫu đối chứng là môi trường chọn lọc với nguồn C bổ sung được chọn và không bổ sung
nguồn N hữu cơ. Thí nghiệm có 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Sau
thời gian nuôi cấy, nguồn N hữu cơ thích hợp là nguồn cho mật độ tế bào đếm được cao
nhất sau 48 giờ nuôi cấy theo Mục 3.5.7.
3.6.7. Xác định nồng độ N hữu cơ bổ sung để nuôi cấy
Sau khi xác định nguồn N hữu cơ bổ sung thích hợp, tiến hành thay đổi nồng độ
nguồn N hữu cơ chọn lọc từ 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2% và 0,25%. Thí nghiệm có 5
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Sau 48 giờ nuôi cấy, tiến hành thu kết quả theo Mục
3.5.7.