Quy trình vi nhân giống cho cây ngập mặn đang bị đe dọa nghiêm trọng, cây trà mủ

EXCOECARIA AGALLOCHA L

Tóm tắt

Excoecaria agallocha L. là 1 giống cây ngập mặn đang bị đe dọa nghiêm trọng, chúng sống ở
rừng bảo tồn cây ngập mặn Pichavaram, vùng ven biển Tamil Nadu. Nó phân bố trên bờ biển và
ở rìa rừng ngập mặn. Để ngăn chặn sự giảm số lượng của chúng ở khu vực Địa trung hải, tình
trạng rừng không được giám sát đã giảm đáng kể. Thêm vào đó, tình trạng phá rừng ngập mặn
cùng với tốc độ nảy mầm hạt thấp đều gây nguy hiểm cho loài này. Trong thí nghiệm này, chúng
tôi phát triển 1 quy trình vi nhân giống cây Excoecaria agallocha trưởng thành. Những cành giâm
in vitro (microcuttings) thu được từ ngọn và chồi bên của cây trưởng thành được sử dụng làm mô
cấy. Cành giâm in vitro thu được từ chồi nách được trồng trên các môi trường khác nhau, chất
điều hòa sinh trưởng thực vật và các hợp chất phenol được tiết ra khác nhau. Chồi nách được tạo
ra từ mẫu cấy sạch bệnh được cắt bớt, phân cắt và tái nuôi cấy trong cùng môi trường để làm
tăng số lượng chồi cho nuôi cấy. Môi trường Murashige và Skoog (MMS) được điều chỉnh bằng
cách thêm các nồng độ khác nhau của 1 trong 2 chất hoặc cả 2 chất N6 – benzyl adenine (BAP)
và Naphthalene acetic acid (NAA) nhằm xác định môi trường tiềm năng cho sự nhân chồi từ các
phân khúc đốt cây. Trong những thí nghiệm sau, nồng độ mol bằng nhau của bốn cytokonin
[BAP, Kinetin và 2 -isopenthenyladenine (2iP)] kết hợp với nồng độ mol bằng nhau của ba
auxins [NAA, acid indolo acetic (IAA) và indole-3 butyric] được sử dụng để kiểm tra tốc độ tăng
trưởng của chồi nách, được cảm ứng trên môi trường MMS agar có bổ sung 3,9 μM BAP và 1,34
μM NAA sau 6 tuần nuôi cấy. Các Auxin khác nhau (NAA, IBA và IAA) được dùng để xác định
điều kiện tối ưu cho sự phát triển rễ in vitro từ chồi in vitro (microshoots). Kết quả tốt nhất thu
được là NAA 5,41 μM (89% mọc rễ) và IBA 2,85 hoặc 5,71μM (lần lượt là 86% và 86,5% mọc
rễ)).
Từ khóa: Bảo tồn, cây ngập mặn, chồi in vitro, vi nhân giống, tạo rễ, các loài đang bị đe dọa
nghiêm trọng
Giới thiệu
Các cây rừng ngập mặn là những thực vật ưa mặn thân gỗ có chức năng bảo vệ, chống lại cơn lốc
xoáy, sóng thần và là nguồn cung cấp năng lượng cho các cư dân ven biển. Nó cũng được sử
dụng trong thuốc chữa bệnh, thuốc nhuộm, tannin và y dược. Chúng có nguồn gốc từ tám mươi
họ cây và cây bụi phát triển trên bờ biển và cửa sông ở các vùng duyên hải nhiệt đới và cận nhiệt
đới [1]. Tuy nhiên, sinh cảnh rừng ngập mặn có vai trò quan trọng về sinh thái, vì chúng có chức
năng như các bộ lọc dinh dưỡng tự nhiên và tái chế, giúp giảm nhẹ lũ lụt và giúp bảo vệ các khu
vực ven biển khỏi sự xâm nhập của nước biển [2]. Sinh cảnh rừng ngập mặn đã bị phá hủy
nghiêm trọng trên toàn thế giới ở mức báo động [3]. Mức độ hủy hoại và phân mảnh môi trường
sống như vậy làm tăng sự lo lắng về việc bảo tồn sự đa dạng của rừng ngập mặn. Để tăng cường
bảo tồn, các nỗ lực quản lý để tăng tỷ lệ nảy mầm, đặc biệt là đối với các kiểu gen quý, phải
được thực hiện [1].
Excoecaria agallocha L. (Euphorbiaceae) một loài cây ngập mặn, còn được gọi là milky
mangrove, có khả năng chống chịu cao với điều kiện môi trường bất lợi [4]. E. agallocha được sử
dụng để điều trị bệnh loét và có chức năng như chất kích thích tình dục. Các chiết xuất của
những cây này cũng được sử dụng cho bệnh thấp khớp, tê liệt và nhiễm trùng da [5]. E.
agallocha được sử dụng như thuốc xổ và trong điều trị chứng động kinh, viêm da, tiểu máu, bệnh
phong và đau răng. E. agallocha, có các hợp chất hoạt tính, ví dụ như excoecariatoxins,
fluratoxin, glycerides của axit béo, lipid và sáp, phorbol, este, polyhenols, polysaccharides,
saponin, steroid, tannin, triterpenes [6]. Sự cấp bách đối với vấn đề bảo tồn E. agallocha chủ yếu
là do việc chặt phá cây không được giám sát để dùng làm nhiên liệu và phục vụ cho nhu cầu của
người dân. Hơn nữa, tỷ lệ tạo hạt và nảy mầm thấp [7, 8] càng làm tăng sự lo lắng, vì hầu hết
rừng ngập mặn đều có vấn đề trong sự nảy mầm hạt do sự ngủ đông của phôi và vỏ hạt thì không
thấm nước. Người ta cho rằng tỷ lệ nảy mầm thấp có thể có liên quan đến sự thay đổi khí hậu,
bởi vì khả năng nảy mầm của hạt giảm do stress thiếu nước [9]. Tóm lại, số lượng hạt giống
không đủ và tỷ lệ nảy mầm thấp đã gây ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng sinh sản và do đó ảnh
hưởng đến số lượng của loài cây có dược tính quan trọng này [6].
Các thí nghiệm về sự nảy mầm của hạt E. agallocha đã được thực hiện với các mức độ xới đất
khác nhau nhưng không thành công do khả năng nảy mầm thấp của hạt [9]. Do đó, vi nhân giống
có thể là một phương pháp thay thế để bảo tồn loài độc đáo này. Mục đích chính của nghiên cứu
này là phát triển một phương pháp nhân giống cho Excoecaria agallocha. Các môi trường nuôi
cấy thực vật, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (PGRs) và các chất chống hóa nâu khác
nhau đã được thử nghiệm. Các mẫu chồi (chồi nách và chồi đỉnh) được thu thập từ cây trưởng
thành cho toàn bộ nghiên cứu. Chúng tôi tập trung vào việc đạt được kết quả tốt nhất và phù hợp
nhất, thông qua vi nhân giống.
Vật liệu và phương pháp
Các đỉnh chồi và đốt được cắt bỏ từ các đỉnh sinh trưởng của cây E. agallocha trưởng thành có
nguồn gốc từ rừng bảo tồn cây ngập mặn Pichavaram, Tamil nadu và được dùng như là mô cấy.
Các mô cấy được chuyển đến phòng thí nghiệm ở 4ºC. Các mảnh đỉnh chồi và đốt (không dài
quá 1 cm) được cắt khỏi chồi non. Các mẫu cấy được rửa dưới vòi nước trong 5 phút, tiếp đến là
rửa bằng dung dịch Tween 20 10% (chất tẩy rửa, Himedia, Ấn Độ) trong 5 phút, sau đó bề mặt
mẫu được khử trùng bằng ethanol 70% (v / v) trong 2 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất vô
trùng và sau đó được xử lý bằng carbomat Methyl N- (1H-benzimidazol-2-YL) 1%. Sau đó, mẫu
cấy được xử lý bằng sodium tungstate Na2WO4 20% và dung dịch natri cacbonat để loại bỏ các
hợp chất phenol ra khỏi mẫu cấy [10] và rửa sạch với 0,1 HgCl2 trong 2 phút và sau đó rửa ba lần
bằng nước vô trùng. Những mẫu cấy này được đặt trong các môi trường khác nhau cùng với các
nồng độ khác nhau của than hoạt tính, axit citric và axit ascorbic.
Sự phát triển chồi non từ mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy
Các mẫu cấy được khử trùng với ít nhất một chồi nách hoặc chồi ngọn được đặt trong ống nuôi
cấy có các chất kết hợp và PGRs khác nhau. Ba môi trường nuôi cấy khác nhau đã được thử
nghiệm trên E. agallocha explants viz là môi trường Murashige và Skoog [11], môi trường
Modified Murashige và Skoog [12] và môi trường Woody Plant [13] với nồng độ khác nhau của
BAP và NAA, để đánh giá môi trường nuôi cấy phù hợp cho E. agallocha. Trong ba môi trường,
môi trường MMS đã được phát hiện là môi trường tốt nhất cho sự tăng trưởng của E. gallocha.
Do đó, môi trường này được sử dụng trong suốt thí nghiệm. Môi trường bao gồm MgSo4 (185
mg / L), KNO3, KHPO4 (85mg / L) và CaCl2 (440 mg / L), với sự vắng mặt của NH4NO3, và
bổ sung thêm 30 g / L sucrose, 8g / l agar và pH được điều chỉnh đến 5,8. Các thí nghiệm được
lặp lại 7 lần. Một chồi được cấy vào một ống nuôi cấy với 10 ml môi trường và 450 mẫu cấy
được sử dụng cho nghiên cứu. Điều kiện buồng nuôi cấy cho tất cả các thí nghiệm là: chu kỳ
quang 16h (Đèn trắng mát , Phillips Master LD 36, mật độ đơn vị cho quang hợp 90 μmol · m-2 s-
1
) và 24 / 19ºC đối với nhiệt độ ban ngày / đêm [14]. Số lượng mẫu cấy được phát triển từ chồi
bên và chiều dài của chồi và trạng thái sinh lý của chúng sau 5 tuần được ghi chép lại. Các môi
trường MMS với 1,4, 3,9, 4,8, 5,4 và 7,4 μM của BAP và 1,34 μM NAA đã được sử dụng cho
nghiên cứu này.
Trong thí nghiệm thứ hai, nồng độ tối ưu của BAP, NAA và IAA được xác định bằng cách sử
dụng các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Các mẫu thân được đặt
theo chiều dọc trong mỗi ống nghiệm cho tất cả các phép thử. Các quan sát liên tục được thực
hiện sau 4 và 6 tuần nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần và số lượng chồi, chiều dài của
mẫu cấy được quan sát.
Thiết lập nhà kính và các thí nghiệm tạo rễ
50 chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy được đặt trong môi trường MMS ½ để cảm ứng tạo rễ với 0,5
đến 2,0 mg / l IBA, NAA và IAA và nuôi cấy trong 2 tuần. Các điều kiện nuôi cấy là 19ºC với
chu kỳ quang 16h [15]. Các chồi được chuyển tới môi trường tạo rễ, đó là môi trường Modified
Murashige và Skoog ½ không chứa PGRs. Thử nghiệm tạo rễ in vitro (Hình 1) được thiết lập
trong một thiết kế khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với ba khối 5 lần lặp lại số lượng chồi rễ, số rễ
trên mỗi chồi và chiều dài rễ trung bình. Dữ liệu được xử lý ANOVA và sai số ít nhất có ý nghĩa
là P ≤ 0,01.
Các cây con mọc rễ in vitro được lấy ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch agar khỏi rễ, sau
đó cây con được cấy vào chậu nhựa nhỏ chứa hỗn hợp than bùn-đá perlite 1: 1 (w / v) được bao
phủ bởi túi thấm polyethylene để duy trì độ ẩm cao. Các chậu cây con được giữ trong nhà kính
với nhiệt độ 24-26ºC vào ban ngày và 18-20ºC vào ban đêm. Điều kiện thông gió cho cây trồng
được tăng lên sau 7 ngày bằng cách tăng kích thước các lỗ của tấm bạt polythene. Sau 3 tuần,
tấm bạt polythene được loại bỏ. Sau 5 tuần sau, các cây con đã thích nghi tốt được chuyển qua
chậu nhựa khác (đường kính - 9cm) chứa hỗn hợp như cũ và sau đó chuyển qua bóng râm 70%.
Nhiệt độ không khí trong bóng râm vào ban ngày là 25-28ºC và 18-22ºC vào ban đêm.
Kết quả và thảo luận
Mô hóa nâu là một trở ngại khiến công việc nuôi cấy mô loài này gặp nhiều khó khăn. Sự có mặt
của các hợp chất phenol và hoạt động mạnh của enzyme ployphenol oxidase khiến mẫu cấy hóa
nâu, ảnh hưởng đến việc nhân giống sinh dưỡng và hạn chế phát sinh hình thái. Các phương
pháp được sử dụng trong quá trình cắt mẫu cấy cho phép mô vẫn giữ được màu xanh trong hai
quá trình nuôi cấy bổ sung (30d). Các mẫu cấy được giữ trong một môi trường không có chất
chống oxy hoá hoặc chất hấp phụ các hợp chất khiến môi trường chuyển màu đen nâu. Ngoại trừ
trường hợp có mặt của than hoạt tính, tỉ lệ mẫu cấy hóa nâu ngược lại liên quan đến nồng độ của
các hợp chất được thử như acid ascorbic và axit xitric (Hình 2). Trong số các tác nhân chống hóa
nâu, 4 g / l than hoạt tính , 100 m / l axit xitric và 100 mg / l axit ascorbic có tỷ lệ chống hóa nâu
cao hơn đáng kể tại các đốt của mẫu cấy hơn là đỉnh chồi mẫu cấy sau 30 ngày. Thêm than hoạt
tính 4 g / l giúp giảm sự hóa nâu ở cả 2 loại mẫu cấy. Than hoạt tính được sử dụng nhằm mục
đích oxy hóa các hợp chất phenol do mẫu cấy tiết ra môi trường nuôi cấy [16, 17], ascorbic axit
cũng có tác dụng tương tự [18]. Chất chống oxy hoá bảo vệ mẫu cấy bằng cách giảm khả năng
oxi hóa khử của phenol trong môi trường nuôi cấy và đạt được bằng cách hoàn nguyên các
quinines được hình thành bởi oxy hóa các hợp chất phenol được sản xuất trong mô bị tổn
thương, hoặc bằng cách cạnh tranh với các gốc tự do và loại bỏ chúng khỏi phản ứng [19]. Với
than hoạt tính, các liên kết hydro hấp thụ polyphenol, làm giảm sự tổng hợp của chúng và do đó
ngăn cản sự hóa nâu của mẫu cấy.
Trong nghiên cứu này, cảm ứng chồi được tiến hành từ các đốt và đỉnh chồi của mẫu cấy ở các
nồng độ BAP và NAA khác nhau. Trong dãy nồng độ được thí nghiệm, 3,9 μM BAP và 1,34 μM
NAA nhận được phản ứng tốt hơn sự kết hợp của các nồng độ khác (Bảng 1) và chúng thúc đẩy
số lượng lớn chồi được cảm ứng trên mỗi mẫu cấy (3.8) (Hình 3).
Một tác dụng phối hợp của cytokinin và auxin trong cảm ứng chồi nách cũng được báo cáo ở loài
Rosa roxburghii [20], trong việc lựa chọn gốc rễ của loài Pirus communis và Pirus betulfolia
[21], ở loài Eucalyptus grandis [22] và Mytus communis [23]. Về chiều dài chồi, môi trường có
bổ sung 1,34 μM NAA và 3,9 μM BAP (Hình 4) cho kết quả tốt nhất, mặc dù hiệu quả của môi
trường này không khác biệt đáng kể so với môi trường không có chất điều hòa tăng trưởng thực
vật và môi trường chỉ chứa BAP (4,8 hoặc 7,4 μM) hoặc kết hợp với NAA (0,12 NAA và 3,9 μM
BAP) (Bảng 1). Sự kết hợp của 1,34μM NAA và 3.9μM BAP đã tạo ra kết quả đầy hứa hẹn về
số lượng và chiều dài của chồi nách. Nồng độ mol bằng nhau của cytokinin (kinetin, 2ip và
zeatin) và auxins (IAA và IBA) được sử dụng để nhân giống chồi (Bảng 2). Sau 4 tuần nuôi cấy,
chồi nách được hình thành ở môi trường không có PGRs thấp hơn so với môi trường có PGRs,
trong khi sau 11 tuần, kết quả tương đối cao hơn khi môi trường kết hợp với IAA cùng với zeatin
và IAA cùng với BAP. Số lượng chồi được sản xuất sau 11 tuần sử dụng 1,34μM IAA kết hợp
với 3.9μM BAP cao hơn đáng kể so với kết quả thu được môi trường chứa kinetin, 2ip và zeatin.
Môi trường MMS cơ bản có bổ sung BAP (3.9 μM) và IAA (1,34μM) thúc đẩy tối đa sự tạo
thành chồi nách (Bảng 2). Kết quả tương tự được báo cáo bởi Rao và các cộng sự [24]. Trong số
các thí nghiệm về auxin, IAA kết hợp với BAP cho hiệu quả tốt hơn đáng kể về số lượng chồi
nách và chiều dài chồi so với sự kết hợp giữa kinetin và zeatin (Bảng 4). Kết quả này tương tự
với nghiên cứu của Ahmed và Mohamed [25]. Chiều dài chồi trong môi trường bổ sung 2ip
(3.9μM) và IAA (1.34μM) cao hơn đáng kể (14 mm) so với thu được với các cytokinin khác.
Tuy nhiên, trong môi trường bổ sung ít IAA, chiều dài chồi không khác biệt đáng kể so với các
auxin khác. Vì thế, nghiên cứu hiện tại của chúng tôi trên E. agallocha cho thấy 1,34μM IAA kết
hợp với 3,9 μM BAP giúp tối ưu hóa tốc độ tạo chồi , nhân lên và tương tự với kết quả của Rao
và cộng sự [24] với 1,34μM IAA và 3,55μM BAP.
Tạo rễ In vitro
Các mẫu chồi in vitro được phân cắt và chuyển qua các môi trường tạo rễ khác nhau (môi trường
MMS có bổ sung NAA, IBA và NAA) để cảm ứng tạo rễ (Bảng 4). Rễ bất định được cảm ứng
trực tiếp từ chồi không thông qua bất kỳ giai đoạn mô sẹo nào trong tất cả các môi trường. Do
đó, nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định rất quan trọng đối với thực tiễn. Sự tạo rễ bất định từ
các cành giâm in vitro của E. agallocha khi có mặt của các auxin khác nhau (IAA, IBA và NAA)
trong môi trường MMS. Auxins ngoại sinh thường được sử dụng với một số loài thực vật để thúc
đẩy tạo rễ in vitro của chồi in vitro [26]. Nhìn chung, sự hiện diện của auxins 1,5 mg / L và 2,0
mg / L trong môi trường giúp sự hình thành rễ tốt hơn. Tuy nhiên, một tần suất đáng kể (86 ±
0.9%) sự hình thành rễ, số lượng rễ (5.9 ± 0.61) với chiều dài thích hợp (3.8 ± 0.51) được quan
sát thấy trong môi trường MMS bổ sung với 5,02 μM IAA (Bảng 4; Hình 5). tần số tạo rễ tăng
lên dần dần và nó đạt đến tỷ lệ sao nhất sau 11 tuần tạo rễ. Có nhiều báo cáo khác cho thấy IAA
có hiệu quả trong việc kích thích hình thành cơ quan bất định, như báo cáo của Fogaca và Fett-
Neto [27], Zhang et al. [28]. Hình 6 cho thấy rằng nồng độ mol bằng nhau của IAA và IBA cảm
ứng tạo rễ tốt nhất và kết quả tương tự được báo cáo bởi Garcinia indica [29] và Rauvolfia
tetraphylla [30]. Những cây In vitro có bộ rễ tốt được lấy ra khỏi ống nghiệm, chuyển sang nhà
kính được bao phủ bởi màng che polythene giúp cây thích nghi (Hình 7), sau đó chúng được
chuyển sang chậu (Hình 8) và cuối cùng là các cây đã được chuyển đến rừng ngập mặn
Picharavaram. Chúng tôi ghi nhận tỷ lệ sống sót là 86%.
Kết luận
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi mô tả chi tiết một phương pháp giá cả phải chăng và có khả
năng lặp lại việc trồng cây ngập mặn quan trọng về mặt y khoa và dễ bị tổn thương này. Nói
cách khác, công việc của chúng tôi thể hiện sự sản xuất thành công và nhanh chóng các mẫu vật
của Excoecaria agallocha. Kéo dài khả năng trồng trọt và tránh biến dị dòng soma thông qua vi
nhân giống tự dưỡng, ít nhất là đối với các loài cây thân gỗ, vì chúng cần được nuôi trồng trong
điều kiện bảo vệ kéo dài và phức tạp.
Lời cảm ơn
Các tác giả xin cảm ơn Bộ Công nghệ Sinh học (Bộ Khoa học và Công nghệ, GOVT. của Ấn
Độ) vì sự hỗ trợ tài chính của bộ và chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu trong dự án của R / D
Nguồn tham khảo
[1] M.A. Al-Bahrany, M.J. Al-Khayri, Micropropagation of grey mangrove Avicennia marina,
Plant Cell Tissue and Organ Culture, 72, 2003, pp. 87-93.
[2] V. Selvam, Atlas of mangrove wetlands, M.S. Swaminathan Research Foundation, Chennai,
India, 2002, pp. 84-93.
[3] K. Kathiresan, B.L. Bingham, Biology of mangrove and mangrove ecosystems, Advances in
Marine Biology, 40, 2001, pp. 81-251.
[4] K. Tenji, Y. Kiyonori, K. Masahiro, K. Takao, F, Yasuhiro, Three Diterpenoids
(Excoecarines V1 – V3) and a Flavanone Glycoside from the fresh stem of Excoecaria agallocha,
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, Tokyo, 51(10), 2003, pp. 1142-1146.
[5] K. Padmanabhan, K. Ayyakkannu, Bioactive compounds from marine plants. II. Antibiotic
properties of Excoecaria agallocha L. from Pichavaram mangroves, Proceedings of National
Symposium of Biology, Utilization and Conservation Mangroves (Editor Leela J. Bosale),
Shivaji University, Kolhapur, 1985, pp. 319-324.
[6] S. Balu, S. Mathavan, Wound healing properties of Excoecaria agallocha L., Journal of
Economic and Taxonomic Botany, 19, 1995, pp. 571-575.
[7] K. Kathiresan, A review of studies on Phichavaram mangrove, southeast India,
Hydrobiologia, 430(1), 2000, pp. 185-241.
[8] K. Ponnambalam, L. Chokkalingam, V. Subramaniam, J. Muthuswamy Ponniah, Mangrove
Distribution and Morphology Changes in the Mullipallam Creek, South Eastern Coast of India,
International Journal of Conservation Science, 3(1), 2012, pp. 51-60.
[9] D. Gracia, R. Zamora, J.A. Hodar, J.M. Gomez, Age structure of Juniperus communis L. in
the Iberian Peninsula: conservation of remnant populations in Mediterranean mountains,
Biological Conservation, 87, 1999, pp. 215-220.
[10] V. Selvam, L. Gnanappazham, M. Navamuniyammal, K.K Ravichandran, V.M.
Karunagaran, Atlas of Mangrove wetlands of India, (Part 1. Tamil Nadu), M.S. Swaminathan
Research Foundation, Chennai, 2004, pp. 85-100.
[11] T. Murashige, F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco
tissue cultures, Physiologia Plantarum, 15, 1962, pp. 473-497.
[12] V. Varsha, S. Mahesh, Micropropagation of rare mangrove Bruguiera cylindrical L. towards
conservation, Indian Journal of Biotechnology, 7, 2008, pp. 255-259.
[13] G. Llyod, B. Mucown, Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia
latifolia, by use of shoot-tip culture, Proceedings of International Plant Propagation Society, 30,
1980, pp. 421-427.
[14] G. Divya, B. Seema, In vitro shoot proliferation in Emblica afficinalis var. Balwant from
nodal explants, Indian Journal of Biotechnology, 7, 2008, pp. 394-397.
[15] C.Ragonezi, K. Klimaszewska, M.R. Castro, M. Lima, P. de Oliverira, M.A Zavattieri,
Adventitious rooting of conifers: influence of physical and chemical factors, Trees, 24(6),. 2010,
pp. 975-992.
[16] M. Jordan, Multiple shoot formation and rhizogenesis from cherimola (Annona cherimola
L) hypocotyls and petiole explants, Gartenbauwissenschaft, 53, 1988, pp. 234-237.
[17] M. Jordan, L. Iturriage, C. Roverraro, A.P Goreux, Promotion of Annona cheromola in vitro
shoot morphogenesis an influenced by antioxidants, Gartenbauwissenschaft, 56, 1991, pp. 224-
227.
[18] D. Charez, L.A. Acevedo, R. Mata, Tryptamine derived amides and acetogenins from seed
of Rollinia musa, Journal of Natural Products, 62, 1999, pp. 1119-1122.
[19] P.C. Debergh, P.E. Read, Micropropagation, Micropropagation Technology and Application
(Editors P.C. Debergh, R.H. Zimmerman), Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, 1993, pp. 1-
13.
[20] Y. Ma, D.H. Byrne, J. Chen, Propagation of rose species in in vitro method, Vitro Cellular
& Developmental Biology – Plant, 32, 1996, pp.103-108.
[21] D. Yeo, B.M. Reed, Micropropagation of three Pyrus rootstocks, HortScience, 30, 1995, pp.
620-623.
[22] O.M.E. Mokotedi, M.P. Watt, N.W. Pammenter, F.C. Blakeway, In Vitro rooting and
subsequent survival of two clones of a cold-tolerant Eucalyptus grandis × E. nitus hybris,
HortScience, 35, 2000, pp.1163-1165.
[23] B. Ruffoni, A. Gazzano, C. Costantina, Micropropagation Myrtus communis Mill.: Effetto
dell’axido indolacetico sulla radicazione, Itulus Hortus, 1, 1994, pp. 8-12.
[24] C. S. Rao, P. Eganathan, A. Anand, P. Balakrishna, T. P. Reddy, Protocol for in vitro
propagation of Excoecaria agallocha L., a medicinally important mangrove species, Plant Cell
Reports, 17, 1998, 861–865.
[25] N. Ahmed, M. Anis, An efficient in vitro process for recurrent production of cloned plants
of Vitex negundo L., European Journal of Forest Research, 130(2), 2011, pp.135-144.
[26] V.P. Gaba, Plant growth regulators in plant tissue culture and development, Plant
development and biotechnology (Editors R.N. Trigano, D.J. Gray), CRC Press, Boca Raton, FL,
2005, pp. 87-99.
[27] C.M. Fogaca, A.G. Fett- Neto, Role of auxin and its modulators in the adventitious rooting
of Eucalyptus species differing in recalcitrance, Plant Growth Regulation, 45, 2005, pp.1-10.
[28] S. Zhang, X. Yao, H. Ren, K. Wang, S.Y. Zhang, A preliminary study on rapid in vitro
propagation of Emblica, For Res Beijing, 15, 2002, pp. 116-211.
[29] S.K, Malik, R. Chandhary, R.K. Kalia, Rapid in vitro multiplication and conservation of
Garcina indica: A tropical medicinal tree species, Sci Hortic, 106, 2005, pp. 539-553.
[30] M. Faisal, N. Ahmed, M. Anis, Shoot multiplication Rauvolfia tetraphylla using
thiadiazuaron, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 80, 2005, pp. 187-190.
Từ viết tắt
 NAA - Naphthalene acetic acid
 MS - Murashige and Skoog Medium (1962)
 MMS - Modified Murashige and Skoog medium (2008)
 Bap - 6- Benzylamino purine
 KIN - Kinetin
 WPM - Woody Plant Medium (1981)
 PGR - Plant Growth Regulators