Machine Translated by Google

Ứng dụng Hóa sinh và Công nghệ sinh học

https://doi.org/10.1007/s12010-020-03437-0

Sản xuất ethanol sinh học từ Azolla

filiculoides bởi Saccharomyces cerevisiae, Pichia
stipitis, Candida lusitaniae và Kluyveromyces marxianus

1
Mariam H. Chupaza1,2,3 & Yu-Rim Park Gwi- & So Hee Kim1 & Ji Won Yang1 &

Teak Jeong1 & Sung-Koo Kim1

Đã nhận: 30 tháng 7 năm 2020 / Đã chấp nhận: 29 tháng 9 năm 2020/

# Springer Science+Business Media, LLC, một phần của Springer Nature 2020

Tóm tắt

Ethanol được sản xuất bằng cách thủy phân và lên men riêng biệt bằng cách sử dụng
Azolla filiculoides làm sinh khối. Thủy phân bằng axit nhiệt và đường hóa bằng enzyme
được sử dụng làm phương pháp tiền xử lý để sản xuất monosacarit từ Azolla. Hàm lượng
tối ưu cho quá trình thủy phân bằng axit nhiệt của bùn cỏ dại Azolla 14% (w/v) tạo ra
16,7-g/L mono-sacarit bằng cách sử dụng 200 mM H2SO4 ở 121°C trong 60 phút. Quá trình
đường hóa bằng enzyme sử dụng Viscozyme 16 U/mL tạo ra monosacarit 61,6 g/L sau 48
giờ. Sản xuất ethanol với hệ số hiệu suất ethanol từ thủy phân cỏ dại Azolla sử dụng
Kluyveromyces marxianus, Candida lusitaniae Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
lần lượt là 26,8 g/L (YEtOH = 0,43), 23,2 g/L (YEtOH = 0,37), 18,2 g/L ( YEtOH = 0,29)
và 13,7 g/ L (YEtOH = 0,22), tương ứng. Saccharomyces cerevisiae cho năng suất thấp
nhất vì nó chỉ sử dụng glucose. Ethanol sinh học từ dịch thủy phân cỏ dại Azolla có thể
được sản xuất thành công bằng cách sử dụng Kluyveromyces marxianus vì nó tiêu thụ hoàn
toàn hỗn hợp glucose và xyloza trong vòng 60 giờ.

Từ khóa Bioetanol. Azolla filiculoides. Kluyveromyces marxianus. Candida lusitaniae.

Viêm mũi Pichia. Saccharomyces cerevisiae

Mariam H. Chupaza và Yu-Rim Park là đồng tác giả đầu tiên.

* Sung-Koo Kim

skkim@pknu.ac.kr

1
Trường Thủy sản Biển và Khoa học Đời sống (Chuyên ngành Công nghệ sinh học), Quốc gia Pukyong
Đại học, 48513 Busan, Hàn Quốc
2
Chương trình Cao học Quốc tế KOICA-PKNU về Khoa học Thủy sản, Đại học Quốc gia Pukyong,
Busan 48513, Hàn Quốc
3
Cục Đánh bắt và Chế biến Cá, Cơ quan Giáo dục và Đào tạo Nghề cá, PO Box 83, Bagamoyo, Vùng
ven biển, Tanzania
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Giới thiệu

Trong thế kỷ XXI, xã hội đang phải đối mặt với những thách thức toàn cầu về cách thức và địa điểm

để có đủ năng lượng bền vững cho giao thông vận tải, sưởi ấm và các quy trình công nghiệp cũng

như nguyên liệu thô cho các ngành công nghiệp khác nhau để vận hành thế giới một cách bền vững [1].

Hiện tại, mục tiêu của nghiên cứu là giảm sự phụ thuộc của chúng ta vào nhiên liệu hóa thạch và ngăn

chặn nạn phá rừng cũng như cạnh tranh lương thực hơn nữa. Điều này đã kích hoạt một cuộc tìm kiếm

rộng rãi để thuần hóa nguyên liệu năng lượng sinh học mới có thể tạo ra sinh khối tái tạo đáng kể

trong một thời gian ngắn với các phân tử năng lượng sinh học phong phú có thể chuyển đổi thành

nhiên liệu sinh học bằng cách sử dụng một bộ công nghệ đã được thiết lập tốt [2]. Vì năng lượng

hóa thạch có hạn và việc sử dụng chúng làm nhiên liệu ở quy mô lớn có tác động tiêu cực đến khí hậu

toàn cầu, do đó cần có các nguồn nhiên liệu thay thế để sản xuất năng lượng [3]. Zhang và cộng sự.

[4] đã chỉ ra rằng năng lượng tái tạo được công nhận là thế hệ tiếp theo sẽ thay thế sự phụ thuộc

của con người vào nhiên liệu hóa thạch.

Ngày nay, ethanol sinh học đã được sản xuất từ nguyên liệu nông nghiệp và sinh khối lignocellulose

ở nhiều nước [5]. Sinh khối dựa trên đường và tinh bột, chẳng hạn như mía hoặc ngô, được coi là

thực phẩm và nguyên liệu thô [6]. Về mặt này, nghiên cứu hiện đã chuyển sang sử dụng nguyên liệu

thô không ăn được như sinh khối lignocellulose hoặc sinh khối tảo thay vì cây lương thực giàu

carbohydrate thế hệ đầu tiên do rủi ro an ninh lương thực của con người liên quan đến nhiên liệu

sinh học thế hệ đầu tiên [7]. Sự sẵn có của nguyên liệu lignocellulose đang mở ra tiềm năng cho các

khu vực địa lý khác nhau tận dụng nguồn nguyên liệu xenlulo dồi dào tại địa phương để sản xuất

ethanol [8].

Việc sử dụng nước thải làm nguồn nước tái chế và các chất dinh dưỡng quan trọng để trồng cây

năng lượng sẽ làm giảm đáng kể chi phí và nhu cầu năng lượng cho sản xuất nhiên liệu sinh học [2].

Thực vật thủy sinh đại diện bởi các loài ngập nước, nổi lên và nổi tự do sống ở vùng đất ngập nước

bị ô nhiễm đã thu hút sự chú ý đáng kể như một nguyên liệu thô tiềm năng cho nhiên liệu sinh học

thế hệ thứ hai và thứ ba vì khả năng sản xuất một lượng lớn sinh khối cũng như chi phí bảo trì rẻ

và dễ dàng. và thu hoạch [9].

Trong nghiên cứu này, cây Azolla được lấy mẫu để sản xuất ethanol với mục đích sản xuất ethanol

từ Azolla filiculoides bằng cách sử dụng bốn loại nấm men khác nhau để lên men. Azolla là một chi

dương xỉ thủy sinh nổi có 7 loài, phân bố khắp vùng nhiệt đới và ôn đới [10]. Đặc điểm đáng chú ý

nhất của Azolla là mối quan hệ cộng sinh của nó với tảo xanh lam cố định đạm (cyanobacteria),

Anabaena azollae [11]. Khả năng cố định nitơ trong khí quyển của Azolla cho phép loài dương xỉ này

phát triển thành công trong môi trường sống dưới nước thiếu hoặc có hàm lượng nitơ thấp. Azolla

là một trong những loại cây phát triển nhanh nhất và có khả năng thích ứng với nhiều điều kiện môi

trường [12]. Azolla là một ví dụ điển hình về việc cây trồng được trồng đúng nơi khi được trồng

cho một mục đích nhất định và nó được coi là loại cỏ dại gây phiền toái ở một số nơi trên thế giới

[13]. Ở vùng nhiệt đới và ôn đới, các loài Azolla có thể hình thành thảm dày trên bề mặt tương đối

yên tĩnh của ao nước ngọt, mương thoát nước và ruộng lúa [14]. Thảm Azolla dày đặc ngăn chặn sự

xâm nhập của ánh sáng ở các vùng nước mở, gây thiếu oxy trong nước và điều kiện sống kém cho cá

[15]. Hossain và cộng sự. [16] cho thấy rằng các loài thủy sinh như lục bình và Azolla có thể là

sinh khối xenlulo tốt và có thể giải phóng đường hiệu quả trong quá trình thủy phân bằng các phương

pháp xử lý tiết kiệm chi phí để sản xuất ethanol.

Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Vật liệu và phương pháp

Nguyên liệu thô

Azolla filiculoides được thu hoạch từ trang trại cá Magadu ở vùng Mororgoro ở Tanzania.
Cỏ dại được phơi khô dưới ánh nắng trong 1 tuần và nghiền thành bột có kích thước hạt
nhỏ hơn 100 μm bằng máy nghiền con lăn, sau đó sàng qua lưới 200 và dùng để phân tích.

Thành phần sinh khối được xác định bằng phương pháp AOAC [17] do Viện nghiên cứu khoa
học nông nghiệp thuộc Trung tâm chứng nhận thức ăn chăn nuôi tại Đại học quốc gia Chungnam
ở Daejeon 34134, Hàn Quốc thực hiện.

Thủy phân axit nhiệt

Ba loại axit (HCl, HNO3 và H2SO4) ở các nồng độ khác nhau từ 50 đến 250 mM được sử dụng cho
hàm lượng bùn trong khoảng 6 đến 16% (w/v) sử dụng thể tích làm việc 100 mL trong bình 250
mL. Hỗn hợp được hấp khử trùng trong các khoảng thời gian khác nhau từ 15 đến 90 phút ở

121°C sau đó được trung hòa bằng NaOH đến độ pH 5,0. Hiệu suất thủy phân axit nhiệt được
tính toán bằng phương trình. (1) như sau:

ΔSmonoð Þ g=L
EPð Þ¼ % 100 ð1Þ
TC gð Þ =L

trong đó Ep là hiệu quả của quá trình tiền xử lý (%), ΔSmono là sự gia tăng xyloza và glucose (g/L)
trong quá trình thủy phân bằng axit nhiệt, và TC là tổng nồng độ carbohydrate (g/L) của cỏ Azolla

[18] .

Tối ưu hóa quá trình đường hóa bằng enzyme

Ba loại enzyme Celluclast, Viscozyme và Cellic C-Tec2 đã được sử dụng để xác định loại
enzyme tối ưu cho quá trình đường hóa. Viscozyme (Novozymes, Bagsvaerd, Đan Mạch)
được bổ sung ở các nồng độ khác nhau từ 4 đến 20 U/mL trong thể tích làm việc 100 mL
đựng trong bình 250 mL, sau đó phản ứng được thực hiện ở 50°C trên tủ ấm lắc ở tốc độ
150 vòng/phút. . Các mẫu 1 mL được lấy định kỳ từ 0 đến 72 giờ và được phân tích để
đánh giá mức độ đường hóa bằng enzyme. Nồng độ monosacarit (xyloza và glucose) được
phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hiệu suất đường hóa enzyme được tính toán bằng phương trình. (2)

ΔSgð Þ g=L
Esð Þ¼ % 100 ð2Þ
TF gð Þ =L

Trong đó Es là hiệu quả của quá trình đường hóa bằng enzyme (%), ΔSg là sự gia tăng nồng độ
monosacarit (g/L) trong quá trình đường hóa bằng enzyme sau khi xử lý trước, TF là hàm lượng

cellulose (g/L) trong A. filiculoides được xử lý trước [19].

Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Lên men

Nuôi cấy nấm men và thích ứng

Saccharomyces cerevisiae KCCM 1129 được lấy từ Trung tâm vi sinh vật văn hóa Hàn Quốc (KCCM,
Seoul, Hàn Quốc), Kluyveromyces marxianus KCTC 7150, Candida lusitaniae và Pichia stipitis
KCTC 17574 được lấy từ Bộ sưu tập các loại văn hóa Hàn Quốc (KCTC, Daejeon, Hàn Quốc) .
Những loại nấm men này được trồng trong môi trường YPD chứa chiết xuất nấm men 10-g/L,
peptone 20-g/L và glucose 20-g/L dưới dạng nuôi cấy hạt giống. Môi trường nuôi cấy được ủ
với khuấy trộn ở tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 30°C. Mỗi chủng nấm men nuôi cấy được
lấy mẫu để xác định trọng lượng tế bào khô thông qua mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600)
sử dụng đường cong chuẩn của trọng lượng tế bào khô và OD600.

Lên men Ethanol

Bốn loại nấm men (S. cerevisiae, K. marxianus, K. lusitaniae và P. stipitis) đã được
sử dụng để sản xuất ethanol trong quá trình lên men. Quá trình lên men ethanol được
thực hiện với 100 mL dịch thủy phân cỏ Azolla trong bình Erlenmeyer 250 mL trong điều
kiện bán kỵ khí. Dịch thủy phân cỏ dại Azolla được lên men ở 30°C và 150 vòng/phút, sau
đó mẫu được thu thập định kỳ từ 0 đến 72 giờ để xác định ethanol và lượng đường dư
được bảo quản ở -20°C trước khi phân tích. Nồng độ ethanol được xác định bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hệ số hiệu suất ethanol (YEtOH) được tính toán bằng phương
trình. (3) như sau:

½ EtOH tối đa
YEtOH ¼ ð3Þ
½ MS đầu tiên

trong đó YEtOH đại diện cho hệ số sản xuất ethanol (g/g), [EtOH]max là nồng độ ethanol
tối đa đạt được trong quá trình lên men (g/L) và [MS]ini là tổng nồng độ monosaccha-
rides (xyloza + glucose) ban đầu tại thời điểm bắt đầu lên men (g/L) [20].

Phương pháp phân tích

Thành phần dư lượng cỏ dại Azolla được phân tích bằng phương pháp AOAC.
Sự phát triển của tế bào được phân tích bằng cách đo OD600 thông qua phép đo quang
phổ và được chuyển đổi thành trọng lượng tế bào khô bằng cách sử dụng đường cong chuẩn.
Các mẫu được ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút và chất nổi phía trên được
sử dụng để xác định nồng độ glucose, xyloza và ethanol sau khi lọc qua bộ lọc ống tiêm
0,22-μm. Nồng độ glucose, xyloza và ethanol được phân tích bằng HPLC (dòng Agilent 110;
Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA) với cột Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm; Bio-
Rad) sử dụng 5 mM H2SO4 đã lọc và khử khí làm dung dịch rửa giải với tốc độ dòng 0,6 mL/
phút và nhiệt độ 65°C.

Phân tích thống kê

Mỗi thí nghiệm được thực hiện trong ba lần. Ý nghĩa thống kê của sự khác biệt về hàm
lượng tiền xử lý, đường hóa và monosacarit được đánh giá bằng phương pháp một chiều.
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định đa phạm vi Duncan (P < 0,05) trên phiên bản SPSS

23 (SPSS, Cary, NC, Hoa Kỳ).

Kết quả và thảo luận

Thành phần của Azolla filiculoides

Thành phần sinh khối của cỏ Azolla được xác định bằng phương pháp AOAC. Nó là

biết rằng những loài này chứa hàm lượng và thành phần khác nhau của các chất chuyển hóa thiết yếu,

bao gồm protein, tinh bột và chất béo thô cũng như các thành phần của thành tế bào bao gồm xenlulo,

hemicellulose và lignin [21]. Zouhair và cộng sự. [22] cũng báo cáo rằng carbohydrate là

chất nền chính cho sản xuất ethanol sinh học. Tổng hàm lượng carbohydrate của Azolla

filiculoides được sử dụng trong nghiên cứu này thu được 47,7% khi bổ sung carbohydrate và chất xơ.

nội dung như trong Bảng 1. Hàm lượng Cellulose, hemicellulose và lignin bao gồm

lần lượt là 11,3%, 14,0% và 28,9%. Hàm lượng chất xơ và carbohydrate cao hơn

của Miranda và cộng sự. [2]. Sự khác biệt là do mức độ trưởng thành bị ảnh hưởng bởi

sự thay đổi theo mùa của nhiệt độ và bức xạ mặt trời [23].

Tối ưu hóa phương pháp tiền xử lý cỏ dại Azolla

Thủy phân Azolla filiculoides bằng axit nhiệt

Saha và cộng sự. [24] đã xác nhận rằng việc xử lý trước bất kỳ sinh khối lignocellulose nào là rất quan trọng trước khi

đường hóa bằng enzym. Hình 1 cho thấy nồng độ monosaccharide tăng theo

tăng hàm lượng bùn từ 6 lên 14% (w/v). Lu và cộng sự. [25] cũng tuyên bố rằng hàm lượng chất rắn cao

bùn tạo ra hàm lượng monosacarit cao bằng cách chuyển đổi polysacarit thành

đường đơn. Hiệu suất tiền xử lý (Ep) đạt 5,1% khi sử dụng 14% (w/v)

Cỏ dại Azolla và 100 mM H2SO4 trong 30 phút. Vượt quá 14% (w/v), hiệu suất giảm xuống

4,9% không có bất kỳ thay đổi đáng kể nào về hàm lượng monosacarit, do đó, 14% (w/v)

được chọn là hàm lượng bùn tối ưu. Vượt quá 14% (w/v), độ nhớt quá cao để

làm việc với phương tiện. Rosgaard và cộng sự. [26] xác nhận rằng hàm lượng chất rắn thích hợp phải được

được áp dụng trong quá trình tiền xử lý.

Hình 2a cho thấy sự tăng nồng độ monosaccharide sau khi thủy phân bằng axit nhiệt

trong 30 phút ở 121°C sử dụng HCl với nồng độ từ 50 đến 250 mM. Trước

nghiên cứu cho thấy nồng độ axit cao tạo ra hàm lượng monosacarit cao. Thấp nhất

nồng độ monosacarit là 0,7 g/L với hiệu suất 1% thu được khi sử dụng HCl 50 mM,

và nồng độ monosaccharide cao nhất là 4,2 g/L với hiệu suất đạt 6,3%.

dùng 200mM HCl. Trên 200 mM, không có sự khác biệt đáng kể về monosacarit

sự tập trung; do đó, 200 mM được chọn là nồng độ HCl tối ưu.

Bảng 1 Phân tích thành phần của Azolla filiculoides

Đơn vị: (%)

Dạng cỏ dại Độ ẩm Tro Mập Chất đạm carbohydrate

Cỏ dại Azolla khô 0,85 26h20 2,21 23.02 47,72

Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Hình 1 Sự tối ưu hóa hàm lượng huyền phù của Azolla filiculoides để thủy phân bằng axit nhiệt (100 mM H2SO4 ở
121°C trong 30 phút) được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA)

Hình 2b cho thấy sự gia tăng nồng độ monosacarit sau khi thủy phân bằng axit nhiệt
trong 30 phút ở 121°C bằng HNO3 với nồng độ dao động từ 50 đến 250 mM. Nồng độ
monosaccharide thấp nhất là 1,3 g/L với hiệu suất đạt 2% khi sử dụng 50 mM HNO3 và nồng
độ monosaccharide cao nhất là 8,9 g/L với hiệu suất đạt 13,3% khi sử dụng 200 mM HNO3.
Ngoài 200 mM, không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ monosacarit; do đó, 200 mM được
chọn là nồng độ HNO3 tối ưu.
Dziekońska-Kubczak và cộng sự. [27] cho thấy kết quả tương tự với nghiên cứu này. Hiệu
suất tiền xử lý của HNO3 cao hơn so với HCl.
Hình 2c cho thấy sự tăng nồng độ monosacarit sau khi thủy phân bằng axit nhiệt trong
30 phút ở 121°C bằng H2SO4 với nồng độ dao động từ 50 đến 250 mM. Hiệu suất thủy phân
cao đã được báo cáo khi xử lý trước vật liệu lignocellulose bằng H2SO4 [28]. Quá trình
thủy phân hóa học sinh khối bằng axit sulfuric loãng đã được nghiên cứu khác công nhận
[29] là một bước quan trọng để loại bỏ hemicellulose khỏi chất nền lignocellulose để
tạo điều kiện chuyển đổi sinh học sinh khối xenlulo thành ethanol. Nồng độ monosac-
charide thấp nhất thu được là 1,4 g/L với hiệu suất 2% khi sử dụng 50 mM H2SO4 và nồng
độ cao nhất là 11,8 g/L với hiệu suất 17,7% khi sử dụng 200 mM H2SO4. Nồng độ axit cao
cho thấy hàm lượng monosacarit cao theo báo cáo của Chiaramonti et al. [30].
Hình 3 cho thấy quá trình thủy phân bằng axit nhiệt sử dụng thời gian thủy phân bằng
axit khác nhau. Nồng độ monosaccha-rides tăng khi tăng thời gian thủy phân bằng axit từ
15 đến 60 phút. Sau 60 phút, không có thay đổi đáng kể về nồng độ monosacarit. Kityo và
cộng sự. [31] đã báo cáo rằng 60 phút là thời gian thủy phân tối ưu và không có sự khác
biệt đáng kể nào về monosacarit vượt quá 60 phút. Monosacarit được tăng lên 6,9 g/L
với hiệu suất 10,3% từ 15 phút lên 16,9 g/L với hiệu suất 25,3% từ 60 phút và hơn 60
phút monosacarit giảm xuống còn 16,2 g/L monosacarit với hiệu suất 24,3%. Vì vậy, thời
gian thủy phân axit tối ưu là 60 phút. Nếu thời gian phản ứng dài hơn 60 phút, nồng độ
xyloza giảm do sự phân hủy xyloza theo Chiaramonti et al. [30].
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Hình 2 Quá trình thủy phân Azolla filiculoides bằng axit nhiệt ở 121°C trong 30 phút với các nồng độ khác nhau
của HCl, b HNO3 và c H2SO4 được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA)
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Hình 3 Quá trình thủy phân Azolla filiculoides bằng axit nhiệt sử dụng các thời gian thủy phân khác nhau (200 mM H2SO4 ở 121°C

trong 15 phút đến 90 phút) được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA)

Hình 4 cho thấy sự gia tăng nồng độ monosacarit khi sử dụng thời gian thủy phân tối
ưu (60 phút) ở 121°C và axit H2SO4 với nồng độ từ 50 đến 250 mM.
Monosacarit được tăng lên khi tăng nồng độ axit từ 50 đến 200 mM.
Vượt quá 200 mM nồng độ axit, không có sự khác biệt đáng kể về monosacarit

Hình 4 Quá trình thủy phân Azolla filiculoides bằng axit nhiệt sử dụng các nồng độ H2SO4 khác nhau từ 50 đến 250 mM ở 121°C

trong 60 phút được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA)
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

sự tập trung. Lu và cộng sự. [25] báo cáo rằng sự gia tăng nồng độ axit tạo ra sản
lượng monosacarit cao. Sự khác biệt được quan sát thấy khi bùn Azolla được xử lý
ở 121°C trong 30 phút như trong Hình 1d và 60 phút như trong Hình 2b. Có sự gia
tăng nồng độ monosacarit là 4,9 g/L từ 11,8 g/L khi lượng bùn được hấp trong 30
phút lên 16,7 g/L khi lượng bùn được hấp trong 60 phút. Vì vậy, nồng độ axit H2SO4
200 mM được chọn là nồng độ axit tối ưu cho nồng độ monosaccharide cao 16,7 g/L
với hiệu suất 25%. Kityo và cộng sự. [31] đã báo cáo rằng 200 mM HNO3 là nồng độ
axit tối ưu tạo ra nồng độ monosacarit cao.

Đường hóa bằng enzyme

Hình 5a cho thấy nồng độ monosacarit sử dụng 8 U/mL enzyme Viscozyme, Celluclast và
Cellic C-Tec2 trong 72 giờ. Viscozyme tạo ra monosaccharide cao 35,8 g/L với hiệu
suất 53,6%, tiếp theo là Celluclast 32,9 g/L với hiệu suất 49,3% và cuối cùng là Cellic

Hình 5. Quá trình đường hóa bằng enzyme của Azolla filiculoides thủy phân bằng axit. a Sản xuất Monosaccharides
sử dụng 8 U/mL Celluclast, Viscozyme và Cellic C-Tec2 với thời gian xử lý bằng Azolla filiculoides. b Sản xuất
monosac-charides từ Azolla filiculoides sử dụng các đơn vị Viscozyme khác nhau được đánh giá bằng cách sử dụng
phân tích phương sai một chiều (ANOVA)
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

C-Tec2 28,9 g/L với hiệu suất 43,3%. Các enzyme cho thấy nồng độ monosacarit cao ở 48 giờ
sau đó không tăng thêm monosacarit. Trong nghiên cứu này, Viscozyme cho thấy hàm lượng
monosaccharide cao so với Celluclast và Cellic C-Tec2, do đó Viscozyme được chọn là enzyme
tối ưu cho quá trình đường hóa bằng enzyme.
Deba và cộng sự. [32] cho thấy Viscozyme chứa nhiều hoạt động enzyme khác nhau bao gồm
cellulase và hemiaellulase.

Hình 5b Nồng độ monosaccharide sử dụng các đơn vị enzyme Viscozyme khác nhau từ 4 đến
20 U/mL. Trong nghiên cứu này, 16 U/mL được chọn là đơn vị Viscozyme tối ưu cho quá trình
đường hóa bằng enzyme vì nó tạo ra hàm lượng monosacarit cao 61,6 g/L với hiệu suất 92,2%
trong khi 4 U/mL tạo ra hàm lượng monosacarit thấp nhất là 13,2 g/L. với hiệu suất 19,8%.
Trên 16 U/mL, nồng độ monosaccharide không tăng đáng kể. Saha và cộng sự. [33] cho thấy
rằng có thể sử dụng nhiều phương pháp tiền xử lý khác nhau để thủy phân chất xơ thành
monosacarit, làm tăng lượng đường có thể lên men để sản xuất nhiều ethanol hơn.

Lên men với K. marxianus, C. lusitaniae, P. stipitis và S. cerevisiae

Lên men bằng 4 loại nấm men; S. cerevisiae, K. marxianus, K. lusitaniae và P. stipitis sau
khi thủy phân bằng axit nhiệt và đường hóa bằng enzyme sẽ tạo ra ethanol như trong Hình 6.

Hình 6 Sản xuất ethanol sinh học từ quá trình thủy phân Azolla filiculoides bằng bốn loại nấm men. a S. cerevisiae, b P.
stipitis, c C. lusitaniae, và d K. marxianus
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Hình 6a cho thấy quá trình sản xuất ethanol bằng cách sử dụng S. cerevisiae. Trong nghiên cứu này, S.

cerevisiae không thể sử dụng xyloza. Kết quả tương tự được báo cáo bởi Limtong et al. [34] đề cập đến đường

pentose không thể được lên men bởi S. cerevisiae. Glucose 27,8 g/L được sử dụng hết sau 48 giờ để sản xuất

ethanol trong khi 33,2 g/L xyloza vẫn chưa được sử dụng. Một số nghiên cứu khác đã báo cáo rằng ethanol có thể

được sản xuất từ xyloza bởi S. cerevisiae biến đổi gen [33–36]. S. cerevisiae có năng suất thấp nhất là 13,7 g/L

ethanol với YEtOH = 0,22 chỉ tiêu thụ glucose chứ không tiêu thụ xyloza.

Hình 6b cho thấy glucose được sử dụng hết trong vòng 36 giờ và xyloza được sử dụng 12,6 g/L trong 60 giờ tạo

ra 18,2 g/L ethanol với YEtOH = 0,29. Người ta biết rằng P. stipitis có thể tiêu thụ xyloza để sản xuất ethanol

mặc dù ưa thích glucose hơn xyloza [37]. Glucose ức chế sự vận chuyển xyloza bằng cách ức chế không cạnh tranh

trong hệ thống vận chuyển proton có ái lực thấp, trong đó vận chuyển ái lực thấp được sử dụng khi nồng độ đường

cao và hệ thống có ái lực cao được sử dụng khi nồng độ đường thấp [38]. Maleszka và cộng sự. [39] báo cáo rằng

C. lusitaniae sản xuất nhiều ethanol hơn P. stipitis đơn giản vì nó có khả năng lên men xyloza tốt hơn.

Hình 6c cho thấy C. lusitaniae đã sử dụng hết glucose như thế nào trong 36 giờ, tuy nhiên xyloza không được

sử dụng hoàn toàn sau 60 giờ. Nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng xyloza có thể được tiêu thụ hoàn toàn trong 48

giờ bằng quá trình tiến hóa thích nghi [36]. C. lusitaniae là loại nấm men thứ hai tạo ra 23,2 g/L ethanol với

YEtOH = 0,37 vì nó tiêu thụ hoàn toàn glucose và 23,7 g/L xyloza.

Hình 6d cho thấy K. marxianus sử dụng hiệu quả monosaccharides từ 27,8 g/L glucose và 33,2 g/L xyloza mang lại

lượng ethanol cao 26,8 g/L với YEtOH = 0,43 so với ba loại nấm men còn lại. Nó cho thấy glucose được sử dụng

hoàn toàn sau 36 giờ trong khi xyloza được sử dụng hoàn toàn sau 60 giờ. Sunwoo và cộng sự. [17] đã báo cáo rằng

K. marxianus có thể tiêu thụ cả glucose và xyloza mặc dù được quan sát thấy sử dụng xyloza sau khi cạn kiệt

glucose. Đã có báo cáo rằng K. marxianus có thể phát triển ở nhiệt độ 47 °C, 49 °C và thậm chí 52 °C và có thể

sản xuất ethanol ngay cả ở nhiệt độ cao hơn 40 °C [35, 36]. Ngoài ra, K. marxianus còn mang lại những lợi ích bổ

sung bao gồm tốc độ tăng trưởng cao và khả năng sử dụng nhiều loại chất nền có liên quan đến công nghiệp như

mía, nước ép ngô ủ chua, mật đường và bột whey [35].

Phần kết luận

Cỏ dại Azolla là một trong những loại cây phát triển nhanh nhất trên trái đất và nó được coi là mối phiền toái ở

một số nơi trên thế giới. Điều này làm cho Azolla trở thành nguồn sinh khối hoàn hảo để sản xuất ethanol sinh học.

Quá trình thủy phân bằng axit nhiệt và đường hóa bằng enzyme đã tăng cường sản xuất ethanol từ quá trình thủy

phân Azolla bằng cách chuyển xenlulo thành đường dễ lên men hơn. Nghiên cứu này xác nhận việc sản xuất ethanol

từ Azolla filiculoides bằng cách sử dụng bốn loại nấm men khác nhau và tất cả chúng đều sử dụng hỗn hợp glucose

và xyloza ngoại trừ S. cerevisiae chỉ sử dụng glucose. Các điều kiện tiền xử lý tối ưu để sản xuất monosaccharide

từ cỏ Azolla là thủy phân bằng axit nhiệt với 200 mM H2SO4 với huyền phù 14% (w/v) ở 121°C trong 60 phút. Điều

kiện tối ưu cho quá trình đường hóa bằng enzyme là xử lý Viscozyme 16 U/mL. Nồng độ ethanol tối đa sản xuất từ

dịch thủy phân Azolla filiculoides là 26,8 g/L với YEtOH = 0,43 ở loài K. marxianus, tiếp theo là C. lusitaniae

với 23,2 g/L với YEtOH = 0,37, sau đó là P. stipitis và S. cerevisiae có sản lượng ethanol thấp nhất là 18,2 g/L

với YEtOH = 0,29 và 13,7 g/L với YEtOH = 0,22.

Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

Tài trợ Nghiên cứu này được Chương trình Nghiên cứu Khoa học Cơ bản hỗ trợ thông qua Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc
(NRF), do Bộ Giáo dục (2019R1F1A1041288), Hàn Quốc tài trợ.

Tuân thủ các tiêu chuẩn đạo đức

Xung đột lợi ích Các tác giả tuyên bố rằng họ không có xung đột lợi ích.

Người giới thiệu

1. Hahn-Hägerdal, B., Galbe, M., Gorwa-Grauslund, MF, Lidén, G., & Zacchi, G. (2006). Ethanol sinh học - nhiên liệu của
ngày mai từ chất thải của ngày hôm nay. Xu hướng Công nghệ sinh học, 24(12), 549–556.
2. Miranda, AF, Biswas, B., Ramkumar, N., Singh, R., Kumar, J., James, A., Roddick, F., Lal, B., Subudhi, S., Bhaskar,
T. , & Mouradov, A. (2016). Cây thủy sinh Azolla là nguyên liệu phổ biến để sản xuất nhiên liệu sinh học. Công nghệ
sinh học cho nhiên liệu sinh học, 9(1), 221.
3. Brouwer, P., van der Werf, A., Schluepmann, H., Reichart, GJ, & Nierop, KGJ (2016). Sản lượng lipid và thành phần của
Azolla filiculoides và ý nghĩa của việc sản xuất dầu diesel sinh học. Nghiên cứu năng lượng sinh học, 9(1),
369–377.

4. Zhang, Q., Wei, Y., Han, H., & Weng, C. (2018). Tăng cường sản xuất ethanol sinh học từ lục bình bằng cách
phương pháp tiền xử lý kết hợp mới. Công nghệ tài nguyên sinh học, 251(11), 358–363.
5. Cho, Y., Kim, H., & Kim, SK (2013). Sản xuất ethanol sinh học từ rong nâu Undaria pinnatifida
sử dụng men thích nghi với NaCl. Kỹ thuật xử lý sinh học và hệ thống sinh học, 36(6), 713–719.
6. Kim, H., Ra, CH, & Kim, SK (2013). Sản xuất ethanol từ rong biển (Undaria pinnatifida) sử dụng men thích nghi với các
loại đường cụ thể. Công nghệ sinh học và Kỹ thuật xử lý sinh học, 18(3), 533–537.
7. Kaur, M., Kumar, M., Sachdeva, S., & Puri, SK (2018). Cỏ thủy sinh là nguyên liệu thế hệ tiếp theo
để sản xuất năng lượng sinh học bền vững. Công nghệ tài nguyên sinh học, 251(10), 390–402.
8. Redding, AP, Wang, Z., Keshwani, DR, & Cheng, JJ (2011). Tiền xử lý bằng axit loãng ở nhiệt độ cao đối với cỏ Bermuda
ven biển để thủy phân bằng enzyme. Công nghệ tài nguyên sinh học, 102(2), 1415–1424.

9. Miranda, AF, Liu, Z., Rochfort, S., & Mouradov, A. (2018). Sản xuất lipid ở thực vật thủy sinh Azolla ở giai đoạn sinh
dưỡng, sinh sản và phản ứng với stress phi sinh học. Sinh lý học và Hóa sinh thực vật, 124(11), 117–125.

10. Speelman, EN, Van Kempen, MML, Barke, J., Brinkhuis, H., Reichart, GJ, Smolders, AJP, et al.
(2009). Sự nở hoa Azolla ở Bắc Cực Eocene: điều kiện môi trường, năng suất và lượng khí thải carbon.
Địa sinh học, 7(2), 155–170.
11. Lumpkin, TA, & Plucknett, DL (1980). Azolla: Thực vật học, sinh lý học và sử dụng làm phân xanh.
Thực vật học kinh tế, 34(2), 111–153.
12. Sood, A., Uniyal, PL, Prasanna, R., & Ahluwalia, AS (2012). Tiềm năng xử lý bằng thực vật của thực vật vĩ mô thủy
sinh, Azolla. Môi trường, 41(2), 122–137.
13. Moore, AW (1969). Azolla: Sinh học và ý nghĩa nông học. Tạp chí thực vật, 35(1), 17–34.
14. Peters, GA, & Meeks, JC (1989). Sự cộng sinh Azolla-Anabaena: sinh học cơ bản. Đánh giá hàng năm về Sinh học thực vật,
40(1), 193–210.
15. Salehzadeh, A., Naeemi, AS, & Arasteh, A. (2014). Sản xuất diesel sinh học từ Azolla filiculoides (dương xỉ nước).
Tạp chí Nghiên cứu Dược phẩm Nhiệt đới, 13(6), 957–960.
16. Hossain, R., Chowdhury, MK, Yeasmin, S., & Hoq, MM (2010). Sản xuất ethanol từ nấm men phân lập trên lục bình và
Azolla. Tạp chí Vi sinh học Bangladesh, 27(2), 56–60.
17. Sunwoo, IY, Nguyen, TH, Sukwong, P., Jeong, GT, & Kim, SK (2018). Tăng cường sản xuất ethanol thông qua quá trình
thủy phân axit siêu nhiệt và đồng lên men bằng cách sử dụng rong biển thải từ bãi biển Gwangalli, Busan, Hàn Quốc.
Tạp chí Vi sinh và Công nghệ sinh học, 28(3), 401–408.
18. Sunwoo, IY, Hau, NT, Ra, CH, Jeong, GT, & Kim, SK (2018). Sản xuất axeton–butanol–etanol từ rong biển thải được thu
thập từ bãi biển Gwangalli, Busan, Hàn Quốc, dựa trên quá trình lên men tuần tự và được kiểm soát độ pH bằng cách
sử dụng hai chủng. Ứng dụng Hóa sinh và Công nghệ sinh học, 185(4), 1075–1087.
19. Ra, CH, Jeong, GT, Shin, MK, & Kim, SK (2013). Sự biến đổi sinh học của 5-hydroxymethylfurfural (HMF) do Scheffersomyces
stipitis trong quá trình lên men ethanol của dịch thủy phân rong biển Gelidium amansii. Công nghệ tài nguyên sinh
học, 140, 421–425.
20. Ra, CH, Kim, YJ, Lee, SY, Jeong, GT, & Kim, SK (2015). Ảnh hưởng của sự thích nghi galactose trong nấm men lên men
ethanol từ rong biển đỏ, Gracilaria verrucosa. Kỹ thuật xử lý sinh học và hệ thống sinh học, 38(9), 1715–1722.
Machine Translated by Google

Hóa sinh ứng dụng và công nghệ sinh học

21. Muradov, N., Taha, M., Miranda, AF, Kadali, K., Gujar, A., Rochfort, S., Stevenson, T., Ball, AS, & Mouradov, A. (2014).
Ứng dụng kép của cây bèo tấm và cây bèo hoa để xử lý nước thải và sản xuất nhiên liệu tái tạo và hóa dầu. Công nghệ
sinh học cho nhiên liệu sinh học, 7(1), 30–47.
22. Zouhair, FZ, Benali, A., Kabbour, MR, EL Kabous, K., El Maadoudi, E. he, Bouksaim, M., & Essamri, A. (2020). Đặc tính

điển hình của bột giấy argan ở các vùng khác nhau của Ma-rốc: sinh khối mới để sản xuất ethanol sinh học thế hệ thứ
hai. Tạp chí của Hiệp hội Khoa học Nông nghiệp Ả Rập Saudi, 19(3), 192–198.

23. Reddy, KR, & DeBusk, WF (1985). Đặc điểm sinh trưởng của thực vật thủy sinh nuôi trong nước giàu dinh dưỡng: II.
Azolla, bèo tấm và Salvinia. Thực vật học kinh tế, 39(2), 200–208.
24. Saha, BC, Iten, LB, Cotta, MA, & Wu, YV (2005). Pha loãng tiền xử lý bằng axit, đường hóa bằng enzyme và lên men vỏ
trấu thành ethanol. Tiến bộ công nghệ sinh học, 21(3), 816–822.
25. Lu, X., Zhang, Y., & Angelidaki, I. (2009). Tối ưu hóa quá trình tiền xử lý thủy nhiệt xúc tác H2SO4 đối với rơm rạ hạt
cải để chuyển hóa sinh học thành ethanol: Tập trung vào tiền xử lý ở hàm lượng chất rắn cao. Công nghệ tài nguyên sinh
học, 100(12), 3048–3053.
26. Rosgaard, L., Andric, P., Dam-Johansen, K., Pedersen, S., & Meyer, AS (2007). Ảnh hưởng của lượng chất nền đến quá
trình thủy phân enzyme và độ nhớt của rơm lúa mạch đã được xử lý trước. Ứng dụng Hóa sinh và Công nghệ sinh học,
143(1), 27–40.
27. Dziekońska-Kubczak, U., Berłowska, J., Dziugan, P., Patelski, P., Pielech-Przybylska, K., & Balcerek, M.
(2018). Tiền xử lý bằng axit nitric của thân cây Atisô Jerusalem để đường hóa bằng enzyme và sản xuất ethanol sinh
học. Năng lượng, 11(8), 2153–2169.
28. Alvira, P., Tomás-Pejó, E., Ballesteros, M., & Negro, MJ (2010). Công nghệ tiền xử lý cho quy trình sản xuất ethanol
sinh học hiệu quả dựa trên quá trình thủy phân bằng enzyme: đánh giá. Công nghệ tài nguyên sinh học, 101(13), 4851–4861.

29. Jang, JS, Cho, YK, Jeong, GT, & Kim, SK (2012). Tối ưu hóa quá trình đường hóa và sản xuất ethanol bằng quá trình
đường hóa và lên men đồng thời (SSF) từ rong biển, Saccharina japonica.
Kỹ thuật xử lý sinh học và hệ thống sinh học, 35(1–2), 11–18.
30. Chiaramonti, D., Prussi, M., Ferrero, S., Oriani, L., Ottonello, P., Torre, P., & Cherchi, F. (2012). Đánh giá các quy

trình tiền xử lý để sản xuất ethanol lignocellulose và phát triển một phương pháp cải tiến.
Sinh khối và năng lượng sinh học, 46, 25–35.

31. Kityo, MK, Sunwoo, I., Kim, SH, Park, YR, Jeong, GT, & Kim, SK (2020). Tăng cường quá trình lên men ethanol sinh học
bằng phương pháp siêu âm sử dụng ba loài nấm men và cỏ dại Kariba (Salvinia molesta) làm sinh khối được thu thập từ
Hồ Victoria, Uganda. Ứng dụng Hóa sinh và Công nghệ sinh học, 192(1), 180–195.
32. Deba, A., Azimah, N., Zain, M., & Salleh, M. (2017). Sản xuất đường sinh học từ sợi mesocarp cọ dầu (OPMF) bằng
Viscozyme. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật và Ứng dụng ARPN, 12(21), 6225–6237.
33. Saha, BC, Điền, BS, & Bothast, RJ (1998). Thực trạng sản xuất ethanol nhiên liệu từ sợi ngô và triển vọng kỹ thuật. Công
nghệ sinh học cho nhiên liệu và hóa chất. Nhà xuất bản Humana, Totowa, 1998, 115–125.
34. Limtong, S., Sringiew, C., & Yongmanitchai, W. (2007). Sản xuất ethanol nhiên liệu ở nhiệt độ cao từ nước mía của loài
Kluyveromyces marxianus mới phân lập. Công nghệ tài nguyên sinh học, 98(17), 3367–3374.

35. Nonklang, S., Abdel-Banat, BMA, Cha-aim, K., Moonjai, N., Hoshida, H., Limtong, S., Yamada, M., & Akada, R. (2008). Lên
men và biến đổi ethanol ở nhiệt độ cao với DNA tuyến tính trong nấm men chịu nhiệt Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042.
Vi sinh vật ứng dụng và môi trường, 74(24), 7514–7521.

36. Sunwoo, IY, Kwon, JE, Nguyen, TH, Jeong, GT, & Kim, SK (2019). Sản xuất ethanol từ lục bình (Eichhornia crassipes) thủy
phân bằng cách thủy phân axit siêu nhiệt, đường hóa bằng enzyme và nấm men thích nghi với nồng độ xyloza cao. Kỹ
thuật xử lý sinh học và hệ thống sinh học, 42(8), 1367–1374.

37. Hanly, TJ, & Henson, MA (2013). Mô hình trao đổi chất động của đồng nuôi cấy nấm men vi hiếu khí: dự đoán và tối ưu hóa
việc sản xuất ethanol từ hỗn hợp glucose/xyloza. Công nghệ sinh học cho nhiên liệu sinh học, 6(1), 44–60.

38. Agbogbo, FK, & Coward-Kelly, G. (2008). Sản xuất ethanol xenlulo sử dụng nguồn gốc tự nhiên
nấm men lên men xyloza, Pichia stipitis. Thư Công nghệ sinh học, 30(9), 1515–1524.
39. Maleszka, R., Wang, PY, & Schneider, H. (1982). Nấm men lên men D-cellobiose cũng như D-xyloza.
Thư về công nghệ sinh học, 4(2), 133–136.

Ghi chú của nhà xuất bản Springer Nature vẫn trung lập đối với các khiếu nại về quyền tài phán trong các bản đồ được xuất
bản và các liên kết thể chế.