1.

CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Việc phát triển các quy trình lên men mới để sản xuất các hợp chất tự nhiên trên cơ sở kỹ
thuật biến dưỡng vi sinh vật đã nổi lên gần đây như một giải pháp thú vị và hấp dẫn về mặt
thương mại do một số lợi thế bao gồm việc sử dụng nguyên liệu thân thiện với môi trường,
yêu cầu năng lượng thấp, và phát thải chất thải thấp. Một số nhóm hợp chất tự nhiên quan
trọng có thể được sản xuất bởi quá trình lên men được tóm tắt ở đây.

1.1. Terpen
Terpenes là một nhóm hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật lớn, đa dạng và có thể
được sinh tổng hợp từ các đơn vị isopren. Terpenes có thể được phân loại theo số lượng đơn
vị isoprene có trong phân tử, bao gồm hemiterpenes, monoterpenes, sesquiterpene, diterpenes
....

Các terpen được nghiên cứu nhiều nhất và được sản xuất bằng công nghệ biến dưỡng sử dụng
vi sinh vật bao gồm artemisinin (sesquiterpene) và taxol (diterpenes).

Hình 1: Sinh tổng hợp terpen với enzyme từ các nguồn gốc khác nhau. Sơ đồ được tóm tắt từ
con đường trao đổi chất của S. cerevisiae cho sinh tổng hợp dị loại terpen.
Con đường MEP/DOXP: Con đường 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate/1-deoxy-D-
xylulose 5-phosphate, là một con đường không mevalonat tồn tại ở thực vật và hầu hết vi
khuẩn. Các hợp chất màu xanh lá cây là những chất chuyển hóa hoặc enzym chủ yếu tồn tại ở
thực vật.

< https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0958166913006332>
1.1. 1. Sinh tổng hợp acid artemisinic

Trong số các terpenoid, artemisinin thu hút sự quan tâm nhiều nhất. Năm 2013, dựa trên các
nỗ lực cải thiện việc sản xuất artemisinin, các nhà nghiên cứu từ công ty Amyris và các viện
nghiên cứu hợp tác, đã giới thiệu một phương pháp sinh tổng hợp hoàn chỉnh, bao gồm việc
phát hiện ra dehydrogenase có nguồn gốc từ thực vật và một cytochrome thứ hai cung cấp
khả năng sinh tổng hợp hiệu quả axit artemisinic với nồng độ cao đến 25g/L. Kết hợp với quy
trình điều chế hóa học hiệu quả để chuyển đổi axit artemisinic thành artemisinin, các nhà
khoa học tự tin rằng việc sản xuất thuốc chống sốt rét sẽ cuối cùng có thế được áp dụng trên
quy mô công nghiệp.

Hình 2:
a. Tổng quan về con đường sản xuất axit artemisinic. Các gen biểu hiện quá mức được
điều khiển bởi hệ thống cảm ứng GAL được hiển thị bằng màu xanh lá cây.
Squalene synthase bị ức chế bằng đồng hoặc methionine (ERG9) được hiển thị bằng
màu đỏ. DMAPP, dimethylallyl diphosphate; FPP, farnesyl diphosphate; IPP,
isopentenyl diphosphate. tHMG1 mã hóa HMG-CoA reductase bị cắt ngắn.
b. Quá trình oxy hóa đầy đủ ba bước của Amorphadiene thành axit artemisinic từ A.
annua được biểu hiện ở S. cerevisiae. CYP71AV1, CPR1 và CYB5 oxy hóa
amorphadiene thành alcol artemisinic; ADH1 oxy hóa alcol artemisinic thành aldehyd
artemisinic; ALDH1 oxy hóa aldehyd artemisinic thành axit artemisinic.

< https://www.nature.com/articles/nature12051>
1.1.2. Sinh tổng hợp Taxol

Kể từ khi phát hiện ra đặc tính chống ung thư mạnh mẽ của Taxol, nhu cầu và giá cả của hợp
chất này trên toàn thế giới đã tăng theo cấp số nhân. Việc gia tăng quy mô trồng trọt của các
loài Taxus sp. và các quy trình chiết xuất không thân thiện với môi trường đã buộc các nhà
khoa học phải phát triển các phương pháp sản xuất Taxol thay thế, chẳng hạn như tổng hợp
hóa học hoặc tìm kiếm các sinh thể khác có thể sản xuất Taxol, như các loài nấm nội sinh
hoặc kỹ thuật biến dưỡng sử dụng các vật chủ tự nhiên và dị loại. Kể từ những năm 1990,
một số công trình tổng hợp hoàn chỉnh đã được xuất bản, tuy nhiên độ phức tạp của chúng
khiến việc ứng dụng là không khả thi ở quy mô công nghiệp. Từ lúc các quá trình tổng hợp
được làm sáng tỏ, các phương pháp bán tổng hợp đã được công bố, bắt đầu từ các chất trung
gian như 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) vốn có nhiều hơn Taxol trong Taxus sp.. Nhờ
vậy có thể tăng năng suất tổng hợp và chiết xuất từ các nguồn tự nhiên nhưng sản xuất vẫn
chủ yếu dựa vào khai thác cây Thủy Tùng. Bất chấp những nỗ lực trong 20 năm qua để phát
triển các phương pháp rẻ và bền vững hơn, chiết xuất Taxol từ cây vẫn là phương pháp thông
dụng nhất.

Quá trình lên men sử dụng vi sinh vật biến đổi gen để thu được Taxol, hoặc các tiền chất cho
phép bán tổng hợp hóa học dễ dàng hơn, đã tự khẳng định nó là giải pháp thay thế hứa hẹn
nhất để ngăn chặn việc khai thác cây quá mức. Escherichia coli (E. coli), Sacharomyces
cerevisiae (S. cerevisiae) và Bacillus subtilis (B. subtillis) đã được sử dụng thành công để sản
xuất taxadiene. Năm 2010, Ajikumar và cộng sự đã đạt sản lượng 1 g/L bằng cách thực hiện
theo chiến lược hai mô-đun ở E. coli. Họ đã tối ưu hóa con đường MEP ngược dòng tự nhiên
và con đường hình thành taxadiene xuôi dòng khác loại với sự tích lũy indole tối thiểu, hoạt
động như một hợp chất ức chế. Ở S. cerevisiae, Engels và cộng sự đã đạt mức 8,7 mg/L thông
qua sự đồng biểu hiện của T. chinensis taxadiene synthase và Sulfolobus acidocaldarius
geranylgeranyl diphosphate synthase. Gần đây hơn, Ding và cộng sự đã đạt được nồng độ
72,8 mg/L; họ đã chọn enzyme geranylgeranyl diphosphate synthase bằng chiến lược lắp
ghép có sự hỗ trợ của máy tính. Tiếp theo đó, B. subtilis được sử dụng bởi Abdallah và công
sự để thu được nồng độ cuối cùng là 17,8 mg/L taxadiene thông qua sự biểu hiện quá mức
của một số enzyme sinh tổng hợp tự nhiên và dị loại. Vào năm 2016, khi tìm cách sản xuất
taxan gần hơn với cấu trúc cuối cùng của PTX, Walters và công sự đã biểu hiện thành công
P-450 oxyase dị loại ở E. coli để tạo ra một số taxan được oxy hóa. Bảng 1 tóm tắt sản lượng
đạt được trong quá trình sản xuất các sản phẩm trung gian Taxol sử dụng vi sinh vật theo các
công việc chính được thực hiện cho đến nay.

Vi sinh vật
Sản phẩm Sản lượng tối đa
chủ
Taxadiene E. coli 1000 mg/L
S. cerevisiae 72.8 mg/L
 Vi sinh vật
Sản phẩm Sản lượng tối đa
chủ
B. subtilis 17.8 mg/L
Oxygenated taxanes E. coli 570 mg/L
Bảng 1: Các phương pháp chính được sử dụng để sinh tổng hợp chất trung gian của Taxol
thông qua kỹ thuật lên men sử dụng vi sinh vật

Nấm nội sinh (endophytic fungi) đã nhận được sự quan tâm đáng kể trong những năm gần
đây như một phương tiện để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp và là giải pháp thay thế cho
quá trình lên men vi sinh vật hoặc tổng hợp hóa học. Khoảng 200 loại nấm nội sinh thuộc hơn
40 chi nấm từ nhiều bộ khác nhau đã được xác định là sản xuất Taxol. Tuy nhiên, sự thiếu
hiểu biết về sinh lý sinh học của nấm nội sinh và sự mất năng suất Taxol sau nhiều lần nuôi
cấy là những trở ngại chính để đạt được phương pháp sản xuất Taxol® cạnh tranh. Tối ưu
hóa các điều kiện lên men, chẳng hạn như nhiệt độ nuôi cấy, pH, tốc độ quay, nguồn carbon,
nguồn nitơ, tiền chất, chất cảm ứng và chất ức chế, là trọng tâm chính của nghiên cứu khoa
học hiện nay. Về vấn đề này, một số nghiên cứu đã báo cáo việc sản xuất Taxol bởi các loại
nấm nội sinh, chẳng hạn như Aspergillus flavipes (185 µg/L), Aspergillus aculeatinus (1,3
mg/L), Aspergillus oryzae (95 µg/L) và Metarizium anisopliae (0,16 mg). /L). Trong một
nghiên cứu gần đây hơn được thực hiện bởi Kumar và cộng sự, nồng độ 1,6 g/L Taxol đã
được tạo ra bằng cách sử dụng nấm nội sinh Aspergillus fumigatus; đây cũng là sản lượng
Taxol cao nhất từ nấm nội sinh từ trước đến nay.

Hình 3: Con đường sinh tổng hợp Taxol®.

(IDI: Isopentenyldiphosphate isomerase; GPPS: geranylpyrophosphate synthase; and
GGPPS: geranylgeranylpyrophosphate synthase.)

< https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7767101/>

1.2. Phenylpropanoids
Phenylpropanoid là một họ hợp chất hữu cơ đa dạng của các chất chuyển hóa thứ cấp trong
thực vật và có thể được chia thành coumarin, flavonoid, lignan, strylpyrones, tannin,
stilbenoid và một số chất khác. Hoạt tính sinh học đa dạng của phenylpropanoid đã thu hút sự
chú ý trong việc ứng dụng vào y tế.

1.2.1. Sinh tổng hợp Resveratrol

Trans-resveratrol đã được tìm thấy đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh tim
mạch và cũng như có thể chống lại một số loại bệnh ung thư và đái tháo đường đường [20].
Báo cáo đầu tiên về việc sản xuất thành công resveratrol bằng vi sinh vật xuất bản vào năm
2003. Bằng cách đưa 4-coumarate:CoAligase (4CL) từ cây Bạch Dương lai (Populus
trichocarpa x Populus deltoides) và stilbene synthase (STS) từ cây nho (Vitis vinifera) vào cá
thể S. cerevisiae, một lượng nhỏ ở mức 1,45 mg/L resveratrol đã được tạo ra từ tiền chất axit
p-coumaric. Vì sản lượng resveratrol trong nấm men chỉ có thể đạt được ở mức rất thấp nên
hầu hết các nghiên cứu sau đó đã sử dụng E. coli làm vi sinh vật chủ. Bằng cách sàng lọc sự
kết hợp với các chủng, chất kích hoạt và enzyme khác nhau, hiệu suất resveratrol đã được cải
thiện đến 2,31 g/L với axit p-coumaric là tiền chất và chất bổ sung là cerulenin để ức chế con
đường cạnh tranh malonyl-CoA trong quá trình sinh tổng hợp axit béo. Đây cũng là kết quả
cao nhất trong sinh tổng hợp resveratrol cho đến hiện tại. Vào tháng 12 năm 2012, công ty
công nghệ sinh học Thụy Sĩ Evolva đã công nghệ sản xuất resevatrol của công ty công nghệ
sinh học Fluxome của Đan Mạch với giá khoảng 550 000 Euro, từ đó thúc đẩy các nhà
nghiên cứu toàn cầu tập trung vào các hợp chất thiên nhiên tương tự.
Hình 4: Sinh tổng hợp phenylpropanoid với enzyme có nguồn gốc khác nhau.
(a) Các con đường khác nhau trong quá trình sinh tổng hợp malonyl-CoA ở
E coli.
(b) Hồ sơ được trừu tượng hóa từ kỹ thuật trao đổi chất của E. coli để sinh tổng hợp
phenylpropanoids dị loại.
(PAL: lyase phenylalanine amoniac; TAL: tyrosine amoniac lyase; 4CL: 4-coumarate:CoA
ligase; CHS: chalcone synthase, CHI: chalcone isomerase.
Các hợp chất màu xanh lá cây là những chất chuyển hóa hoặc enzym chủ yếu tồn tại ở thực
vật.

< https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0958166913006332>

1.3. Alkaloids
Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên đặc trưng bởi nguyên tử nitơ trung tâm. Alkaloid cũng là
thành phần có hoạt tính sinh học tác động lên thần kinh trung ương có trong các loại thực
phẩm như cà phê, chè, thuốc lá, ca cao…. Nhiều alkaloid cũng là dược chất trong các cây
thuốc như
như cocaine, vincristine/catharanthine, atropine và quinine. Hầu hết các alkaloid này đã được
sử dụng làm thuốc trong một lịch sử lâu dài.

Không giống như phenylpropanoid và terpen, các alkaloid có nhiều con đường sinh tổng hợp
khác nhau bắt nguồn từ các tiền chất trao đổi chất chính. Để có hoạt tính sinh học chuyên sâu,
việc tăng cường sản xuất alkaloid có thu hút ngày càng nhiều sự quan tâm từ cả giới học thuật
và các lĩnh vực công nghiệp. Tuy nhiên, cho đến gần đây, việc sản xuất các alkaloid từ vi
sinh vật là hầu như không thành công. Phần lớn kỹ thuật biến dưỡng vi sinh vật để sản xuất
alkaloid là tạo ra các alkaloid benzylisoquinoline (BIA).

< https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0958166913006332>

1.3.1. Sinh tổng hợp Alkaloid benzylisoquinolin (BIA)

Benzylisoquinoline alkaloid (BIA) là một họ các sản phẩm tự nhiên thực vật được sản xuất
bởi các cây thuộc loài Ranunculales, ví dụ như cây thuốc phiện (Papaver somniferum), cây
anh túc California (Eschscholzia californica), sợi vàng Nhật Bản (Coptis japonica) và cây
Hoàng Liên (Berberis wilsonae). Có khoảng 2500 BIA khác nhau đã được xác định, nhiều
loại trong số đó có đặc tính dược lý sâu rộng và đã được sử dụng trong y học cổ truyền hàng
nghìn năm, như morphine và codeine, berberine, noscapine. Cấu trúc hóa học của các BIA có
dược tính này được thể hiện trong Hình 1.

< https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00055-0>
Hình 5: Con đường sinh tổng hợp đại diện của BIA trong thực vật. Các chất chuyển hóa và
enzyme chính được hiển thị.

< https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00055-0>
Việc cung cấp BIA làm thuốc chủ yếu dựa vào việc trồng cây. Ví dụ, cây thuốc phiện là
nguồn BIA tự nhiên chính cung cấp morphine, codeine, sanguinarine, noscapine và
papaverine. Năm 2019, khoảng 240.800 ha cây thuốc phiện được trồng và sản xuất 73 tấn
dược phẩm opioid. Tuy nhiên, chuỗi cung ứng dựa trên nông nghiệp này có thể tốn kém về
tài nguyên đất và nước. Nó cũng dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như sâu bệnh và
khí hậu.

Tầm quan trọng của BIA và chuỗi cung ứng dễ bị tổn thương đã thúc đẩy nghiên cứu về sinh
tổng hợp BIA trong thực vật. Những tiến bộ gần đây về công nghệ sinh học đã thiết lập nền
tảng dẫn đến việc xác định các enzyme thực vật và các phản ứng nối tầng mà chúng xúc tác,
cụ thể là các con đường sinh tổng hợp BIA.

< https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00055-0>

(S)-reticuline là một hợp chất quan trọng trong con đường sinh tổng hợp BIA, từ đó tạo ra
nhiều chất khác. Năm 2008, Minami và cộng sự đã xây dựng con đường sinh tổng hợp BIA
với một monoamine oxidase (MAO) từ M. luteus và bốn gen khác từ C. japonica. Kết quả có
thể sản xuất 55 mg/L reticuline từ dopamine. Với các nghiên cứu sau đó sản lượng ở vi khuẩn
như E. coli,đã đạt 46 mg/L vào năm 2011 (Nakagawa và cộng sự 2011) và 160 mg/L vào
năm 2018 (Matsumura và cộng sự 2018). Một số con đường cần có cytochrome P450
monooxygenase và một reductase tương ứng nhưng chúng không thể biểu hiện ở E. coli. Việc
sử dụng S. cerevisiae có thể giải quyết vấn đề này vì nó có thể biểu hiện một số
monooxygenase cytochrome P450 hoạt động. Bằng cách đưa một cytochrome P450
monooxygenase và một enzyme reductase tương ứng vào S. cerevisiae, nó có thể tạo ra
reticculine từ (R,S)-norlaudanosoline.

< https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0958166913006332>

Sử dụng chủng nấm men có mức độ sản xuất (S)-reticuline cao là điều cần thiết để sản xuất
các BIA xuôi dòng khác. Chủng nấm men đầu tiên để sản xuất (S)-reticuline đã được báo cáo
vào năm 2008 với sự tích hợp của 6OMT, CNMT và 4′OMT từ P. somniferum, trong đó
norlaudanosoline (NLDS) đã được sử dụng như chất nền. Việc tái thiết con đường tổng hợp
dopamine ngoại sinh trong nấm men đã vượt qua trở ngại của quá trình sản xuất (S)-reticuline
mới bắt đầu. Vào năm 2015, biểu hiện dị loại của thực vật TyrH hoặc động vật có vú TyrH
dẫn đến sản xuất 80,6 hoặc 19,2 μg/L de novo (S)-reticuline từ tyrosine. Tuy nhiên, sản lượng
vẫn chưa thể so sánh với sản lượng ở vi khuẩn như E. coli. Một bước đột phá lớn giúp tăng
cường đáng kể việc sản xuất (S)-reticuline trong nấm men đã đạt được vào năm 2020 khi sản
lượng (S)-reticuline trong nấm men đạt 4,6 g/L bằng cách giới thiệu một ortholog TryH mới
(CYP76AD5), điều chỉnh số lượng bản sao gen và xóa bảy enzyme oxyoreductase của vật
chủ có khả năng tiêu thụ cạnh tranh tiền chất 4-HPAA (Pyne và cộng sự 2020).

1.3.2. Sinh tổng hợp alkaloid morphinan

Trong số việc xây dựng các con đường tổng hợp BIA xuôi dòng, con đường phân nhánh
hướng tới các alkaloid morphinan là hấp dẫn nhất do giá trị ứng dụng dược phẩm cao của các
sản phẩm như morphine và codeine cũng như các opioid bán tổng hợp như oxycodone,
hydrocodone và hydromorphone. Trước khi xác định được enzyme để tổng hợp (R)-reticuline
từ (S)-reticuline, không thể thiết kế vật chủ tái tổ hợp để sản xuất các alkaloid morphinan
mới. Sử dụng (R)-norlaudanosoline làm cơ chất, (R)-reticuline được sản xuất thông qua
6OMT, CNMT và 4’-OMT với hiệu giá khoảng 150 mg/L, và từ đó salutaridin được sản xuất
lần đầu tiên với hiệu giá khoảng 20 mg/L (Hawkins và Smolke 2008). Đây là alkaloid
morphinan đầu tiên được sản xuất trong nấm men. Năm 2014, các alkaloid morphinan có giá
trị cao bao gồm codeine (7,7 mg/L), morphine (4,7 mg/L), hydrocodone (51 mg/L) và
oxycodone (70 mg/L) đã được sản xuất thành công từ thebaine trong nấm men (Bảng 1). )
(Thodey và cộng sự 2014).
Con đường tổng hợp thebaine từ (R)-reticuline sau đó được tái tạo lại trong nấm men, với
hiệu giá thebaine là 0,31 mg/L (Bảng 1) (Fossati và cộng sự 2015). Cuối cùng, với việc xác
định DRS-DRR xúc tác quá trình chuyển đổi từ (S)-reticuline thành (R)-reticuline, quá trình
tổng hợp de novo của các alkaloid morphinan đã đạt được vào năm 2015 với sản lượng là 6,4
μg/L thebaine và 0,3 μg /L hydrocodone (Galanie và cộng sự 2015).
Các chủng nấm men được biến đổi gen đã được tối ưu hóa hơn nữa dựa trên phát hiện mới về
cơ chế tổng hợp ở thực vật. Ví dụ, vào năm 2018, thebaine synthase (THS),mới được phát
hiện để xúc tác sự hình thành thebaine từ 7-(S)-salutaridinol 7-O-acetate đã được kết hợp
trong men biến đổi gen và tăng sản lượng thebaine lên gấp 24 lần so với với chủng dựa vào
phản ứng tự phát để hình thành thebaine (Chen và cộng sự 2018).
< https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00055-0>

1.3.3. Sinh tổng hợp berberin, noscapine và sanguinarine

Berberine, noscapine và sanguinarine là 3 BIA dược phẩm đại diện bên cạnh các alkaloid
morphinan. Năm 2008, dựa trên loại men sản xuất (S)-reticuline đầu tiên, canadine, tiền chất
quan trọng của berberine và noscapine, đã được sản xuất trong nấm men (Hawkins và
Smolke 2008). Chủng này được tối ưu hóa bằng sàng lọc biến thể enzyme và biến đổi số
lượng bản sao di truyền, dẫn đến hiệu giá canadine 1,8 mg/L và sản xuất berberine 6,5 μg/L
(Bảng 1) (Galanie và Smolke 2015).

Con đường tổng hợp Noscapine từ norlaudanosoline đã được tái tạo trong nấm men vào năm
2016 (Li và Smolke 2016) và được tối ưu hóa vào năm 2018 (Li et al. 2018). Chủng nấm men
chứa con đường tổng hợp de novo noscapine hoàn chỉnh đã đạt hiệu giá sản xuất noscapine là
2,2 mg/L (Li và cộng sự 2018). Hơn nữa, con đường tổng hợp sanguinarine đã được tái tạo và
thiết kế trong nấm men, tạo ra 80 μg/L sanguinarine (Trenchard và Smolke 2015).
< https://link.springer.com/article/10.1007/s42994-021-00055-0>