A.

Giới thiệu
1/Nói về nhựa
Trong nhiều thập kỷ, nhựa là sản phẩm có giá trị toàn cầu nhờ
tính tiện lợi và giá thành rẻ.Nhưng hầu hết các loại nhựa
không tự phân hủy. Khi nhựa thải ra môi trường, nó phân rã
thành những mảnh có kích thước nhỏ và tích tụ trong hàng
triệu năm.
B. Sâu ăn nhựa
1/ Lý do chọn
Rác thải vi nhựa là một mối nguy của môi trường và nghiêm
trọng hơn khi chúng trở thành một mắt xích của chuỗi thức
ăn. Sâu ăn nhựa có thể là giải pháp cho mối nguy này vì
chúng có kích thước nhỏ và có khả năng tiêu hóa nhựa.
Sâu ăn nhựa có thể mang lại lợi ích về môi trường và cả kinh
tế. (đang bổ sung)
2/ Nội dung (Yen)
3/ Nhược điểm
(đang bổ sung)

C. Chuyển

Các nghiên cứu phân tích tổng hợp chỉ ra rằng polyetylen
(PE), polypropylen (PP) và polystyrene (PS) là những loại
nhựa hiện diện phổ biến nhất trong hệ thống thủy sinh.
[HÌNH 1
https://www.researchgate.net/figure/Main-plastic-types-and-
their-applications-in-packaging_tbl1_337506127
]
Ví dụ, polyethylene terephthalate (PET) là một trong những
vật liệu phổ biến nhất để sản xuất chai dùng một lần do các
đặc tính có lợi của nó như khả năng chống va đập, độ trong
cao và trọng lượng nhẹ. Nhu cầu sử dụng nhựa ngày càng
tăng dẫn đến việc người tiêu dùng thải bỏ bừa bãi, gây ra tình
trạng tích tụ rác thải nhựa nghiêm trọng. Năm 2019, thị trường
PET toàn cầu đạt 39,8 tỷ USD.

Nhưng vấn đề là chỉ chất thải PET sạch không có thức ăn dư

thừa hoặc cặn bã mới có thể được xử lý bằng cơ học hoặc
hóa học, do đó tỷ lệ tái chế vẫn thấp. Năm 2021, tỷ lệ tái chế
PET sau của Hoa Kỳ tăng lên 28,6% ở Bắc Mỹ tăng lên
36,8% so với năm 2020. Hiện nay, hầu hết chất thải PET
không thể tái chế đều được đốt tạo ra một lượng lớn các chất
gây ô nhiễm không khí như CO2.

Vì vậy, các nhà khoa học đã nỗ lực rất nhiều để tìm ra

phương pháp xử lý sinh học rác thải nhựa. Cho đến nay, các
nhà khoa học đã xác minh được 27 enzyme có khả năng
phân hủy polyme tổng hợp hoặc oligome, và hầu hết các
enzyme này là lipase, cutinase và esterase. Hầu hết sự
phân hủy nhựa không chỉ xúc tác bởi một enzyme duy nhất
mà nhiều enzyme tham gia xúc tác nhiều con đường trao đổi
chất.
D. PETase
1/Nguồn gốc
Năm 2016, các nhà nghiên cứu đã phân lập được Ideonella
sakaiensis 201-F6[HÌNH 2] từ chất thải PET, có thể phân hủy
và sử dụng PET làm nguồn carbon duy nhất. Họ đã xác định
được hai loại enzyme mới từ I. sakaiensis 201-F6: PET
hydrolase (PETase) và mono(2-hydroxyethyl) terephthalic
acid hydrolase (MHETase), cả hai đều có hoạt tính phân hủy
PET. Các enzyme này thủy phân PET thành các monome
không độc hại (axit terephthalic (TPA), ethylene glycol
(EG)). [HÌNH 3]
Sau khi phát hiện ra PETase, nhiều nghiên cứu đã được thực
hiện để xác minh cấu trúc và tăng cường hoạt động của nó.
2/ Lý do không chọn vi khuẩn
Việc sản xuất PETase đã được nghiên cứu trong các hệ
thống vi khuẩn do vi khuẩn có: tốc độ tăng trưởng cao, chi phí
thấp, dễ thao tác, các công cụ di truyền được thiết lập tốt, v.v.
Tuy nhiên, vi khuẩn cũng có thể được coi là chất gây ô nhiễm
do nội độc tố hoặc cần nguồn carbon phong phú cho quá
trình sản xuất, sự phát triển. Hơn nữa, sự phát triển nhanh
chóng của vi khuẩn là một mối đe dọa khác nếu nó xâm nhập
vào môi trường.

E. Tảo
1/ Lý do chọn tảo thay vk và lý do chọn tảo C. Reinhardtii
Vi tảo phù hợp hơn nhiều cho các ứng dụng môi trường vì
chúng không cần nguồn carbon hữu cơ trong điều kiện quang
tự dưỡng và thường không có nội độc tố. Năm 2019, việc sản
xuất PETase bằng vi tảo biển Phaeodactylum tricornutum
đã được trình diễn thành công, hoạt động của enzyme được
chứng minh thông qua sắc ký lỏng và kính hiển vi điện tử. Tuy
nhiên, P. tricornutum cần nhiệt độ thấp, chất dinh dưỡng là
silic và độ mặn cao để phát triển. Nhìn chung P. tricornutum
sinh trưởng kém hơn so với các loài tảo xanh như
Chlamydomonas và Chlorella. Vi tảo nước ngọt
Chlamydomonas Reinhardtii là vi sinh vật đơn bào, quang
hợp. Vì C. Reinhardtii được coi là thường được công nhận là
an toàn (GRAS do FDA công nhận) nên nó phù hợp cho các
ứng dụng thân thiện với môi trường. Để tạo ra chất biến đổi
ổn định, hai chủng C. Reinhardtii đã được so sánh. Sau khi
biến nạp, sự biểu hiện của PETase được xác nhận bằng
phương pháp Western blot. Hoạt động của PETase được
chứng minh định lượng và định tính thông qua sắc ký lỏng
hiệu năng cao và kính hiển vi điện tử quét.

2/Thí nghiệm phân phân lập chủng có biểu hiện PETase

có hoạt tính cao
Chlamydomonas Reinhardtii CC-124 (mt− [137c]) là một
chủng vi khuẩn dại phổ biến trong phòng thí nghiệm, mang
đột biến nit1 và nit2 và thường được sử dụng để chuyển gen.
C. Reinhardtii CC-503 (cw92 mt+) là thể đột biến không có
vách tế bào của CC-125 được phát triển để biến nạp hiệu
quả. Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu kiểm tra hai
chủng này để biến nạp và biểu hiện gen PETase.

Bằng cách sử dụng plasmid pBR9_PETase_Cre, hai chủng

đã được biến nạp thông qua quá trình điện di. Họ dùng phản
ứng chuỗi polymerase (PCR), mồi là Cre_Sh-ble_PETase F
và R, để xác nhận sự tích hợp gen ở C. Reinhardtii.[HÌNH 4]

Để xác nhận biểu hiện của PETase, phân tích Western blot
được thực hiện với các dòng vô tính đã chọn. Đối với chất
biến đổi CC-124, tế bào được nuôi cấy trong 5 ngày và sau đó
được sử dụng để lấy mẫu protein. Tất cả năm dòng vô tính
đều biểu hiện PETase (Hình 3a). Bản sao số 1 và số 11 lần
lượt cho thấy mức biểu hiện thấp nhất và cao nhất.
Ngược lại, tất cả các chất biến đổi CC-503 đều cho thấy sự
tăng trưởng rất chậm và kém, do đó cần hơn 2 tuần nuôi cấy
để thu được lượng tế bào tối thiểu để lấy mẫu protein. Mẫu có
xuất hiện các dải mờ nhưng kích thước không chính xác. Các
thí nghiệm lặp đi lặp lại cho thấy kết quả hơi khác nhau nhưng
vẫn không có dải rõ ràng.
Từ thí nghiệm này, các nhà khoa học đã kết luận rằng CC-124
phù hợp hơn với biểu hiện PETase. Bản sao số 11 đã được
chọn làm chất biến đổi cuối cùng và được sử dụng cho phần
còn lại của thí nghiệm.

3/ Xét nghiệm hoạt tính xúc tác của PETase do chủng CC-
124 mẫu số 11 sản xuất
Để tìm hiểu xem PETase do CC-124_PETase #11 tạo ra có
thể hiện hoạt động chống lại chai PET thương mại hay không,
hai thí nghiệm đã được thiết kế và thực hiện [Hình 4a. Chú
thích: Hình a: Xét nghiệm hoạt tính xúc tác của PETase do
C. Reinhardtii sản xuất. Hình b-d Hồ sơ HPLC của các thí
nghiệm ủ bột PETase: 2 tuần (b), 3 tuần (c) và 4 tuần (d) sau
khi ủ. Các đường màu xanh lá cây và màu đỏ lần lượt biểu thị
loại hoang dã CC-124 và lysates CC-124_PETase #11]

Trong thí nghiệm đầu tiên, bột PET được điều chế bằng cách
cạo chai nước giải khát PET thương mại bằng giấy nhám.
Ống đối chứng chứa dịch ly giải tế bào của CC-124 hoang dã
và CC-124_PETase #11 được bổ sung một loại dịch ức chế
protease ở mức 4 mg/mL tổng lượng protein. Bột PET và dịch
ly giải tế bào được đựng trong các ống có nắp vặn 1,5 mL và
ủ ở 30°C trong 2 tuần.
Sau khi ủ, phần nổi phía trên của mỗi ống nghiệm được thu
thập và phân tích HPLC được thực hiện.
Sau 2 tuần, các dịch tế bào của CC-124 hoang dã và CC-
124_PETase #11 cho thấy không có đỉnh đơn phân nào như
MHET, BHET hoặc TPA (Hình 4b).
Sau 3 tuần, chỉ có dịch tế bào CC-124_PETase #11 cho thấy
đỉnh BHET, đây là dạng PET bị phân hủy (Hình 4c).
Sau 4 tuần, đỉnh TPA đã được quan sát thấy trong phân tích
HPLC của lysate CC-124_PETase #11 (Hình 4d).
Để phân tích định lượng, diện tích đỉnh của TPA đã được tính
toán. Kết quả là 9,12 mg TPA được tạo ra từ 30 mg bột PET,
tỷ lệ chuyển đổi là 35,17%.
Trong thí nghiệm thứ hai, cho màng PET 2 cm × 1 cm vào các
ống nghiệm và để ủ ở 30 °C trong khoảng từ 2-4 tuần. Sau khi
ủ, bề mặt của màng PET được phân tích bằng kính hiển vi
điện tử quét (SEM) để nghiên cứu hoạt động của PETase.
Sau 2 tuần, cấu trúc bề mặt màng PET không bị thay đổi,
điều này phù hợp với kết quả của thí nghiệm đầu tiên (hình
5b).
Sau 4 tuần, nhiều lỗ và vết lõm xuất hiện với dung dịch ly giải
tế bào CC-124_PETase #11 (hình 5c), trong khi đó dịch ly giải
tế bào chủng CC-124 hoang dã không ảnh hưởng đến cấu
trúc bề mặt của màng (hình 5a). Phần nổi phía trên của lysate
CC-124_PETase #11 tuần thứ 4, được ủ với màng PET, cũng
được phân tích bằng HPLC và quan sát thấy đỉnh TPA.[HÌNH
5]
4/ So sánh hoạt tính xúc tác của PETase ở C. Reinhardtii
và P. tricornutum
Trong nghiên cứu trước đây, PETase được sản xuất từ P.
tricornutum cho thấy một đỉnh PET bị phân hủy hoàn toàn
(TPA), sau 10 ngày nuôi cấy. Sự phân hủy nhanh hơn nhiều
so với các dẫn xuất C. Reinhardtii được sử dụng trong nghiên
cứu này, chỉ cho thấy những thay đổi về mặt hóa học và hình
thái sau 4 tuần.
Trong nghiên cứu P. tricornutum, PETase được tiết vào môi
trường nuôi cấy. Do đó, PETase sẽ không bị ảnh hưởng bởi
protease nội sinh hoặc các thành phần khác, trong khi đó
trong nghiên cứu này, PETase tiếp xúc với các yếu tố này do
quá trình ly giải tế bào. Mặc dù phản ứng chậm, các nhà khoa
học đã chứng minh rằng PETase có nguồn gốc từ C.
Reinhardtii xúc tác PET với tỷ lệ chuyển đổi cao khoảng 35%
là đủ để giải quyết tiềm năng.
Ngoài ra, sự biểu hiện nội bào của PETase ở C. Reinhardtii
có thể có lợi cho ứng dụng cụ thể. Ví dụ, PETase biểu hiện
trong các tế bào nguyên vẹn có thể được sử dụng để nuôi
động vật phù du hoặc cá nhằm kiểm soát nồng độ sinh học
của vi nhựa.
Ngoài ra, trong nghiên cứu P. tricornutum, một đột biến được
cải thiện hoạt động, R280A, đã được sử dụng, do đó sự phân
hủy PETase diễn ra nhanh hơn nhiều. Nếu đột biến R280A
được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo, nó sẽ hữu ích
trong việc tăng cường hoạt động xúc tác của PETase.
Nguồn:
https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.11
86/s12934-020-01355-8