ỨNG DỤNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT ĐỂ SẢN

XUẤT VINCA ALKALOID

I. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP:
1. Định nghĩa:

 Hợp chất thứ cấp là các chất không có chức năng trực tiếp trong các quá trình
đồng hóa, hô hấp, vận chuyển, tăng cường và phát triển thực vật. Chức năng chủ
yếu của các hợp chất thứ cấp là bảo vệ thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh và
động vật ăn cỏ. Nhiều chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mạnh được dùng làm chất
diệt côn trùng, nấm, dược chất.

2. Phân loại:

Hợp chất thứ cấp được phân làm ba nhóm chính ở thực vật: Các terpen, các hợp
chất phenolic và alkaloid.

- Nhóm terpene: Terpene, hoặc isoprenoid, là một trong những loại hợp chất
thứ cấp đa dạng nhất. Theo từ điển “Dictionary of Natural Products” đã liệt kê trên
30000 sản phẩm thuộc nhóm này, chủ yếu có nguồn gốc thực vật, bao gồm các
chất mùi vị, kháng sinh, hóc môn động thực vật, lipid màng, chất kháng côn trùng,
… Terpenoid là nhóm sản phẩm tự nhiên lớn nhất và đa dạng nhất, có cấu tạo từ
các phân tử tuyến tính đến đa phân tử và có kích thước từ 5- carbon hemiterpene
đến cao su tự nhiên, bao gồm hàng nghìn đơn vị isoprene. Tất cả các terpenoid
được tổng hợp thông qua việc ngưng tụ các đơn vị isoprene (C5) và được phân loại
theo số lượng năm đơn vị carbon có trong cấu trúc lõi. Nhiều tinh dầu thực vật,
như menthol, linalool, geraniol và caryophyllene được tạo thành bởi các
monoterpene (C10), với hai đơn vị isoprene, và sesquiterpene (C15), với ba đơn vị
isoprene. Các hợp chất khác, như diterpenes (C20), triterpenes (C30) và
tetraterpene (C40) cũng có đặc tính rất đặc biệt.
- Nhóm phenolic: Tất cả các chất thuộc nhóm phenol có đặc trưng là đều
chứa ít nhất một vòng thơm gắn với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl. Hơn 8000 cấu
trúc phenol đã được tìm thấy và chúng được phân bố rộng rãi ở các loài thực vật.
Chúng có cấu trúc từ đơn giản với một vòng thơm cho đến các polymer phức tạp
như tannin, lignin. Chúng có thể được phân loại dựa trên số lượng và sự bố trí của
các nguyên tử carbon và chúng được tìm thấy kết hợp với đường và các acid hữu
cơ. Nhóm phenol có thể được phân thành hai nhóm nhỏ hơn là: flavonoid và phi
flavonoid. Các hợp chất phenol từ thực vật là một trong những nhóm hợp chất thứ
cấp lớn nhất có ở rau quả, chè, ca cao, … Chúng có nhiều tính chất có lợi nên được
nghiên cứu nhiều trong các lĩnh vực hóa học, sinh học, nông nghiệp và y học.
Chúng được đặc trưng bởi các tính chất chống oxy hoá, chống viêm, chống lại các
chất gây ung thư và một số bệnh khác. Các chất phenol đơn giản là các chất diệt
khuẩn và gây mê.
- Nhóm alkaloid: Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitơ, có
thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid. Alkaloid có hoạt tính sinh lý
trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Ngoài carbon, hydro
và nitơ, nhóm này cũng có thể chứa oxy, lưu huỳnh và hiếm khi có các nguyên tố
khác như clo, brom và phospho. Alkaloid được tạo ra bởi rất nhiều sinh vật, như vi
khuẩn, nấm, động vật nhưng chủ yếu từ thực vật. Hầu hết trong số chúng là độc đối
với các sinh vật khác. Chúng có tác dụng dược lý đa dạng và được sử dụng làm
thuốc chữa bệnh từ rất lâu.

3. Ứng dụng:

Hợp chất có hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thực vật hiện đang được ứng
dụng rất nhiều trong công nghiệp như: hóa chất nông nghiệp, phụ gia thực phẩm,
dược phẩm (bảng 1). Các hợp chất này thuộc về một nhóm được gọi là hợp chất
thứ cấp:

1.Dược phẩm
a. Alkaloid (Giúp điều trị huyết áp Ajmalicine,atropine,berberine,
cao, điều trị thần kinh, đái tháo codeine,reserpine,vincristine,
đường, tiêu chảy…) vinblastine.
b. Steroid (Chống ung thư, chống Diosgenin.
viêm ...)
c. Cardenolide (Điều trị tĩnh mạch) Digitoxin, digoxin.
2. Phụ gia thực phẩm
a. Chất tạo vị ngọt Stevioside, thaumatin
b. Chất tạo vị đắng Quinine
c. Chất màu Crocin
3. Chất màu và tinh dầu
a. chất màu Shikonin, anthocyanin, betalin
b. tinh dầu Hoa hồng, hoa lài, oải hương
4. Hóa chất nông nghiệp và hóa chất
tinh chế
a. Hóa chất nông nghiệp Pyrethrin, salannin, azadirachtin
b. Hóa chất tinh chế Protease, vitamin, lipid, dầu
Bảng 1: Ứng dụng của hợp chất thứ cấp
II. GIỚI THIỆU VỀ VINCA ALKALOID:

1. Khái niệm về Vinca alkaloid:

Là một họ các hợp chất indole dạng dimer, bao gồm khoảng 130 hợp chất được
chiết xuất hoặc bán tổng hợp từ cây dừa cạn Catharanthus roseus

Đặc biệt, hai loại alkaloid là vincristine và vinblastine có hoạt tính chống ung
thư

Cơ chế hoạt động gây độc tế bào của chúng là là ức chế sự hình thành vi ống
bằng cách gắn với protein tubulin, làm ngừng chu trình tế bào ở giai đoạn nguyên
phân.

2. Lịch sử nghiên cứu:

Vào năm 1961, lần đầu tiên được phân lập từ cây dừa cạn

Tuy nhiên thu được nồng độ thấp chỉ khoảng 0,0005% (1 tấn lá dừa cạn thu
được khoảng 50g vincristine thô). Các nhà khoa học đã thử áp dụng công nghệ
nuôi cấy mô thực vật, nghiên cứu đầu tiên vào năm 1966 bơi Carew.

Phân tử vinblastine có nguồn gốc từ 2 loại alkaloid là catharanthine và

vindoline. Trong khi đó, hàm lựng vindoline trong cây dừa cạn nguyên vẹn là 0,2%
so với trọng lượng khô => cao hơn nhiều so với hàm lượng catharanthine và
vinblastine và chi phí chiết xuất rẻ hơn.

Năm 1988, Endo và cs. đã thiết lập được quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào
cây dừa cạn nhằm thu nhận các enzyme xúc tác sự kết hợp giữa vindoline và
catharanthine để tạo ra 3’, 4’ – anhydrovinblastine.

Năm 2008, Ramani và Jayabaskaran đã sử dụng tia UV – B để kích ứng sự gia

tăng hàm lượng catharanthine và vindoline trong giai đoạn nuôi cấy huyền phù tế
bào cây dừa cạn ở giai đoạn tăng trưởng cuối pha lũy thừa và pha ổn định => nuôi
cấy ở pha ổn định đáp ứng nhanh hơn với tia UV – B.

Hàm lượng catharanthine tăng gấp 3 lần, còn hàm lượng vindoline tăng gấp 12
lần khi được chiếu tia UV – B.

Năm 2018, Pliankong và cs. đã bổ sung chitosan vào môi trường nuôi cấy
huyền phù tế bào Catharanthus roseus để kích thích sinh tổng hợp Vincristine.
 Khi bổ sung chitosan có nồng độ 100 mg/l vào môi trường sẽ làm gia tăng hàm
lượng Vincristine ở mức 5,48 ug/mg so với trọng lượng khô tế bào. Khi không bổ
sung thì có hàm lượng là 2,49 ug/mg so với trọng lượng khô tế bào.

3. Ưu và nhược điểm:

Ưu điểm:

- Ngăn chặn sự nhân đôi của tế bào ung thư.

Nhược điểm:

- Tuy nhiên, nhược điểm của Vincristine là nó không chỉ ảnh hưởng đến quá
trình phân chia tế bào ung thư. Nó ảnh hưởng đến tất cả các loại tế bào đang
phân chia nhanh chóng, khiến nó cần thiết cho việc sử dụng thuốc rất cụ thể.
III. QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ TÁCH CHIẾT:

Hình 1: Quy trình nuôi cấy và tách chiết Vinca Alkaloid

 1. Thu nhận và xử lí mẫu:
Nuôi cấy mô sẹo và rễ được tạo ra từ các đoạn cuống lá của C. roseus
Hạt giống C. roseus được lấy từ nhà kính của công viên Tehran
Sử dụng lá của cây con sáu tuần tuổi, và các đoạn cuống lá (khoảng 2cm) được cắt
ra và sử dụng cho nuôi cấy mô.
Cuống lá được khử trùng bằng hypochlorite 5% trong 45 phút, rửa bằng nước cất
đã khử trùng.
2. Nuôi cấy mẫu:
Các đoạn mẫu đã được xử lí sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch MS, bổ
sung các nồng độ khác nhau của NAA và kinetin theo bảng sau:

Hình 2: Kết quả nuôi cấy mô sẹo và rễ của môi trường MS với nồng độ NAA và
Kinetin khác nhau
Các mẫu nuôi cấy sẽ được đặt trong một buồng tăng trưởng ở thời kì tối trong 2
tuần đầu và thời gian chiếu sáng 24h (huỳnh quang, ánh sáng trắng, 7 W/m2) cho
lần 2 trong 4 tuần ở nhiệt độ 35°C.
Sau 6 tuần, mô sẹo và rễ được hình thành. Rễ, mô sẹo và mô sẹo rễ của N.1 và
N.14 được cấy truyền trong môi trường MS N.1 và MS0, thời gian chiếu sáng
trong 24h, chúng phát triển và tạo ra mô sẹo và rễ mới.
Các mẫu được sử dụng để xét nghiệm alkaloid
3. Chiết xuất alkaloid:
Cho 3-5g mô sẹo, rễ đem đi nghiền, sau đó đồng nhất hóa trong 60-100ml
ethanol, 1 phút. Đặt trong phòng có nhiệt độ 60°C trong 10 phút.
Dung dịch sẽ được đem đi lọc. Sau khi lọc, chiết xuất ethanol của alkaloid sẽ được
quay cô bằng thiết bị bay hơi chân không ở 60°C và đưa đi phân lập.
Giai đoạn phân lập Alkaloid:
- Dùng acid sulfuric (5%) hòa tan phần bột trong bình gạn. Cho diethelic ether
vào. Tách pha và giữ lại pha acid.
- Trung hòa pha acid bằng NaOH 10N (pH=10). Sau đó cho 60-100ml
cloroform vào trong bình gạn. Một số chất ưa dung môi hữu cơ sẽ đi vào
Chloroform, số còn lại sẽ ở trong pha nước (acid sau khi trung hòa thành pha
nước).
 - Đưa pha Clorofomic đi cô đặc bằng thiết bị cô quay chân không ở 60°C.
Các chiết xuất alkaloid thu được sẽ hòa tan trong 1ml etanol.

IV. XÉT NGHIỆM TLC:

1. Cách tiến hành:
Một phần nhỏ trong 50µl alkaloid được bôi lên các bản sắc ký sắc ký lớp mỏng
(TLC). 
Hệ dung môi TLC thường được sử dụng là ethyacetate:ethanol (4:1) và bản TLC
được tạo thành bởi silica gel G60 (Merck).

Hình 3: Silica Gel 60 Merck/Silika Gel 60 GF254/Silica Gel TLC

Các alkaloid được xác định bằng cách sử dụng TLC và phản ứng màu với Ceric
Ammonium Sulfate (CAS) và phát hiện tia cực tím (UV) (= 254 và 366 nm). Tính
di động và đặc điểm của từng alkaloid được phân tích bằng TLC được so sánh với
các alkaloid tiêu chuẩn và được phát hiện bằng RF của chúng. phản ứng màu với
CAS và máy dò UV (λ = 254 và 366 nm). Các tiêu chuẩn là từ Fluka và 0,0025 mg
từ mỗi trong số sáu ancaloit tiêu chuẩn được hòa tan trong 1 ml etanol và được sử
dụng để xét nghiệm ancaloit
RF là một thuộc tính quan trọng của bất kỳ hợp chất nào, là giá trị RF (hệ số duy
trì) của nó. Nói một cách đơn giản, giá trị này là dấu hiệu cho biết hợp chất đã đi di
chuyển trên tấm TLC. 
 Hình 4: Tính toán giá trị R của hai điểm
Giá trị RF cao cho biết hợp chất đã di chuyển xa lên trên tấm và ít phân cực hơn,
trong khi giá trị RF thấp hơn cho biết hợp chất chưa di chuyển xa và có nhiều cực
hơn. Giá trị này được tính toán dễ dàng bằng cách đo khoảng cách mà điểm đã đi
lang thang và chia giá trị này cho khoảng cách mà dung môi đã di chuyển. 
Giá trị RF phụ thuộc vào cả hợp chất và dung môi được sử dụng để phát triển.
Nếu chúng ta phân tích hai hợp chất và chúng cho cùng RF giá trị với cùng một hệ
dung môi, hai hợp chất rất có thể giống hệt nhau.
2. Kết quả:
- Ajmalicine (RF= 0,95) có màu với λ =366nm và chất tẩy CAS có màu xanh
táo.
- Serpentine tartrate (RF= 0,1) có màu với λ =366, λ= 254 nm là màu xanh
lam và không có màu với chất tẩy CAS.
- Vinblastine (RF= 0,35) và vincristin (RF= 0,25) với λ =366 là không màu

Bảng 2: Phản ứng màu của các alkaloid với UV (λ = 366, = 254) và thuốc thử
ammonium sulfate ceric (CAS) 
V. XÉT NGHIỆM HPLC:

 
Hình 5: Sơ đồ dòng chảy HPLC

1. Cách tiến hành:

 Dịch chiết thô (10 mg/mL), từ nguồn lá C. roseus được hóa lỏng đến nồng
độ 1,5 mg/mL
 HPLC được thực hiện với hệ thống sắc ký Shimatzu LC-6A sử dụng dung
dịch rửa giải đẳng tốc được lập trình làm từ axetonitril và đệm amoni
cacbonat pH 7,3 (1:1) 
 Cột bảo vệ được cố định bằng cột C18 pha đảo ngược (Synergi 4u Polar -
RP80A Cột 250 x 4,6 mm 5um) duy trì ở 30˚C. 
 Pha di động bao gồm 3% (v/v) acetonitril 0,2% (v/v) axit orthophosphoric
(Dung môi A) và acetonitril tuyệt đối (Dung môi B)
2. Kết quả:
 Bảng 3: Thời gian lưu và nồng độ một số alkaloid chuẩn phân tích bằng HPLC.

Hình 6: Sắc kí đồ chiết xuất ankaloid của mẫu rễ mới N22

VI. KẾT QUẢ NUÔI CẤY MÔ SẸO:

Sau 6 tuần ủ, mô sẹo và rễ được hình thành bởi các đoạn cuống lá với sự hiện
diện 0,1, 5, 10 và 20 mg/l NAA bổ sung 0,1, 5, 10 và 20 mg/l Kin (Bảng 1)
 Hình 7: Kết quả nuôi cấy mô sẹo và rễ của môi trường MS với nồng độ NAA và
Kinetin khác nhau

Rễ mới được tái sinh trong môi trường chứa: a. 0,1 - 5 mg/l NAA với 0,1 mg/l
Kin (Hình 1a) và b. 5, 10, 20 mg/l NAA với 5 mg/l Kin (Hình 1b). Mô sẹo được
tạo ra ở tất cả các nghiệm thức nhưng ở 0,1 mg/l NAA với 0,1 mg/l Kin (N.1) là
thấp (15%).

Hình 8: Sự phát sinh cơ quan rễ từ cuống lá trên môi trường MS bổ sung NAA và
Kinetin.

Rễ, mô sẹo và mô sẹo rễ từ N.1 và N.14 được cấy truyền trong môi trường N.1
và MS0; chúng phát triển và tạo ra mô sẹo và rễ mới (N. 17 - 23 của Bảng 6 và
Hình 1c, d). Mô sẹo và rễ được tái sinh ở N. 18, 19, 20, 21 và 23 của môi trường 2
nhưng chỉ có mô sẹo ở N.17 và rễ ở N.18 của môi trường 2 được tạo ra.
 Bảng 4: Sự sinh trưởng và phát sinh của các cơ quan sau nuôi cấy lần 2

Hình 9: Sự phát sinh cơ quan rễ từ cuống lá trên môi trường MS bổ sung NAA và
Kinetin.

VII. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TLC VÀ HPLC

Bảng 5: Kết quả phân tích TLC: Phát hiện Alkaloid trong cơ quan mới hình thành
từ cuống lá

Kết quả TLC cho thấy dạng vindoline (vin), catharanthine (cat) và ajmalicine
(aic) của rễ và mô sẹo từ môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l NAA và 5, 10 và 20
mg/l Kin, là tương tự như mô hình cuống lá của cây nguyên vẹn (Bảng 4). Kết quả
từ mô sẹo (Ca), mô sẹo ra rễ (CaR), ra rễ cuống lá (PR) và rễ (R) của N.17-23
(Bảng 6) tương tự như kiểu cuống lá của cây nguyên vẹn.

Bảng 6: Kết quả phân tích HPLC: Lượng Alkaloid tương đối trong cơ quan mới
được hình thành từ cuống lá.

Phân tích kết quả HPLC cho thấy đặc tính của vindoline, catharanthine,
ajmalicine, vincristine (vcr) và serpentine (ser) của rễ mới của cuống lá trong 0,1
mg/l NAA tương tự như cuống lá nguyên vẹn của cây nhưng với mức độ thấp hơn
(Bảng 5).
 Bảng 7: Kết quả phân tích HPLC: Lượng Alkaloid tương đối trong cơ quan mới
được hình thành từ cuống lá sau 6 tuần.

Việc sản xuất vin và ajc từ PR, Ca, R và CaR thấp (0,44 đến 0,9%) so với sản
xuất ở cuống lá (1,8%). Mức độ vib (1,6%) và vcr (3,4%) của rễ (N.22) cao hơn so
với của cuống lá (0,085 và 0,54%) gấp khoảng 20 và 6 lần nhưng ở CaR (N. 23) rất
thấp (Bảng 7). Tuy năng suất vin thấp hơn nhưng cat lại cao, gấp 10 lần ở cuống lá.
Mức độ ser trong rễ và mô sẹo từ 1,31 đến 16,34%, cao hơn nhiều so với ở cuống
lá với 0,08%. Những kết quả này gợi ý rằng khả năng tổng hợp vib và vcr cũng
như đối với vin và cat có liên quan đến sự khác biệt về hình thái, ánh sáng và nhiệt
độ cao (35°C).

Trong nghiên cứu này, hàm lượng vin (0 - 0,9%) và ajc (0 -5,8%) ở các mẫu đều
thấp hơn ở cuống lá; vin = 1,81% và ajc = 7,32%. Hàm lượng ser (0,09-16,34%)
trong tất cả các mẫu lớn hơn nhiều so với cuống lá (0,08%). 

Lá C. roseus chứa các alkaloid kém chất lượng như vincristine và vinblastine ở
nồng độ từ 0,0004 đến 0,0003% trọng lượng khô (dw) được sử dụng trong điều trị
ung thư. Rễ và thân gốc rất giàu các alkaloid đơn phân như ajmalicine và
serpentine, 0,03 đến 0,1%, được sử dụng để giảm huyết áp cao.

VIII. KẾT LUẬN:

Để sản xuất các loại thuốc chống ung thư hữu ích này hiệu quả hơn, nhiều nhà
khoa học đã thử áp dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên, việc sản xuất
cả vinca alkaloid sử dụng mô sẹo hoặc tế bào nuôi cấy huyền phù của C. roseus
cho đến nay không hứa hẹn vì năng suất của các tế bào nuôi cấy được báo cáo cho
đến nay là rất thấp.

Các hợp chất thứ cấp từ thực vật thường được tạo ra với một lượng rất nhỏ,
nhưng lại có hoạt tính sinh học rất cao, đặc biệt quan trọng đối với con người do
được sử dụng trong các lĩnh vực thực phẩm và y học. Nhiều loại hợp chất thứ cấp
từ thực vật có tác dụng hiệu quả trong điều trị ung thư như vincristin, vinblastin,
taxol, … Tuy nhiên, các quá trình phân tách và tinh sạch hợp chất thứ cấp rất phức
tạp và tốn thời gian, đặc biệt khi hợp chất chỉ tồn tại một lượng rất nhỏ trong tế
bào. Chính vì vậy, việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu chủ động chứa các hợp chất có
hoạt tính sinh học cao, phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp để phục vụ
cho nhu cầu con người là vấn đề đang được các nhà khoa học quan tâm. Hiện nay,
phương pháp nuôi cấy tế bào đang được nghiên cứu rộng rãi để cải thiện tiềm năng
thu nhận các chất có hoạt tính sinh học ở nhiều loài thực vật trong điều kiện có
kiểm soát.

IX. TÀI LIỆU THAM KHẢO:

High in vitro production of ant-canceric indole alkaloids from periwinkle
(Catharanthus roseus) tissue culture | Request PDF (researchgate.net)
SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ
BÀO THỰC VẬT Phạm Thị Mỹ Trâm (1), Ngô Kế Sương (3), Lê Thị Thuỷ Tiên
(2).