Machine Translated by Google

So sánh Sinh hóa và Sinh lý Phần B 129 2001 853 Ž . 861

Phosphatase kiềm chịu nhiệt từ tôm phía Bắc ž /

Pandalus borealis : phân tích trình tự protein
và cDNA

Inge W. Nilsen, Kersti Øverbø, Ragnar L. Olsen1

Trung tâm Công nghệ Sinh học Biển, Viện Nghề cá và Nuôi trồng Thủy sản Na Uy, N-9291 Tromsø, Na Uy

Nhận ngày 28 tháng 12 năm 2000; nhận được ở dạng sửa đổi ngày 16 tháng 3 năm 2001; chấp nhận ngày 19 tháng 3 năm 2001

trừu tượng

Phân tích trình tự các đoạn ngắn do quá trình tiêu hóa trypsin của phosphatase kiềm tôm chịu nhiệt Ž
. SAP từ tôm phương Bắc Pandalus borealis đã hình thành cơ sở để khuếch đại cDNA mã hóa của nó. Trình tự protein dự đoán được công nhận
là có chứa mô-đun phosphatase kiềm đồng thuận bao gồm vị trí hoạt động của họ protein này. Các tìm kiếm tương đồng trình tự protein đã
xác định được một số phosphatase kiềm của sinh vật nhân chuẩn mà polypeptit SAP gồm 475 axit amin tiết lộ có chung 45% nhận dạng trình tự
axit amin. Dư lượng liên kết kim loại tiềm năng dường như được bảo tồn trong các protein này. Khối lượng phân tử 54-kDa được dự đoán của
SAP nhỏ hơn so với báo cáo trước đây, nhưng phù hợp với phân tích SDS-PAGE gần đây của chúng tôi về protein tự nhiên. So với các chất
tương đồng của nó, enzyme tôm có dư thừa axit amin tích điện âm, trong khi số lượng proline tương đối thấp hơn và tần suất tồn dư chất
thơm cao hơn so với các chất tương tự ưa nhiệt.
2001 Elsevier Science Inc. Bảo lưu mọi quyền.

. Chất đạm; Căn chỉnh trình tự

Từ khóa: Tôm; gan tụy; Phosphatase kiềm EC 3.1.3.1; chịu nhiệt; cADN;
Ž

1. Giới thiệu protein thường được liên kết với màng tế bào
chất bằng glycosyl-phosphatidylinositol Ž
Phosphatase kiềm ALPs Ž EC .Ž 3.1.3.1 là . . Axit amin được biến đổi GPI ở gần đầu cuối
phosphohydrolase orthophosphoric-monoester
carboxyl Low và Finean, 1977; Micanovic và
thường yêu cầu Zn2 và hoặc Mg2 cho hoạt
cộng sự, 1988 . Cấu
Ž . trúc ba chiều đầu tiên

động của enzyme, tối ưu ở pH cao Fernley, của ALP được tiết lộ từ Escherichia coli gần
1971; McComb và cộng sự, 1979 Ž
. Ở.sinh vật nhân thực, các
hai thập kỷ trước Wyckoff Žet al., 1983. và ,
chưa có cấu trúc tinh thể ALP nào từ sinh vật
Chữ viết tắt: ALP, phosphatase kiềm; GPI, glycosyl nhân thực được công bố. Mặc dù chỉ có một
phosphatidylinositol; RACE, sự khuếch đại nhanh chóng của phần homolo gous trong , ALP từ vi khuẩn
cDNA kết thúc; SAP, phosphatase kiềm chuỗi 25 Ž . 35% và động vật có vú được cho
của tôm Tác giả tương ứng. ĐT: 47-776-29000; fax: 47-
776-29100. cấu trúc tương tự Kim .và Wyckoff, 1990
là có Ž
Ž .
Địa chỉ email: ingewn@fiskforsk.norut.no IW Nilsen . và cơ chế hoạt động của chúng được hiểu
1 Địa chỉ hiện tại: Trường Cao đẳng Thủy sản Na Uy, Đại tương
Stec và đối
cộng rõ
sự, Ž
2000. . Có ý kiến cho rằng các
học Tromsø, Na Uy. phosphatase này thuộc về một siêu họ gồm

1096-495901$ - xem vấn đề chính 2001 Elsevier Science Inc. Bảo lưu mọi quyền.
PII: S 1 0 9 6 - 4 9 5 9 0 1 Ž . 00391-8
Machine Translated by Google

854 (
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853 ) 861

metalloenzymes, cũng bao gồm một số sulfatase và 2. Vật liệu và phương pháp
Ž
đột biến liên kết với phosphate Galperin và cộng
.
sự, 1998. Bất chấp tất cả những điểm tương đồng
của chúng, các protein ALP có các đặc tính hóa 2.1. phân tích protein
lý rất khác nhau và ở vi khuẩn, các biến thể gấp
10 lần ở kích
kDa thước
đã được
monome
tìm thấy
15 Ž.
Fitt
Ž và
160Peterkin,
1976; Goldman và cộng sự, 1990.. Phosphatase kiềm của tôm, được tinh chế
Ví dụ về chất nền ALP là DNA, RNA và ribo-, cũng đến độ đồng nhất rõ ràng như Olsen Ž đã mô
như các phate triphos deoxyribonucleoside. Trong , et al., 1991 được cung cấp bởi
tả trước đây.
ống nghiệm, ALP được khai thác trong các phản ứng, Ž
SAP. nhà sản xuất Biotec ASA Tromsø, Na Uy .
chẳng hạn như quá trình khử phospho của DNA thường Một dải protein duy nhất được phát hiện bằng cách
được biết đến, để ngăn chặn quá trình tự thắt sau nhuộm màu xanh coomassie hoặc bạc sau khi điện di
khi phân cắt endonuclease hạn chế của các vectơ Hệ thống gel 10% NuPAGE BisTris trong
NovexŽsử
.

nhân bản hoặc để khử phospho hóa các dNTP có trong
hỗn hợp phản ứng PCR trước các phản ứng giải trình
tự DNA.
Ruan .
et al., 1990 . Các ALP nhạy cảm với nhiệt
có thể bị bất hoạt khi ủ trong thời gian ngắn ở
nhiệt độ nếu không sẽ không gây hại cho các
thành phần có mặt Ž trong hỗn hợp phản ứng
. và Jendrisak, 1990 . Một số ALP có khả
Hoffman
năng chịu nhiệt độ khác nhau đã được phát hiện
hoặc thiết
Ž ´
kế từ động vật Whitmore và Goldberg,
Ž 1995 hoặc vi khuẩn
1972; Asgeirsson. và cộng sự,
Kobori và cộng sự, 1984; Shandilya và Chatterjee,
1995; de Prada và, Brenchley, 1997 . nhưng chỉ
có enzyme nhạy cảm với nhiệt từ một loại vi
khuẩn ở Nam Cực đã được công bố với trình .
tự
Rina et al., 2000 . Enzym thứ hai, trái ngược
với ALP của vi khuẩn nói chung, cho thấy các
hoạt động cụ thể gần như cao như các đối tác
động vật của nó. Sự vô hiệu hóa không thể đảo
. borealis Ž kiềm
ngược của enzyme SAP Pandalus
phosphatase của tôm phương Bắc đạt được bằng
cách xử lý nhiệt ngắn ở 65C. Khả năng tan chảy
của enzyme tôm tương đối vừa phải, và các
nghiên cứu về nhiệt độ so với hoạt động trong
Ž
SAP cho thấy sự thay đổi 10C về phía nhiệt độ
thấp hơn. so với enzyme bê Olsen và cộng sự,
1991. Mặc dù vậy, SAP khá ổn định trong quá
trình bảo quản hoặc trong điều kiện làm việc và
có hoạt.tính đặc hiệu cao thuận lợi Ž2000 Umg
protein . Theo hiểu biết của chúng tôi, không
có ấn phẩm nào trước đây về trình tự protein
hoặc DNA ALP chịu nhiệt từ sinh vật nhân chuẩn.
Sự mơ hồ của đầu cuối N Một
khôngsốđược
nỗ lực
côngsắp xếpdochuỗi SAP đã tiết lộ nhiều Ž .
bố và
đó những nỗ lực này đã thất bại. Để giải quyết vấn
đề này, SAP đã được cắt thành các đoạn peptit nhỏ
và các trình tự này được sử dụng để cô lập một cDNA
của SAP. Các tính năng trình tự và bối cảnh của
chúng được thảo luận dựa trên những phát hiện trước
đây về ALP.
dụng bộ đệm chạy 2-Ž. Axit N-morpholino
ethane sul fonic chứa 0,1% SDS và thời
lượng di chuyển SAP được so sánh với
Ž
Mark12TM . chất chuẩn protein Novex để xác
định trọng lượng phân tử.
Một phân tích về tổng thành phần axit amin đã
được chuẩn bị bằng cách hòa tan protein SAP đông
khô trong 6 M HCl. Huyền phù protein được thủy
phân ở 110C trong 24 giờ, sau đó làm bay hơi
HCl, trước khi các mẫu được tái tạo huyền phù
trong dung dịch đệm natri citrat 0,2 M, pH 2,2
và được đưa vào HPLC để xác định và phân hủy mol.
% axit amin trong sản phẩm thủy phân.
Protein SAP đông khô cũng được gửi đến dịch
vụ phân tích trình tự thương mại Innova-Ž.
, nơi protein được phân mảnh
gen, Thụy Điển
bằng trypsin và các mảnh được phân tách bằng
HPLC pha đảo ngược. Hơn 30 mảnh đã được tạo
ra và bốn trong số này đã được chọn để phân
tích thêm. Các phân tích trình tự qua trung
gian phép đo khối phổ của các đoạn được chọn
H23:18, H23:30, 5ReRP6:26 và 5ReRP6:17 lần
lượt tạo ra 12, 10, 8 và 5 axit amin. Các
trình tự axit amin này được dịch mã ngược bởi
các dự đoán codon tiêu chuẩn, và các
oligonucleotide thoái hóa của các trình tự
bổ sung ngăn và đảo ngược sau đó đã được
Eurogentec, Bỉ.. Ž
2.2. Tổng hợp cDNA của tôm
Tôm P. borealis mới thu thập được mổ xẻ và
các mô gan tụy riêng lẻ được bảo quản trong nitơ
lỏng cho đến khi sử dụng. mARN
Machine Translated by Google
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853
đã được phân lập từ một gan tụy duy nhất bởi .
Ž .
sử dụng PolyATract System 1000 Promega
MRNA riêng biệt được sử dụng để tổng hợp cDNA
chuỗi thứ nhất trước khi tổng hợp chuỗi thứ hai
và quá trình khuếch đại cDNA được thực hiện
theo hướng dẫn được đưa ra trong SmartTM PCR
cDNA
Ž . bộ luận án syn
Clontech và Advantage cDNA Ž .
Bộ kit PCR Clontech .
2.3. phân tích trình tự PCR và DNA
Một phần nhỏ của cDNA tổng hợp đã được sử dụng
làm khuôn mẫu trong PCR được xác định bởi sự kết
hợp theo cặp thuận
Ž và ngược hướng của các đoạn.
mồi oligonucleotide có nguồn gốc từ protein. Các
phản ứng khuếch đại, có thành phần hỗn hợp tiêu
chuẩn, được chạy trong 36 chu kỳ 94 Ž C, 10
51C, 10 giây; 72C, 1 phútgiây;
trong. máy điều nhiệt
gradient Eppendorf, và quá trình di chuyển điện di
trên gel agarose sau đó cho phép phát hiện các sản phẩm PCR.
Sự kết hợp mồi của 17F GCITAYTG- Ž .
GAAYAAR và 26R CKYTCICCICCCAT-
Ž DATIAC đã cho ra
. khuếch đại khác biệt.
một sản phẩm
Để xác nhận danh tính của sản phẩm PCR, nó được
giải trình tự bằng cách sử dụng bộ giải trình tự
chu kỳ đầu cuối được đánh dấu phóng xạ Thermo
. Amersham
Sequenase Ž ,cũng khai thác các đoạn mồi PCR để
cô lập.
Dựa trên trình tự DNA được tìm thấy trong sản
phẩm PCR, các đoạn mồi xuôi và ngược mới, cụ thể
để khuếch đại nhanh cDNA 5 và 3 kết thúc Ž
. Các phản ứng RACE được tổng hợp để đáp
ứng các yêu cầu được mô tả cho việc sử dụng
Ž cDNA Clontech .
MarathonTM . bộ khuếch đại xác định là xấp xỉ 65 kDa. Olsen và cộng sự,
Đoạn mồi chuyển tiếp đặc hiệu gen SAP MalpF ATT- Ž 1991.. Các tờ sản phẩm sau này từ nhà phân phối
. mồi AP1
TCGTGGGAAGAATTCGACTTTGC kết hợp với đoạn
của bộ công cụ, có nhận dạng thứ tự đối với bộ
chuyển đổi Marathon dây chằng, đã xác định một
đoạn 3-RACE khuếch đại đơn.
Phân tích giải trình tự DNA đã xác nhận rằng các
sản phẩm RACE trùng lặp với trình tự sản phẩm
PCR phân đoạn bên trong.
Không thường xuyên, một đoạn 5-RACE 0,5 kb được khuếch
đại bằng cách sử dụng đoạn mồi AP1 và đoạn mồi antisense .
MalpR GATCTGCCAGCCTCCTGGAACCA
Ž .
Trình tự DNA đã phát hiện nhiều tín hiệu cho gần
như toàn bộ vị trí trình tự. Các phản ứng 3-RACE
mới sử dụng mồi thay thế dành riêng cho gen cũng
cho kết quả âm tính tương tự. Nhân bản phụ các
ứng cử viên sản phẩm 5-RACE trong một vectơ trước
(
) 861 855
giải trình tự cho thấy một số kết quả dương tính giả, nhưng không
có trình tự nào liên quan đến SAP.
Một PCR cuối cùng đã được thực hiện bằng cách sử dụng mồi SapF
Ž. AARGCNTAYTGGAAYAARGAT và SapR Ž
. GAAGGTAATCATCTACATCTCA và Ž, .
Pfu polymerase độ chính xác cao Stratagene để
khuếch đại cDNA của SAP 40 chu kỳ 94 C, 10 giây;
55C, 15 giây; 72C, 3 phút . . Sản phẩm PCR 1,5-kb
thu được đã được phân tích để xác nhận trình tự
thu được.
2.4. phân tích máy tính
Các phân tích trình tự DNA và sản phẩm dịch mã
được thực hiện chủ yếu bởi các chương trình trong
Nhóm Máy tính Di truyền Gói Wisconsin Phiên bản 10.0,
Madison, WI, Hoa Kỳ. Các tương đồngŽ trình
. tự SAP đã
được FASTA Ž .Ž Pearson, 1990 hoặc BLAST Altschul
et al., và .Ž tìm kiếm trong các cơ sở dữ liệu có
BLAST.,1997
sẵn trong
CLUSTAL
các cơ
W Thompson
sở dữ liệu
và có
cộng
sẵn,
sự,1990
1994hoặc
đã
hướng dẫn sắp xếp các chuỗi protein tương đồng, tất
cả các chương trình được lưu trữ bởi máy chủ
Internet EBI trạm ngoài EMBL. Việc trình bày các
sắp xếp theo trình tự nhiều tiple đã được chuẩn bị
bằng cách
Chương trình GeneDoc Nicholas và sử dụng
cộng sự, Ž . .
1997
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân tích protein và cDNA
SAP chịu nhiệt từ gan tụy của tôm phương Bắc
trước đây đã được chứng minh là một enzyme
dimeric với các tiểu đơn vị hoạt động xúc tác,
và khối lượng phân tử của mỗi tiểu đơn vị được
thương mại Hoa Kỳ Biochemicals USB Ž . hoạt
động với Mr là 59 kDa. Khi SAP tinh khiết được
đưa vào hệ thống điện di SDS-PAGE có độ phân
giải có lẽ cao hơn so với ban đầu được sử dụng,
chúng tôi thấy rằng SAP di chuyển dưới dạng Ž .
đồng nhất 5455 kDa Hình 1a Protein protein .
rõ ràng tinh
khiết này đã chịu tổng số Ž . phân tích axit
trypsin, và các phân tích
Hình 1b và phân táchamin
trình tự axit amin tiếp theo. của bốn đoạn được
Ž đồng trong các
chọn Hình 1c . Tìm kiếm tương
chuỗi protein đã công bố hoặc có khả năng mã hóa
DNA bị giới hạn bởi các đoạn SAP ngắn có sẵn cho
các chuỗi truy vấn và các tương đồng protein
quan trọng không được xác định.
Machine Translated by Google

856 (
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853 ) 861

Hình 1. Phân tích protein phosphatase kiềm của tôm. một SDS-PAGE để xác định khối lượng phân tử của kiềm tôm tinh khiết Ž.
Ž và 1 g trong
phosphatase 0,2 coomassie.
làn 2 Ž
và .3,Žtương
. b Tóm
ứngtắt
bằng
hàm
Ž . . cách
lượng
so tương
sánh với
đốiprotein
của cáckích
axitthước
amin tiêu
trongchuẩn
protein
làn tinh
1 saukhiết
khi nhuộm
được thủy
phân và
HPLC bằng
sau
axit.
đó được
c Bốn
MSđoạn
phânpeptide
tích trình
đượctự.
tạo ra bằng cách phân tách trypsin của protein, RP-
sau đó các peptide được phân lập bằng

Các trình tự DNA được tạo ra bằng cách với tổng thành phần axit amin của protein tự
dịch mã ngược của bốn peptide được phân tích nhiên, xem Hình Ž
1b. Bốn đoạn peptit từ protein
và các đoạn mồi PCR đặc hiệu cho gen bị thoái tinh khiết được nhận dạng trong trình tự protein
hóa đã được tổng hợp tương ứng. Quá trình SAP dự đoán và dư lượng 8088 Ž
khuếch đại PCR rất nhạy cảm với nhiệt độ ủ và . VTDSAASAT bao gồm một mẫu
chỉ có một bộ mồi 17F. Ž
26R mang lại một sản phẩm trình tự tương ứng với sự đồng thuận của một
khuếch đại khác biệt. Kích thước của sản phẩm này vị trí hoạt động của phosphatase kiềm PROSITE Ž
, và giải trình tự
gần 600 bp khôngŽđược hiển thị. PS00123 .
. Kết quả tìm kiếm sự giống nhau về
DNA cho thấy một khung đọc mở của một polypeptide trình tự trong cơ sở dữ liệu protein đã
có điểm tương đồng với các phosphatase kiềm đã biết. chứng minh rõ ràng rằng SAP là một thành viên
Phản ứng 3-RACE được thực hiện bằng cách sử dụng của họ ALP eukaryote. Ba mô gan không đặc
trình tự mồi giống với vùng chứa trong sản phẩm hiệu Ž . phosphatase kiềm xươngthận từ người
PCR 600-bp và sản phẩm khuếch đại 1,4-kb chứa Ž .Ž Weiss et al.,,1986
chuột Terao và Mintz,
một khung đọc dài, mở, một codon dừng trong khung 1987 và
hiệu và .Ž
chocộng
gà
mô.Crawford
từ
sự,
Ž tơ
.1991
một
tằm.
et
chia
phosphatase
al.,
bướm
sẻ1995
đêm
sự tương
Itoh ,
ruột đặc
đồng
và đuôi polyA. đáng
kể với bản sắc 45% protein SAP và . 60% tương
PCR cuối cùng với mồi từ các đầu cDNA đã cho sản
tự, nhưŽ được hiển thị bởi nhiều se- . căn
phẩm 1,5 kb, được phân tích và . được tìm thấy để Ž đồng thấp hơn
chỉnh hàng rào Hình 3 . Tương
Ž có
xác nhận các trình tự tiếp giáp Hình 2 Không .
một chút so với nhiều ALP khác đã được phát
cấu trúc tương đồng DNA nào được phát hiện trong Ž
hiện.
các ngân hàng dữ liệu có sẵn. Các vấn đề cụ thể
liên quan đến việc thiếu dữ liệu trình tự 5 cDNA
Cấu trúc tinh thể của phosphatase kiềm từ
bổ sung được mô tả trong Phần 2. Có thể, điều này Escherichia coli đã được sử dụng để mô hình hóa
có thể phản ánh tình trạng 5 không đồng nhất tương lõi của cấu trúc ba chiều của phosphatase ở động
tự như các vấn đề đã gặp phải trước đây với đầu N
vật có vú bằng 'bằng chứng tình huống đáng kể',
của protein SAP. Số lượng axit amin có khả năng bị
và dư lượng axit amin giả định liên quan đến vị
thiếu trong dữ liệu của chúng tôi sẽ được thảo luận bên dưới.
trí hoạt động và liên kết kim loại đã được xác
định Ž .
Kim và Wyckoff, 1990 . Phép ngoại suy dữ liệu từ
3.2. Trình tự protein được suy ra, các vị trí liên kết cơ chất

và kim loại, và các chất tương đồng protein

Khung đọc mở của cDNA mã hóa một polypeptide
gồm 475 axit amin Hình 2 với khốiŽ lượng.phân
tử lý thuyết là 53 kDa. Trình tự protein được
tạo ra phần lớn phù hợp với
E. coli đã đề xuất ba vị trí gắn kết của . các
ion kim loại hóa trịŽhai hai kẽm và một magiê
trong ALP của con người, và một serine hoạt động
như một chất ưa nhân trong khoang tương tác cơ
chất Kim Ž và Wyckoff, 1990; Holtz và Kantrowitz, 1999..
Các axit amin này cho túi chất nền
Machine Translated by Google

(
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853 ) 861 857

Hình 2. cDNA và trình tự protein suy ra của phosphatase kiềm chịu nhiệt từ Pandalus borealis. Trình tự nucleotide của cDNA
được khuếch đại và sản phẩm 475 axit amin được mã hóa được hiển thị. Các axit amin tương ứng với các peptide được giải trình
tự của protein tự nhiên được gạch dưới. Mã kết thúc được đánh dấu bằng dấu hoa thị và đuôi polyAđược chỉ định A Ž .n . Năm vị
Ž
trí nucleotide trong .
chữ thường 5 trình tự bị sai lệch bởi đoạn mồi PCR thoái hóa được sử dụng để khuếch đại và giải trình tự,
trí là Ž . do đó không được chỉ định. Chữ thườngvàphần
các dư
vị lysine ở đầu N có thể là arginine. Trình tự cDNA của P. borealis
phosphatase kiềm được gửi tới Ngân hàng gen đã nhận được số gia nhập AJ296089.

nhóm phốt phát và để liên kết các kim loại là . được bảo
toàn hoàn toàn trong SAP và các tương đồng của nóŽHình
3 . hoạt
Hai phần còn lại của trang web đang Ž động
aspartate-153 và . lysine-328 đã được xác định trong
enzyme E. coli và chúng được thay thế bằng histidine trong
Ž enzyme động vật có vú Holtz và Kantrowitz,
1999.. Enzym tôm cũng chứa histidine ở các
vị trí tương ứng 146 và 313.
Vị trí thứ ba do arginine chiếm giữ được bảo tồn
ở tất cả các vị trí enzyme 166 và 159 ở E. coli
Ž
Machine Translated by Google

858 (
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853 ) 861

Hình 3. Sắp xếp trình tự của phosphatase kiềm của tôm và các protein tương đồng. Các protein có tính tương đồng cao với SAP đã được
. vị trí liên kết
xác định bằng BLAST và các trình tự được căn chỉnh bằng CLUSTAL W. Các axit amin giống hệt nhau có màu xám Žvà các
Ž nổi bật. Mô-đun.vị trí hoạt động của phosphatase kiềm PROSITE PS00123 bao gồm nucleophile serine
kim loại được đề xuất có nền đen
được chỉ định bên dưới hình thức của nó và trình tự tín hiệu dự đoán trong các tương đồng SAP được chỉ định. Các ALP tương đồng là
Ž
mô không đặc hiệu từ việc gia nhập chuột không. P09242 . Ž. Ž , congà
con người
Q92058 . và,thể
P05186 mô cụ
từ con tằm Ž . ruột P29523 .
,

. và P. borealis tương ứng , và được phát hiện là có vai Bốn tương đồng được căn chỉnh của SAP đã được chỉ
trò quan trọng đối với liên kết cơ chất phốt phát trong định riêng lẻ là liên kết màng. Tuy nhiên, các kiểm tra
Ž .
E. coli ALP Chaidaroglou và cộng sự, 1988 . dự đoán đã không chỉ ra một mem-
Machine Translated by Google
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853
Brane GPI-anchor trong SAP. Sự liên kết cho thấy
rằng đầu C của SAP kết thúc 2530 axit amin sớm
hơn các ALP khác. Điều này có thể chỉ ra rằng
dự đoán neo GPI tiêu cực là chính xác và SAP
không bị ràng buộc bởi màng. Ngoài ra, nhiều
công cụ dự đoán khác nhau đã thất bại trong việc
xác định các vùng xuyên màng trong protein tôm.
Kích thước được tính toán theo lý thuyết của SAP
có nguồn gốc từ cDNA gần với khối lượng protein
tự nhiên 55-kDa được xác định bởi SDS-PAGE. Sự
khác biệt nhỏ có thể gợi ý rằng 510 axit amin bị
thiếu trong trình tự protein của chúng ta và từ
sự liên kết trong Hình 3, có vẻ như các ALP có
phần mở rộng của 79 gốc đầu N, ngoài peptide tín
hiệu của chúng, so với SAP se quen thuộc. Do đó,
có khả năng là dạng trưởng thành tự nhiên của
enzyme tôm chứa khoảng 482 axit amin, phù hợp
với khối lượng phân tử được xác định bằng phân
tích SDS-PAGE.
3.3. Thích ứng lạnh, điện tích phủ định và tính linh hoạt
của cấu trúc
Một tính năng thú vị của SAP là điện tích
âm cao so với các tương đồng. Điều này là do
dư lượng axit dư thừa đáng kể Ž17,2% Asp và
Glu trong SAP và 10,812,6% trong các ALP
khác . trong khi ,mức dư lượng tích điện dương
tương tự như các ALP khác Ž9,5% Lys và Arg
trong SAP và 9.510,6% trong các chất tương
. quả là pI là 4,5 trong SAP, trong
đồng . Kết
khi giá trị pI tương đồng nằm trong khoảng
từ 6,2 đến 7,0. PhoA nhạy cảm với nhiệt độ
cao từ Ž vi khuẩn ưa lạnh TAB5 Rina et al.,
2000 .chứa lần lượt 10,7 và 9% axit amin tích
điện âm và dương, cho pI dự đoán là 5,5, cao
hơn đáng kể so với pI của loại ít hơn. SAP
nhạy cảm với nhiệt độ.
Do đó, sự xuất hiện thường xuyên của dư lượng axit
không nên giải thích cho khả năng thích ứng lạnh
vừa phải của SAP. Tuy nhiên, chúng tôi muốn đề cập
đến báo cáo gần đây của chúng tôi về một loại
protein giống như lysozyme kháng khuẩn và hoạt
tính lạnh Ž .
từ sò điệp Iceland Nilsen và cộng sự,
1999. Protein được phát hiện có pI thấp hơn đáng
kể so với cấu trúc tương đồng chính của nó ở động
vật không xương sống ở biển cũng như trên cạn,
trong trường hợp cụ thể đó cũng là do tỷ lệ Asp
và Glam cao hơn mà không làm giảm số lượng Lys và
Arg. Mặc dù là những ví dụ riêng lẻ, có thể là
vì chịu
tình cờ, nhưng hai ví dụ này về các enzym hoạt động lạnh hoặc sự giúp đỡ của họ trong việc xem xét bản thảo.
nhiệt
(
) 861 859
ở các sinh vật thích nghi với lạnh có thể gợi ý các đặc
.
Ž vật không xương sống biển cận Bắc Cực.
điểm tiến hóa ở động
Thật không may, thông tin trình tự có sẵn từ
các cơ quan như vậy rất hạn chế.
Các enzyme thích nghi với lạnh thường được chấp
Ž trúc Gerday et
nhận để yêu cầu tính linh hoạt của cấu
, . và quan điểm này được hỗ trợ bởi các
al.,
nghiên cứu về cấu trúc tinh thể năm 1997 trên syn
Žthase citrate ưa khí từ một loại vi khuẩn ở Nam Cực,
Russell Cấu trúc. 1998
et al., protein
. cố định cục bộ thường
là kết quả của axit amin cứng proline, được
phát hiện là ít phong phú hơn trong
psycrophilic so với Ž
enzyme mesophilic Chessa
, George- . lette et al.,
và cộng sự, 1999;
và SAP luôn có Ž thấp. tỷ 2000
lệ dư lượng Pro
. 4,8%
2,7% so với protein tương đồng 3,8. Ž
Thậm chí
thấp
hơn Ž . mức độ Pro 2,0% đã được tìm thấy trong
phoA của vi khuẩn ưa lạnh TAB5. Các trình tự được
căn chỉnh trong Hình 3 và sự căn chỉnh trước đó
của Ž trình tự ALP của vi khuẩn và nấm men Rina
. 2000 cho thấy rằng một số thay thế Pro
et al.,
trong SAP không phải là duy nhất đối với protein tôm.
Tuy nhiên, SAP được phân biệt với các ALP khác
do không có Pro trong trình tự cho đến vị trí
149. Cuối cùng, lượng tương đối của dư lượng
thơm trong SAP cao hơn gần 40% so với Ž trong
các protein của sinh vật nhân chuẩn so với lượng
tự do tương đối. độ mịn lần lượt là 9,4 và 7%
và về mặt này, SAP giống với TAB5 phoA.
Việc thiếu dữ liệu cấu trúc trực tiếp từ các ALP
sinh vật nhân chuẩn làm cho các dự đoán về cấu trúc
của chúng có tính chất thăm dò hợp lý. Thậm chí
nhiều sự không chắc chắn hơn được thêm vào khi một
nỗ lực được thực hiện để giải thích các biến thể
ổn định nhiệt bằng sự khác biệt về cấu trúc 3-D.
Việc xác định cấu trúc tinh thể của SAP bởi một
nhóm hợp tác hiện đang tiến đến giai đoạn hoàn thiện
cuối cùng. Điều này chắc chắn sẽ cung cấp nhiều
thông tin có giá trị về enzyme tôm chịu nhiệt. Những
nỗ lực để tạo ra SAP tái tổ hợp đã được bắt đầu và
các mối quan hệ chức năng cấu trúc hy vọng có thể
được nghiên cứu trong tương lai gần.
Sự nhìn nhận
Công trình này được tài trợ bởi The Regional
Au thority of Northern Norway. Để đánh giá cao,
.
chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ Sean McSweeney ESRF,
Grenoble, Pháp và Tiến sĩ Egil Olsen Viện Nghề
Ž Ž
cá & Nuôi trồng Thủy sản Na Uy, Tromsø, Na Uy.
Machine Translated by Google

860 (
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853 ) 861

Người giới thiệu phản ứng phosphatase kiềm: hiểu biết sâu sắc về NMR, tinh thể

học và đột biến đặc hiệu tại chỗ.

Thư tháng 2. 462, 711.
Altschu, SF, Madde, TL, Schaffe, AA, và cộng sự, 1997.
Itoh, M., Takeda, S., Yamamoto, H., Izumu, S., Tomino, S.,
Gapped BLAST và PSI-BLAST: một thế hệ chương trình tìm kiếm
Eguchi, M., 1991. Nhân bản và phân tích trình tự của cDNA
cơ sở dữ liệu protein mới. Axit nucleic Res. 25, 33893402.
phosphatase kiềm gắn màng của tằm, Bombyx mori . sinh học. lý

´
Asgeirsso, B., Hartemin, R., Chlebowski, JF, 1995.
sinh học. Đạo luật 1129, 135138.

Phosphatase kiềm từ cá tuyết Đại Tây Dương ŽGadus morhua..

Kim, EE, Wyckoff, HW, 1990. Cấu trúc của phosphatase kiềm. lâm
Các đặc tính cấu trúc và động học cho thấy khả năng thích
sàng. Chim. Acta186, 175188.
ứng với nhiệt độ thấp. Hợp phần
hóa sinh. Phys.110B, 315329. Kobori, H., Sullivan, CW, Shizuya, H., 1984. Phosphatase kiềm

Chaidaroglou, A., Brezinski, DJ, Middleto, SA, Kantrowitz, ER, nhiệt-la mật từ vi khuẩn Nam Cực: ghi nhãn nhanh 5 đầu của

1988. Chức năng của arginine-166 trong vị trí hoạt động của axit nucleic. Proc. tự nhiên.

phos phatase kiềm Escherichia coli . Hóa sinh 27, 83388343. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 81, 66916695.

Low, MG, Finean, JB, 1977. Giải phóng phosphatase kiềm từ màng
Chessa, JP, Feller, G., Gerday, C., 1999. Tinh chế và mô tả đặc bởi phospholipase đặc hiệu phosphatidyl-in ositol. hóa sinh.
tính của alpha-amylase không bền với nhiệt do vi khuẩn ưa J. 167, 281284.
lạnh TAC 240B tiết ra.
Có thể. J. Vi sinh vật. 45, 452457.
McComb, RB, Bowers Jr, GN, Posen, S., 1979. Phosphatase dòng
Crawford, K., Weissig, H., Binette, F., Milian, JL, Goetnick,
kiềm. Nhà xuất bản toàn thể, New York.
PF, 1995. Phosphatase kiềm không đặc hiệu của mô tham gia vào
Micanovic, RB, Bowers Jr, GN, Posen, S., 1979.
quá trình hình thành và phát triển mầm lông trong môi trường
Axit aspartic-484 của phosphatase kiềm nhau thai mới sinh
nuôi cấy phôi gà trên da. nhà phát triển Dyn. 204, 4856.
ngưng tụ với phosphatidylinositol glycan để trở thành đầu

cuối carboxyl của enzym trưởng thành. Proc. tự nhiên. học

de Prada, P., Brenchley, JE, 1997. Tinh chế và mô tả đặc tính
viện. Khoa học. Hoa Kỳ 85, 13981402.
của hai phatase kiềm ngoại bào từ một chủng Arthrobacter ưa
khí .
Nicholas, KB, Nicholas Jr, HB, Deerfield II, DW, 1997. GeneDoc:
ứng dụng môi trường. vi sinh vật. 63, 29282931.
phân tích và trực quan hóa biến thể di truyền. EMBnet. TIN
Fernley, HN, 1971. Phosphatase kiềm của động vật có vú.
TỨC 4, 14.
Trong: Boyer, PD Ed.
Ž . , Các Enzyme, tập. IV, tái bản lần thứ 3.

Nhà xuất bản Học thuật, New York, trang 417447. Nilsen, IW, Oøveroø, K., Sandsdalen, E., Sandaker, E., Sletten,

Fitt, PS, Peterkin, PI, 1976. Phân lập và tính chất của một K., Myrnes, B., 1999. Tinh sạch protein và phân lập gen của

phosphatase dòng kiềm vi khuẩn kích thích mangan-ion nhỏ. chlamysin, một loại enzyme hoạt động lạnh giống như lysozyme

hóa sinh. J. 157, 161167. có hoạt tính kháng khuẩn .

Galperin, MY, Bairoch, A., Koonin, E., 1988. Một họ siêu enzym Thư tháng 2. 464, 153158.

kim loại hợp nhất phosphoentomu tase và mu tase Olsen, RL, Oøverboø, K., Myrnes, B., 1991. Phosphatase kiềm từ
phosphoglycerate độc lập với cofactor với phosphatase và gan tụy của tôm Ž
sulfatase kiềm. Prot.
.
Pandalus borealis : một enzyme dimeric với xúc tác được gọi
Khoa học. 7, 18291835.
là tiểu đơn vị hoạt động. Hợp phần hóa sinh. vật lý. 99B,

¨ ZO, Van Petegern, F., và cộng sự, 2000.

Georlette, D., Jonsson, 755761.
Một DNA ligase từ Pseudoal teromonas haloplanktis ưa khí
Pearson, WR, 1990. So sánh trình tự nhanh và nhạy với FASTP và
mang lại hiểu biết sâu sắc về sự thích nghi của protein với
FASTA. Phương pháp Enzyme mol. 183, 6398.
nhiệt độ thấp. Ơ. J. Hóa sinh. 267, 35023512.

Rina, M., Pozidis, C., Mavromatis, K., Tzanodaskalaki, M.,

Gerday, C., Attaleb, M., Arpigny, JL, và cộng sự, 1997.
Kokkinidis, M., Bouriotis, V., 2000. Phosphatase kiềm từ
Enzyme tâm thần: một thách thức nhiệt động lực học.
chủng TAB5 ở Nam Cực; cấu trúc và thích nghi psycrophilic.
sinh học. lý sinh học. Đạo luật1342, 119131.
Ơ. J. Hóa sinh. 267, 12301238.
Goldman, S., Hecht, K., Eisenberg, H., Mevarech, M., 1990.
Phosphatase dòng kiềm cảm ứng phụ thuộc Ca2 ngoại bào từ vi
Ruan, CC, Samols, SB, Fuller, CW, 1990. Nhận xét 17, Số 2 .
khuẩn cổ Haloarcula marismortu cực kỳ ưa mặn. J. Bacte riol.
172, 70657070. . Công ty Hóa sinh Hoa Kỳ. Cleveland, OH.

Hoffman, LM, Jendrisak, J., 1990. Phos phatase không bền với Russell, RJ, Gerike, U. Danson, MJ, Hough, DW, Taylor, GL, 1998.

nhiệt giúp đơn giản hóa việc chuẩn bị DNA vector khử phospho. Sự thích nghi về mặt cấu trúc của enzym tổng hợp citrate hoạt
Gen 88, 9799. tính lạnh từ một loại vi khuẩn ở Nam Cực. Cấu trúc 6, 351361.
Holtz, KM, Kantrowitz, ER, 1999. Cơ chế của
Machine Translated by Google
IW Nilsen et al.So sánh Sinh hóa và Sinh lý học Phần B 129 2001 853
Shandilya, H., Chatterjee, DK, 1995. Một phosphatase kiềm
nhạy cảm với nhiệt độ đã được thiết kế cho DNA phoryl hóa
dephos. Tập trung 17, 9395.
Stec, B., Holtz, KM, Kantrowitz, ER, 2000. Một cơ chế sửa
đổi cho phản ứng phosphatase kiềm liên quan đến ba ion kim
loại. J. Mol. sinh học. 299, 13031311.
Terao, M., Mintz, B., 1987. Nhân bản vô tính và xác định đặc
điểm của cDNA mã hóa cho phosphatase kiềm nhau thai của
chuột. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 84,
70517055.
Thompson, JD, Higgins, DG, Gibson, TJ, 1994.
CLUSTAL W: cải thiện độ nhạy của căn chỉnh nhiều trình tự
lũy tiến thông qua trọng số trình tự, hình phạt khoảng
cách cụ thể theo vị trí và lựa chọn ma trận trọng số. Axit
nucleic Res. 22, 46734680.
(
) 861 861
Weiss, MJ, Henthorn, PS, Lafferty, MA, Slaughter, C.,
Raducha, M., Harris, H., 1986. Phân lập và mô tả đặc tính
của cDNA mã hóa phosphatase kiềm kiểu gan-thận của con
người. Proc.
tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 83, 71827186.
Whitmore, DH, Goldberg, E., 1972. Phosphatase kiềm trong ruột
cá hồi II. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzym in
vitro và in vivo. J. Exp.
Động vật hoang dã. 182, 5968.
Wyckoff, HW, Handschumacher, MD, Murthy, HMK, Sowadski, JM,
1983. Cấu trúc ba chiều của phosphatase kiềm từ E. coli
Adv.
enzim. quan hệ. Khu vực Mol. sinh học. 55, 453480.