BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
___________________________________________

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT

SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA
(PHYLLANTHUS URINARIA L.)

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN HỌC VIÊN THỰC HIỆN

1
 MỞ ĐẦU
1/ Lý do chọn đề tài:
- Hiện nay, mọi người có xu hướng thích sử dụng các loại cây thảo dược để
chữa bệnh hơn l{ sử dụng thuốc T}y. Trong đó, c}y chó đẻ răng cưa là một
trong những loại thảo dược m{ được mọi người truyền miệng nhau về khả
năng chữa được một số loại bệnh đặc biệt là các bệnh liên quan đến gan, đường
tiêu hóa. Việc nghiên cứu thành phần hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh
học của cây chó đẻ răng cưa có ý nghĩa quan trọng trong việc góp phần làm
tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của
Việt Nam, nâng cao giá trị kinh tế của cây Chó đẻ răng cưa, góp phần l{m tăng
thu nhập cho người nông dân trồng loại cây này.

2/ Mục đích nghiên cứu:

- X|c định thành phần hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học của cây chó
đẻ răng cưa từ đó x|c định những đặc tính sinh học của cây.
- Nâng cao giá trị kinh tế của cây chó đẻ răng cưa từ đó giúp b{ con nông d}n
trồng loại cây này tăng thu nhập.

3/ Nhiệm vụ nghiên cứu:

- Tách chiết và tinh chế một số hợp chất có trong cây chó đẻ răng cưa và phân
tích thành phần, cấu trúc, x|c định hoạt tính sinh học của các hợp chất đó.

4/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Cây chó đẻ răng cưa mọc tại vùng giáp ranh giữa Huyện Đồng Hỷ và Thành
Phố Thái Nguyên.

5/ Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp thu, xử lý mẫu:
- Mẫu c}y tươi sau khi thu h|i gồm cả thân, lá và quả được đem sấy ở 800oC
trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600oC cho tới khi khô
hoàn toàn. Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong etanol 90o ở nhiệt độ
phòng nhiều lần, liên tục trong 10 ngày. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến
dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng
dần: n-hexan, etylaxetat, nbutanol, metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung
môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được
phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần
để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh ph}n đoạn và kết
tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch .

2
 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết:
- Phối hợp sử dụng c|c phương ph|p sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích
hợp. C|c phương ph|p gồm:
+) Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
+) Sắc kí cột silicagen, thường dùng silicagen Merck 63- 200nm.
+) Kết tinh ph}n đoạn và kết tinh lại.

Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất:
- Các chất kết tinh phân lập ra được x|c định những hằng số vật lý đặc trưng:
màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ hồng ngoại
(FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối lượng
(MS) và các phổ phân giải cao. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch
được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.

6/ Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- X|c định chính xác những công dụng của cây chó đẻ răng cưa, nâng cao giá trị
kinh tế của cây chó đẻ răng cưa
- Sản xuất thuốc chữa bệnh từ cây chó đẻ răng cưa.

3
 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

Cách phân biệt các loại cây chó đẻ:

- (1) Cây chó đẻ thân xanh
(Phyllanthus niruri): phiến lá tù và
mỏng, màu xanh lục nhạt.
- (2) Cây chó đẻ răng cưa
(Phyllanthus urinaria): th}n đỏ,
phiến l| d{i v{ d{y hơn c}y diệp hạ
ch}u đắng.
- (3) Cây chó đẻ Phyllanthus sp:
khoảng cách lá rời rạc, lá bẹp và có
chop nhọn. Màu xanh lục sậm và
không phải là cây thuốc.

1.1/ Mô tả thực vật:

1.1.1/ Mô tả thực vật:
- Cây chó đẻ răng cưa còn được gọi là Diệp Hạ Ch}u đỏ, Diệp Hạ Châu ngọt, chó
đẻ th}n đỏ, diệp hòe thái, lão nha châu, trân châu thảo.
- Tên khoa học là: Phyllanthus urinaria L.
- Phân bố địa lý: cây chó đẻ răng cưa phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới.
- Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh
thành trong cả nước, điển hình như: Th|i Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ An, Hà
Giang,… Trên thế giới loại cây này mọc nhiều ở c|c nước Ch}u Á như: Trung
Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Indonesia, Myanma, Th|i Lan,… ở Ch}u Mĩ
như: Brazil, Argentina,…
- Đặc điểm sinh trưởng và phát triển:
+) Cây chó đẻ răng cưa là một loại cỏ mọc h{ng năm, cao chừng 30cm, thân
gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang canh, thường có m{u đỏ hơi tía. Cây có vị
hơi ngọt. Lá thuôn hay hình bầu dục ngược, cuống rất ngắn. Lá kèm hình tam
giác nhọn. Cụm hoa đực mọc ở nách gần phía ngọn, hoa có cuống rất ngắn hoặc
không có, đ{i 6 hình bầu dục ngược, đĩa mật có 6 tuyến, nhị 3 chỉ nhị rất ngắn,
dính nhau ở gốc. Hoa cái mọc đơn độc ở phía dưới các cành, dài 6 hình bầu dục
mũi m|c, đĩa mật hình vòng phân thùy, các vòi nhụy rất ngắn xẻ đôi th{nh 2
nhánh uốn cong, bầu hình trứng. Quả nang không có cuống, hạt hình 3 cạnh.
1.1.2/ Tác dụng dược lý:
4
- Điều trị viêm gan: Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng
điều trị viêm gan của Diệp hạ ch}u đ~ được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên
cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đ~ th{nh công với
chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus; nhóm nghiên cứu của Trần Danh
Việt, Nguyễn Thượng Dong (Viện Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001).
- Tác dụng trên hệ thống miễn dịch: V{o năm 1992, c|c nh{ khoa học Nhật Bản
cũng đ~ kh|m ph| t|c dụng ức chế sự phát triển HIV-1 của cao lỏng Phyllanthus
niruri thông qua sự kìm hãm quá trình nhân lên của virus HIV. Năm 1996, Viện
nghiên cứu Dược học Bristol Myezs Squibb cũng đ~ chiết xuất từ Diệp hạ châu
được một hoạt chất có tác dụng n{y v{ đặt tên l{ “Nuruside”.
- Tác dụng giải độc: Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng Diệp hạ ch}u để
trị các chứng mụn nhọt, lở loét, đinh r}u, rắn cắn, giun. Nhân dân Java, Ấn Độ
dùng để chữa bệnh lậu. Theo kinh nghiệm dân gian Malaysia, Diệp hạ châu có
thể dùng để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm
đạo,... Công trình nghiên cứu tại Viện Dược liệu - Việt Nam (1987 - 2000) cho
thấy khi dùng liều 10 - 50g/kg, Diệp hạ châu có tác dụng chống viêm cấp trên
chuột thí nghiệm.
- Điều trị các bệnh đường tiêu hóa: Cây thuốc có khả năng kích thích ăn ngon,
kích thích trung tiện. Người Ấn Độ dùng để chữa các bệnh viêm gan, vàng da,
kiết lỵ, t|o bón, thương h{n, viêm đại tràng. Nhân dân vùng Haiti, Java dùng cây
thuốc này trị chứng đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa,..
- Bệnh đường hô hấp: Người Ấn Độ sử dụng Diệp hạ ch}u để trị ho, viêm phế
quản, hen phế quản, lao,..
- Tác dụng giảm đau: Kenneth Jones v{ c|c nh{ nghiên cứu Brazil đ~ kh|m ph|
tác dụng giảm đau mạnh và bền vững của một vài loại Phyllanthus, trong đó có
cây Diệp hạ châu - Phyllanthus niruri. Tác dụng giảm đau của Diệp hạ châu
mạnh hơn indomethacin gấp 4 lần và mạnh hơn 3 lần so với morphin. Tác dụng
n{y được chứng minh là do sự hiện diện của acid gallic, ester ethyl và hỗn hợp
steroid (beta sitosterol và stigmasterol) có trong Diệp hạ châu.
- Tác dụng lợi tiểu: Y học cổ truyền một số nước đ~ sử dụng Diệp hạ châu làm
thuốc lợi tiểu, trị phù thũng. Ở Việt Nam, Diệp hạ ch}u được dùng sớm nhất tại
Viện Đông y H{ Nội (1967) trong điều trị xơ gan cổ trướng. Một nghiên cứu của
trường Đại học Dược Santa Catarina (Brazil-1984) đ~ ph|t hiện một alkaloid
của Diệp hạ châu (phyllan thoside) có tác dụng chống co thắt cơ v}n v{ cơ trơn,
các nhà khoa học đ~ nhờ v{o điều n{y để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận,
sỏi mật của cây thuốc.
- Điều trị tiểu đường: Tác dụng giảm đường huyết của Diệp hạ châu
(Phyllanthus niruri) đ~ được kết luận v{o năm 1995, đường huyết đ~ giảm một
c|ch đ|ng kể trên những bệnh nhân tiểu đường khi cho uống thuốc này trong

5
10 ngày.

1.2/ Một số hình ảnh về cây chó đẻ răng cưa:

6
7
 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
2.1/ Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu:
2.1.1/ Dụng cụ và hoá chất:
- Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn
các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, dùng để kết tinh lại là hoá
chất loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng đế nhôm DC
– Alufolien Kiesegel 60 F254 tráng sẵn, độ d{y 0,2mm được sử dụng để xác
định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, c|c ph}n đoạn chạy cột và
kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển:

SKLM: 1. n-Hexan – CHCl3 85:15 Hệ A

2. Cloroform – etylaxetat 90:10 Hệ B

3. Cloroform – metanol 90:10 Hệ C

4. Cloroform – metanol 50:10 Hệ D

5. Toluen – etylaxetat – axit formic 5:4:1 Hệ E

Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở
bước sóng λ= 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong
dung dịch metanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 100oC . Các giá trị Rf trong hệ
dung môi triển khai có biểu thức:

2.1.2/ Thiết bị nghiên cứu:

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên m|y Boetus (Đức), hoặc trên máy Eletronthermal
IA–9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 dạng viên nén KBr.
- Phổ LC/MS ghi trên máy ESI-LC/MS 1100 MSD Trap spectrometer.
- Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm eletron (EI-
MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz, nội chuẩn TMS, dung
môi CDCl3, DMSO, aceton-D6.

2.2/ Quy trình nghiên cứu:

2.2.1/ Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và xử lý mẫu.
2.2.2/ Phân lập và tinh chế các hợp chất từ các dịch chiết.

8
2.2.3/ Khảo sát định tính các dịch chiết.
2.2.4/ Khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất.
2.2.5/ Thử hoạt tính sinh học.

9
CHƯƠNG III: DỰ KIẾN VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ
NGHIÊN CỨU
4.1/ Nguyên tắc chung:
- Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm
ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng
dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu
mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.
- Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ
biến sau.
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có
độ phân cực tăng dần: ete dầu hỏa hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol
hoặc etanol vv...
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol :
nước. Sau đó s{ng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng
dần như phương ph|p 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ
phân cực tương đối giống nhau.
- Việc chiết mẫu thực vật chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) được thực
hiện theo phương |n 2.
- Các dịch chiết thô đem thử hoạt tính sinh học. Điều đó giúp cho việc định
hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có hoạt tính mạnh với các
chủng vi khuẩn đ~ thử nghiệm.
4.2. Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên:
- Ph}n tích định tính các hợp chất hữu cơ thiên nhiên trong c|c mẫu nghiên cứu
là việc làm cần thiết trước khi tiến hành phân lập v{ x|c định cấu trúc của các
chất cụ thể.
- Để x|c định định tính các nhóm hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh lí cao có
trong thực vật thường dùng hơn cả là phân tích bằng các phản ứng đặc trưng
đối với mỗi nhóm.
4.3/ Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau
của cây chó đẻ răng cưa:
- Các dịch chiết từ c}y chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) đều là những
hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất kh|c nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi
hỗn hợp, đ~ sử dụng các phương ph|p sắc ký cột như: Cột với chất hấp phụ
silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp v{ thường phải lặp lại nhiều
lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương ph|p kết tinh lại trong dung
môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các hợp chất có độ tinh
khiết cao, đ|p ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của
chúng. Đó l{ những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng v{ x|c định
10
cấu trúc hóa học của các chất đ~ ph}n lập được từ c|c đối tượng nghiên cứu nói
trên.
4.4/ Thử hoạt tính sinh học:
- Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định.
- Thử định tính theo phương ph|p khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy
lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn.
- Các chủng vi sinh vật gồm đại diện các nhóm:
* Vi khuẩn Gr(-) Escherichia coli.
* Vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus auresu.
* Vi khuẩn: Salmonella typh.

KẾT LUẬN
1. Khẳng định những lớp chất có trong c}y chó đẻ răng cưa mọc hoang tại Thái
Nguyên bằng phương ph|p ph}n tích định tính.

2. Các chất đ~ phân lập v{ x|c định được cấu trúc hóa học.

3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết tổng của c}y chó đẻ răng
cưa (Phyllanthus urinaria L).

11
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:

1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,
NXB Khoa học v{ Kĩ thuật, Hà Nội.

2. Nguyễn Văn Đ{n (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, NXB Y-
Dược, Tp. Hồ Chí Minh.

3. Nguyễn Văn Đậu, Lưu Ho{ng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Phân lập
một số hoạt chất từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 9 năm 43, tr.12-
15.

4. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Ngiên cứu hóa thực vật cây chó
đẻ răng cưa (Phyllanthus uticulatus niruri L)”. Tạp chí dược học, số 369 năm 47,
tr.15-18.

5. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội,
tr.65-67.

6. Nguyễn Thượng Dong v{ đồng tác giả (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc
của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), tr.72-75.

7. Trần Đình Thắng và cộng sự (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số
hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 371 năm 47,
tr.14-17.

Tiếng Anh:

8. Anjaneyulu (1973), “A. S. R et al”, Tetrahedron, 29(1), p.1291.

9. Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine-type alkaloid from

Phyllanthus niruroides”, Phytochemistry, 41(5), p.1441-1443.

10. Bikram Singh, P.K. Agrawal and R.S. Thakur (1989), “An acyclic triterpene
from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 28(7), p.1980-1981.

11. Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus
Phyllanthus”, Pharmacology, 4(18), p.225-258.

12
 KẾ HOẠCH THỰC HIỆN

THỜI GIAN CÔNG VIỆC

10/2016 Hoàn thành và bảo vệ đề cương
11/2016-12/2016 Tổng hợp tài liệu, chuẩn bị hóa chất
12/2016-1/2017 Thu và xử lý mẫu cây
1/2017-2/2017 Tiến hành phân tích mẫu cây
2/2017-3/2017 Phân tích kết quả
3/2017-4/2017 Hoàn thành luận văn
4/2017-5/2017 Bảo vệ luận văn

Huế, ngày 15 tháng 9 năm 2016

Giảng viên hướng dẫn Học viên lập đề cương

13