Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER

CÓ KHẢ NĂNG OXY HÓA ETHANOL CAO VÀ THỬ NGHIỆM
LÊN MEN GIẤM DỨA
Đỗ Thị Hiền(1), Đặng Thị Ánh Sương(1), Hoàng Thị Quý(1), Nguyễn Thị Chiến(1)
(1)
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. HCM
Ngày nhận bài 20/3/2017; Ngày gửi phản biện 30/3/2017; Chấp nhận đăng 30/6/2017
Email: hiendt@cntp.edu.vn

Tóm tắt
Chủng vi sinh vật được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để lên men giấm là Acetobacter
Dứa là loại trái cây rất khó bảo quản được lâu do đặc tính: mềm, dễ dập, mọng nước và giàu
đường. Hiện nay, ở Việt Nam, sản xuất giấm theo phương pháp truyền thống cho hiệu suất không
cao, chất lượng không ổn định. Vì vậy, việc lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp chịu được nồng độ
ethanol cao sẽ giúp nâng cao hiệu suất và rút ngắn thời gian sản xuất giấm. Đề tài đã tiến hành
phân lập và tuyển chọn được chủng TS2 có khả năng chịu nồng độ cồn cao. Định danh 16S cho
thấy TS2 là loài Acetobacter senegalensis. Khảo sát điều kiện lên men giấm dứa của Acetobacter
senegalensis thu được kết quả: Thời gian lên men 8 ngày; pH tối ưu ở khoảng 5,0 ÷ 5,5; nồng độ
ethanol từ 6 - 8%v/v thì lượng acid acetic tạo ra khoảng 3,10 ÷ 3,37%.
Từ khóa: dứa, Acetobacter, giấm, factors affecting
Abstract
IDENTIFICATION OF ACETOBACTER SP. IN HIGH ABILITY OF ETHANOL
METABOLISM AND EX VITRO EXPERIMENTAL VINEGAR FERMENTATION
FROM PINEAPPLE FRUITS
Acetobacter sp. has been known as the most popular microorganism strain for vinegar
fermentation. Pineapple fruit has been defined that the preservation processes is difficult for
continuous time due to soft, succulent, sugar-rich profiles. Traditional vinegar products currently
have showed low efficiencies and unstable qualities. Therefore, microorganism inoculum selection
haing a high ethanol metabolism would improve time, efficiency and quality of producing vinegar.
This study aims to identify Acetobacter senegalensis using rDNA 16S from TS2 sample. The results
indicated vinegar fermentation processes from pineapple using Acetobacter senegalensis optimized
in 8 days, pH from 5.0 ÷ 5.5, ethanol concentration from 6 - 8%v/v which can receive 3.1 ÷ 3.37%
(v/v) of acetic acid.

1. Đặt vấn đề
Giấm là dung dịch acetic loãng có nồng độ ≤ 8%, là loại gia vị được sử dụng từ các
nguyên liệu có đường hoặc bột bằng cách lên men rượu và acid acetic (Lê Văn Nhương, 1990).
Acetobacter và Gluconerbacter là hai chủng vi khuẩn lên men acetic phổ biến nhất. Chúng có
khả năng oxi hóa mạnh ethanol thành acid acetic trong điều kiện hiếu khí bắt buộc. Đồng thời 2
chủng vi khuẩn này có khả năng chịu được nồng độ acid acetic cao nên chúng được ứng dụng

33
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

để lên men sản xuất giấm (Watchara Kanchanarach và cộng sự, 2010). Kết quả nghiên cứu
Nanda và cộng sự, 2001 phân lập các chủng Acetobacter từ giấm gạo komesu và kurosu được
lên men tĩnh trong 50mL môi trường chứa 1,0% D - glucose, 1,0% glycerol, 0,2% polypeptone,
0,2% chiết xuất nấm men, 10% chiết xuất từ khoai tây, 1,0% acid acetic, và 4,0% ethanol ở
30°C trong 2 tuần. lượng acid acetic sinh ra là 6,0 - 6,5 % với pH = 3,1. Nghiên cứu đặc biệt
của Ndoye và cộng sự, 2007 về “Acetobacter senegalensis, một loài vi khuẩn acid acetic chịu
nhiệt được phân lập từ xoài tại Senegal” cho thấy chủng A.senegalensis phát triển tốt trên môi
trường chứa 30% D -glucose với amoni là nguồn nitơ duy nhất, ethanol như nguồn carbon, chịu
được nồng độ ethanol là 10% và có thể tạo được 6% acid acetic.
Dứa là loại trái cây nhiệt đới, hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8 - 12%, có nơi
trồng tốt và nếu được chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15 - 16% (trong đó 66% đường dưới
dạng saccarose và 34% dưới dạng fructose và glucose). Dứa còn có màu sắc, mùi thơm đặc
trưng thích hợp để chế biến, làm gia vị cho các món ăn và làm giấm.
2. Nội dung nghiên cứu
2.1. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn acid acetic.
Nguồn nguyên liệu lựa chọn để phân lập vi khuẩn lên men acetic: dịch giấm gạo, giấm
nuôi, nước dừa lên men, được thu thập ở chợ Sơn Kỳ (quận Tân Phú), dịch thủy sâm được mua
tại quận 12 (TP. Hồ Chí Minh). Tiến hành tăng sinh mẫu phân lập trong 24 giờ, ở 30 0C, lắc 150
rpm/phút. Sau đó pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (thường 10 -3 đến10-7) rồi tiến hành cấy
trải trên môi trường YPGD: Yeast extract 5g/L, peptone 5g/L, Glycerol 5g/L, D – Glucose
5g/L, Ethanol 4%v/v, 0,5% CaCO3 (Moryadee và Wasu, 2008). Nuôi cấy mẫu phân lập ở nhiệt
độ thường (28-320C). Sau khoảng 1-2 ngày, vi khuẩn sẽ phát triển trên bề mặt thạch. Tiến hành
quan sát, chọn những khuẩn lạc có khả năng tạo vòng halo (vòng phân giải CaCO 3) là vi khuẩn
acetic, tách và làm thuần các khuẩn lạc đó. Chọn dòng vi khuẩn có tỉ lệ vòng phân giải lớn nhất.
Cấy trải chủng vi khuẩn vừa mới phân lập được với nồng độ pha loãng: 10 -4, 10-5 , 10-6. Ủ ở
nhiệt độ thường (28-320C) trong 24-48 giờ. Tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc,
kích thước vi khuẩn. Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào. Chọn ra các tế bào
có hình que, bắt màu đỏ vàng hay đỏ tía với thuốc nhuộm.
Thử nghiệm tính sinh acid acetic (Davidson et al., 1993): Nuôi các chủng phân lập được
trên môi trường định tính acid acetic ((Glucose 30g/L, KH 2PO4 15g/L, (NH4)2SO4 15g/L,
Ethanol 3%v/v) ở nhiệt độ phòng (28 – 32oC) trong 4 ngày. Cho vào ống nghiệm 3mL dịch
mẫu và 1mL dung dịch NaOH. Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl 3 5%, lắc đều, đun
sôi trên ngọn đèn cồn. Nếu dịch lên men có acid acetic thì sẽ có màu đỏ.
Thử nghiệm khả năng oxy hóa acetate (Sharafi et al., 2010): Nếu chủng phân lập được có
khả năng oxy hóa acetate thì chủng đó thuộc giống Acetobacter còn ngược lại chủng đó thuộc
giống Gluconobacter. Cấy chủng phân lập được trên môi trường YPGD (giống môi trường
phân lập) có bromocresol green (0,01% g/L) làm chất chỉ thị màu. Ủ các đĩa ở nhiệt độ thường
(28 – 32oC) trong 24 - 72 giờ cho tới khi không có sự thay đổi màu sắc.
2.2. Kiểm tra khả năng phát triển của các chủng phân lập được trên môi trường nuôi
cấy có nồng độ ethanol cao
Các chủng vi khuẩn thí nghiệm đuợc cấy trong môi truờng phân lập YPGD đã được bổ
sung nồng độ ethanol với các nồng độ 6, 8, 10, 12, 14%v/v. Sau đó tiến hành ủ ở nhịệt độ
thường (28 - 320C). Theo dõi khả năng phát triển của các chủng sau 48 - 72 giờ bằng cách quan

34
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

sát mức độ sinh trưởng mạnh hay yếu của chúng trên môi trường thạch đĩa. Chọn chủng
Actobater có khả năng chịu nồng độ ethanol cao → định danh để xác định loài.
2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm dứa bằng chủng vi
sinh vật phân lập được.
Dứa  Gọt vỏ  Ép  lọc Pha loãng (1 dứa:3 nước) Lên men  Rót chai  Thanh
trùng Thành phẩm. Khi lên men bổ sung Acetobacter phân lập được ( 10%v/v). Đồng thời
khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: pH, ethanol và thời gian lên men.
Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu: Sử dụng dịch dứa sau khi pha loãng với các
khoảng pH 3,5; 4,0; 4,5; 5,0, 5,5; 6,0 và 6,5. Cho lên men với chủng Acetobacter 10% v/v đã
phân lập được, mật độ tế bào 106 CFU/ml. Thể tích lên men 100mL, acid acetic bổ sung ban
đầu 0,6% v/v, ethanol 8% v/v, nhiệt độ phòng (khoảng 28-32 oC), thời gian lên men 8 ngày.
Định lượng acid acetic tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ.
Khảo sát ảnh hưởng của ethanol bổ sung: Sử dụng dịch dứa sau khi pha loãng cho lên
men với chủng Acetobacter 10% v/v đã phân lập được, mật độ tế bào 10 6 CFU/ml. Thể tích lên
men 100mL, acid acetic bổ sung ban đầu 0,6% v/v, pH tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.1, nhiệt độ
phòng (khoảng 28-32oC), thời gian lên men 8 ngày. Định lượng acid acetic tạo ra bằng phương
pháp chuẩn độ.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men: Sử dụng dịch dứa sau khi pha loãng cho lên
men với chủng Acetobacter 10% v/v đã phân lập được, mật độ tế bào 10 6 CFU/ml. Thể tích lên
men 100ml, acid acetic bổ sung ban đầu 0,6% v/v, pH tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.1, ethanol
bổ sung tối ưu từ thí nghiệm mục 2.3.2, nhiệt độ phòng (khoảng 28-32 oC), thời gian lên men 2,
4, 6, 8 ngày. Định lượng acid acetic tạo ra bằng phương pháp chuẩn độ.
2.4. Xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận và xử lý thống kê bằng phần
mềm Statgraphic Centurion XV.I, Excel 2013 với mức độ tin cậy 95%.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập chủng Acetobacter
Các chủng vi khuẩn được lựa chọn là vi khuẩn acid acetic khi chúng tạo được vòng halo
trên môi trường YPGD. Kết quả nhuộm Gram khuẩn lạc có màu hồng đỏ thu được 14 chủng vi
khuẩn (Gq1, Gq2, Gq3, Gq4, Gq5, GN1, GN2, GN3, D1, D2, D3, TS1, TS2, TS3) thỏa mãn các
điều kiện trên và chúng có sự đa dạng về đặc điểm hình thái, khuẩn lạc cụ thể như sau: Phần lớn
các khuẩn lạc tròn đều, bìa nguyên, một số trơn bóng, một số có tâm ở giữa. Có màu trắng đục,
trắng trong hoặc màu vàng nhạt. Có hình cầu, hình que ngắn hoặc que dài xếp thành chuỗi.
Tuyển chọn chủng có khả năng sinh acid acetic mạnh
Tiến hành cấy chấm điểm các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường YPGD. Sau
48 giờ quan sát vòng phân giải CaCO 3 xung quanh điểm cấy. Kết quả được thể hiện trong hình
2 và bảng 1.
Bảng 1. Đường kính vòng phân giải CaCO3
Chủng Vòng phân giải CaCO3 (mm) Chủng Vòng phân giải CaCO3 (mm)
Gq1 8,0 ± 1,15c D1 18,0 ± 1,15f
Gq2 9,67 ± 0,88cd D2 13,0 ± 1,53e

35
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

Gq3 11,33 ± 1,20de D3 4,33 ± 1,20b

Gq4 19,33 ± 1,20fg GN1 10,33 ± 0,88cde
Gq5 0,0 ± 0.0a GN2 11,67 ± 0,33de
GN3 3,0 ± 1,53ab TS1 20,67 ± 1,20fg
GN4 1,33 ± 0,67ab TS2 21,67 ± 0,88g

Gq D1
2

GN TS2
1

Hình 1. Hình dạng

khuẩn lạc và hình thái TS3
vi thể của chủng Gq2,
GN1, D1, TS1,TS2.

Hình 2. Vòng phân giải CaCO3 của các

chủng phân lập được.

Qua số liệu được thể hiện ở bảng 3.2, ta thấy chủng Gq5 và chủng GN4 cho kết quả đường
kính phân giải CaCO3 thấp nhất lần lượt là Gq5 (0,0mm), GN4 (1,33mm). Một số chủng có đường
kính phân giải cao như: TS2 (21,67mm), TS1 (20,67mm), Gq4 (19,33mm), D1 (18,0mm). Với mục
đích là tuyển chọn các chủng có khả năng tạo vòng halo cao, nhóm tiến hành sàng lọc, loại bỏ hai
chủng Gq5 và chủng GN4, 12 chủng còn lại sẽ tiếp tục tiến hành các thử nghiệm sinh hóa khác.

36
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

Thử nghiệm tính sinh acid acetic

Để kiểm chứng khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic của các chủng vi khuẩn phân
lập được, tiến hành định tính acid acetic tạo ra được trên môi trường nuôi cấy bằng dung dịch
FeCl3 5%. Kết quả cho thấy trong 11 chủng phân lập có 2 chủng không tạo ra acid acetic là
chủng Gq1 và chủng D2 (môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng ban đầu), 9 chủng còn lại đều
tạo được acid acetic do chúng đều tạo ra dung dịch có màu đỏ thẫm nhưng chúng có màu nhạt
hơn so với ống nghiệm chứa dung dịch acid acetic chuẩn.

Acid TS D Gq TS GN GN Gq2 Gq3 GN Gq1 D2 Đ

chuẩn 1 1 4 2 1 2 3 C

Hình 3. Định tính acid acetic của các chủng vi khuẩn phân lập được.
Thử nghiệm khả năng oxy hóa acetate
Bảng 2. Kết quả phân loại của các chủng acid acetic phân lập được.
STT Loại mẫu Ký hiệu Phân lọai
Acetobacter Gluconobacter
1 Giấm gạo Gq2 X
2 Gq3 X
3 Gq4 X
4 Giấm nuôi GN1 X
5 GN2 X
6 GN3 X
7 Nước dừa lên men D1 X
8 Dịch thủy sâm TS1 X
9 TS2 X
Theo tài liệu định danh của Bergey (Holt và các cộng sự, 1994), dựa vào phản ứng oxy
hóa acetate sẽ chia được chủng phân lập thành hai nhóm là Acetobacter và Gluconobacter. Tiến
hành cấy các chủng phân lập được trên môi trường YPGD có bổ sung 0,01% g/L bromocresol
green. Ủ ở nhiệt độ phòng (28 – 32oC) trong 24 giờ, quan sát thấy tất cả các chủng đều chuyển
môi trường từ màu xanh lam sang màu vàng. Tuy nhiên sau 72 giờ có sự khác biệt về màu sắc
môi trường giữa các chủng phân lập, một số chủng môi trường vẫn giữ được màu vàng là
Gluconobacter, một số chủng chuyển từ màu vàng thành màu xanh lục là Acetobacter. Kết quả
phân loại được thể hiện ở Bảng 2 và hình ảnh minh họa là hình 4. Các chủng Acetobacter có thể
dễ dàng phân biệt được với chủng Gluconobacter nhờ đặc điểm Q - 9 (thành phần ubiquinone

37
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

chính trong màng tế bào) chúng giúp chủng Acetobacter dễ dàng thực hiện quá trình oxy hóa
acetate tạo ra sản phẩm cuối cùng là CO 2 và H2O. Còn chủng Gluconobacter không diễn ra quá
trình oxy hóa acetate (Larpent et al., 1990). Đối với chất chỉ thị bromocresol green nhạy cảm
với pH thấp và khi pH đạt mức 4,5 sẽ chuyển sang màu xanh lục.
Đối với chủng Acetobacter, việc tạo ra CO2 làm giảm pH môi trường và khi pH đạt mức
4,5 sẽ làm môi trường chuyển từ vàng sang xanh lục. Trong khi đó chủng Gluconobacter không
tạo ra CO2 nên môi trường vẫn giữ được màu vàng ban đầu.

A B
C D

Hình 4. Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 72 giờ.
*Ghi chú: (A): màu môi trường đối chứng; (B) visinh vật không làm đổi màu môi trường; (C) chủng Acetobacter làm môi
trường chuyển màu xanh;, (D) chủng Gluconobacter làm môi trường chuyển sang màu vàng.
3.2. Kiểm tra khả năng phát triển của các chủng phân lập được trên môi trường có bổ
sung ethanol.
Cấy các chủng phân lập được trên môi trường phân lập YPGD đã bổ sung nồng độ
ethanol khác nhau: 6%, 8%, 10%, 12%, 14% (%v/v). Ủ ở nhiệt độ phòng (28 – 32 oC) trong 48
giờ, ta thu được kết quả như Bảng 3.
Bảng 3. Mức độ phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
chứa nồng độ ethanol khác nhau.
Ethanol Ethanol 8% Ethanol Ethanol Ethanol 14%
STT Chủng
6%(v/v) (v/v) 10%(v/v) 12%(v/v) (v/v)
1 Gq4 ++ + + - -
2 GN1 + - - - -
3 D1 ++ ++ ++ -
4 TS1 ++ ++ ++ + -
5 TS2 ++ ++ ++ ++ -
*Ghi chú: (++) Phát triển mạnh , (+) Phát triển, (-) Không phát triển.
Từ bảng trên ta thấy tất cả các chủng đều phát triển mạnh trên môi trường chứa 6%
ethanol, 8% thì khả năng phát triển bắt đầu giảm và không phát triển được ở môi trường có
chứa nồng độ ethanol 14%.
Ở môi trường có chứa 12% ethanol, có hai chủng D1 và TS2 có thể phát triển được.
Trong đó chủng TS2 cho kết quả phát triển hơn chủng D1. Chọn chủng TS2 để định danh loài
và để khảo sát cho các thí nghiệm.
Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử cho thấy đoạn DNA khuếch đại
của chủng TS2 tương đồng với gen mã hóa 16S rDNA của loài Acetobacter senegalensis, mã
số LN606600.1 với độ tương đồng 100%.

38
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

A B C

D E

Hình 5. Thử khả năng chịu nồng độ ethanol cao của các chủng phân lập được.
*Ghi chú: (A):các chủng trên môi trường ethanol 6% v/v; (B) môi trường ethanol 8% v/v; (C) môi trường ethanol
10% v/v, (D) môi trường ethanol 12% v/v, (E) môi trường ethanol 14% v/v

Hình 6. Kết quả so sánh độ tương đồng đoạn DNA của chủng TS2 với dữ liệu trên ngân
hàng gen NCBI

39
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

3.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm dứa bằng chủng vi
sinh vật phân lập được.
Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu
Để xác định được khoảng pH thích hợp cho quá trình lên men giấm dứa, tiến hành cho
lên men 100ml dịch dứa đã xử lý chỉnh nồng độ đường lên 10g/L, bổ sung 8% v/v ethanol,
0,6% v/v acid acetic, 10% v/v dịch TS2 đã tăng sinh, thời gian 8 ngày. Lấy mẫu để chuẩn độ để
xác định được % acid acetic trong mẫu. Kết quả thu được theo Bảng 4 và Hình 7.
Bảng 4. Nồng độ acid acetic thu
được ứng với các giá trị pH
pH % acid acetic
3,5 1,50 ± 0,17a
4,0 1,73± 0,16ab
4,5 2,36 ± 0,04bc
5,0 3,43 ± 0,26d
5,5 3,23 ± 0,32d
6,0 2,50 ± 0,29c
6,5 1,32 ± 0,27a
Hình 7. Đồ thị thể hiện hàm lượng acid
acetic tương ứng với các giá trị pH
Trong quá trình lên men lượng acid acetic tạo ra đến một thời điểm nào đó sẽ quay ngược
trở lại ức chế lên sự phát triển của chủng Acetobacter vì acid acetic sẽ làm giảm pH môi trường.
pH quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng của chủng
Acetobacter. Kết quả phân tích Statgraphics cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện
thống kê học (P < 0,05) giữa các giá trị trung bình của nồng độ acid acetic sinh ra sau 3 lần thí
nghiệm tương ứng với các giá trị pH khác nhau. Từ đồ thị ta có thể thấy lượng acid acetic sinh
ra có xu hướng tăng dần từ pH 3,5 lên pH 5,0 và giảm dần khi tăng pH từ 5,0 lên 6,5. Ở pH 3,5
÷ 4,0 lượng acid acetic sinh ra rất ít (1,5 - 1,73%) do pH quá thấp làm ức chế hoạt động của A.
senegalensis. Trong khoảng pH 4,5 ÷ 6,0, acid acetic tạo ra cao, ở pH 5,5 acid acetic đạt mức
cao nhất với 3,51%. Nhưng khi pH tăng cao đến mức 6,5 thì lượng acid acetic sinh ra giảm
mạnh xuống còn 1,32%, khác biệt này là có ý nghĩa thống kê so với các giá trị còn lại. Nghiên
cứu của S.Ghosh (2012) lên men giấm trái cọ cũng cho thấy chủng Acetobacter spp. có khả
năng sinh acid acetic cao trong khoảng pH 4,5 ÷ 6,5. Điều này chứng tỏ, khoảng pH tối ưu cho
quá trình lên men của chủng Acetobacter senegalensis này trong khoảng từ 5,0 ÷ 5,5. Quan sát
sản phẩm ta thấy màu dịch dứa có sư thay đổi rõ rệt, nó không giữ màu vàng ban đầu, màu sắc
đậm dần theo giá trị tăng của pH. Đồng thời chủng Acetobacter senegalensis tạo màng khá
mỏng, chìm ở đáy và trong quá trình lên men tạo nhiều vẩn đục làm cho màu sắc môi trường bị
thay đổi.
Khảo sát ảnh hưởng của ethanol bổ sung
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol bổ sung vào môi trường thích hợp cho quá
trình lên men giấm dứa, tiến hành cho lên men 100mL dịch dứa đã xử lý bổ sung đường 10g/L,
acid acetic 0,6% v/v, dịch Acetobacter senegalensis 10% v/v đã tăng sinh, pH =5,0-5,5, thời
gian 8 ngày, nhiệt độ phòng. Định lượng % acid acetic trong mẫu. Kết quả thu được theo Bảng
5 và hình 8.
40
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

Bảng 5. Nồng độ acid acetic thu được

ứng với các nồng độ ethanol.
Nồng độ ethanol Acid acetic
(%v/v) (%)
6 3,37 ± 0,29c
8 3,10 ± 0,55c
10 2,07 ± 0,14b
12 1,60± 0,06ab
14 0,77 ± 0,08a

Hình 8. Nồng độ acid acetic thu được

ứng với các nồng độ ethanol.
Ethanol là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tạo thành acid acetic
của chủng Acetobacter spp. Kết quả thu được cho thấy chủng Acetobacter senegalensis có khả
năng oxi hóa ethanol khá cao. Dựa vào phân tích số liệu bằng phần mềm Statgraphics cho thấy
có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P < 0,05) giữa các giá trị trung bình
của nồng độ acid acetic sinh ra sau 3 lần thí nghiệm tương ứng với các mức nồng độ ethanol
khác nhau. Lượng acid acetic sinh ra khá cao ở mức ethanol 6% và 8% và có xu hướng giảm
dần khi nồng độ ethanol tăng lên.
Ở nồng độ ethanol 6% cho kết quả nồng độ acid acetic là cao nhất với 3,37%, tiếp tục
tăng nồng độ ethanol lên 8% thì chủng A. senegalensis vẫn phát triển rất tốt với 3,10% acid
acetic. Tuy nhiên, lượng acid acetic tạo thành giảm đáng kể từ 3,10% ở 8% ethanol xuống còn
2,07% ở 10% ethanol. Khi tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 12% và 14%, do lượng ethanol quá
cao đã khiến chủng vi khuẩn A. senegalensis bị ức chế dẫn đến lượng acid acetic tạo thành rất
thấp chỉ đạt 1,6% (tương ứng mức ethanol 12%) và 0,77% (tương ứng mức ethanol 14%). Kết
quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Ndoye, Bassirou và cộng sự (2007), vi khuẩn A.
senegalensis có thể chịu được nồng độ ethanol lên đến 10%, thậm chí A. senegalensis phát triển
được trên môi trường có nồng độ ethanol 12% nhưng lượng acid acetic tạo thành không cao.
Nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2004) cũng chỉ ra rằng nồng độ ethanol
thích hợp cho quá trình lên men giấm là 6 - 15%. Tuy nhiên khả năng oxi hóa ethanol để taọ
thành acid acetic của vi khuẩn acetic có sự thay đổi lớn giữa các giống, loài và các điều kiện
ảnh hưởng đến quá trình lên men như nhiệt độ, pH, phương pháp lên men. Vì vậy với nồng độ
ethanol là 12% và 14% thì lượng acid acetic tạo thành rất thấp. Ngược lại, ở nồng độ ethanol là
6% , 8% và 10% cho lượng acid acetic sinh ra cao do ở nồng độ ethanol này vi khuẩn thích ứng
nhanh với môi trường, kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, acid sinh ra nhiều,
pH giảm mạnh ức chế hoạt động của các vi sinh vật khác. Quan sát dịch dứa không giữ màu
vàng ban đầu do chủng Acetobacter senegalensis trong quá trình lên men tạo nhiều vẩn đục làm
cho màu sắc môi trường bị thay đổi. Đồng thời chủng này tạo màng chắc, khá mỏng ở nồng độ
ethanol 6% và 8% trong môi trường.
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Để xác định được thời gian lên men thích hợp, tiến hành cho lên men 100mL dịch dứa đã
xử lý có bổ sung 8% v/v ethanol, 0,6% v/v acid acetic, 10g/L glucose, 10% v/v dịch vi khuẩn
Acetobacter senegalensis đã tăng sinh, pH= 5-5,5. Cách hai ngày, lấy mẫu để chuẩn độ nhằm
xác định được % acid acetic trong mẫu. Kết quả thu được theo bảng 6 và hình 9.

41
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

Bảng 6. Nồng độ acid acetic thu

được theo thời gian.
Thời gian lên Acid acetic
men (ngày) (%)
2 1,32 ± 0,17a

4 1,79 ± 0,24ab

6 2,65 ± 0,42abc

8 3,74 ± 0,59c

10 2,91 ± 0,60bc

12 1,86 ± 0,45ab

Hình 9. Đồ thị thể hiện sự thay đổi hàm lượng acid acetic
theo thời gian.
Lượng acid acetic tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 8, lần lượt là 1,32%; 1,79%;
2,65%; 3,74% vì lúc này chủng Acetobacter senegalensis trải qua các giai đoạn thích nghi, tăng
trưởng và phát triển mạnh nên lượng acid acetic tích lũy qua từng ngày sẽ tăng. Ở ngày thứ 8
lượng acid acetic thu được là cao nhất (3,74%), đến ngày thứ 10 lượng acid aceic có dấu hiệu
giảm (còn 2,91%) và đến ngày 12 thì giảm mạnh (còn 1,86%). Nguyên nhân là do khi lượng
acid acetic tạo ra quá cao sẽ ức chế trở lại quá trình phát triển của vi khuẩn làm khả năng
chuyển hóa ethanol thành acid acetic giảm, hoặc do hết ethanol nên vi khuẩn này phải oxy hóa
acid acetic lấy năng lượng để sống. Cũng có thể do thời gian quá dài làm bay hơi một lượng
acid cetic. Vì thế, trong khoảng từ 8 - 10 ngày nên thu sản phẩm và kết thúc quá trình lên men.
Kết quả này cũng tương tự như nghiên cứu của Nguyễn Thị Thùy Lam (2006), lên men giấm
trái cây của chủng Acetobacter aceti, thời gian lên men của chủng này cũng trong khoảng từ 8 -
12 ngày, cụ thể lượng acid acetic sinh ra được trong 8 ngày là 3,54%, 10 ngày là 3,69%, 12
ngày là 3,61%. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Võ Thị Ngọc Bích (2012) thời gian lên men giấm
của chủng Acetobacter tropicalis cho kết quả tối ưu nhất ở 5 - 7 ngày. Với điều kiện nuôi cấy ở
37oC ba chủng DK1, DK4, K4 thì sau 5 ngày cả ba chủng đều cho hàm lượng acid acetic cao
nhất lần lượt là DK1 (3,42%), DK4 (3,54%), K4 (3,66%). Còn theo nghiên cứu của TS. Trịnh
Văn Dũng (2005), thời gian lên men dịch nước mía ở chủng Acetobacter spp. cũng cho kết quả
thời gian lên men tối ưu nhất là 9 ngày với lượng acid acetic thu được là 5,74%. Và nghiên cứu
của Seyram K. Sossou (2009) đã tiến hành theo dõi sự phát triển của chủng Acetobacter spp.
ASV03 thì cho thấy ASV03 tăng trưởng nhanh bắt đầu từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 11 với mật
độ tế bào đo được là 10 6 cfu/mL (ngày thứ 2) và tăng lên 1,2 x 10 9 cfu/mL (ngày thứ 11), sau
ngày thứ 11 mật độ giảm xuống và đạt 4,4 x 105 cfu/mL vào ngày thứ 23.
4. Kết luận
Từ các nguồn mẫu ban đầu như giấm gạo, giấm nuôi, nước dừa lên men, dịch thủy sâm
phân lập được 5 chủng nghi ngờ là chủng Acetobacter là Gq4, GN1, D1, TS1, TS2. Khả năng
phát triển của 5 chủng này trên YGPD có bổ sung các nồng độ ethanol khác nhau 6, 8, 10, 12,
14% tuyển chọn được ba chủng phát triển tốt ở nồng độ ethanol 10% là chủng D1, TS1, TS2.

42
Tạp chí Khoa học Đại học Thủ Dầu Một Số 1(36)-2018

Có hai chủng D1 và chủng TS2 phát triển được trên môi trường chứa 12% ethanol, trong đó
TS2 cho kết quả tốt hơn. Tiến hành định danh 16S cho kết quả TS2 là chủng Acetobacter
senegalensis. Là một chủng vi khuẩn chịu được nhiệt độ cao (có thể phát triển ở nhiệt độ 40 oC),
có khả năng lên men tạo 6% acid acetic.
Các thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng Acetobacter senegalensis để lên men
giấm dứa thu được kết quả như sau: Ở 8 ngày cho lượng acid acetic cao nhất 3,74%, pH tối ưu
ở khoảng 5,0 ÷ 5,5 với lượng acid acetic tạo ra 3,03 ÷ 3,58%; nồng độ ethanol từ 6 - 8% v/v
cho kết quả lên men cao với 3,10 ÷ 3,37% acid acetic. Sàng lọc thêm các yếu tố của các chủng
phân lập được như: Khả năng phát triển trên các nồng độ acid acetic khác nhau, ở các nhiệt độ
khác nhau. Khảo sát thêm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men giấm như: hàm lượng
giống bổ sung, khảo sát lượng acid acetic cho vào môi trường ban đầu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Võ Thị Ngọc Bích (2012), Ảnh hưởng của ethanol và acid acetic đến khả năng lên
men của Acetobacter tropicalis, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
[2] Trịnh Văn Dũng (2005), Lên men liên tục acid acetic từ nguyên liệu tự nhiên bằng
phương pháp nhanh, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng.
[3] Davidson, P. M., and A. L. Branen (1993), "Antimicrobials in foods", Food science
and technology (USA).
[4] Ghosh, S., et al (2012), "Study on fermentation conditions of palm juice vinegar by
response surface methodology and development of a kinetic model", Brazilian Journal of
Chemical Engineering 29.3, pp: 461-472.
[5] Nguyễn Thị Thùy Lam (2006), Thử nghiệm lên men trái cây theo phương pháp lên
men hồi lưu cố định vi khuẩn trên giá thể, Luận văn kỹ sư, Trường Đại học Nông Lâm TP
HCM.
[6] Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ vi sinh vật, tập 1, NXB Đại học Quốc gia TP
HCM.
[7] Moryadee, Amornrut, and Wasu Pathom-Aree (2008), "Isolation of thermotolerant
acetic acid bacteria from fruits for vinegar production", Res. J. Microbiol 3, pp: 209-212.
[8] Lê Văn Nhương (1990), Nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất giấm năng suất cao,
NXB Nông nghiệp.
[9] Nanda, Kumiko, et al (2001), "Characterization of acetic acid bacteria in traditional acetic acid
fermentation of rice vinegar (komesu) and unpolished rice vinegar (kurosu) produced in
Japan", Applied and Environmental Microbiology 67.2, pp: 986-990.
[10] Ndoye, Bassirou, et al (2007), "Acetobacter senegalensis sp. nov., a thermotolerant
acetic acid bacterium isolated in Senegal (sub-Saharan Africa) from mango fruit (Mangifera
indica L.)", International journal of systematic and evolutionary microbiology 57.7, pp: 1576-
1581.
[11] Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn, Lê Thị Mỹ Xuyên (2014), Phân lập, tuyển
chọn nấm men và vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha), Tạp chí
Khoa học Trường Đại học Cần Thơ.
[12] Shafiei, Rasoul, et al (2013), "Evaluation of viability and growth of Acetobacter
senegalensis under different stress conditions", International journal of food microbiology 163.2,
pp: 204-213.

43
Đỗ Thị Hiền... Phân lập, tuyển chọn chủng vi khu

[13] Sharafi, S. M., I. Rasooli, and K. Beheshti-Maal (2010), "Isolation, characterization

and optimization of indigenous acetic acid bacteria and evaluation of their preservation
methods", Iranian Journal Of Microbiology 2.1, pp: 38.
[14] Nguyễn Trương Bảo Trân (2007), Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện
lên men acetic để làm giấm trái cây, Trường Đại học Sư phạm TP HCM.

44