NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANO ĐỒNG BẰNG DỊCH CHIẾT LÁ BÀNG

(TERMINALIA CATAPPA L.) ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG VÀO PHÒNG TRỪ
VI KHUẨN XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. MANGIFERAE TRÊN CÂY
XOÀI.

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ở Việt Nam, xoài là một trong những cây ăn quả phổ biến, có giá trị kinh tế
cao, mang lại lợi ích to lớn tới nhà nông cũng như trong nông nghiệp. Nhưng hiện nay
với thời tiết xảy ra thất thường như nắng nóng, mưa nhiều kèm theo những cơn bảo
xảy ra liên tục là điều kiện thuận lợi cho các loài vi khuẩn tấn công gây bệnh trên cây
trồng, bệnh do vi khuẩn gây ra rất nguy hiểm và gây nhiều khó khăn cho công tác
phòng trừ.
Một số nhà vườn trồng xoài đang gặp phải bệnh đốm do vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. Mangiferae gây ra. Bệnh gây hại trên lá và trái, vết bệnh
xuất hiện trên chóp lá có các đốm nhỏ màu nâu vàng, nhiều đốm bệnh liên kết thành
mãng lớn sần sùi, bệnh nặng lá bị khô và rụng. Trên trái, vết bệnh là những chấm nhỏ
màu nâu đen hoặc những vết nứt dọc hình chân chim, chung quanh có quầng vàng,
trái bị bệnh thường thối từng mãng và rụng. Đây là nỗi lo lắng đối với nhiều nhà vườn
trồng xoài.
Những cách phòng trừ bệnh đốm do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv.
Mangiferae gây ra chủ yếu là: phòng trừ bằng biện pháp canh tác, vi sinh đối kháng,
các chế phẩm hóa học có nguồn gốc muối đồng,... vẫn chưa mang tính hiệu quả cao.
Tuy nhiên hiện nay nano đồng với các tính chất đặc biệt của vật liệu nano có thể tiêu
diệt vi khuẩn chỉ với liều lượng rất nhỏ, không gây ảnh hưởng đến môi trường và an
toàn với con người, có hiệu quả diệt khuẩn hơn ion Cu 2+ do cơ chế: khuếch tán vào tế
bào trực tiếp thông qua các vi lỗ hiện diện trong màng tế bào do kích thước vô cùng
nhỏ của chúng, hoặc các hạt nano đồng oxide xâm nhập qua kênh vận chuyển ion và
protein có mặt trên màng plasma. Ngoài ra một số hạt nano có thể xâm nhập vào tế
bào thông qua endocytosis (các túi bao bọc và vận chuyển các hạt nano đồng oxide
vào trong màng tế bào). Sau khi xâm nhập vào màng tế bào hạt nano đồng sẽ giải
phóng ion Cu2+ gây ra nhiều phản ứng sinh hóa phá hủy cấu trúc bên trong tế bào của
nấm và vi khuẩn dẫn đến chết tế bào và tiêu diệt được nấm và vi khuẩn[2].
Trong dịch chiết lá bàng chứa các hợp chất Flavonoid, Tannin, Saponin, Alkaloid, các
Polyphenol,…chứa các nhóm chức -OH, -C=O là những tác nhân khử muối đồng về
nano đồng hiệu quả[1].
Vì vậy, việc tổng hợp dung dịch chứa hạt nano đồng định hướng phòng trừ vi
khuẩn Xanthomonas campestris pv. Mangiferae mang tính cấp thiết, phương pháp
thực hiện dịch chiết lá bàng sử dụng nguồn nguyên liệu dồi dào, xuất hiện nhiều trên
địa phương dễ khai thác và đặc biệt là thân thiện với môi trường phù hợp với xu
hướng phát triển hóa học xanh hiện nay. Từ những phân tích trên để nâng cao hiệu
quả sử dụng vật liệu nano đáp ứng nhu cầu phòng trừ vi khuẩn của nhà vườn tôi quyết
định thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nano đồng bằng dịch chiết lá bàng định
hướng ứng dụng phòng trừ vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. Mangiferae trên cây
xoài.
2. Tổng quan nghiên cứu
 Tình hình nghiên cứu trong tỉnh
Năm 2020, Phạm Dương Khang và cộng sự đã tổng hợp vật liệu nano đồng từ
dịch chiết lá bàng kết quả thu được hạt nano đồng có dạng hình cầu, kích thước từ
5nm-20nm. Dung dịch chứa hạt nano đồng có khả năng ức chế mạnh với
nấm Collectotrichum spp. Phần trăm ức chế của dung dịch chứa hạt nano đồng ở nồng
độ 16000 (µL/L) đối với Collectotrichum spp. lên đến 74,50%.
 Tình hình nghiên cứu ngoài tỉnh
Trong bài nghiên cứu của Nguyễn Thị Dung “Nghiên cứu tổng hợp nano đồng từ
dung dịch Cu2+ bằng dịch chiết nước lá bàng và ứng dụng làm chất kháng khuẩn” tác
giả đã dựa trên kết quả phân tích định tính cho thấy trong dịch chiết của lá bàng có
chứa các nhóm chất Alkaloid, Saponin, Tannin, Flavonoid. Các nhóm chất này có
chứa các nhóm -OH ở vòng thơm. Các nhóm -OH của Polyphenol (như Catechin,
Quercetin, Lutecolin, Punicalin, Tercatin,…) sẽ đóng vai trò là tác nhân khử ion Cu2+
thành hạt nano đồng. Kết quả tạo ra các hạt nano đồng với kích thước trung bình từ
15.2 nm đến 25.0 nm và có hoạt tính kháng 2 loại vi khuẩn là Escherichia coli và
Bacillus subtilis[1].

 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trong nghiên cứu “The Toxic Effects and Mechanisms of CuO and ZnO
Nanoparticles” của Ya-Nan Chang và cộng sự, nhóm tác giả đã đưa ra ba cơ chế diệt
nấm và vi khuẩn thuộc loại tế bào nhân chuẩn khác nhau là: oxidative stress,
coordination effects và nonhomeostasis effects. Dựa vào những cơ chế đó tác giả đã
giải thích được sự xâm nhập, ảnh hưởng, và phóng thích ion Cu2+ từ nano oxide đồng
để tiêu diệt tế bào nấm bệnh và vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác giả đã nêu
được cơ chế diệt nấm bệnh và vi khuẩn của nano oxide đồng[2].
Trong nghiên cứu của Madiha Batoool và cộng sự, nhóm tác giả đã sử dụng
chiết xuất nước cà chua với vai trò khử muối đồng về nano đồng và làm chất ổn định.
Hỗn hợp gồm dịch chiết và muối Cu2+ được đun sôi trong khoảng 10 - 20 phút ở 50°C
- 70°C, sau đó ly tâm dung dịch sau phản ứng trong 15 phút ở tốc độ 4000
(vòng/phút). Kết quả tổng hợp được hạt nano đồng có kích thước 40 – 70nm ứng dụng
kháng khuẩn trên cây trồng.
Adamantia Varympopi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của hạt
nano đồng chống lại Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ở cây cà chua Trong
nghiên cứu này, CuNP phát triển đã được đánh giá dựa trên X.
campestris pv. Vesicatoria, tác nhân gây bệnh đốm lá vi khuẩn, in vitro và in
planta .Nghiên cứu cho thấy hoạt tính diệt khuẩn của hạt CuNP cao hơn so với các sản
phẩm đồng thương mại tương ứng. CN_S2 được chứng minh là có hiệu quả trong việc
ngăn chặn sự hình thành Xcv ở nồng độ thấp. Các phép đo XRF chỉ ra rằng công nghệ
nano làm tăng khả dụng sinh học của đồng trong mô thực vật so với thuốc diệt khuẩn
đồng thông thường và cho phép sản xuất các hợp chất hiệu quả, ổn định và thân thiện
với môi trường để bảo vệ cây trồng[3].
Vì vậy việc tổng hợp dung dịch chứa hạt nano đồng định hướng phòng trừ nấm
vi khuẩn Xanthomonas Campestris PV. Mangiferae mang tính cấp thiết, đồng thời
tổng hợp dung dịch chứa hạt nano đồng bằng dịch chiết lá bàng, sử dụng lá bàng là
nguồn nguyên liệu dồi dào ở địa phương, thân thiện môi trường là xu hướng phù hợp
với hóa học xanh hiện nay.
3. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát: Tổng hợp nano đồng từ dịch chiết lá bàng với kích thước dưới
30nm và thử khả năng kháng khuẩn Xanthomonas campestris pv. Mangiferae gây hại
trên cây xoài.
Mục tiêu cụ thể:
 Tổng hợp nano đồng với kích thước dưới 30nm với các điều kiện tối ưu: thời gian
tạo nano Cu, tỉ lệ thể tích dịch chiết/dung dịch Cu 2+, nồng độ Cu2+ từ dịch chiết lá
bàng.
 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano đồng với khuẩn Xanthomonas
campestris pv. Mangiferae
4. Nội dụng nghiên cứu
 Nội dung 1: Tổng hợp nano đồng từ dịch chiết lá bàng ở các điều kiện tối ưu (thời
gian tạo nano đồng, tỉ lệ thể tích dịch chiết/dung dịch Cu2+, nồng độ Cu2+ .)
 Nội dung 2: Đánh giá hạt nano đồng từ dịch chiết lá bàng (TEM,UV-VIS, XRD..)
 Nội dung 3: Đánh giá khả năng kháng khuẩn Xanthomonas campestris pv.
Mangiferae từ hạt nano đồng.
5. Phương pháp nghiên cứu
a. Hóa chất, dụng cụ
Hóa chất

CuSO4.5H2O (muối) Môi trường NA

Na2HPO4 (muối) Thuốc thử Mayer

KH2PO4 (muối) Pb(OAc)4 (muối)

Môi trường PDA FeCl3 (muối)

Nước deion

Dụng cụ
Erlen 250mL Pipet 1mL
Bình định mức Pipet 5mL
25mL
Bình định mức Pipet 10mL
50mL
Bình định mức Pipet 25mL
100mL
Bình định mức Bếp điện từ
250mL
Bình định mức Nhiệt kế
500mL
Beaker 50mL Giấy lọc whatman
no 1
Beaker 100mL Bốp cao cu
Beaker 250mL Phiễu thủy tinh
Beaker 500mL Cá từ thẳng
b. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Dịch chiết lá bàng

Thí nghiệm dựa trên các tỉ lệ tối ưu của các nghiên cứu Nguyễn Thị Dung,
Phạm Dương Khang,.. lá bàng sau khi thu về, rửa sạch với nước thủy cục và rửa lại
với nước deion, sấy ở 500C sau đó cắt nhỏ, để trong túi nilon bịt kín, bảo quản ở 4 0C
để dùng cho các thí nghiệm.
Quá trình ly trích dịch chiết: Cân 10g lá bàng đã sấy khô cắt nhỏ như trên, cho
vào erlen 250mL, đổ vào erlen 100mL nước deion sau đó đun sôi ở nhiệt độ khoảng
850C trong 15 phút, sau khi đun để nguội ở nhiệt độ phòng rồi lọc để loại bỏ phần rắn
bằng giấy lọc whatman số 1, phần dung dịch thu được là dịch chiết dùng để tiến hành
thí nghiệm.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ Cu2+
NT Nồng độ dung Thể tích Thể tích Thời Nhiệt
dịch dung dịch gian tạo độ tạo
dịch Cu2+
chiết(mL) Cu2+ (mL) nano nano
(mM)
Cu Cu (0C)
(phút)
1 0.5
2 1
3 2 10 40 15 85
4 3
5 4

 Mô tả thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức tương ứng với các sự thay đổi nồng độ
2+
Cu , cố định các thông số còn lại. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Hút 40mL
dung dịch Cu2+ với từng nồng độ khảo sát cho vào beaker 100mL, cho từ từ 10mL
dịch chiết vào hỗn hợp phản ứng, hỗn hợp phản ứng ở 850C trên bể đun cách thủy
trong 10 phút, sau đó ly tâm dung dịch sau phản ứng trong 15 phút ở tốc độ 4000
(vòng/phút).
Chỉ tiêu theo dõi: Bước sóng cực đại (λmax) và độ hấp thu cực đại (Abs) của dung dịch
nano đồng tạo thành.
Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ thể tích dịch chiết/ dung dịch Cu2+
NT Thể tích dịch Nồng độ Thể tích Thời gian Nhiệt độ
chiết(mL) dung dịch dung dịch tạo nano tạo nano
Cu2+(mM) Cu2+ (mL) Cu(phút) Cu (0C)

1 1
2 5
3 10 Tối ưu ở 40 15 85
TN2
4 15
5 20

 Mô tả thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức thay đổi tỉ lệ thể tích dịch chiết/
dung dịch Cu2+, cố định thể tích dung dịch Cu2+ là 50mL, cố định các thông số tối ưu
của các thí nghiệm trước.
Dịch chiết và dung dịch Cu2+ làm thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của thí
nghiệm 2.
Chỉ tiêu theo dõi: Bước sóng cực đại ( λmax) và độ hấp thụ cực đại (Abs) của dung
dịch nano đồng tạo thành.
Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian phản ứng
NT Thời gian tạo Nồng độ Thể tích Thể tích Nhiệt
nano dung dịch dịch dung dịch độ tạo
Cu(phút) Cu2+(mM) chiết(mL) Cu2+ (mL) nano
Cu
(0C)
1 5
2 10
3 15 Tối ưu ở Tối ưu ở TN3 85
TN2
4 20
5 25

 Mô tả thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức tương ứng với các sự
thay đổi về thời gian phản ứng, cố định các thông số tối ưu của các thí nghiệm trước.
Dịch chiết và dung dịch Cu2+ làm thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của thí
nghiệm 1.
Chỉ tiêu theo dõi: Độ hấp thụ cực đại (Abs) và bước sóng cực đại (λ max) của dung dịch
nano đồng tạo thành.

c. Phương pháp đánh giá hạt nano đồng

STT Phương pháp phân tích Mục đích phân tích Đơn vị phân tích
1 Phổ UV-Vis Đánh giá quá trình hình Trường Đại Học
thành CuNP, đồng thời dự Trà Vinh
đoán kích thước hạt nano
2 Nhiễu xạ tia X(XRD) Đánh giá hình thái hạt nano Viện khoa học và
công nghệ
3 Kính hiển vi điện tử truyền Đánh giá hình thái và kích Phòng thí nghiệm
qua TEM thước hạt nano công nghệ nano
 Bảng 5: Phương pháp đánh giá hạt CuNPs
Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng kháng khuẩn Xanthomonas campestris pv.
Mangiferae của dung dịch chứa hạt nano đồng
Mục tiêu: đánh giá khả năng kháng nấm Xanthomonas campestris pv. Mangiferae của
dung dịch nano đồng được tổng hợp từ dịch chiết thực vật trong điều kiện môi trường
NA.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 4 nghiệm thức, được
lặp lại 3 lần với mỗi lần là 1 đĩa petri khảo sát khả năng kháng khuẩn.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:

Hình 2. Sơ đồ tạo giếng thạch trên môi trường NA

(1) Đối chứng âm (nước cất khử trùng); (2) Đối chứng dương 1 (dịch chiết ly trích từ
thực vật); (3) Đối chứng dương 2 (Dung dịch Cu 2+ được sử dụng tạo nano đồng); (4)
Dung dịch nano đồng tổng hợp
Phương pháp tiến hành:
Xác định khả năng ức chế của sản phẩm cần thử nghiệm trong giếng thạch, khuếch tán
vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh giếng. Vùng ức chế
càng lớn thì tác dụng của sản phẩm cần thử nghiệm càng mạnh[4].
Tiến hành thí nghiệm: các thông số tối ưu được chọn bên trên được sử dụng để tạo
dung dịch chứa hạt nano đồng từ dịch chiết lá bàng. Môi trường NA được hấp khử
trùng và rót ra đĩa petri với mỗi đĩa 20 ml môi trường, để cho môi trường đặc. Dòng vi
khuẩn Xanthomonas campestris pv. Mangiferae được nuôi trong môi trường NA lỏng
48 giờ, pha loãng và đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu. Hút 50µl huyền phù vi
khuẩn mật số 106 tb/mL cho vào đĩa petri có môi trường NA, trãi đều bằng que cấy
trang. Tạo 4 giếng có đường kính 5 mm trên môi trường đã trãi vi khuẩn. Hút 50µl
nước cất khử trùng cho vào giếng số 1 Đối chứng âm; 50µl dịch chiết lá bàng cho vào
giếng số 2 Đối chứng dương 1; 50µl dung dịch Cu 2+ 1 mM cho vào giếng số 3; 50µl
dung dịch nano đồng cho vào giếng số 4. Để yên 30 phút cho dịch chiết khuếch tán từ
giếng vào môi trường. Cho các đĩa petri thí nghiệm vào bình hút ẩm, đốt đèn cầy, đậy
nắp bình chờ đến khi đèn tắt. Để bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Ủ ở nhiệt độ phòng 48
giờ. Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn nếu có.
Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) được tính theo công thức:

Trong đó:
C: Đường kính vòng vô khuẩn (mm).
D: Đường kính vòng sáng halo xung quanh giếng thạch (mm).
d: Đường kính giếng thạch (mm)

Tài liệu tham khảo

[1] Nguyễn Thị Dung (2014), Nghiên cứu tổng hợp nano đồng từ dung dịch Cu2+
bằng dịch chiếc nước lá bàng và ứng dụng làm chất kháng khuẩn, luận văn thạc sĩ
khoa học chuyên nghành hóa hữu cơ – Trường đại học Đà Nẵng.
[.] Phạm An Dương, K. (2020). Nghiên cứu tổng hợp dung dịch chứa hạt nano đồng
từ dịch chiết lá bàng định hướng ứng dụng vào phòng trừ nấm Collectrotrichu trên cây
trồng.
[2] Ya-Nan Chang et al. (2012), The Toxic Effects and Mechanisms of CuO and ZnO
Nanoparticles, Materials 2012, 5, 2850-2871; DOI:10.3390/ma5122850.
[3] Varympopi, A., Dimopoulou, A., Papafotis, D., Avramidis, P., Sarris, I.,
Karamanidou, T., ... & Skandalis, N. (2022). Antibacterial activity of copper
nanoparticles against Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato
plants. International Journal of Molecular Sciences, 23(8), 4080.
[4] Đỗ Trung Đàm, Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý
của thuốc từ dược thảo, Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật.