@mihkhar

Thực tập VI SINH

Bài 1: SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ CƠ BẢN TRONG PHÒNG XÉT NGHIỆM VI SINH

Kiến thức cần nắm

Đèn cồn: có 2 phần gồm phần ở giữa có màu sáng xanh, nhiệt độ khoảng 400oC và phần ngoài có màu đỏ,
nhiệt độ khoảng 1700oC => Dùng để tiệt khuẩn dụng cụ

Vòng cấy-Kim cấy: làm bằng kim loại Platin hoặc chrome, thường sử dụng vòng cấy 10 micromet, cấy
định lượng thì khoảng 1 micromet, cầm nghiêng 45 độ đưa vào tâm ngọn lửa đèn cồn, tránh vi khuẩn bắn
ra xung quanh => Dùng để lấy vi khuẩn

Hộp Petri: các môi trường cấy được cho vào hộp.

Ống nghiệm: nắp ống nghiệm được cặp ở ngón tay út vào lòng bàn tay, mở ống nghiệp phải nghiêng một
góc 45o, lấy vi khuẩn phải thực hiện gần đèn cồn.

Kính hiển vi quang học

*Độ chiết xuất: là một đơn vị đo lường tốc độ tương đối của ánh sáng khi nó đi xuyên qua một vật chất .

Bài 2: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

Bác sĩ sẽ chỉ định khi bác sĩ muốn sử dụng thuốc điều trị theo kinh nghiệm của bác sĩ khi chẩn đoán cần
cho thuốc liền.

Kiến thức cần nắm

Nguyên tắc: chất cồn tẩy được màu

tím của vi khuẩn gram âm.

Thuốc nhuộm:

+Tím gentian

+Dung dịch lugol

+Cồn 95o

+Đỏ safranin

Thực hiện:

Làm phết => Gentian (10s) => Rửa nước => DD

lugol (20s, giúp VK giữ màu)=> Rửa cồn 95o (5s,
tẩy màu VK gram âm) => Rửa nước => Đỏ
safranin (10s, VK gram âm bắt màu)=> Rửa nước
=> Thấm khô => Quan sát dưới vật kính X100
 @mihkhar

Ý nghĩa:

+Kết quả chung cuộc sớm

+Kết quả gợi ý

+Kết quả tin cậy để nuôi cấy, phân lập

+Mẫu không cần khảo sát trực tiếp

Đọc kết quả :

Hình dạng Cầu Trực

Song cầu gram âm hình hạt đậu
Màu sắc Gram âm: đỏ
Gram dương: tím Song cầu gram dương hình mũi giáo
Cách sắp xếp Đơn Đơn
Đôi => Song cầu Đôi
Chùm Dây
Chuỗi Đám

Song cầu=> Hình mũi giáo, Gram dương, Xếp đôi

Liên cầu khuẩn,Gram dương,Xếp thành chuỗi

 @mihkhar

Trực khuẩn, Gram âm + Gram dương, Xếp rải (Cầu khuẩn, Gram dương, Xếp thành chùm) + (Trực khuẩn,
rác Gram âm, Xếp rải rác “đơn, đôi, đám”)

Bài 3: PHƢƠNG PHÁP NHUỘM KHÁNG ACID (phƣơng pháp nhuộm Ziehl-Neelsen)

Phương pháp này dành riêng cho một loại trực khuẩn mà ta không thể phân biệt là Gram âm hay Gram
dương => Xét nghiệm thường quy căn bệnh lao (hoặc phong), còn gọi là PP AFB

Kiến thức cần nắm

Mycobateria: trực khuẩn dài, mãnh, phân nhánh hoặc dạng sợi

Vỏ tế bào có 1 lớp dày => 40% lipid => Không ăn màu bất kì thuốc nhuộm nào hết, kháng lại sự xâm
nhập của phẩm nhuộm=> Vỏ lipid sẽ bị giãn nở bởi nhiệt độ

Ăn màu rất chắc với carbonfuchsin (5-10p) hoặc đun nóng và không tẩy màu được

Bệnh phẩm: mẫu đàm (bao gồm: VK thường trú, VK gây bệnh, VK lao, tế bào niêm mạc đường hô hấp=>
tế bào trụ, tế bào niêm mạc miệng => tế bào vẩy, tế bào bạch cầu, nấm) => lao phổi (5ml)

Thuốc nhuộm:

+Carbonfuchsin (đỏ hồng)

+Xanh methylen (màu nền)

+DD cồn-acid (cồn 70o và acid chlohydric 3%) (tẩy

màu)

Thực hiện: phủ carbonfuchsin => hơ lam đến bốc hơi

(10s) => hơ 3 lần => rửa nước để lớp sáp đông lại =>
Tầy màu bằng dd cồn acid => Rửa nước => Phủ
xanh methylen (1p)=> Rửa => Thấm khô.

Kết quả (Là BS phải đọc được KQ):

-Trả lời: có hay không AFB

+TH âm tính: chưa chắc chắn bệnh nhân không mắc bệnh
 @mihkhar

+TH dương tính: chắc chắn bệnh

*Dấu (+) biểu hiện mức độ lây lan trong cộng đồng.

-Một XN có độ đặc hiệu cao, khi (+) => Chắc chắn là

mắc bệnh.

-Một XN có độ nhạy thấp, khi (-) => Quá bình thường.

-Độ nhạy là trong 100 người mắc bệnh, bao nhiêu người
được xác định là (+).

-Độ đặc hiệu là trong 100 người không mắc bệnh, bao
nhiêu người được xác định là (-).

 XN tìm AFB đàm có độ nhạy rất thấp, độ đặc hiệu rất cao, có nghĩa là kết quả (-) rất cao, kết quả
(+) rất thấp, một khi BN (+) thì chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh.

Khi thi: Chỉ có thể quan sát được ở một quang trường nên không xđ được mức độ (+) => Chỉ cần trả lời
có hay không có trực khuẩn kháng acid.

+Nếu có trực khuẩn dài, mảnh, bắt màu đỏ trên nền xanh thì : có trực khuẩn kháng acid

+Không có: Không tìm thấy trực khuẩn kháng acid

Hình ảnh trực khuẩn kháng acid sau thời gian bệnh nhân sử dụng
phác đồ điều trị bệnh => Đứt đoạn trực khuẩn
 @mihkhar

(Hình ảnh nhìn thấy

chỉ là cặn thuốc nhuộm)

Bài 4: PHÂN LẬP VI KHUẨN

Khi bệnh nhân mắc căn bệnh nhiễm trùng đến với bác sĩ => Cần nuôi cấy, phân lập vi khuẩn, định danh
vi khuẩn và lập kháng sinh đồ.

Kiến thức cần nắm

Nguyên tắc: Phân lập vi khuẩn là tách rời VK từ một hỗn hợp dựa trên nguyên tắc làm cạn dần mầm cấy
(áp dụng phương pháp cấy vạch ba chiều).

Môi trường: thạch agar NA (trong TH đối với VK khó mọc: bỏ vào hộp thạch 5% máu cừu hoặc ngựa)

Phương pháp cấy:

-Chia hột thạch thành 4 phần, khử trùng vòng cấy

-Cấy lần 1: Vùng 1,2; 1/3 đường kính => Đốt vòng cấy, để nguội

-Cấy lần 2: Vùng 2,3; 1/3 đường kính => Đốt vòng cấy, để nguội

-Cấy lần 3: vùng 3,4, S còn lại

@mihkhar

-Đặt ngược hộp thạch, ủ 37o, 18-24h.

Khi thi

-Đọc kết quả: Có bao nhiêu loại khúm hoặc bao

nhiêu loại khuẩn lạc? (Lưu ý: Khi xét về kích thước
có bao nhiêu loại VK phải xét trên cùng một đường
cấy, không xét trên 2 đường cấy riêng biệt do tùy
vào mật độ và chất dinh dưỡng => Ảnh hưởng đến
kích thước của VK ở 2 đường cấy khác nhau)

(Đường cấy thứ nhất có vị trí

VK màu vàng là do lượng đường lactose tại đó ít
nên VK chưa kịp lên men
@mihkhar

(Khi chọn tác nhân gây bệnh

thì có 1 loại khuẩn lạc) Thi sẽ ít gặp 3 loại
@mihkhar

Bài 5: KHÁNG SINH ĐỒ

Mục đích là tìm độ nhạy của VK với thuốc kháng sinh

Định tính : Kirby-Bauer

Định lượng:

-Pha loãng trong ống nghiệm

-E-test.

Kiến thức cần nắm

Phương pháp Kirby-Bauer

Nguyên tắc:

-Đĩa giấy tẩm kháng sinh => Khuếch tán => Vòng vô khuẩn

-Đường kính vòng vô khuẩn phản ánh mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh.

Vật liệu

-Đĩa kháng sinh: ĐK = 6mm. Bảo quản bằng ống chứa chất chống ấm to -4oC, chuẩn bị thử nghiệm lấy
ra ở 2-8oC, chuẩn bị làm để ở nhiệt độ phòng từ 1-2h.

*Tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh:

+Đại diện cho nhóm cùng phổ tác dụng

+Tùy thuộc vào loại VK

+Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn

+Chính sách sử dụng kháng sinh từng vùng

-Môi trường: MHA; MHA có trộn máu; pH 7,2-7,4; dung dịch chuẩn độ đục là BaSO42H2O (McFaland
0,5)  108 CFU/ml.

-Mầm cấy:thuần nhất, lấy từ khuẩn lạc sau khi ủ 18-24h (3-4 khúm), 108 CFU/ml

-Vi khuẩn kiếm chứng:

+Chưa có biểu hiện kháng thuốc

+Kiếm tra chất lượng môi trường và đĩa kháng sinh

+Thực hiện // với thử nghiệm KSĐ trên VK phân lập từ bệnh nhân

+Các VK thường sử dụng: ATCC.

@mihkhar

Thực hiện: Dùng tampon vô khuẩn trải VK đều trên hộp thạch MHA => Đặt các đĩa kháng sinh lên => U
ở 35-37 oC từ 18-24h=> Đo ĐK vòng vô khuẩn => So sánh => Kết luận

Khi thi

Ví dụ:

Erythomycine: Đo được là
32mm so với (22-30). Ta cần
hiểu là:

+Từ 22 trở xuống là đề

kháng: Resistant (R)

+Tử 22-30 là trung gian:

Intermediate (I)

+Từ 30 trở lên là nhạy cảm:

Sensitive (S)

 Vậy trường hợp trên kết luận là nhạy cảm

Ý nghĩa:

-Kết quả định tính

- Nhạy cảm (chọn lựa KS sử dụng, phụ thuộc vào cơ địa BN, dược ĐH, dược LH); Đề kháng (không sử
dụng KS); Trung gian (có thể sử dụng được)

Phương pháp pha loãng liên tiếp (có thể pha loãng trong thạch hoặc ống nghiệm)

Nguyên tắc

-Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ kháng sinh và sự tăng trưởng của VK để xác định độ nhạy cảm của
VK đối với kháng sinh.
@mihkhar

-Xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với VK (MIC: minimal ihibitory
concentration) (~ nồng độ kháng sinh thấp nhất mà VK bị ức chế)

Vật liệu:

1ml (0,5 KS 200ucm/mL + 0,5 mtrdd)

-Môi trường dinh dưỡng lỏng (NB)

-Canh cấy VK trẻ

0,5 ml mtr dd
-Kháng sinh pha loãng

0,5 ml KS 200um/mL
-Dụng cụ khác (ống nghiệm,..)

Thực hiện: (chú ý độ đục của mầm cấy chỉ là

105 CFU/mL): theo thứ tự từ 1 đến 10 thì:

-Nồng độ kháng sinh sẽ giảm dần từ 1-9

-Ống 1: không có mtr dinh dưỡng

-Ống 10: không có kháng sinh

-Vi khuẩn cho đều hết vào các ống nghiệm.

-Ống 2-9: đều có KS, MT, VK

Khi thi: đọc ống MIC

*Ống trong cuối cùng là ống có nồng độ kháng sinh

thấp nhất còn có khả năng ức chế được vi khuẩn. (xác
định MIC không đồng nghĩa chúng ta có thế xác định
được vi khuẩn kháng hay không kháng thuốc).

Chú ý:

+Trong trường hợp tất cả các ống đều trong thì đồng
nghĩa với việc kháng sinh pha loãng vẫn đang còn cao,
phải pha loãng thấp dần hơn nữa.

+Trong trường hợp tất cả các ống đều đục là do kháng

sinh đang pha loãng có nồng độ thấp.
@mihkhar

Phương pháp E-test:

Nguyên tắc:

-Là phương pháp khuếch tán trong thạch cải tiến

-Cho kết quả định lượng (MIC)

Ý nghĩa của phương pháp tìm MIC (Pha loãng liên tiếp + E-test):

-Kết quả định lượng

-MIC<Nồng độ KS trong dịch cơ thể => Nhạy cảm

-MIC Nồng độ KS trong dịch cơ thể => Đề kháng (~ VK đòi hỏi nồng độ lớn hơn mới diệt được nhưng
trong điều trị thì nồng độ KS trong cơ thể chỉ đạt ở một mức nhất định).

-Dựa vào MIC để điều chỉnh liều.

BÀI 6: VI KHUẨN ĐƢỜNG RUỘT (Enterobacteriaceae)

Kiến thức cần nắm

Đặc điểm chung: Họ enterobacteriacea đều phải có tất cả các tính chất này:

-Nhuộm Gram: Trực khuẩn gram âm

-Nhóm E.coli gây tiêu chảy: EPEC, ETEC, EIEC, EHEC,
-Đa số di động (Trừ Shigella, Klebsiella, Yersinia) EAEC
-Mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường. -Shigella: nhóm A (S.dysenteriae), nhóm B (S.flexneri),
nhóm C (S.boydii), nhóm D (S.sonnei)
-Hiếu kỵ khí tùy nghi
-Salmonella: S.typhi, S.cholerae, S.enteritidis
-Lên men Glucose
-Yersinia: Y.pestis, Y.enterocolitica,
-Khử Nitrate thành Nitrite
Y.pseudotuberculosis.
-Oxidase (-).
 @mihkhar

Môi trường:

-Mtr chuyên chở (Carry-Blair): lưu giữ bệnh phầm, ít dinh dưỡng, VK không tăng sinh (VKĐR=> mt
Cary-Blair).

-Mtr phong phú: giàu dinh dưỡng, VK tăng sinh (VD:mtr GN (Gram Negative), Selenite F broth, BHI).

-Mtr phân lập (tách rời): phân lập => Chọn khuẩn lạc

+Không chọn lọc: NA, BA (Tất cả các dạng VK đều có khả năng mọc được)

+Chọn lọc: Ít: MC, EMB

Vừa: SS

Cao: Bismuth salfite agar, Brilliant green agar

+Môi trường phân biệt (nhận biết): MC, EMB, SS, BA.

*Làm sao để phân biệt được đâu là VK gây bệnh? Đâu là VK thường trú?  Trong môi trường phân lập,
người ta cho thêm đường Latose vào, những VK nào lên men đường latose sẽ là VK thường trú (xuất hiện
khúm màu hồng hoặc màu tím than), những VK nào không lên men đường latose sẽ là VK gây bệnh

-Môi trường khảo sát tính chất sinh vật hóa học: giúp phát hiện đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn =>
Định danh được vi khuẩn. (VD: KIA, SIM, Citrate, Ure, MR-VP)

Khi thi (Học 3 môi trường phân lập + 5 môi trường sinh hóa): Nắm được ý nghĩa, thành phần, kỹ thuật và
đọc kết quả.

Môi trường phân lập Thành phần Kỹ thuật Ý nghĩa Đọc kết quả
MC (Mac Conkey) -Latose -Cấy vạch ba chiều Khảo sát nhóm -Bao nhiêu loại khúm?
*Ít -Chất chỉ thị màu: đỏ trung tính -Cấy định lượng VK Gram âm
-Latose{
=> Khuẩn lạc lên men lactose có (pha loãng nhiều
màu đỏ lần)
-Muối mật
-Crystal violet
=> Ức chế VK gram dương
EMB (Eosin -Lactose -Cấy vạch ba chiều -Phân lập VK -Bao nhiêu loại khúm?
Methylen Blue) -Chất chỉ thị màu: Eosin Methylen -Cấy định lượng Gram âm
-Lactose{
*Ít Blue -Phát hiện VK
=> Khuẩn lạc E.Coli có màu tím E.Coli -Ánh kim loại: , nếu xuất hiện
than, óng ánh kim loại ván mực trên bề mặt khúm thì
-Methylene Blue => Ức chế VK (+), còn không thì (-)
Gram dương
SS (Shigella, -Lactose -Cấy vạch ba chiều -Khảo sát -Bao nhiêu loại khúm?
Salmonella) -Chất chỉ thị màu: đỏ trung tính => -Cấy định lượng Shigella và
-Lactose{
*Vừa khuẩn lạc lên men latose có màu đỏ Salmonella
-Muối mật=> UC VK Gram dương -Khảo sát VK
-H2S{
-Brilliant Green => ức chế Gram âm
Coliform
-Ferric Citrate => H2S (FeS: màu
đen
@mihkhar

Hình ảnh:
@mihkhar

Choose the correct answer:

1. E.coli không có tính chất nào trong họ VK đường ruột:

A. Trực khuẩn gram âm
B. Di động
C. Mọc được trên môi trường MC
D. Glucose (+)
E. Hiểu kỵ khí tùy nghi
F. Khử nitrite thành nitrate ()
2. Salmonella có hình thái cấu trúc nào sau đây
A. Trực khuẩn gram âm ()
B. Trực khuẩn gram dương
C. Cầu khuẩn gram âm
D. Cầu khuẩn gram dương
3. Trong bốn loại VKĐR sau, loại nào có khả năng chuyển động?
A. Klebsiela
@mihkhar

B. Shigella
C. Yersinia
D. Proteus mirabilis ()
4. Yersinia có khả năng lên men đường nào sau đây?
A. Latose
B. Mantose
C. Fructose
D. Glucose ()
5. Môi trường nào sau đây là môi trường chuyên chở của Vi khuẩn đường ruột?
A. Cary-Blair ()
B. Gram Negative
C. BHI
D. MC
6. Môi trường nào sau đây là môi trường phân lập chọn lọc mức độ vừa?
A. NA
B. MC
C. SS ()
D. EMB
7. Môi trường nào sau đây là môi trường phân lập chọn lọc mức độ cao?
A. Brilliant Green Agar ()
B. Chocolate Agar
C. Blood Agar
D. Cary-Blair
8. Trong 3 loại môi trường sau, môi trường nào là môi trường phân lập mức độ vừa?
A. MC
B. EMB
C. SS ()
D. BA
9. Chỉ thị màu trong môi trường SS là chỉ thị màu nào sau đây?
A. Đỏ phenol
B. Đỏ trung tính ()
C. Eosin methylene blue
D. Bromothymol blue.
10. Môi trường phân lập nào giúp dễ nhận biết khuẩn lạc E.Coli?
A. MC
B. BA
C. EMB ()
D. NA
11. Chỉ thị màu trong môi trường EMB là chỉ thị màu nào sau đây?
A. Bromothymol blue
B. Eosin methylene blue ()
C. Đỏ phenol
D. Đỏ trung tính
12. Trong môi trường EMB, có loại đường nào sau đây?
 @mihkhar

A. Glucose
B. Mantose
C. Lactose ()
D. Fructose
13. Môi trường nào sau đây giúp phân lập được nhóm vi khuẩn gram âm?
A. MC ()
B. EMB ()
C. SS ()
14. Để tạo được khuẩn lạc Shigella, cần cấy Shigella ở môi trường nào sau đây?
A. MC ()
B. EMB ()
C. SS () (Riêng mtr SS thì khi cấy chỉ mọc được Shigella)
D. BA
15. Môi trường MC, EMB, SS, ta sẽ chọn kĩ thuật cấy nào sau đây?
A. Cấy vạch ba chiều
B. Cấy định lượng
C. Cấy trán
 Môi trường không quyết định cách cấy, mẫu bệnh phẩm mới quyết định cách cấy.
16. Môi trường SS đọc bao nhiêu thông tin?
A. 1
B. 2
C. 3 ()
D. 4

Môi trường Thành phần Kỹ thuật Ý nghĩa Đọc kết quả

sinh hóa
KIA (mtr đặc) -Glucose/ Latose=1/10 Đâm thẳng tới Khảo sát Glucose
-Glucose (đứng){
-Chỉ thị màu: Đỏ phenol đáy ống (đứng), Lactose
-H2S nghiệm=> Cấy (nghiêng), H2S
-Gas zig zag, nhiệt độ (đen), Gas (bọt) -Lactose(nghiêng){
37oC, 18-24h
-H2S{

-Gas{
SIM -Sinh H2S=> Đen Cấy 2/3 thạch -Phát hiện VK H2S
-H2S{
(Sulfurhydro- -Di động => Đục lan ra ngoài -Khảo sát sự di
Indol-Motility) đường cấy động của VK
-Indol{
(mtr bán lỏng) -Tryptophan => Indol (+Kovac’s -Sinh men
=> màu đỏ) +A.pyruvic Tryptophase -Di động{
Citrate (mtr -Muối citrate Cấy zig zag Khảo sát VK sử
-Citrate{
đặc) -Chỉ thị màu: bromothymol blue dụng carbron làm
-Xanh lá cây (pH=6,9) => Xanh nguồn năng lượng (Chỉ cần là có màu xanh dương=> (+))
dương (pH=7,6) duy nhất
Ure (mtr lỏng) -Chất chỉ thị màu: Đỏ phenol Lấy khuẩn lạc bỏ Khảo sát VK tiết
-Ure{
Ure=>NH3(+H2O=NH4OH)+CO2 vào môi trường được men Urease
-Đỏ nhạt (pH=6,8) => Đỏ cánh sen
(pH=8,1)
 @mihkhar

MR-VP (Methy MR: Khảo sát VK sinh

MR{
Red-Voges- (+): VK lên men Glucose mạnh => acid lactic.
Proskauer) (mtr pH<4,2 (đỏ), sp tạo thành là acid Vi khuẩn chỉ đi một
VP{
lỏng) lactic trong 2 con đường
VP: (hoặc MR hoặc VP) Hoặc MR(+), VP(-)
Glucose=>Acetymethycarbinol=> Hoặc MR(-), VP(+).
Diacetyl (+ -napthol)=>Hợp chất
màu đỏ
-KOH dùng để thử lại bằng cách
trung hòa hợp chất đã đổ methy
red

Đọc kết quả:

@mihkhar
@mihkhar

Choose the correct answer:

1. Môi trường nào sau đây sẽ cấy thẳng xuống đáy ống nghiệm?
A. KIA ()
B. SIM
C. Citrate
D. MR-VP
2. Môi trường nào giúp phát hiện VK sinh H2S?
A. KIA ()
B. SIM ()
C. Citrate
D. MR-VP
3. Môi trường nào giúp khảo sát sự di động của VK?
A. KIA
B. SIM ()
C. Citrate
D. MR-VP
4. Môi trường nào giúp phát hiện VK sử dụng carbon là nguồn năng lượng duy nhất?
A. KIA
B. SIM
C. Citrate ()
D. MR-VP
5. Chỉ thị màu trong môi trường citrate là:
A. Đỏ trung tính
@mihkhar

B. Đỏ phenol
C. Bromothymol Blue ()
D. Promo Methylene Blue
6. Chỉ thị màu trong môi trường Ure là:
A. Đỏ trung tính
B. Bromothymol Blue
C. Đỏ phenol ()
D. Đỏ cánh sen
7. Môi trường nào sau đây là môi trường bán lỏng?
A. KIA
B. SIM ()
C. Citrate
D. MR-VP
8. Môi trường nào sau đây là môi trương đặc?
A. KIA ()
B. SIM
C. Citrate ()
D. MR-VP
9. Tỉ lệ đường Glucose/Lactose trong môi trường KIA là:
A. 1/10 ()
B. 1/100
C. 10
D. 100
10. Chỉ thị màu nhận biết trong môi trường KIA là chỉ thị màu nào sau đây?
A. Đỏ phenol ()
B. Đỏ trung tính
C. Xanh methylene
D. Bromothymol Blue
11. Thành phần nào trong môi trường KIA giúp phát hiện sinh H2S?
A. Lactose
B. FeS ()
C. H2S
D. Glucose
12. Môi trường nào cấy 2/3 thạch?
A. KIA
B. SIM ()
C. Citrate
D. MV-VP
13. Môi trường nào phát hiện được VK sinh được Urease?
A. KIA
B. SIM
C. Citrate
D. Ure ()
14. Môi trường nào phát hiện được VK sinh men tryptophanase?
@mihkhar

A. KIA
B. SIM ()
C. Citrate
D. Ure

*Quy triình định danh VK: Bệnh phẩm => Cấy phân lập (MC, EMB, SS) => Chọn khúm, nhuộm gram
=> Thử nghiệm sinh hóa => Cấy vào mtr sinh hóa => Định danh, lập KSĐ

*Cách lấy bệnh phẩm

-Đúng thời điểm

-Đúng nơi

-Đúng cách

-Bảo quản đúng

-Vật chứa bệnh phẩm thích hợp

BÀI 7: ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN

Kiến thức cần nắm

Các thử nghiệm định danh cầu khuẩn Gram dương (Chủ yếu nắm nguyên tắc và cách đọc kết quả):

1. Tiêu huyết:

Nguyên tắc:

-Một số loại VK sinh hemolysin làm ly giải hồng cầu

-Steptococci gây ly giải hồng cầu hoàn toàn (tiêu huyết ) hoặc không hoàn toàn (tiêu huyết )

-Quan sát trên môi trường Blood Agar

Đọc kết quả:

 @mihkhar

Hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu

Tiêu huyết 𝛽 (tiêu huyết hoàn toàn) huyết sáng

Hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu Không tạo vòng tiêu huyết
huyết mờ, hơi ánh lên màu xanh, vàng.

2. Thử nghiệm Catalase (Không thử nghiệm được trên môi trường thạch máu=> Gây (+) giả)

Nguyên tắc:

2H2O2 2H2O +O2 (sủi bọt) (pư do men Catalase thủy phân)

-Men catalase chỉ có ở tụ cầu, dùng để phân biệt tụ cầu với liê ncầu và phế cầu

Đọc kết quả:

 @mihkhar

3. Thử nghiệm Coagulase: dùng để định danh tụ cầu vàng (phân biệt S.aureus với các Staphylococci
khác)

Nguyên tắc:

-Coagulase gây đông huyết tương

-Coagulase hiện diện dưới 2 dạng:

+Coagulase tự do

+Coagulase liên kết

Đọc kết quả:

Thử nghiệm trên lam => Tìm Coagulase liên kết Thử nghiệm trong ống nghiệm => Tím Coagulase tự do

4. Thử nghiệm lên men Mannitol

Nguyên tắc:
@mihkhar

-S. aureus có khả năng lên men đường mannitol trên mtr MSA, acid sinh ra sẽ làm đổi màu môi
trường từ đỏ sang vàng.

-Môi trường MSA (Mannitol Salt Agar): NaCl 7,5%, Mannitol, Chất chỉ thị màu đỏ phenol.

Đọc kết quả:

5. Thử nghiệm Taxo A

Nguyên tắc: Streptococcus tiêu huyết nhóm A

(S.pyogennes) nhạy cảm với bacitracin => Phân biệt
Streptococcus tiêu huyết nhóm A với các
Streptococcus thuộc nhóm khác.

Đọc kết quả:

6. Thử nghiệm Taxo P

Nguyên tắc:Pneumococci nhạy cảm với Optochin=>

Phân biệt Pneumococcus với các Streptococcus tiêu
huyết khác.

Đọc kết quả

7. Thử nghiệm kháng Novobiocin

Nguyên tắc: S.saprophyticus đề kháng với novobiocin

Đọc kết quả:

@mihkhar

8. Thử nghiệm CAMP

Nguyên tắc: Streptococci nhóm B tiết ra yếu tố

CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với

-hemolysin của S.aureus.

Đọc kết quả:

9. Thử nghiệm Bile-Esculin

Nguyên tắc:

Đọc kết quả:

Màu đen (+)

Không có màu đen (-)

@mihkhar

10. Thử nghiệm tan trong muối mật

Đọc kết quả:

11. Thử nghiệm ASLO

Nguyên tắc:

-Độc tố Streptolysin O của liên cầu gây ly giải hồng cầu

-Kháng thể ASLO có khả năng trung hòa độc tố streptolysin O, do đó hồng cầu không bị ly giải

-Thử nghiệm ASLO xác định hiệu giá Kháng thể ASLO trong huyết thanh bệnh nhân.

Đọc kết quả:

-Không tan máu (+)

-Tan máu (-)

12. Thử nghiệm phồng nang:

Nguyên tắc:

-Pneumococcus gây bệnh có lớp vỏ nang bên ngoài tế bào

-Lớp vỏ này sẽ phồng to ra khi gặp kháng thế tương ứng.

Đọc kết quả:

@mihkhar

Cầu khuẩn

*Staphylococci (Tụ Cầu Khuẩn):

Đặc điểm:

-Cầu khuẩn Gram dương (+), chùm nho

-Môi trường nuôi cấy thông thường

-Mọc được NaCl 7,5% (tính chất mà nhóm cầu khuẩn gram dương khác không có)

-30 loại, thường gặp là: S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus,..

Tính chất sinh hóa:

-Gây tiêu huyết (tiết hemolysin) hoặc không tiêu huyết trên môi trường BA

-Thử nghiệm Calase (+), phân biệt với liên cầu, phế cầu.

-Mọc được trên môi trường MSA (NaCl 7,5%)

*Streptococci (Liên Cầu Khuẩn)

-Cầu khuẩn Gram dương (+), xếp thành chuỗi

-Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng

-Mọc ở khí trường 5-10% CO2 (ủ bình nến)

-Gây tiêu huyết , tùy VK trên môi trường BA

@mihkhar

*Pneumococci (Phế cầu khuẩn)

-Cầu khuẩn gram dương (+), hình ngọn nến, xếp đôi

-Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng

-Mọc ở khí trường 5-10% CO2 (ủ bình nến)

-Tiêu huyết trên môi trường BA

*Song cầu Gram âm (Neisseria)

@mihkhar

-Gram âm (-), hạt coffee, đứng thành đôi, mặt lõm

quay vào nhau

-Môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng

-Mọc ở khí trường 5-10% CO2

Tính chất sinh hóa:

Oxidase (+)

Calalase (+)

Test lên men đường nhanh

BÀI 8: THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH HỌC CHẨN ĐOÁN BỆNH GIANG MAI

Xoắn khuẩn:

-Borrelia: B. recurrentis => Sốt hồi quy

-Treponema: T. pallidum => Bệnh giang mai

-Leptospira => Bệnh leptospira.

Kiến thức bổ sung về bệnh giang mai:

-Tác nhân: Xoắn khuẩn Treponema pallidum, phân lập 1905

+Hình sóng sin

+Chuyển động xoay tròn

+Không nuôi cấy được

-Gồm:
@mihkhar

+Giang mai mắc phải: thời kí 1 => thời kì 2 => thời kì 3

Thời kì Thời kì 1 Thời kì 2 Thời kì 3

Đặc điểm -Từ 10-90 ngày sau khi -Từ 2-12 tuần sau khi -Từ vài năm-vài chục
nhiễm khuẩn có săng năm
-Có săng giang mai, -Sốt, rụng tóc, nốt -Gôm giang mai, ít lây
hạch hồng ban
-Lây lan mạnh -Lây lan mạnh
+Giang mai bẩm sinh: Xoắn khuẩn qua nhau thai => Sẩy thai, thai chết lưu, thai đẻ non + Giang mai
bẩm sinh sớm/muộn.

Kiến thức cần nắm

Thử nghiệm không đặc hiệu:

Nguyên tắc: Dùng kháng nguyên cardiopipin tìm reagin trong máu bệnh nhân

Gồm:

-Phản ứng lên bông VDRL (Veneral Disease Research Laboratories)

-Phản ứng kết hợp bổ thể BW (Bordet-Wassemann)

-Phản ứng ngưng tụ RPR (Rapid Plasma Reagin)

Đối với phản ứng ngưng tụ RPR, thì:

-Nguyên tắc: Dùng kháng nguyên cardiopipin gắn trên hạt carbon tìm kháng thể reagin trong máu
bệnh nhân.

-Bộ thuốc thử:

-Thực hiện: Trộn huyết thanh của bệnh nhân và vài giọt dung dịch chứa kháng nguyên gắn hạt carbon
=> Để lên máy lắc trong vòng 1p

-Đọc kết quả

@mihkhar

+Kết cụm các hạt màu đen => (+)

+Không kết cụm => (-)

Thử nghiệm đặc hiệu:

Gồm:

-TPI (Treponema pallidum immobillisation) (dùng chủ yếu trong nghiên cứu)

-FTA (Flourescene Treponema Antibody) (Thử nghiệm kháng thể huỳnh quang) (so complex and
expensive => For study and research)

-TDIA (Treponema pallidum immunoadherence)

-TPHA (Treponema pallidum hemmaglutination assay) (phổ biến)

Đối với thử nghiệm TPHA:

-Nguyên tắc: Dùng hồng cầu già đã được phủ kháng nguyên Treponema pallidum (dòng Nichol) có
thể liên kết với kháng thể chuyên biệt có trong huyết thanh của bệnh nhân. => Phát hiện kháng thể
đặc hiệu của xoắn khuẩn giang mai trong máu bệnh nhân.

-Bộ thuốc thử:

-Đọc kết quả: Thử nghiệm cho kết quả định tính và định lượng
@mihkhar

+Thử nghiệm định tính: Nhỏ tế bào thử

nghiệm và huyết thanh của BN vào giếng,
sau đỏ đem ủ

+Thử nghiệm định lượng:

Đọc kết quả:

Hồng cầu kết thành mạng bao phủ toàn bộ đáy giếng => (+)

Hồng cầu đọng thành nút đỏ => (-)

Đọc ở giếng dương tính cuối cùng, nồng độ huyết thanh pha loãng => Hiệu
giá kháng thể (tử luôn là 1, mẫu số càng lớn chứng tỏ nồng độ kháng thể
trong huyết thanh của người đó càng cao)
Nhận định kết quả phản ứng kháng nguyên kháng thể:

-KQ định tính

-KQ định lượng: pha loãng huyết thanh, nồng độ nào thấp nhất cho dương tính => Hiệu giá kháng thể

-Ranh giới hiệu giá:giá trị hiệu giá trung bình trong một quần thể người nhất định (ngoài cộng đồng)

-KQ dương tính giả: KQ xét nghiệm dương tính nhưng thực sự không có kháng thể

-KQ âm tính giả: trong máu BN có kháng thể nhưng kết quả lại âm tính

-XN sàng lọc/ XN xác định:

@mihkhar

+XN sàng lọc: Dùng các xét nghiệm không đặc hiệu để sàng lọc ngoài cộng đồng (có thể xuất hiện
dương tính giả)

+XN xác định: Dùng các xét nghiệm đặc hiệu để loại ra số người dương tính giả.

Kiến thức cần lưu ý:

Một số lưu ý về xét nghiệm huyết thanh học:

-XN HTH => Tìm kháng thể trong máu

-Thời gian xuất hiện kháng thể: (IgG + IgM => Liên quan mật thiết với tình trạng nhiễm trùng, trong
đó IgG là kháng thể duy nhất được truyền từ bà mẹ qua nhau thai)

-Hiệu giá kháng thể

-Lấy máu 2 lần