Nghiên cứu Y học Y Học TP.

Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018

SẢN XUẤT KHÁNG THỂ IgY TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ

ĐẶC HIỆU H. PYLORI
Phạm Hùng Vân1,2, Phạm Thái Bình1,3, Trương Thị Diệu Hồng1,4, Lê Thúy Quyên1, Lưu Ly Bích Ngân1,
Trần thị Kiều1, Trần thị Kiều Thảo1, Đặng Hồng Phúc5, Phạm Thiên Hương6, Phạm Trường Sơn7,
Nguyễn Hữu Huân8, Simon M. Cutting9,10

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Tại Việt Nam, tình hình vi khuẩn H. pylori đề kháng các kháng sinh đặc trị và thông dụng như
clarithromycin, metronidazole, levofloxacin ngày càng gia tăng và hậu quả thất bại điều trị ngày càng ghi nhận
càng nhiều. Chính vì vậy giải pháp sử dụng IgY đặc hiệu H. pylori hiện đang được các bác sĩ quan tâm.
Mục tiêu: Sản xuất được kháng thể IgY đặc hiệu H. pylori từ lòng đỏ trứng đẻ từ gà mái được gây miễn
dịch bằng đường chích vi khuẩn H. pylori.
Vật liệu và phương pháp: Kháng nguyên là H. pylori được trộn với tá chất Freund rồi chích gây miễn dịch
cho gà. Trứng được lấy từ 1 tháng sau mũi chích đầu tiên. Tách lòng đỏ và trộn đều vào 8 thể tích nước để tách
lấy IgY tan trong phase nước, sau đó tủa IgY bằng 40% ammonium sulfate bảo hòa hay 70% NaCl bảo hòa. Thu
tủa rồi thẩm tích loại bỏ muối. Điện di qua SDS-PAGE để kiểm tra độ tinh khiết của IgY. Định lượng IgY bằng
OD260. Định lượng hiệu giá kháng thể IgY đặc hiệu bằng ELISA phủ vi khuẩn H. pylori. Xác định hoạt tính
ngưng tụ H. pylori bằng phản ứng tụ trên lame kính, và xác định hoạt tính ức chế urease của kháng thể IgY đặc
hiệu H. pylori bằng phương pháp sử dụng CLO test.
Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp tách IgY từ lòng đỏ trứng bằng nước cho
hiệu quả tách được 100% IgY qua kết quả định lượng protein lên đến 395mg/trứng. Phương pháp tủa với muối
ammonium sulfate là thu được IgY gần như tinh khiết vì đã loại gần hết các protein khác. Phương pháp tủa bằng
NaCl cũng hiệu quả nhưng kém hơn. Kết quả ELISA cho thấy sau 1 tháng kể từ mũi chích đầu tiên gây miễn
dịch, hiệu giá IgY đặc hiệu đã đạt 1/12,800 và sau 3 tháng đã đạt hiệu giá tối đa là 1/25,600. Kết quả tụ trên kính
và kết quả trên CLO test cũng cho thấy IgY đặc hiệu H. pylori thu được từ lòng đỏ trứng là có hoạt tính gây kết
tụ H. pylori cũng như ức chế enzyme urease và các hiệu quả này chắc chắn sẽ phát huy tác dụng nếu sản phẩm
được sử dụng in-vivo.
Kết luận: Do tình hình đề kháng các kháng sinh của H. pylori tại Việt Nam ngày càng cao và càng gia tăng,
nhu cầu sử dụng IgY đặc hiệu H. pylori bằng đường uống sẽ rất cao. Do các hạn chế về công nghệ nên chưa có
một công ty sản xuất trong nước nào sản xuất được sản phẩm này. Chính vì vậy nghiên cứu với các kết quả thu
nhận được chính là một mở đầu cho sản phẩm mới áp dụng trong hổ trợ kháng sinh để điều trị viêm loét dạ dày
do H. pylori tại Việt Nam.
Từ khóa: Sản xuất IgY, IgY đặc hiệu H. pylori

1 2 3
Công ty Nam Khoa, Đại Học Phan Châu Trinh, Đại Học Y Dược TP. HCM,
4 Công ty Bioland, 5 Bệnh viện Pháp Việt, 6 Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch,
7 8 9
Đại Học Sydney, Đại Học Bang Arizona, Royal Holloway Đại Học Luân Đôn,
10
Công ty Sporogen
Tác giả liên lạc: TS. BS. Phạm Hùng Vân, ĐT: 0903698920 email: phhvan.nkbiotek@gmail.com
100
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học

ABSTRACT
PRODUCTION OF IGY SPECIFIC FOR H. PYLORI FROM THE EGG YOLK
Pham Hung Van, Pham Thai Binh, Truong Thi Dieu Hong, Le Thuy Quyen, Luu Ly Bich Ngan,
Tran Thi Kieu, Tran Thi Kieu Thao, Dang Hong Phuc, Pham Thien Huong, Pham Truong Son,
Nguyen Huu Huan, Simon M Cutting * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 100- 110

Background: In Vietnam, H. pylori resistance to common and first-line antibiotics such as clarithromycin,
metronidazole, and levofloxacin is increasing and the treatment failure consequences are increasingly recognized.
Therefore, the using of IgY specific for H. pylori is currently being considered by physicians.
Aim of the study: Production of H. pylori-specific IgY antibody from egg yolk taken from eggs delivered
from H. pylori immunized hens
Materials and methods: The antigen is H. pylori mixed with Freund adjuvants and then immunized to
chickens by injection. Eggs are taken from one month after the first injection. Remove the yolk and mix into 8
volumes of water to isolate the IgY that were dissolved in the water phase, then precipitate IgY by 40% saturated
ammonium sulfate or 70% saturated NaCl. Collect the precipitate and then remove the salt by dialysis. SDS-
PAGE to check the purity of IgY. Quantify the amount of the collected IgY by OD260. Determination the titer of
the H. pylori specific-IgY by ELISA coated with H. pylori. Confirm the agglutination activity of the H. pylori
specific IgY by the agglutination on glass slides, and determination of urease inhibitory activity of H. pylori-
specific IgY antibody by CLO test method.
Results and discussions: The received results showed that the method of extracting IgY from egg yolk by
water could collect 100% IgY, demonstrated by quantifying the protein up to 395mg/egg yolk. The method of
precipitation with ammonium sulfate salts could obtain pure IgY as it eliminated most of the other proteins.
Precipitation with NaCl was quite good but less effective. ELISA results showed that 1 month after the first
immunization, H. pylori specific-IgY could reach the titer of 1/12,800 and after 3 months, reached a maximum
titer of 1/25,600. The results of the glass slide agglutination and on the CLO test also showed that H. pylori-
specific IgY from egg yolk is active in H. pylori agglutination as well as inhibition of urease activity, and these
effects will undoubtedly works if the product is used in-vivo.
Conclusions: As the antibiotic resistance of H. pylori in Vietnam is increasing days by days, the demand for
H. pylori-specific IgY by oral route will be high. Due to technological constraints, there is no domestic company
producing this product. Therefore, research with the results obtained is a start for new products applied in
supportive treatment to the gastric ulcer or gastro-duodenal ulcer caused by H. pylori in Vietnam.
Key words: Production of IgY, H. pylori specific IgY
ĐẶT VẤN ĐỀ là tác nhân gây viêm loét dạ dày nên các bác sĩ
phải chỉ định kháng sinh trong phát đồ điều trị
H. pylori là tác nhân gây viêm loét dạ dày tá bệnh nhằm mục đích tiệt trừ vi khuẩn. Tuy
tràng với cơ chế sinh bệnh chính là vi khuẩn tiết nhiên hiện nay H. pylori đã phát triển đề kháng
ra urease làm kiềm hóa môi trường acid của dạ nhiều kháng sinh chủ yếu trong phát đồ điều trị
dày để tồn tại và bám được trên niêm mạc, dùng như clarithromycin, metronidazole, và
các yếu tố độc như cagA và vacA gây hư hại các levofloxacin với tỷ lệ được ghi nhận ngày càng
tế bào biểu mô dạ dày để gây các sang thương cao tại Việt Nam, và đây là lý do chính yếu gây
loét, thậm chí gây loạn sản với hậu quả sinh ung nên các thất bại điều trị. Chính vì vậy đang có
thư dạ dày. Nhờ phát hiện được H. pylori chính nhiều nổ lực tìm thêm các giải pháp để hổ trợ

101
Nghiên cứu Y học
kháng sinh trong điều trị đặc hiệu và tiệt trừ H.
pylori và một trong những giải pháp đang là
khuynh hướng hiện nay là sử dụng IgY đặc hiệu
H. pylori trích từ lòng đỏ trứng gà đẻ ra từ các gà
mái đã được gây miễn dịch bằng vi khuẩn H.
pylori đường chích. Đặc điểm của IgY là có thể
bền vững ở pH 4-5 của dạ dày nên có thể dùng
bằng đường uống. Nhờ tính chất miễn dịch đặc
hiệu với H. pylori nên IgY sẽ làm ngưng tập, cản
trở khả năng di động, làm cho vi khuẩn không
bám được lên niêm mạc dạ dày và dễ bị thực bào
trong sang thương. Cuối cùng do đặc hiệu với
urease của H. pylori nên IgY trung hòa được hoạt
tính của enzyme này, nhờ vậy cản trở khả năng
vi khuẩn sống và bám được lên niêm mạc dạ dày
để gây các sang thương loét hay dị sản tế bào
niêm mạc.
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của nghiên cứu này là sản xuất
được IgY đặc hiệu H. pylori từ lòng đỏ của trứng
được đẻ ra từ các gà mái được gây miễn dịch
bằng đường chích các vi khuẩn H. pylori. Các
mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là: (1) Đánh giá
được hiệu giá của kháng thể IgY đặc hiệu vi
khuẩn H. pylori có trong lòng đỏ của trứng đẻ ra
từ gà mái được gây miễn dịch; (2) Định lượng
được số lượng IgY có trong lòng đỏ trứng; (3)
Đánh giá được hiệu quả của IgY đặc hiệu H.
pylori gây ngưng tập cũng như trung hòa được
enzyme urease sinh ra từ H. pylori.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Gà mái được gây miễn dịch là giống gà siêu
trứng đang đẻ ở 30 tuần tuổi. Kháng nguyên gây
miễn dịch cho gà được chế từ chủng H. pylori
phân lập từ bệnh nhân, đã được định danh
chính xác và xác định cagA [+], vacA [+] bằng kỹ
thuật real-time PCR thực hiện tại phòng thí
nghiệm dịch vụ của công ty Nam Khoa. Kháng
nguyên được làm nhủ hóa với adjuvant Freund
và được chích vào ức và đùi gà vào các ngày 0,
10, 20, 30 và sau đó mỗi 2 tháng. Gây miễn dịch 5
gà và để lại 2 gà không gây miễn dịch làm
chứng. Bắt đầu từ ngày 30 cho đến 3 tháng sau
102
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018
mũi chích đầu tiên thì thu trứng lấy lòng đỏ để
tách chiết IgY. Để tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
thì trước hết lòng đỏ được pha với 8 thể tích
nước cất và trộn đều trong tủ 4oC có lắc trong 24
giờ, sau đó quay ly tâm lấy dịch nổi, lọc qua giấy
lọc để loại bỏ cặn và váng mở, sau đó lọc qua lọc
vô trùng 0.2. Tách IgY từ dịch nổi bằng phương
pháp tủa với 2 phương pháp là dùng 40% dung
dịch ammonium sulfate bảo hòa hay dùng 70%
dung dịch NaCl bảo hòa. Tủa được hòa tan trong
PBS để đạt thể tích 1/10 so với thể tích ban đầu,
sau đó thẩm tích để loại muối bằng PBS. Kiểm
tra độ tinh sạch của IgY bằng điện di SDS-PAGE.
Định lượng protein tổng trong dung dịch IgY
tinh sạch bằng phương pháp đo OD ở bước sóng
280nm với đường chuẩn xây dựng từ các dung
dịch chứa BSA đã biết nồng độ. Ngoài cách làm
tinh sạch IgY ở trên, lòng đỏ trứng thu được từ
gà không gây miễn dịch và gà được gây miễn
dịch ở các thời điểm 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng
sau mũi chích đầu tiên cũng được làm đông khô
thành bột. Định lượng hiệu giá kháng thể đặc
hiệu H. pylori có trong các tách chiết IgY trước và
sau tủa cũng như có trong lòng đỏ trứng đông
khô bằng kỹ thuật ELISA với kháng nguyên phủ
trên giếng là huyền dịch H. pylori rồi sử dụng
cộng hợp là kháng thể đặc hiệu IgY gắn men
HRPO để phát hiện sự hiện diện của phức hợp
kháng nguyên kháng thể. Với các tách chiết IgY
thì pha loãng ban đầu trong PBS là 1/10 (trước
tủa) và 1/100 (sau tủa). Với các lòng đỏ trứng
đông khô thì độ pha loãng ban đầu là 1/10 tức là
lấy 100mg lòng đỏ trứng đông khô pha trong
PBS để đạt 1ml. Hiệu giá kháng thể IgY đặc hiệu
H. pylori được định nghĩa là độ pha loãng cao
nhất của mẫu thử chứa IgY đặc hiệu H. pylori còn
cho được kết quả dương tính trên giếng ELISA
so với giếng chứng là giếng chỉ thử với lòng đỏ
trứng thu từ gà mái không được gây miễn dịch.
Để xác định hiệu quả ức chế urease của IgY,
trước hết chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn H. pylori
đạt nồng độ McF. 4 gặt từ hộp thạch cấy vi
khuẩn được 3 ngày ủ, sau đó trộn 1 thể tích
huyền dịch vi khuẩn với 1 thể tích các độ pha
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học

loãng dung dịch IgY tinh sạch trước và sau tủa,
cũng như với dung dịch lòng đỏ trứng đông khô
được chuẩn bị như trên rồi thử xem hoạt tính
urease của huyền dịch vi khuẩn có bị trung hòa
hay không bằng cách thử nghiệm trên NKPylori
test với mẫu thử là que giấy thấm dày 0.5mm
kích thước 1 x 5mm thấm hổn hợp trên cho vào
giếng NKPylori rồi ghi nhận thời gian xuất hiện
kết quả dương tính màu đỏ cánh sen. Cuối cùng
phát hiện hiệu quả gây ngưng tập vi khuẩn H.
pylori của IgY đặc hiệu có trong các tách chiết IgY
trước tủa và sau tủa bằng phương pháp ngưng
tụ trên lame kính. Thực hiện bằng cách trộn 20µl
huyền dịch H. pylori gặt tươi từ hộp thạch nuôi
cấy với 20µl các tách chiết IgY trước tủa hay sau
tủa (pha loãng 1/2, 1/5 và pha loãng 1/10) rồi
quan sát hiện tượng tụ qua mắt thường và qua
kính hiển vi qua phết nhuộm Gram sau khi để
khô và gắn lên lame kính bằng nhiệt. Kết quả
nhuộm Gram được chụp hình qua kính hiển vi.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả tách chiết IgY
Kết quả tách chiết IgY qua diên di SDS-
PAGE được trình bày trong hình 1 dưới đây.
Phân tích kết quả trên hình 1 chúng ta thấy
rằng dung dịch tách chiết IgY bằng phương
pháp tủa với ammonium sulfate hay bằng
NaCl đều có hai thành phần chủ yếu, một
thành phần có trọng lượng phân tử #60-70KD,
và một thành phần có trọng lượng phân tử #
dưới 20KD, tương đương trong lượng phân tử
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của IgY là 65.1KD và
18.7KD. Như vậy chúng ta có thể nói rằng qui
trình tách chiết IgY là hoàn toàn thành công và
dung dịch tách chiết chỉ chứa chủ yếu là IgY
mà ít các thành phần protein khác. Cũng trên
hình 1, so sánh kết quả tách chiết bằng phương
pháp tủa với ammonium sulfate và phương
pháp tủa với NaCl, kết quả điện di SDS-PAGE
cho thấy phương pháp sử dụng ammonium
sulfate thu được IgY nhiều hơn phương pháp
sử dụng NaCl.

Hình 1: Hình điện di SDS-PAGE sản phẩm tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà đã gây miễn dịch với vi khuẩn H.
pylori. Các mẫu tách chiết IgY với phương pháp tủa bằng ammonium sulfate được pha ở các độ pha loãng 1/2
(lane 3), 1/4 (lane 2 và 6), 1/8 (lane 1 và 5), 1/16 (lane 4). Các mẫu tách chiết IgY với phương pháp tủa bằng NaCl
được pha ở các độ pha loãng 1/2 (lane 10), 1/4 (lane 7 và 11), 1/8 (lane 8 và 12), 1/16 (lane 9)

103
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018

Kết quả định lượng IgY có trong lòng đỏ trứng

Bảng 1: Giá trị OD280 của các nồng độ BSA và các tách chiết IgY (được pha loãng 1/5 trong PBS)
Nồng độ BSA (mg/ml) 20 10 5 2 1
OD280 9.96 5.186 2.522 0.999 0.491
OD280 của tách chiết IgY bằng ammonium sulfate (pha loãng 1/5) 4.436
OD280 của tách chiết IgY bằng NaCl (pha loãng 1/5) 2.210
OD280 của tách chiết IgY chưa qua tủa (không pha loãng) 2.997

Biểu đồ 1: Đường biểu diễn chuẩn của nồng độ BSA với OD280, từ đó tình được nồng độ IgY có trong các dịch
tác chiết IgY dựa trên OD280 đo được trên các dịch tách chiết này.
Bảng 2: Hiệu giá kháng thể IgY đặc hiệu H. pylori hiện diện trong các mẫu thử
Mẫu thử Hiệu giá
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (trước tủa) 1/25.600
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với ammonium sulfate) 1/25.600
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với NaCl) 1/12.800
Lòng đỏ trứng đông khô ở gà không gây miễn dịch Tương đương chứng [-] là NS
Lòng đỏ trứng đông khô 1 tháng sau mũi chích đầu tiên 1/12.800
Lòng đỏ trứng đông khô 3 tháng sau mũi chích đầu tiên 1/25.600
Lòng đỏ trứng đông khô 6 tháng sau mũi chích đầu tiên 1/25.600
Các dịch tách chiết IgY bằng phương pháp đó thu được 2000ml dịch tách chiết trước tủa và
tủa với ammonium sulfate và phương pháp 200ml dịch tách chiết IgY sau tủa, từ đó có thể
muối ăn được định lượng bằng các đo mật độ tính ra lượng IgY tách chiết được trong mỗi
quang (OD) ở bước sóng 280nm và tính toán trứng là 320mg với phương pháp tủa bằng
theo đường chuẩn dựng bởi OD các nồng độ ammonium sulfate và 145mg với phương pháp
BSA 20mg/ml, 10mg/ml, 5mg/ml, 2mg/ml và tủa bằng NaCl. Đối với dịch tách chiết IgY trước
1mg/ml. Kết quả đo OD được trình bày trong khi tủa thì lượng IgY tách chiết được trong mỗi
Bảng 1. trứng là 395mg. Như vậy có thể thấy nếu chưa
Từ kết quả trình bày trong bảng 1, vẽ được tủa thì lượng IgY đo được cao hơn dịch tách
đường chuẩn sự tương quan OD280 với nồng độ chiết sau tủa vì phương pháp tủa sẽ loại bớt các
protein không phải IgY. Ngoài ra, phương pháp
protein (biểu đồ 1), qua đó tính được nồng độ IgY
tủa bằng ammonium sulfate thu được lượng IgY
có trong dịch tách chiết bằng ammonium sulfate
cao gần gấp đôi phương pháp tủa IgY bằng
là 9.6mg/ml, và trong dịch tách chiết bằng NaCl
muối ăn thông thường NaCl.
là 4.4mg/ml. Cứ 30 trứng là thu được 300ml, từ

104
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học

Hiệu giá kháng thể IgY đặc hiệu H. pylori phát dịch, lòng đỏ trứng gà đã cho được kháng thể
hiện bằng kỹ thuật ELISA IgY đặc hiệu H. pylori đạt hiệu giá cao nhất là
Khi thực hiện phản ứng ELISA, độ pha loãng 1/25.600.
của mẫu thử trong giếng đầu tiên sẽ là 1/10 trong Hiệu quả ức chế urease của kháng thể IgY đặc
PBS, do vậy nếu so với tách chiết IgY trước tủa, hiệu H. pylori
sau tủa và lòng đỏ trứng đông khô là giống Kết quả ức chế urease được phát hiện qua
nhau: 1/100 của dung dịch lòng đỏ trứng. Bảng 2 thời gian xuất hiện kết quả [+] (hình 2) của que
trình bày kết quả hiệu giá kháng thể IgY đặc giấy thấm hổn dịch vi khuẩn H. pylori với tách
hiệu H. pylori trong lòng đỏ trứng đẻ ra từ gà đã chiết IgY trước và sau tủa cũng như của dung
gây miễn dịch. Phân tích các kết quả này chúng dịch lòng đỏ trứng đông khô pha 1/10 trong PBS.
ta có thể thấy rằng chỉ 3 tháng sau khi gây miễn
Bảng 3: Kết quả hoạt tính của IgY đặc hiệu H. pylori ức chế được enzyme urease sinh ra từ H. pylori
NK
Mẫu thử Kết quả Pylori test Kết luận
Huyền dịch H. pylori McF pha loãng 1/2 trong PBS [+] sau 3 phút Chứng [+]
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (trước tủa) không pha loãng [+] sau 5 phút Ức chế 2 phút
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với ammonium sulfate) không pha loãng [+] sau 6 phút Ức chế 3 phút
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với ammonium sulfate)
[+] sau 5 phút Ức chế 2 phút
pha loãng 1/10 trong PBS
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với NaCl) PBS không pha loãng [+] sau 5 phút Ức chế 2 phút
Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng (sau tủa với NaCl) pha loãng 1/10 trong PBS [+] sau 4 phút Ức chế 1 phút
Lòng đỏ trứng đông khô 1 tháng sau mũi chích đầu tiên pha 1/10 trong PBS [+] sau 10 phút Ức chế 7 phút
Lòng đỏ trứng đông khô 3 tháng sau mũi chích đầu tiên pha 1/10 trong PBS [+] sau 14 phút Ức chế 11 phút
Lòng đỏ trứng đông khô 6 tháng sau mũi chích đầu tiên pha 1/10 trong [+] sau 23 phút Ức chế 20 phút
Kết quả trình bày trong bảng 3 cho thấy đông khô pha loãng 1/10 thì khả năng ức chế lâu
kháng thể IgY đặc hiệu H. pylori có hoạt tính ức hơn: chỉ 1 tháng sau khi gây miễn dịch đã có thời
chế urease của H. pylori biểu hiện qua thời gian gian ức chế urease lên đến 7 phút, sau 3 tháng thì
xuất hiện kết quả [+] trể hơn so với chứng là lên đến 11 phút, và lên 6 tháng thì thời gian ức
huyền dịch H. pylori pha loãng 1/2 trong PBS. chế lên đến 20 phút, trong khi đó thì lòng đỏ
Với các dung dịch tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng lấy từ gà không gây miễn dịch không có
trứng thì thời gian xuất hiện kết quả [+] trể hơn tác động ức chế urease của H. pylori.
so với chứng từ 4 đến 6 phút, nhưng với lòng đỏ

Hình 2: Thử nghiệm hoạt tính ức chế urease trên NKPylori test với mẫu thử là que giấy thấm dày 0.5mm kích
thước 1 x 5mm thấm hổn hợp vi khuẩn H. pylori và kháng thể IgY đặc hiệu rồi cho vào giếng NKPylori, ghi nhận
thời gian xuất hiện kết quả dương tính màu đỏ cánh sen

105
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018

Kết quả ngưng tập H. pylori
Kết quả ngưng tập của vi khuẩn H. pylori khi
gặp kháng thể IgY đặc hiệu được ghi lại qua các
hình ảnh chụp qua kính hiển vi phết nhuộm
Gram (hình 3, hình 4, hình 5, và hình 6). Hình 3
cho thấy canh cấy vi khuẩn H. pylori khi chưa
gặp IgY đặc hiệu có hình ảnh là các trực khuẩn
Gram [-] mãnh, hình cong như chim én hay dấu
ngã, tách rời nhau mà hình ảnh qua vật kính 10x
là những đốm màu hồng rời rạc. Hình 4 cho thấy
khi gặp kháng thể IgY đặc hiệu hiện diện trong
dịch tách chiết trước tủa thì H. pylori bắt đầu bị
kết tụ, tuy chưa nhiều vì lượng kháng thể đặc
hiệu còn ít nhưng vẫn phân biệt được với hình
ảnh không kết tụ ở hình 3. Hình 5 và hình 6 cho
thấy khi gặp dịch tách chiết IgY đậm đặc hơn
(sau tủa và được pha loãng 1/2 và 1/5) thì vi
khuẩn H. pylori bị kết tụ rõ thậm chí vi khuẩn bị
co lại. Hình 7 cho thấy khi gặp kháng thể IgY đặc
hiệu hiện diện trong dịch tách chiết sau tủa được
pha loãng 1/10 (chứa hàm lượng IgY tương
đương trước tủa) thì H. pylori vẫn còn bị kết tụ
dù không còn mạnh nhưng vẫn phân biệt được
với hình ảnh không kết tụ ở hình 3.

Hình 3: Vi khuẩn H. pylori khi chưa gặp kháng thể IgY đặc hiệu nhìn qua vật kính dẩu x100 (hình trái) và vật
kính x10 (hình phải)

Hình 4: Vi khuẩn H. pylori gặp tách chiết kháng thể IgY trước tủa nhìn qua vật kính dầu x100 (hình trái) và vật
kính x10 (hình phải). Kết quả cho thấy H. pylori có kết tụ nhẹ

106
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học

Hình 5: Vi khuẩn H. pylori gặp tách chiết kháng thể IgY sau tủa pha loãng 1/2 nhìn qua vật kính dầu x100 (hình
trái) và vật kính x10 (hình phải). Kết quả cho thấy H. pylori có kết tụ mạnh

Hình 6: Vi khuẩn H. pylori gặp tách chiết kháng thể IgY sau tủa pha loãng 1/5 nhìn qua vật kính dầu x100 (hình
trái) và vật kính x10 (hình phải). Kết quả cho thấy H. pylori vẫn có kết tụ mạnh

Hình 7: Vi khuẩn H. pylori gặp tách chiết kháng thể IgY sau tủa pha loãng 1/10 nhìn qua vật kính dầu x100
(hình trái) và vật kính x10 (hình phải). Kết quả cho thấy H. pylori vẫn còn bị kết tụ

107
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018

Bảng 4: Kết quả ngưng tập H. pylori của dịch tách chiết IgY trước và sau tủa (bằng ammonium sufate)
Tụ thấy được qua phết Gram
Mẫu thử Tụ thấy được qua mắt thường
X 10 X 100
Tách chiết IgY trước tủa +/- +/- +/-
Tách chiết IgY sau tủa pha loãng 1/2 ++ ++ ++
Tách chiết IgY sau tủa pha loãng 1/5 ++ ++ ++
Tách chiết IgY sau tủa pha loãng 1/10 + + +
Các kết quả gây ngưng tập H. pylori được hiệu H. pylori đủ để phòng ngừa thì sẽ rất tốn
trình bày tổng kết trong bảng 4. kém trong sản xuất vaccine(16). Chính vì vậy
BÀN LUẬN khuynh hướng hiện nay là sử dụng kháng thể
IgY đặc hiệu H. pylori trích từ lòng đỏ trứng gà
Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm H. pylori theo
được gây miễn dịch(4,14). Nhờ ưu điểm là khả
nhiều nghiên cứu trước đây là khoảng 50% đến
năng tạo kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng của
80% ở người lớn và khoảng 26% đến 71.4% ở trẻ
gà mái đẻ được gây miễn dịch là rất cao, với
em(3-8,10). Tỷ lệ nhiễm cao này chính là lý do cho
lượng lớn, có thể đạt 300mg tổng lượng protein
thấy đa số các trường hợp viêm loét dạ dày tá
trong đó IgY là 100mg cho mỗi lòng đỏ
tràng và ung thư dạ dày tại Việt nam là gây ra do
trứng(13,14). Một vấn đề trở ngại khi sử dụng IgY
H. pylori vì có thể đến 15% các trường hợp nhiễm
đường uống là IgY cũng giống như protein,
H. pylori là đưa đến loét dạ dày tá tràng và 1-3%
không bền với pH acid, nhiệt và enzyme thủy
là bị ung thư dạ dày(17). Kháng sinh là giải pháp
phân protein. Tuy nhiên nghiên cứu của Shin và
cần thiết để điều trị các trường hợp nhiễm H.
các CS(14) đã cho thấy IgY vẫn còn giữ được hoạt
pylori có triệu chứng viêm loét dạ dày tá tràng và
tính ở pH từ 4 trở lên, kháng được trypsin
những kháng sinh Amoxicillin, clarithromycin,
nhưng với pepsin của dạ dày thì IgY vẫn còn giữ
tetracycline, levofloxacin và metronidazole được
được hoạt tính trên 80% ở pH 4 và 100% ở pH 5,
các nhà chuyên môn sử dụng trong các phát đồ
nhờ vậy mà giải pháp sử dụng IgY đường uống
điều trị. Tuy nhiên hiện nay tại Việt nam, vi
vẫn hoàn toàn khả thi. Nghiên cứu của Shin(14) đã
khuẩn H. pylori phân lập từ các sang thương
chứng minh được hoạt tính của IgY đặc hiệu H.
viêm loét dạ dày tá tràng đề kháng các kháng
pylori cũng như khả năng ức chế hoạt tính urease
sinh trên đã được nhiều nghiên cứu ghi nhận
qua thử nghiệm ELISA, đồng thời khả năng
đặc biệt là các kháng sinh thường được chỉ định
ngăn chận được sự bám dính của H. pylori lên tế
nhất như metronidazole, clarithromycin(1,9,11,12),
bào niêm mạc ruột qua cấy tế bào. Ngoài ra, Shin
kể cả kháng sinh mới được đề nghị sau này như
cũng đã chứng minh được hiệu quả bảo vệ
levofloxacin(1,9), và đây là một trong các lý do gây
nhiễm H. pylori trên chuột nhảy Mongolian
thất bại điều trị. Chính vì vậy, đã có các giải
gerbils(14). Về nghiên cứu lâm sàng trên bệnh
pháp được đề nghị để hổ trợ kháng sinh trong
nhân thì hiện nay còn rất ít, chỉ có một nghiên
điều trị như sử dụng vaccine H. pylori đường
cứu cho thấy hiệu quả tiệt trừ H. pylori khi phối
uống(2,15,16), hay sử dụng đường uống kháng thể
hợp IgY đặc hiệu H. pylori với sữa chua
đặc hiệu H. pylori(4,14). Sử dụng vaccine đường
(yogurt)(4), tuy nhiên điều này cũng dễ hiểu vì
uống là giải pháp sử dụng để ngừa nhiễm H.
hiện nay tại các nước tiên tiến thì H. pylori đề
pylori chứ không phải là giải pháp hổ trợ điều trị,
kháng các kháng sinh còn rất thấp. Tại Việt Nam
ngoài ra để có thể tạo được kháng thể IgA đặc

108
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018
thì vấn đề H. pylori đề kháng các kháng sinh điều
trị đặc hiệu ngày càng gia tăng đến mức báo
động , chính vì vậy giải pháp sử dụng
(1,9,11,12)
kháng thể IgY đặc hiệu vi khuẩn H. pylori bằng
đường uống để hổ trợ cho điều trị kháng sinh là
rất cần thiết. Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có
một công ty trong nước nào sản xuất được sinh
phẩm này vì trở ngại không chỉ trong kỹ thuật
cấy H. pylori để làm kháng nguyên mà cả trong
vấn đề tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng cũng như
kiểm tra chất lượng kháng thể IgY. Nghiên cứu
của công trình này đã cho thấy phòng thí
nghiệm đã thành công trong tạo được kháng
nguyên H. pylori chích cho gà mái sinh được
kháng thể IgY đặc hiệu H. pylori, nghiên cứu
được qui trình tách chiết được IgY từ lòng đỏ
trứng, chứng minh được lượng IgY trích từ lòng
đỏ trứng đạt được #300mg/trứng, hiệu giá kháng
thể đặc hiệu H. pylori phát hiện được bằng xét
nghiệm ELISA đạt đến 1/25,600 sau khi chích
được 3 tháng từ mũi chích đầu tiên, có được hoạt
tính ức chế urease sinh ra từ H. pylori và gây kết
tụ được vi khuẩn H. pylori. Không chỉ vậy, kết
quả của công trình này đã cho thấy phòng thí
nghiệm hoàn toàn là chủ được công nghệ gây
miễn dịch trên gà mái để để thu được kháng thể
IgY đặc hiệu H. pylori qua hoạt tính đặc hiệu trên
các thành phần của H. pylori, qua ức chế urease,
qua ngưng tập vi khuẩn H. pylori và đã xây dựng
được qui trình kiểm tra chất lượng IgY có được.
KẾT LUẬN
Với dân số 90 triệu người thì có thể có đến 9.
5 triệu người bị viêm loét dạ dày tá tràng do
nhiễm H. pylori tại Việt Nam. Do tình hình đề
kháng các kháng sinh của H. pylori tại Việt Nam
ngày càng cao và càng gia tăng, nhu cầu sử dụng
IgY đặc hiệu H. pylori bằng đường uống sẽ rất
cao. Trong khi ấy do các hạn chế về công nghệ
Nghiên cứu Y học
nên chưa có một công ty sản xuất trong nước nào
sản xuất được sản phẩm này. Chính vì vậy
nghiên cứu với các kết quả thu nhận được chính
là một mở đầu cho công nghệ này tại Việt Nam
và mở đầu cho sản phẩm mới áp dụng trong hổ
trợ kháng sinh để điều trị viêm loét dạ dày do H.
pylori tại Việt Nam. Nếu được trở thành sản
phẩm thì chắc chắn rằng chúng ta sẽ có cơ hội để
làm thêm các thử nghiệm lâm sàng chứng minh
được hiệu quả và đây sẽ là một đóng góp rất cần
thiết hiện nay cho y tế nước nhà.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Binh TT, Shiota S, Nguyen LT, Ho DD, Hoang HH, Ta L,
Trinh DT, Fujioka T, Yamaoka Y (2013) The incidence of
primary antibiotic resistance of Helicobacter pylori in Vietnam. J
Clin Gastroenterol 47: 233-238.
2. Czinn SJ, Blanchard T (2011) Vaccinating againts Helicobacter
pylori infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 8: 133-140.
3. Hoang HT, Bentsson C, Phung CD, Nyren O, Granstrom M
(2003). Seroprevalence of Helicobacter pylori infection in
urban and rural Vietnam. Helicobacter 8: 481-482.
4. Horie K, Horie N, Abdou AM, Yang JO, Yun SS, et al. (2004)
Suppressive effect of functional drinking yogurt containing
specific egg yolk immunoglobulin on Helicobacter pylori in
Humans. J Dairy Sci 87: 4073-4079.
5. Nguyen BV, Nguyen KG (2005). Epidemiological features of
Helicobacter pylori in children. J Med Res 35: 14-19.
6. Nguyen BV, Nguyen KG, Phung CD, Kremp O, Kalach N, et
al. (2006). Prevalence of and factors associated with
Helicobacter pylori infection in children in the north of
Vietnam. Am J Trop Med Hyg 74: 536-539.
7. Nguyen BV, Nguyen GK, Phung DC, Okrainec K, Raymond J,
et al. (2006). Intra-familial transmission of Helicobacter pylori
infection in children of households with multiple generations
in Vietnam. Eur J Epidemiol 21: 459-463.
8. Nguyen BV, Nguyen XAT, Nguyen AVT, Pham PD, Hoang
HT, Phung CD(2015). Epidemiology of Helicobacter pylori
infection in Kinh and Khmer Children in Mekong Delta,
Vietnam. Annals of Clinical and Laboratory Research ISSN 2386-
5180.
9. Nguyen TVH, Bengtsson C, Yin L, Nguyen GK, Hoang TT,
Phung DC, Sörberg M, Granström M. (2012). Eradication of
Helicobacter pylori in children in Vietnam in relation to
antibiotic resistance. Helicobacter 17: 319-325.
10. Nguyen XAT, Nguyen BV (2007). Epidemiological features of
Helicobacter pylori infection in a rural central village. J Med
Res 332: 621-629.
11. Phan TN, Santona A, Tran VH, Tran TN, Le VA,
Cappuccinelli P, Rubino S, Paglietti B (2015) High rate of
levofloxacin resistance in a background of clarithromycinand
metronidazole-resistant Helicobacter pylori in Vietnam. Int J
Antimicrob Agents 45: 244-248.
12. Quek C., Pham TS, Tran TK, Pham TB, Huynh VL, Luu LBN,
Le TKT, Quek K, Pham HV. (2016). Antimicrobial
109
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018

susceptibility and clarithromycin resistance patterns of 16. Svennerholm AM, Lundgren A (2007) Progress in vaccine
Helicobacter pylori clinical isolates in Vietnam. F1000Research development against Helicobacter pylori. FEMS Immunol Med
2016, 5:671 Last updated: 13 APR 2016. Microbiol 50: 146-156.
13. Rahman S, Van Nguyen S, Icatlo Jr FC, Umeda K, Kodama Y 17. Wroblewski LFX, Peek Jr RM, Wilson KT. (2010). Helicobacter
(2013) Oral passive IgY-based immunotherapeutics. A novel pylori and gastric cancer: factors that modulate disease risk.
solution for prevention and treatment of alimentary tract Clin Microbiol Rev 23: 713–39.
diseases. Hum Vaccin Immunother 9:1039-1048.
14. Shin JH, Yang M, Nam SW, Kim JT, Myung NH, et al. (2002)
Ngày nhận bài báo: 13/02/2018
Use of egg yolk-derived immunoglobulin as an alternative to
antibiotic treatment for control of H. Pylori Infection. Clin Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/02/2018
Diagn Lab Immunol 9: 1061-1066.
Ngày bài báo được đăng: 10/03/2018
15. Sutton P, Lee A (2000) Helicobacter pylori vaccine: The current
status. Aliment Pharmacol Ther 14: 1107-1118.

110