Kính mời quý thầy cô và các bạn tham khảo chương trình

LUYỆN ĐỀ THỰC CHIẾN

Có giới hạn người tham gia
CHI TIẾT TẠI: https://forms.gle/xHXk8YHGZuXfRyKL7

1
 CHUYÊN ĐỀ: KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ ỨNG DỤNG

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU...................................................................................................................2
1. Lý do chọn đề tài.....................................................................................................................2
2. Mục đích của đề tài.................................................................................................................3
PHẦN 2: NỘI DUNG................................................................................................................5
1. NHÂN DÒNG ADN..............................................................................................................5
1.1. Các enzyme cắt giới hạn......................................................................................................6
1.2. Vector tách dòng................................................................................................................10
1.3. Kỹ thuật nhân dòng............................................................................................................16
1.4. Các ứng dụng của kỹ thuật tách dòng................................................................................21
2. PCR – PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP.....................................................................22
2.1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR.....................................................................22
2.2. Phản ứng PCR xảy ra như thế nào.....................................................................................24
2.3. Các ứng dụng của phản ứng PCR......................................................................................27
3. GIẢI MÃ TRÌNH TỰ ADN...............................................................................................28
3.1. Nguyên lý giải mã trình tự ADN.......................................................................................28
3.2. Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert........................................................................28
3.3. Phương pháp kết thúc chuỗi trùng hợp nhờ dideoxynucleotide........................................30
3.4. Giải mã trình tự ADN tự động...........................................................................................34
4. CÂU HỎI LUYỆN TẬP.....................................................................................................36
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................................52
1. Kết luận.................................................................................................................................52
2. Đề nghị..................................................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................53

2
 PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Kỹ thuật di truyền là thao tác thay đổi gen bằng công nghệ sinh học. Nó bao
gồm các phương pháp kỹ thuật dùng để thay đổi nhân tố di truyền của các tế
bào, bao gồm sự dịch chuyển gen cùng loài và khác loài để tạo ra những sinh vật
mới hoặc hoàn hảo hơn.

Những thành tựu rực rỡ của di truyền học đã đem lại những nhận thức mới về
cấu tạo và sự vận hành bộ máy di truyền của cơ thể sống. Cùng với sự phát triển
mạnh mẽ của di truyền học, một lĩnh vực nghiên cứu mới của di truyền học ra
đời, đó là kỹ thuật di truyền hay còn gọi là công nghệ gen hoặc công nghệ di
truyền (genetic engineering). Có thể nói, kỹ thuật di truyền là một tập hợp của
nhiều kỹ thuật như hóa học, sinh học phân tử, vi sinh vật học,... mà trong đó, vai
trò hàng đầu thuộc về các tư duy và phương pháp của di truyền.

Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA từ
một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người
ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu
theo chủ ý lựa chọn. Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ
thể sống trong các ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau
các thao tác cắt, nối có một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được
tách ra từ tế bào sống, được gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là
kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Sự tái tổ hợp DNA được đánh giá là thành công chỉ
sau khi đưa được phân tử DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu
hiện các hoạt tính di truyền và ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ
hợp

Kỹ thuật di truyền đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau bao gồm
nghiên cứ, y học, công nghệ sinh học, và nông nghiệp. Trong nghiên cứu, GMO
được dùng để nghiên cứu về chức năng gen qua các phương pháp như làm mất
chức năng, tạo ra chức năng mới, theo dõi biểu hiện gen. Bằng cách loại bỏ một

3
số gen với chức năng đã được biết đến, chúng ta có thể tạo ra sinh vật mô
hình động vật để nghiên cứu bệnh con người. Ngoài việc có thể tạo ra nội tiết tố,
vắc-xin, và các dược phẩm khác, kỹ thuật di truyền còn có tiềm năng chữa bệnh
qua phương pháp điều trị gen. Những phương pháp kỹ dùng để tạo ra dược
phẩm còn có các ứng dụng công nghiệp khác như sản xuất enzyme để tạo ra
thuốc tẩy, phô mai, và các sản phẩm khác.

Chính vì vậy, kỹ thuật gen thực sự trở thành nhu cầu của sự hiểu biết để con
người có thể sử dụng công nghệ nhằm phục vụ mục đích khác nhau. Ở nước ta,
kỹ thuật gen không chỉ được giảng dạy ở bậc đại học và THPT mà ngày càng
thâm nhập vào nhiều lĩnh vực hoạt động khoa học và lĩnh vực kinh tế khác. Tuy
nhiên, ngoài nội dung kiến thức được dùng để ôn thi đại học thì kỹ thuật gen còn
trở thành một trong những nội dung của các đề thi tuyển chọn học sinh giỏi
Quốc gia và Olympic Sinh học. Đây là nội dung tương đối khó, học sinh phải sử
dụng nhiều kiến thức chuyên ngành và kiến thức thực tiễn để giải quyết vấn đề
này, một nội dung ít được tiếp cận trong chương trình sinh học THPT.

Với mong muốn nâng cao chất lượng của HSG, cũng như cung cấp cho giáo
viên và học sinh nguồn tư liệu để tham khảo, giảng dạy, học tập và quan trọng
hơn là hoàn thiện kiến thức của bản thân nên Tôi đã chọn nội dung “ Nguyên lý
kỹ thuật di truyền và Ứng dụng” làm đề tài nghiên cứu.

2. Mục đích của đề tài

- Cung cấp nguồn tư liệu tham khảo cho giáo viên và học sinh chuyên trong
giảng dạy và bồi dưỡng học sinh giỏi:
+ Giúp giáo viên và học sinh có cái nhìn tổng quan và chuyên sâu về phần
kỹ thuật di truyền.
+ Hiểu sâu hơn về các nguyên lý của kỹ thuật di truyền cơ bản và ứng dụng
trong việc phân tích gen và các sản phẩm của gen.
- Giúp học sinh chuyên biết cách đọc tài liệu để phát huy năng lực theo hướng tự
học, tự nghiên cứu: khái quát vấn đề, tự đặt các câu hỏi, hiểu được nguyên lý
của các phương pháp và khả năng ứng dụng trong thực tế.

4
- Xây dựng hệ thống câu hỏi liên quan đến các kỹ thuật di truyền, từ đó rèn
luyện kĩ năng trả lời câu hỏi cho học sinh.
- Xây dựng được mạch kiến thức cơ bản của chuyên đề, có thể áp dụng để dạy
nền cho mọi đối tượng học sinh.

5
 PHẦN 2: NỘI DUNG

1. NHÂN DÒNG ADN

Nhân dòng gen là khái niệm chỉ một nhóm các phương pháp được sử
dụng để phân lập một một trình tự gen (ADN) đặc hiệu từ hỗn hợp các phân tử
ADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học vốn có cấu trúc phức tạp,
kích thước lớn; khuếch đại (sao chép) trình tự lên một số lượng lớn đủ để có thể
tiến hành phân tích về cấu trúc và chức năng của gen tương ứng.
Khả năng tinh sạch các đoạn gen (ADN) đặc hiệu có số lượng đủ lớn là
cần thiết để có thể “thao tác” các đoạn gen đó vì các mục tiêu nghiên cứu khác
nhau. Chẳng hạn, từ các phân đoạn ADN được tách dòng, người ta có thể tạo ra
các phân tử ADN tái tổ hợp mang các phân đoạn ADN mang nguồn gốc khác
nhau. Các phân tử ADN tái tổ hợp mới có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện
bình thường của một gen (chẳng hạn bằng việc dung hợp giữa một trình tự mã
hóa của một loài này với trình tự promoter của một loài khác) hoặc thậm chí mã
hóa tổng hợp một loại protein “dung hợp” mới (protein lai) mang các trình tự
axit amin từ các protein có nguồn gốc khác nhau. Hiện nay, các kỹ thuật tách
dòng phân tử (bao gồm cả PCR) đã trở thành các công cụ thiết yếu trong nghiên
cứu về sự điều hòa và biểu hiện của các gen và hệ gen ở các loài sinh vật khác
nhau.
Quá trình tách dòng ADN và tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp điển
hình thường liên quan đến việc sử dụng các véctơ là trình tự mang thông tin điều
khiển hoạt động nhân lên (khuếch đại) và/hoặc biểu hiện trong tế bào của phân
tử ADN tái tổ hợp mang đoạn ADN cài (đoạn trình tự được phân lập) bao gồm
trình tự gen được quan tâm nghiên cứu. Các “công cụ” chính để tạo nên các
phân tử ADN tái tổ hợp là các enzym giới hạn giúp cắt các phân tử ADN tại các
vị trí xác định và các enzym nối cho phép ghép nối các phân đoạn ADN có
nguồn gốc khác nhau với nhau. Bằng việc tạo nên các phân tử ADN tái tổ hợp
có thể tự nhận lên trong tế bào chủ, một đoạn ADN cài xác định nào đó có thể
được phân lập, tinh sạch và nhân lên thành một số lượng lớn các bản sao.

6
 Tiếp theo đây, chúng ta sẽ mô tả bằng cách nào các phân tử ADN được
cắt, tái tổ hợp và nhân lên, đồng thời đề cập đến việc xây dựng thư viện hệ gen
gồm tập hợp các phân tử ADN lai chứa các đoạn cài xuất phát từ một hệ gen cần
được thiết lập để phục vụ cho việc nghiên cứu, phân tích một hệ gen. Thông
thường một thư viện hệ gen được thiết lập bằng việc sử dụng chung cùng một
loại véctơ mang các phân đoạn ADN cài khác nhau. Chúng ta sẽ thấy bằng cách
nào các phân đoạn ADN đặc hiệu có thể được xác định và phân lập từ các thư
viện hệ gen.
1.1. Các enzyme cắt giới hạn
1.1.1. Enzyme giới hạn
Là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt ADN đặc hiệu.
Những enzyme này phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung ADN mạch
đôi mà không gây tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt
có thể được nối trở lại bằng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các phân
đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc
thể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính
bổ sung với nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đều dựa
vào các enzyme giới hạn.
Phân loại enzyme giới hạn
Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung thành ba loại, gọi là
Loại I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid
nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp
enzyme lớn. Mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những
trình tự ADN đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả
trăm base. Chúng cũng cần ATP để hoạt động. Những enzyme này bắt đầu bằng
việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết. Nếu cả
hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiện cho thấy đây là ADN ngoại
lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Tuy
nhiên, nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là ADN của tế bào,
enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc

7
adenine còn lại để duy trì sự ổn định cho ADN bộ gene. Với enzyme giới hạn
loại II, chức năng phân giải của nó không liên quan đến chức năng methyl hóa
hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hay kế cạnh
vị trí nhận biết. Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này và
chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường
gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích ADN.

Một số enzyme cắt giới hạn (RE)

Vị trí điểm cắt
Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5´-3´
trên mạch ADN (palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của
enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này. Một số
enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn ADN "đầu
bằng". Hầu hết các en đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo ra

8
các "đầu dính". Các enzyme giới hạn có ba chức năng quan trọng, mỗi chức
năng cắt ADN bằng các cơ chế khác nhau.
(a) Đầu bằng (Rsal)

(b) Đầu dính 5’ (EcoRI)

(c) Đầu dính 3’ (Kpnl)

2.1.2. Các loại enzyme cắt giới hạn tạo các đoạn ADN khác nhau
Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là
một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, RNA hay protein dựa trên các đặc
điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện
tích (isoelectric point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn
diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay
polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất
nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí
các phân tử trên gel sau khi điện di.
Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào
các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các
chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống
mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử
(agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân
tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của (a)

9
lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) (b)
kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và (c) hình dạng, độ cồng
kềnh của phân tử.
Gel agarose: Là một polysaccharide, thường được chiết xuất từ rong biển đỏ
nhất định. Nó là một polymer tuyến tính được tạo thành từ đơn vị lặp đi lặp lại
của agarobiose, là một disaccharide tạo thành từ D -galactose và 3,6-anhydro- L
-galactopyranose. Agarose là một trong hai thành phần chính của thạch, và được
tinh chế từ thạch bằng cách loại bỏ thành phần khác của agar, agaropectin.
Agarose có cấu trúc dạng lưới ba chiều các kênh có đường kính từ 50 nm đến>
200 nm tùy thuộc vào nồng độ agarose được sử dụng - nồng độ cao hơn mang
lại đường kính lỗ chân lông trung bình thấp hơn. Cấu trúc 3-D được tổ chức
cùng với liên kết hydro và do đó có thể bị gián đoạn do làm nóng trở lại trạng
thái lỏng.
Quy trình điện di gel trên agarose

Chuẩn bị dung dịch đệm Agarose được sử dụng làm Các lỗ trên bản gel là các
và bản gel chất nền để phân tách các giếng chứa ADN
đoạn ADN

Nạp mẫu vào các giếng ADN tích điện âm di chuyển Nhuộm bản gel với
trên bản gel về phía cực dương ethyldium-bromid

Vì có cấu trúc dạng lưới phù hợp nên agarose thường được sử dụng trong sinh
học phân tử để tách các phân tử lớn, đặc biệt là ADN, bằng điện di. Các tấm gel
agarose (thường là 0,7 - 2%) đối với điện di được chuẩn bị dễ dàng bằng cách đổ

10
dung dịch ấm, lỏng vào khuôn. Một loạt các agaroses khác nhau của trọng lượng
phân tử khác nhau và tài sản là thương mại có sẵn cho mục đích này. Agarose
cũng có thể được hình thành thành các hạt và được sử dụng trong một số
phương pháp sắc ký để làm sạch protein.

Bản gel sau khi nhuộm, rửa nước thì được đặt vào
máy có tia soi UV để quan sát kết quả điện di.
Các phân tử ADN có kích thước càng lớn (khối
lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng
chậm.
Đoạn ADN mang kích thước nhất định sẽ dịch
chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa
các nồng độ agarose khác nhau
Agarose có khả năng phân tách các phân tử có kích
thước lớn khác nhau trong khoảng 20kb.
Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình điện di ADN trên gel agarose
qua link video sau https://www.youtube.com/watch?v=BKgi6aJMIWw
1.2. Vector tách dòng
Vector tách dòng (cloning vector) là một phân tử ADN có kích thước nhỏ cho
phép cài gắn một đoạn ADN ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn ADN
ngoại lai lên với số lượng lớn.
Các đặc điểm cần có của một véctơ tách dòng:
- Có khả năng cài gắn các đoạn ADN ngoại lai
- Có kích thước nhỏ để xâm nhập tế bào chủ
- Có thể tái bản độc lập không phụ thuộc vào bộ gen của tế bào chủ.
- Có chứa các gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị
màu...)
Tùy thuộc vào kích thước đoạn ADN mà chúng ta muốn cài mà sử dụng các
vector tách dòng khác nhau. Các loại vector tách dòng thường dùng như là
Plasmid, Cosmid, Phage, BAC (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast
artificial chromosomes)

11
 Vector Tế bào chủ Đoạn ADN cài

Lamda phage E.coli 5 – 25 kb

Lamda cosmids E.coli 35 – 45 kb

P1 phage E.coli 70 – 100 kb

PACs E.coli 100 – 300 kb

BACs E.coli < 300 kb

YACs Saccharomyces 200 – 2000 kb

cerevisae

1.2.1. Vector chuyển gen là plasmid

Các plasmid là những mẫu ADN nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi
nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn.
Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và
không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tùy các kiểu của
plasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau. Một số plasmid chỉ
có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mổi lần phân bào.

Plasmid pGEX-3x là một vector tách dòng phổ biến.

12
 Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗi
chu kỳ phân bào. Những plasmid có từ 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ
được xem như plasmid có bản sao cao. Plasmid khác có từ 1 đến 4 bản sao trong
tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp. Trong sinh vật eucaryote,
plasmid chỉ có trong tế bào nấm men.
Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng
tự tái bản ADN. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, ADN không
thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector
chuyển gen để nhân dòng ADN cần thiết.
Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc
tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid
không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho
việc tạo dòng.
Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra
từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi ADN.

pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen

kháng thuốc, một chống chịu được
ampicilline (ampR) và một chống chịu được
tetracycline (tetR).
Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn
chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết
nằm trong gen kháng kháng sinh. Ví dụ, gen
kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi
ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI.
Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận
biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, Cấu tạo plasmid pBR322
NnuI.

Việc cài ADN lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc. Nếu chỉ còn
một gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn cài.
Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp. Một ứng dụng nữa của

13
pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ
hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến
3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.

1.2.2. Các vector chuyển gen là phage

Lamda phage làm vector chuyển những đoạn gen có kích thước nhỏ

Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi
khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với
vector là plasmid
- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn,
- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ,
- Khả năng tiếp nhận đoạn ADN lạ lớn hơn plasmid.
Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như
- Thao tác ghép ADN lạ phức tạp,

14
- ADN tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như ADN tái tổ hợp là plasmid, mà
thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn
Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc
thế hệ thứ nhất.

1.2.3. Các vector chuyển gen khác

- Các cosmid: là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos
của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự
đóng gói ADN tái tổ hợp vào đầu của phage. Khi bao gói các vùng cos đều bị
cắt, chỉ còn một phần ADN của cosmid được giới hạn bởi các đầu dính với đoạn
cài ADN lạ được bao gói. Trong phản ứng bao gói in vitro, các protein cần thiết
cho sự tạo thành đầu và đuôi phải được thêm vào để cho các phage có thể tự hợp
thành.

Vector chuyển là cosmid

Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể
cài lắp ADN lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb do
đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb . Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli,
ADN tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt
cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng và tái bản như một plasmid.
Ưu điểm và ứng dụng của cosmid: Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm
nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn. Trong tế bào chủ,
nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ
không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát. Với những
tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân

15
hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu
với môi trường có ampiciline.
- Vector chuyển là các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeast
Artificial Chromosomes)
Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự ADN ngày càng lớn, các nhà nghiên
cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra
YAC cho phép tạo dòng với những đoạn ADN dài 150÷1.000kb, trung bình là
350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae),
nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự.

YAC làm vector chuyển những đoạn gen có kích thước lớn
- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST
- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia đôi
và đi về 2 cực của tế bào
- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự
như ori ở plasmid
Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với cấu
tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn ADN cần
tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các
gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các

16
chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay
mang một mảnh ADN hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori.
Việc cài ADN lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm
biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng
sang đỏ) khi có mặt của ADN lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ
hợp trong tế bào nấm men.
Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên
như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.

1.3. Kỹ thuật nhân dòng

Kỹ thuật tách dòng bao gồm việc phải cài một mảnh (chuỗi) ADN lạ vào
một vector (plasmide hoặc phage λ) bằng phương pháp hóa sinh. Sau đó, đưa
phân tử lai này vào tế bào chủ đã chọn lựa bằng phương pháp biến nạp hoặc tải
nạp. Trường hợp muốn tạo dòng tổng hợp enzyme thì mảnh ADN định cài phải
mã hóa cho gen cấu trúc của một enzyme nào đó.

Các bước của kỹ thuật nhân dòng

17
Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình nhân dòng qua link video sau:
https://www.youtube.com/watch?
v=DiUH4nCUSV0&list=PLjFxRogufQiNh8eJtI5k0jpZxC4UFxxZC&index=3&t=25s

1.3.1. Tạo ADN tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)

Việc tạo ADN tái tổ hợp bằng cách ghép ADN lạ vào vector đã được cắt cùng
một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại
với nhau nhờ bắt cặp bổ sung. Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của
enzyme ADN ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.
Tách lập các ADN lạ cần tạo dòng: Chọn và cắt ADN lạ của tế bào cho bằng
một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân lập đoạn ADN (gen quí) phù hợp với vector
và mục đích cần tạo dòng. Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa
biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn ADN cần tạo dòng khi dự
đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cADN từ mRNA.
Chọn và xử lí vector: Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn
của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng.
Cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt ADN nói trên
(để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này). Khử
nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector
đóng kín trở lại.
Công đoạn nối với sự có mặt của ADN ligase: Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối
các đoạn ADN vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang ADN lạ. Phản ứng nối được
thực hiện nhờ enzyme ADN ligase. ADN ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai
mảnh ADN bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai
nucleotide đứng cạnh nhau (Hình 6-2). Trong sinh học phân tử, người ta coi ADN ligase như
một chất keo phân tử để kết dính các mẫu ADN lại với nhau.

18
Nối đầu bằng
Khi hai đoạn ADN đầu bằng đứng
cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme
ligase, liên kết phosphodiester giữa
đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình
thành và hai nucleotide được nối lại
với nhau. Khả năng nối hai đoạn ADN
đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất
phản ứng, thường người ta phải tăng
nồng độ của các đoạn ADN.

Nối đầu lệch

Đầu tiên, hai mảnh ADN đầu lệch do
có những bazơ bổ sung nên chúng tiến
gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa
các bazơ nitơ bổ sung. Sau đó, hai
nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết
ADN và các phản ứng nối
este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác
dụng của enzyme ADN ligase.

1.3.2. Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp
hoặc tải nạp
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao
chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển ADN tái tổ
hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có
khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên
hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm
vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà
người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể
cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa
hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện

19
với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến
nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp
vi tiêm.
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho
D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus.
Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage,
cosmid, ...

Chuyển plasmid vào tế bào bằng cách xử lý CaCl2 ở nhiệt độ 42oC trong 30 giây

Chuyển plasmid vào tế bào bằng cách dùng xung điện ở 15kV/cm trong 5.10-3 giây

Plasmid được đưa vào tế bào nhận bằng cách xử lý hóa học

20
1.3.3. Phát hiện dòng cần tìm
Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc
chọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí
nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc
lên theo ba khả năng
- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp,
- Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ,
- Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp.
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau
để xác định dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết,
người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn ADN đã biết (cADN), công việc sẽ đơn
giản và nhanh chóng.
Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phương
pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp. Nếu là mục đích thiết lập
ngân hàng cADN, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải tách
plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme RE loại II và thu được hai băng ADN, một có độ dài bằng khung vector,
còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cADN. Cách kiểm tra lại cADN
đã được cắt bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và kiểm tra lại độ dài của
những băng cADN thu được. Những đoạn có kích thước khác nhau sẽ di chuyển
những khoảng cách khác nhau trên gel.
Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine,
kháng sinh,... người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách
lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.
Một số phương pháp xác định dòng cần tìm
Phương pháp lai axit nucleic
- Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic: Dựa vào khả năng biến tính khi
nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của ADN. Khi tăng nhiệt độ của
ADN lên quá nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn ADN
sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối ADN đã

21
biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự
bắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự ADN hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tính
đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào
cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình
tự ADN và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát
hiện đoạn lai.
- Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt
độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa ADN
và ADN, RNA và ADN, RNA và RNA.
Phương pháp sử dụng kháng thể
- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà
chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo
màu, phản ứng kết tủa.
- Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein).
Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể
đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc
trưng giữa protein và kháng thể.
- Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu là ADN cần nghiên
cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời,
vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu
hiện cần phải có kháng thể đặc trưng.
Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn
- Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector
tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.
- Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc
trở lên, ví dụ như vector pBR 

1.4. Các ứng dụng của kỹ thuật tách dòng

- Xác định các gen gây bệnh: Việc tách dòng ADN giúp xác định các gen bị
hỏng hoặc sai lệch, đột biến gây nên các bệnh di truyền chẳng hạn như bệnh

22
thiếu máu hồng cầu hình liềm, rối loạn dinh dưỡng cơ, các gen gây ung thư và
gen ức chế khối u có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển khối u. Việc
nghiên cứu đặc tính của các gen này giúp nâng cao hiểu biết về cơ chế phát sinh
bệnh.
- Lập bản đồ gen: Việc xác định và làm rõ đặc tính các dòng gen nằm gần
nhau trên nhiễm sắc thể được sử dụng để lập bản đồ gen. Nhờ ứng dụng có thể
xác định được vị trí tương đối của các gen trên nhiễm sắc thể.
- Các protein tái tổ hợp: Kỹ thuật tách dòng gen được sử dụng để sản xuất một
lượng lớn các loại protein có giá trị trong y học, chẳng hạn như insulin trong
điều trị bệnh đái tháo đường, protein yếu tố VIII trong điều trị chứng thiếu máu.
Các gen mã hóa các loại protein hữu ích được tách dòng nhờ các vector biểu
hiện và biến nạp vào một cơ thể chủ thích hợp chẳng hạn như nấm men để các
gen tách dòng có thể được biểu hiện và sản xuất ra một lượng lớn protein theo
nhu cầu.
- Tạo ra các cơ thể biến đổi di truyền GMO: Người ta có thể sử dụng kỹ thuật
tách dòng gen để khuếch đại, chuyển các gen ngoại lai mong muốn vào một cơ
thể sinh vật nào đó để tạo ra những cơ thể( động vật, thực vật) mới mang các đặc
tính di truyền mong muốn.

2. PCR – PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP

Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR (DNA polymerase chain reaction) là một kĩ
thuật hữu hiệu được sử dụng rộng rãi và có vai trò quan trọng trong hầu hết các
nghiên cứu hiện nay. ADN nhiễm sắc thể trong tế bào chứa hàng ngàn gen. Điều
đó làm cho việc phân tích và phân lập một gen riêng lẻ trở nên khó khăn. Phản
ứng PCR là công cụ cho phép chúng ta sao chép nhiều lần một trình tự ADN đặc
thù, thông thường tướng ứng với các gen hoặc từng phần của các gen đó, xuất
phát từ mẫu ADN nhiễm sắc nhờ một phản ứng enzyme đơn giản. Yêu cầu duy
nhất của quá trình này là cần phải biết một số trình tự của hai đầu của đoạn
ADN cần khuếch đại.

23
 Đoạn ADN được quan tâm nghiên cứu được nhân lên (khuếch đại) hàng triệu
lần và trở thành đoạn ADN chiếm ưu thế sau khi phản ứng PCR kết thúc. Lượng
ADN của đoạn trình tự được quan tâm nghiên cứu lúc đó đủ lớn để có thể sử
dụng trong các nghiên cứu chi tiết tiếp theo về gen hoặc sử dụng cho mục đích
thao tác di truyền liên quan đến các đoạn gen được khuếch đại.
2.1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR
ADN mạch khuôn: Phân tử ADN này chứa đoạn ADN cần khuếch đại. Phân tử
ADN mạch khuôn thường là một hỗn hợp phức tạp của nhiều trình tự ADN khác
nhau vì được chiết suất từ ADN nhiễm sắc thể. Tuy vậy, mọi phân tử AND chứa
đoạn trình tự đích đều có thể sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phân tử
PCR cũng có thể sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR nhờ việc sử dụng
enzyme phiên mã ngược( reverse transcriptase) để chuyển trình tự ARN thành
trình tự ADN
Đoạn mồi oligonucleotide: Một phản ứng PCR thường cần một cặp mồi
oligonucleotide. Đây là những phân tử AND mạch đơn ngắn ( thường gồm
khoảng 10-20 base nitơ) thu được nhờ quá trình tổng hợp hóa học. Các đoạn mồi
được chọn sao cho trình tự các oligonuceotid của chúng bổ trợ với trình tự ở hai
đầu đoạn ADN cần khuếch đại( trên mạch đối diện).

Một số đoạn mồi cho quá trình khuếch đại PCR theo chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’
ADN polymerase: Một số loại ADN polymerase được sử dụng trong phản ứng
PCR. Những enzym này là các enzyme bền ở nhiệt độ cao, có thể ổn định và
hoạt động ở nhiệt độ tới 100 độ C. Enzym được sử dụng phổ biến nhất là Taq
ADN polymerase có nguồn gốc từ Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn được

24
phát hiên ở suối nước nóng. Vai trò của ADN polymerase trong phản ứng PCR
là xúc tác quá trình sao chép các phân tử ADN. Enzym này gắn vào chuỗi ADN
mạch đơn và tổng hợp ADN mới có trình tự bổ trợ với mạch ADN làm khuôn
( mạch gốc). Tuy vậy, enzyme AND polymerase đòi hỏi phải có một đoạn ADN
mạch kép để có thể khởi đầu phản ứng trùng hợp phân tử ADN.Trong quá trình
phản ứng PCR xảy ra, đoạn mồi oligonucleotid gắn vào hai đầu của đoạn ADN
cần khuếch đại theo nguyên tắc bổ trợ và tạo ra các vùng ADN sợi kép ngắn.
Nhờ vậy, các đoạn mồi giúp định hướng để enzyme ADN polymerase tiến hành
kéo dài chuỗi polynucleotide và chỉ sao chép đoạn trình tự AND đích.
Cấu trúc không gian enzim DNA polymerase
beta ở người
Enzim này xúc tác phản ứng hóa học sau
Deoxynucleoside triphotphate + ADNn ↔
Diphotphate + ADNn+1
Xúc tác mở rộng DNA-template của 3'- cuối của
một sợi DNA của một nucleotide tại một thời
điểm.

Các tiểu phân dNTP (deoxyribonucleotid trisphotphate): Các đơn phân tử

này tương ứng với bốn loại base nitơ có mặt trong phân tử ADN( adenine,
guanine, thymine và cytosine), đồng thời chúng là cơ chất hoạt động của enzym
ADN polymerase. Mỗi phản ứng PCR cần 4 loại dNTP (dATP, dTTP, và dCTP)
như các tiểu phân cấu trúc hình thành nên phân tử
2.2. Phản ứng PCR xảy ra như thế nào
Phản ứng PCR cho phép khuếch đại các đoạn trình tự ADN đích thông qua
nhiều chu kỳ tổng hợp ADN lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi một phân tử ADN đích
được tổng hợp mới sau đó lại được sử dụng làm mạch khuôn cho chu kỳ tổng
hợp tiếp theo. Kết quả là lượng ADN của đoạn trình tự đích tăng lên nhanh
chóng sau mỗi chu kỳ và trở thành phân tử chiếm ưu thế sau khi phản ứng kết
thúc. Trong các chu kỳ đầu tiên, quá trình tổng hợp ADN tăng lên theo hàm số
mũ, nhưng ở các chu kỳ sau vì lượng ADN đích được sao chép tăng lên và các

25
thành phần tham gia phản ứng được sử dụng hết, lượng ADN được khuếch đại
tăng lên theo kiểu tuyến tính, sau đó không tăng lên nữa.
Mỗi một chu kỳ tổng hợp ADN liên quan dến 3 giai đoạn là biến tính, gắn mồi,
kéo dài chuỗi, trong đó mỗi giai đoạn xảy ra ở một chế độ nhiệt khác nhau đến
khi một phân tử ADN mới được tổng hợp hoàn chỉnh.
Giai đoạn biến tính:
Nhiệt độ phản ứng được nâng lên trên 90°C. Ở nhiệt độ này, cấu trúc ADN xoắn
kép bị biến tính và tách ra thành hai mạch đơn riêng biệt và có thể dùng làm
khuôn để tổng hợp nên phân tử ADN mới nhờ hoạt dộng của enzym ADN
polymerase.

Phân tử ADN được khuếch đại sau nhiều chu kỳ

Giai đoạn gắn mồi:

26
Phản ứng được làm lạnh về nhiệt độ phù hợp cho việc gắn của các đoạn mồi vào
phân tử ADN mạch đơn làm khuôn, nhưng không làm các mạch đơn làm khuôn
liên kết trở lại với nhau thành mạch kép. Vì vậy, giai đoạn này gọi là giai đoạn
gắn mồi. Nhiệt độ của giai đoạn này có thể thay đổi (35 - 60°C) tuỳ thuộc vào
chủng loại và số lượng các nucleotid có trong đoạn mồi.
Giai đoạn kéo dài chuỗi:
Giai đoạn này diễn ra ở nhiệt độ mà enzym ADN polymerase có hoạt tính cao.
Đối với Taq polymerase, nhiệt độ này là 72°C. Nhờ sự định hướng của đoạn
mồi, enzym ADN polymerase tiến hành sao chép phân tử ADN theo nguyên tắc
kéo dài chuỗi polynucleotid dựa trên một mạch ADN làm khuôn. Một phản ứng
PCR điển hình thường gồm tổng cộng 20 - 40 chu kỳ tùy thuộc vào lượng trình
tự ADN đích có trong phân tử ADN làm khuôn. Phản ứng PCR có thể sử dụng
để khuếch đại các đoạn ADN có kích thước đến vài ngàn cặp base nitơ. Để có
thể thực hiện một số lượng lớn các chu kỳ biến đổi nhiệt độ khác nhau, phản
ứng PCR được tiến hành nhờ máy biến nhiệt theo chu kỳ (thermal cycler).
Trong chu kỳ đầu tiên, các phân tử ADN dược tổng hợp đến đầu tận cùng của
chuỗi ADN gốc, đó là do không có sự ngăn cản enzym ADN polymerase tiến
hành sao chép cho đển đầu tận cùng cùa mạch ADN gốc. Tuy vậy, trong các chu
kỳ tiếp theo, phân tử ADN mới được tổng hợp có đầu tận cùng là trình tự của
đoạn mồi được sử dụng làm khuôn, và vì vậy việc tổng hợp các phân tử ADN
mới chỉ giới hạn trong đoạn trình tự được giới hạn bởi các đoạn mồi, hay nói
cách khác chỉ đoạn trình tự ADN đích được tổng hợp.

27
 Sự thay đổi nhiệt độ qua các giai đoạn DNA denaturation – Biến tính ở 920C; Primer
annealing – Gắn mồi ở 35 - 60°C và Primer extension – Kéo dài chuỗi ở 72°C
Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình khuếch đại qua link video sau
https://www.youtube.com/watch?v=MyLrs_h1OlE

2.3. Các ứng dụng của phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng rộng rãi như một phương tiện nghiên cứu giúp tăng
cường các khả năng nghiên cứu về gen. Phần lớn các nghiên cứu về di truyền
phân tử hiện nay đòi hỏi việc sử dụng kỹ thuật PCR như một kỹ thuật đầu tay
chủ yếu, hoặc dễ phối hợp với các phương pháp nghiên cứu khác. Chẳng hạn
như, sản phẩm PCR có thể được sử dụng để giải trình tự ADN, sử dụng làm mẫu
dò trong các phương pháp thẩm tách Southern và Northem, và để tạo ra các
dòng gen mới. Kỹ thuật PCR không chỉ được ứng dụng trong các lĩnh vực
nghiên cứu sinh học và y học thực nghiệm, mà ngay cả trong các lĩnh vực sinh
học đại cương như nhân chủng học và cổ sinh vật học.
Sau đây là một số lĩnh vực mà kỹ thuật PCR ngày nay dược sử dụng rộng rãi và
đã có những đóng góp đáng kể:
- Nghiên cứu về các bệnh di truyền: Các rối loạn bệnh lý gây ra do dột biến
gen có thế được di truyền từ bố, mẹ sang con cái. Chẳng hạn như đối với bệnh
máu khó đông và bệnh xơ nang, người ta có thế sử dụng kỹ thuật PCR để

28
khuếch đại các trình tự gen để sàng lọc và tìm ra các đột biến gây bệnh. Thông
tin thu được sẽ giúp cán bộ nghiên cứu hiểu biết chi tiết hơn về nguyên nhân của
các dạng bệnh lý này, đồng thời có thể giúp xác định các cá thể mang gen gây
bệnh.
- Nghiên cứu về ung thư học: PCR đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các
nghiên cứu tìm hiểu về vai trò cùa gen trong quá trình phát sinh các tế bào ung
thư. Chẳng hạn như đột biến xảy ra ở các gen gây ung thư (oncogene), hoặc các
gen ức chế khối u (tumor suppressor) có thể xác định được bằng việc khuếch đại
ADN thu đươc từ các tế bào ung thư nhờ việc sử dụng kỹ thuật PCR. Điều này
giúp cho các nhà nghiên cứu có hiểu biểt chi tiết hơn về quá trình hình thành và
phát triển của các tế bào ung thư.

3. GIẢI MÃ TRÌNH TỰ ADN

3.1. Nguyên lý giải mã trình tự ADN

Có hai nguyên lý giải mã trình tự các nucleotide của phân tử ADN đã

được phát triển, đó là phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy (ddNTP) của Sanger
và phương pháp biến tính hóa học của Maxam và Gilbert. Phương pháp kết thúc
chuỗi ( sử dụng ddNTP ) hiện nay được sử dụng thay thế cho phương pháp hóa
học do kỹ thuật này hiệu quả và dễ thực hiện hơn.
Nguyên lý của phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy là dựa trên việc phân
tử ADN được sao chép nhờ hoạt động của enzym ADN polymerase. Việc sử
dụng các phân tử nucleotid Triphosphate cải tiến thành dạng dideoxynucletid
triphosphate ( ddNTP) làm dừng phản ứng tổng hợp ADN một cách ngẫu nhiên
tại vị trí tương ứng với một trong bốn loại base nito trên mạch ADN làm khuôn.
Kết quả là một dãy các phân tử ADN sai khác nhau về chiều dài được tạo ra.
Các phân tử này sau đó sẽ được phân tách nhờ phương pháp điện di trên gel.

29
Trình tự cửa các base nito trên mạch ADN làm khuôn được xác định bằng việc
xác định loại base nito có mặt ở đầu tận cùng của mỗi phân tử ADN được tổng
hợp kể từ phân tử ngắn nhất cho đến phân tử dài nhất .

Sự kết thúc tổng hợp ADN bởi dideoxynucleotide

3.2. Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp
giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên tắc của phương pháp là
dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với
nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.

30
 Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của
mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lí
hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã
đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1
nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí
mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định
được trình tự mạch đơn.
Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng
- Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm
đứt mạch tại G.
- Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gây đứt
mạch đơn tại A hoặc G.
- Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch
đơn tại T và C.
- Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ
muối cao làm đứt mạch đơn tại C.
Kết quả: Các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích
thước khác nhau. Điện di trên gel polyacriamid đọc kết quả điện di bằng máy
phóng xạ tự ghi ta thu được trình tự nucleotide của mạch đơn DNA.

31
Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình giải trình tự ADN bằng
phương pháp hóa học link video sau: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0

3.3. Phương pháp kết thúc chuỗi trùng hợp nhờ dideoxynucleotide

Phân tử ADN được giải mã trình tự được gọi là mạch khuôn. Phân tử này
phải được làm tinh sạch và đồng nhất, nghĩa là nó chỉ chứa các phân tử ADN có
trình tự giống hệt nhau.
Các vector plasmid tinh sạch chứa trình tự ADN được tách dòng hoặc các
phân tử ADN được tạo ra nhờ phản ứng PCR thường được sử dụng làm mạch
khuôn. Một yêu cầu đối với quá trình giải mã trình tự sử dụng phương pháp kết
thúc chuỗi trùng hợp là phân tử ADN phải ở trạng thái mạch đơn là dạng có thể
sao chép bởi enzym ADN polymerase. Trước đây, việc này có thể thức hiện nhờ
việc tách dòng phân tử ADN bằng vector phago M13, khi vector phago tái tổ hợ
được dùng để lây nhiễm vi khuẩn E coli , nó tạo ra các bản sao của tình tự ADN
được tách dòng ở trạng thái mạch đơn là vì vậy có thẻ sử dụng để làm mạch

32
khuôn cho quá trình giải mã trình tự. Gần đây người ta sử dụng phương pháp
đơn giản hơn nhiều là gây biến tính ADN bằng việc xử lí nhiệt hoặc dung dịch
kiềm để thu phân tử ADN ở trạng thái mạch đơn sử dụng cho việc giải mã trình
tự , qua đó không phải tiến hành việc tách dòng phân tử . Có một số loại ADN
polymerase được sử dụng cho mục đích giải mã trình tự, bao gồm một phần của
emzym ADN polymerase I của E coli gọi là đoạn Klenow, đây là một enzyme
ADN polymerase được cải tiến di truyền có nguồn gốc từ phago T7 là
Sequencase và Taq ADN polymerase vốn được sử dụng trong phản ứng PCR.
Tất cả các enzyme ADN polymerase yêu cầu phải có cùng một vùng ADN
sợi kép ngắn ở đầu để có thể khởi đầu việc xúc tác tổng hợp phân tử ADN dựa
trên trình tự nucleotid trên mạch đơn làm khuôn. Vì vậy, phản ứng giải mã trình
tự phải được bổ sung bằng các phân tử ADN mạch đơn ngắn gọi là các đoạn mồi
oligonucleotid được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp hóa học. Các đoạn mồi
được chọn sao cho trình tự nucleotid nó bổ trợ với trình tự nucleotid của mạch
khuôn.Nhờ vậy,các đoạn mồi có thể gắn vào mạch ADN làm khuôn tạo nên
vùng ngắn ADN cấu trúc mạch kép,đó là điểm phản ứng giải mã trình tự bắt đầu
diễn ra. Để giải mã trình tự một phân tử ADN ,người ta chuẩn bị 4 phản ứng
enzyme riêng biệt. Mỗi phản ứng gồm:phân tử ADN làm khuôn ở trạng thái
mạch đơn, ADN polymerase, đoạn mồi,hỗn hợp bốn loại deoxyribonucleotid
triphosphate (dNTP) là đơn phân tử cấu thành nên phân tử ADN trong phản ứng
trùng hợp, và một loại nucleotid cải tiến được gọi là dideoxyribonucleotid
triphosphate (ddNTP). Có bốn loại ddNTP khác nhau tương ứng với bốn loại
base nito trong phân tử ADN. Các phân tử ddNTP khác với dNTP ở chỗ không
có nhóm hydroxyl(-OH) ở vị trí C-3’ của phân tử đường pentose.Phân tử ddNTP
có thể liên kết được vào chuỗi ADN đang được trùng hợp nhờ hoạt tính của
enzyme ADN polymerase, nhưng vì thiếu nhóm –OH ở vị trí C-3’, liên kết
phosphodieste không được hình thành với nucleotid ở vị trí kế tiếp. Vì vậy, quá
trình kéo dài chuỗi ADN bị dừng lại. Có thể nói ddNTP là yếu tố kìm hãm phản
ứng tổng hợp ADN. Vì mỗi một trong bốn phản ứng giải mã trình tự chứa một
loại ddNTP khác nhau, nên phù thuộc vào loại ddNTP nào có mặt trong phản

33
ứng, quá trình tổng hợp ADN sẽ kết thúc ở vị trí của nucleotid đó. Vào mọi thời
điểm trong quá trình tổng hợp ADN, enzyme ADN polymerase có thể xúc tác
phản ứng liên kết của dNTP vào chuỗi polynucleotid đang được tổng hợp, lúc đó
phản ứng kéo dài chuỗi tiếp tục xảy ra,hoặc có thể xúc tác để ddNTP liên kết
vào chuỗi đang được mở rộng, nhưng trong trường hợp đó phản ứng tổng hợp
ADN bị dừng lại. Kết quả cuối cùng là mỗi một trong số 4 phản ứng giải mã
trình tự sẽ tạo ra một dãy các phân tử ADN có kích thước khác nhau ,và mỗi
phân tử sẽ có trình tự được kết thúc tại vị trí có mặt base nito tương ứng trên
phân tử ADN mạch khuôn. Ví dụ như trong phản ứng giải mã trình tự chứa
ddATP, một dãy các phân tử ADN sẽ được tổng hợp trong đó mỗi phân tử sẽ kết
thúc ở vị trí A (adenin) tương ứng với vị trí T trên mạch khuôn
Khi phản ứng giải mã trình tự kết thúc, các phân tử ADN mới được tổng hợp
được phân tách nhờ phương pháp điện di trên gel với sản phẩm của 4 phản ứng
giải mã được chạy trên các giếng gần nhau cùng lúc bằng việc bổ sung thêm
dNTP được đánh dấu phóng xạ nhờ các đồng vị lưu huỳnh và phospho, các phân
tử ADN sẽ có hoạt tính phóng xạ vì vậy có thể phát hiện được khi đưa bản gel
polyacrylamide lên tấm phim chụp tia X. Phương pháp này gọi là phương pháp
phóng xạ tự chụp. Sau khi xử lí phim tia X, một dãy các bang điện di hiện lên
trên bề mặt của phim tương ứng với 4 dãy điện di chạy từ 4 giếng của 4 phản
ứng giải mã trình tự khác nhau. Trình tự của việc ADN khuôn nhờ vậy có thể
xác định bằng việc đọc từ các băng có kích thước nhỏ nhất lần lượt đến các bang
có kích thước lớn hơn liền kề.

34
 Giải trình tự ADN bằng kết thúc đoạn ddNTPs
Mời các bạn cùng theo dõi những bước cơ bản trong quá trình giải trình tự ADN theo
phương pháp Sanger theo link https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ&t=42s

35
3.4. Giải mã trình tự ADN tự động

Mặc dù nguyên lí cơ bản của phương pháp giải mã trình tự không thay đổi,
nhưng kỹ thuật này được phát triển lên thành một kỹ thuật tự động, bao gồm
một hệ thống bán tự động trong đó công việc điện di sản phẩm ADN khuếch đại
và việc phát hiện cũng như phân tích các phản ứng giải mã trình tự được thực
hiện bởi một hệ thống thiết bị do máy tính điều khiển. Với thiết kế như vậy, bốn
loại ddNTP được đánh dấu bằng các loại thuốc nhuộm màu khác nhau thông qua
liên kết cộng hóa trị.
Đặc điểm Giải trình tự tự động Giải trình tự trên bản gel
ADN đánh dấu Phát huỳnh quang Đồng vị phóng xạ
Tín hiệu dò Tự động Phim
Mẫu 1 đường/1 mẫu 4 đường/1 mẫu
Chiều dài đoạn đọc 400-1000 bp 250-500 bp
Chỉ cần thực hiện một phản ứng giải mã trình tự duy nhất mà sản phẩm tạo
ra là một dãy các phân tử ADN mà phân tử này chỉ dài hơn phân tử kia một
nucleotid duy nhất được đánh dấu bằng thuốc nhuộm có màu tương ứng nằm ở
vị trị cuối cùng của chuỗi polynucleotid. Các sản phẩm ADN được khuếch đại
sau đó được điện di trên gel polyacrylamid. Nucleotid cuối cùng nằm trên chuỗi
phát ra ánh sáng huỳnh quang khi được chiếu bằng nguồn sáng laser và được ghi
nhận bằng một thiết bị dò có sẵn trong hệ thống. Nhờ vào bước sóng của ánh
sáng phát ra, thiết bị dò có thể xác định được nucleotid cuối cùng trong mỗi
chuỗi polynucleotid, đồng thời xây dựng một “bức tranh toàn cảnh” về thành
phần và trình tự các nucleotid của phân tử ADN được khuếch đại.
Phương pháp giải mã trình tự ADN tự động có nhiều ưu thế vượt trội so với
các phương pháp truyền thống hoặc phương pháp hóa học (thực hiện bằng tay).
Mỗi một phản ứng giải mã trình tự đối với một mẫu chỉ đòi hỏi một ống nghiệm
đựng mẫu và chạy trên một dải điện di duy nhất, trong khi số lượng này trong
phương pháp truyền thống là bốn. Đặc tính này kết hợp với khả năng phát hiện
và phân tích mẫu tự động giúp làm tăng tốc độ giải mã trình tự và dung lượng
dữ liệu có thể quản lí khai thác một cách rõ rệt.

36
Phân tích trình tự ADN được giải mã: Giải mã trình tự ADN là một trong những
kỹ thuật nền tảng của lĩnh vực di truyền học phân tử và ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong các nghiên cứu. Điểm quan trọng của kỹ thuật này là khả năng xác
định thông tin liên quan đến thành phần của ADN. Trong những năm gần đây,
lượng thông tin liên quan đến trình tự ADN được xác định ở các loài sinh vật
khác nhau đã tăng lên nhanh chóng, đến mức những thông tin này phải được
quản lí dưới dạng các ngân hàng dữ liệu, trong đó có các ngân hàng dữ liệu
EMBL ở Châu Âu và Genbank ở Mỹ. Các ngân hàng dữ liệu này chứa các trình
tự của các gen và hệ gen người cũng như của nhiều loại sinh vật khác nhau được
các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới tìm ra. Những thông tin về trình tự
ADN trong các ngân hàng dữ liệu như vậy hiện nay có thể dễ dàng truy cập và
tải về miễn phí thông qua mạng Internet.
Việc giải mã trình tự ADN giúp tạo ra một lượng số liệu khổng lồ. Để giúp cho
việc phân tích các trình tự được dễ dàng hơn, người ta sử dụng một số phần
mềm chuyên dụng. Chẳng hạn như phần mềm GCG của Đại học
Wisconsin,v.v... cho phép phân tích nhanh chóng các đặc tính quan trọng của
các trình tự ADN, như vị trí cắt của enzym giới hạn, mã bộ ba mở đầu, các mã
bộ ba kết thúc, khung đọc, phần giao nhau giữa exon – intron và các trình tự gen
điều hòa. Các gen này cũng cho phép so sánh các trình tự mới được phát hiện
với các trình tự đã có trong ngân hàng dữ liệu và qua đó cho biết mức độ giống
nhau, khác nhau và mối quan hệ của các gen này.
Việc phát triển các hệ thống giải mã trình tự ADN tự động đã giúp việc xác
định trình tự ADN của toàn bộ hệ gen một số loài sinh vật quan trọng trở nên dễ
dàng hơn. Cho đến nay toàn bộ hệ gen của E.coli (4,6 x 10 6 bp) nấm men
S.cereviseae ( 2,3 x 107 bp) , người ( 6,4 x 109 bp ) và một số loài sinh vật khác
đã được xác định . Ngoài ra , dự án giải mã trình tự hệ gen cơ bản của người đến
nay cũng đã hoàn thành.

37
4. CÂU HỎI LUYỆN TẬP
Các câu hỏi được trích từ các đề thi IBO, Chọn học sinh giỏi cấp Quốc gia,
Chọn đội tuyển thi Quốc tế và một số câu hỏi được dịch từ các sách, tạp chí…
Câu 1: Em hãy gọi têncác thành phần, quá trình trong công nghệ ADN tái tổ
hợp được mô tả ở hình dưới đây

Các bước trong công nghệ ADN tái tổ hợp

Đáp án:
1. Lựa chọn và phân lập gen mong 6. Đoạn gen mong muốn với đầu
muốn dính
2. Plasmid 7. Ligase
3 và 4. Enzyme cắt giới hạn 8. ADN tái tổ hợp
5. EcoRI 9. Biến nạp
10. Phiên mã và dịch mã

38
Câu 2: Có mẫu ADN được cắt bằng enzyme cắt giới hạn riêng rẽ hoặc có thể
kết hợp các loại enzyme. Sau đó mang mẫu đi điện di trên điện trường gel
agarose thu được kết quả như hình bên dưới. Dựa vào kết quả em hãy vẽ vị trí
cắt của các enzyme.

Đáp án:

Câu 3: Em hãy cho biết trình tự của đoạn ADN dựa vào kết quả phân tích ADN
theo phương pháp Sanger theo hình bên dưới.

Đáp án:
Trình tự của đoạn ADN

39
3’ T G T A T G C C T A A G 5’
5’ A C A T A C G G A T T C 3’
Câu 4: Cho kết quả phân tích ADN như sau

a. Mẫu nào (A hoặc B) chứa ADN dạng vòng

b. Tổng chiều dài của phân tử ADN dạng thẳng
c. Tổng chiều dài của phân tử ADN vòng
Đáp án:
a. A
b. 10kb
c. 10kb
Câu 5: Đoạn mồi nào sau đâycó thể được sử dụng để khuếch đại chuỗi ADN
điachs, biết đoạn exon mã hóa protein của gen CFTR

Đáp án: A

40
Câu 6: Hình bên thể hiện kết quả phân tích ADN trên điện trường gel bằng cách
nhuôm ethidium bromide. Với đoạn ngắn ADN có trình tự như hình vẽ, hãy cho
biết nó có thể cắt bởi enzyme cắt giới hạn EcoRi (5’GÂATTC), Alul (5’AGCT)
và Pstl (5’CTGCAG). Có bao nhiêu sản phẩm được tạo thành?

Đáp án:
- EcoRi (5’GAATTC) cắt 1 lần tạo 2 sản phẩm
- Alul (5’AGCT) cắt 2 vị trí tạo 3 sản phẩm
- Pstl (5’CTGCAG) không cắt tại bất kỳ vị trí nào

Câu 7: Enzyme cắt giới hạn EcoRi (5’GAATTC) và Pstl (5’CTGCAG) có thể
cắt như hình vẽ bên dưới.

Hãy chỉ ra vị trí 5’ và 3’ của phân tử khi bị cắt? Đuôi có thể thay đổi như thể nào
nếu ủ phân tử ADN bị cắt với ADN polymerase với sự có mặt cả 4 dNTPs. Sau
đó có thể nối đầu BamHI với T4 ligase không?
Đáp án:

41
Câu 8: Để lập bản đồ enzyme cắt giới hạncủa BamHI 3.0kb. cho 3 mẫu cắt với
EcoRI, Hpall và hỗn hợp EcoRI và Hpall. Sau đó phân tích sản phẩm bằng
phương pháp điện di gel. Từ kết quả hãy lập bản đồ enzyme cắt giới hạn.

Đáp án:
Bởi vì Hpall chỉ tạo 2 đoạn chứng tỏ chỉ cắt một lần. Bởi Hpall chỉ tạo 3 đoạn
chứng tỏ cắt ở 2 vị trí. Bản đồ enzyme cắt giới hạn chỉ có thể như sau:

Câu 9: Để nhân dòng một đoạn ADN có đuôi KpnI vào vector có đuôi BamHI.
Vấn đề đặt ra là đuôi BamHI và KpnI không phù hợp với nhau (hình bên trái).

42
Một cách giải quyết là sử dụng đoạn oligonucleotide (hình bên phải) để nẹp lại
với nhau. (A) Em hãy vẽ hình mô tả sự kết hợp của KpnI-BamHI và
oligonucleotide? (B) Vẽ hình mô tả phân tử sau khi xử lý với ADN ligase.

Đáp án:

Câu 10: Đoạn mồi nào có thể được sử dụng để khuếch đại phân tử ADN như
hình vẽ bên dưới

Phân tử ADN cần khuếch đại

Đoạn mồi nào là phù hợp để thực hiện sự khuếch đại?

43
Đáp án:
Đoạn mồi 1 và 8 là phù hợp. Các đoạn mồi còn lại hoặc không bổ sung hoặc bổ
sung nhưng lại không đúng hướng.
Câu 11: Phân tích ADN theo phương pháp
Sanger cho kết quả điện di như hình vẽ bên
dưới. Hãy cho biết trình tự ADN của mạch
khuôn?

Đáp án:
Trình tự của mạch bổ sung lấy nguyên liệu từ các dNTP là:
5’GTACCCGAAATCAGGA3’
 Trình tự trên mạch khuôn của ADN mẫu là 3’CATGGGCTTTAGTCCT5’
Câu 12: Phân tích ADN theo phương
pháp Sanger cho kết quả điện di trên
agarose của 2 mẫu kiểu dại (wild type)
và mẫu đột biến (mutant) như hình vẽ
bên dưới.
a. Hãy cho biết trình tự 5’ – 3’ của mẫu
kiểu dại.
b. Hãy cho biết trình tự 5’ – 3’ của
mẫu đột biến. Loại đột biến nào đã xảy
ra?

Đáp án:
a. 5’TGGCGTAAAGTCTGGCATCC3’
b. 5’TGGCGTAAGTCTGGCATCC3’. Đột biến điểm dạng mất cặp nucleotit
A-T đã xảy ra làm khung đọc thay đổi từ bộ ba thứ 3 trở đi.

44
Câu 12: Trong một nghiên cứu tạo thư viện plasmid cDNA, các đoạn cài dài 10
– 15 kb (kb: nghìn cặp base nito) từ hệ gene của một vi khuẩn được cắt thành
các phân đoạn bởi enzyme giới hạn EcoRI rồi cài vào vector plasmid tại vị trí
giới hạn EcoRI. Trong nghiên cứu này, người ta phải xác định được plasmid
mang gene purB. Để thực hiện được việc đó, người ta lấy 5 plasmid khác nhau
của thư viện đem cắt bằng EcoRI rồi điện di. Trong thí nghiệm tiếp theo, cũng 5
plasmid đó được phân tích bằng PCR với cặp mồi có trình tự nằm trong gene
purB, rồi sản phẩm PCR được điện di trên gel. Biết rằng để quan sát DNA, trước
khi điện di cả hai bản gel đều được bổ sung thuốc nhuộm đặc hiệu DNA
(ethidium bromide).

Mỗi phát biểu dưới đây là ĐÚNG hay SAI?

A. Các plasmid chứa các đoạn cài có thể nằm gối lên nhau là plasmid 1 và
plasmid 3.
B. Để xác định plasmid chứa đoạn cài có gene purB, ngoài phương pháp PCR
có thể sử dụng
phương pháp chọn lọc khuẩn lạc “xanh – trắng”.
C. Để xác định plasmid chứa đoạn cài có gene purB, ngoài phương pháp PCR
có thể sử dụng phương pháp lai Southern.
D. Phần trình tự của gene purB bắt cặp với đoạn mồi PCR có ở các plasmid 2
và plasmid 5.
Đáp án:
- Phát biểu đúng: A, C, D
- Phát biểu sai: B

45
Câu 13: Frederick Sanger (1918-2013) đã phát minh ra kĩ thuật giải trình tự
DNA, RNA và protein; Shankar Balasubramanian (1966-đến nay) đã phát minh
ra kĩ thuật giải trình tự DNA hiệu năng cao. Trung tâm Chăm sóc Sức khỏe
Quốc gia hiện đang giải trình tự 100.000 hệ gen từ các bệnh nhân mắc bệnh
hiếm gặp, nhưng các công nghệ giải trình tự khác nhau đều có những giá trị
riêng, như được mô tả dưới đây.

Mỗi phát biểu dưới đây về dự án 100.000 hệ gen là đúng hay sai?
A. Công nghệ Illumina là phù hợp nhất để tìm ra những biến đổi đơn nucleotide
(các đột biến ở một bazơ đơn lẻ) trong các hệ gen của bệnh nhân.
B. Công nghệ PacificBiosciences là phù hợp nhất để đánh giá những biến đổi
trong phiên mã bằng việc giải trình tự RNA.
C. Công nghệ PacificBiosciences là phù hợp nhất để phát hiện sự tái sắp xếp
của các đoạn ADN trong các hệ gen bệnh nhân.
D. Giải trình tự Sanger là phù hợp nhất để kiểm định (kiểm tra lại) các kết quả
giải trình tự, trước khi dùng thông tin di truyền của bệnh nhân để chỉ định can
thiệp y tế.
Hướng dẫn giải:
- Phát biểu đúng: A, C, D
- Phát biểu sai: B
Câu 14: Một phản ứng PCR gồm chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau để
khuếch đại đoạn gen đích lên thành nhiều bản sao từ một mẫu ADN ban đầu.
Hỏi trải qua bao nhiêu chu kỳ đoạn gen đích được tạo ra.

46
Đáp án: ở chu kỳ thứ 3. Kết quả được giải thích theo sơ đồ sau

47
Câu 15: Michael Smith (1932-2000) đã phát minh kĩ thuật gây đột biến hướng
đích. Gần đây các nhà khoa học đã phát minh công nghệ CRISPR-Cas9 để tiến
hành gây đột biến dễ dàng hơn. Protein Cas9 từ Streptococcus pyogenes được
dẫn bởi một guideARN (ARN chỉ dẫn, gARN) dài 20 bp liên kết với ADN đích.
Enzyme Cas9 này chỉ có thể cắt sợi kép ADN tại vị trí cách ba nucleotide nằm
ngược dòng trình tự 5'-NGG-3' (1). Các phân đoạn ADN sợi kép đã bị cắt bởi
các enzyme này, và sau đó vẫn có thể được nối trở lại. Gen X cần được làm mất
chức năng nhờ enzyme Cas9 được mô tả ở đây (2). Một cách khác để knockout
gen là sử dụng một cặp gồm Cas9 cải biến có khả năng chỉ tạo ra các vết cắt sợi
đơn và ARN chỉ dẫn (guideRNA) hướng đích tới các vị trí liền kề.

Chọn trình tự guideARN sẽ chỉ dẫn Cas9 tới vị trí I.

1 = 5'-ATTTTTCGACGTTTAGGCCA-3'

48
2 = 5'-AUUUUUCGACGUUUAGGCCA-3'
3 = 5'-AUAAAACGUGCAAAUCCGGU-3'
4 = 5'-UUUGCACGUUUAGGCCAAGG-3'
5 = 5'-UUUUUGGGGGCCCAGGAUCU-3'
Mỗi phát biểu dưới đây là đúng hay sai?
A. Sử dụng cặp đôi Cas9 và guideARN bị biến đổi làm tăng các tổn thương sai
đích ở các gen khác.
B. Hệ gen Streptococcus pyogenes ngẫu nhiên có nhiều vị trí NGG hơn mong
đợi.
C. Nếu gen không có các trình tự GG, các protein Cas9 từ các loài khác cần
được nghiên cứu.
Đáp án:
- Trình tự đúng: 2 = 5 – AUUUUC …………………..
- Phát biểu đúng: C
- Phát biểu sai: A và B
Câu 16: Giả sử em xác định được 1 gen ở nấm men rượu, tương đồng với gen
mã hóa tiểu đơn vị của enzyme telomerase từ động vật nguyên sinh. Sau đó em
tạo môt đột biến đích làm mất một bản sao của gen ở chủng lưỡng bội của nấm
men và sau đó cảm ứng để tạo bào tử và sinh ra các tế bào đơn bội. Tất cả bốn
bào tử nảy mầm tốt, và em có thể tạo khuẩn lạc trên đĩa thạch. Cứ sau 3 ngày,
em cấy ria lại các khuẩn lạc lên môi trường thạch đĩa mới. Sau 4 lần cấy chuyển
liên tục như vậy, các thế hệ sau của 2 trong số 4 bào tử ban đầu sinh trưởng rất
kém, thậm chí không sinh trưởng. Em lấy các tế bào từ các đĩa gốc nuôi 3, 6 và
9 ngày để tách chiết ADN, sau đó cắt mẫu ADN ở vị trí cách điểm khởi đầu của
vùng lặp lại ở đầu mút của nhiễm sắc thể khoảng 35 nucleotit. Phân tách các
phân đoạn bằng điện di, và lai chúng với mẫu dò đặc hiệu đầu mút đánh dấu
phóng xạ (các băng màu tối) (Hình Q.52). Giả thiết là thời gian thế hệ là 6 giờ.

49
Hãy chỉ ra các câu sau là Đúng hay Sai
A. Độ dài trung bình của đầu mút của nấm men rượu là 300 nucleotit.
B. Bào tử 2 và 4 có vẻ thiếu enzyme tổng hợp đầu mút telomerase.
C. Đầu mút nhiễm sắc thể nấm men rượu mất không quá 20 nucleotit sau mỗi
lần nhân đôi nhiễm sắc thể.
D. Các nấm men rượu mất các đầu mút sẽ có kích thước tế bào bình thường.
Đáp án:
- Phát biểu sai: A, B
- Phát biểu đúng: C, D
Câu 17: Mr. Trung nhân dòng 1 trình tự mã hóa (coding sequence-CDS) của
một gen vào một vector rồi đặt tên plasmid tạo thành là pVN2016. CDS được
chèn tại vị trí nhận biết SacII nằm trong vùng MSC (multi cloning site) trong
vùng gen lacZ của vector (Hình Q.93A). CDS được chèn có một vị trí cắt giới
hạn Pstl cách bộ ba kết thúc của nó 0,8 kb. Để xác định kích thước và hướng
của CDS đã được chèn, Mr. Trung đã cắt plasmid này với enzyme cắt giới hạn
khác nhau, và sản phẩm cắt được trình bày trong hình Q.93B.

50
Dựa vào dữ liệu ở trên, hãy cho biết câu nào sau đây là đúng hay sai
A. CDS dài 2.6 kb và có vị trí nhận biết EcoRI ở điểm cách một đầu tận cùng
của nó khoảng 0,5 kb.
B. SpeI có thể được sử dụng để xác định hướng của CDS.
C. CDS được chèn vào cùng chiều với lacZ.
D. Nếu plasmid pVN2016 bị cắt bởi cả hai enzyme SpeI và EcoRI trong đệm
Tango (EcoRI và SpeI cắt ở mức tương ứng là 100% và 20%), thì 5 đoạn với
kích thước 0,5; 0,8; 1,3; 2,1 và 3,0 kb có thể được xác định bởi điện di trên gel,
giả sử khôngquan sát được các đoạn nhỏ hơn 50 bp.
Đáp án
- Phát biểu đúng: A, D
- Phát biểu sai: B, C
Câu 18: Tốc độ dịch mã của một mARN có thể được ước tính bằng điện di
SDS-PAGE. Trong thí nghiệm này, một mARN vi rút khảm thuốc lá (TMV) mã
hoá cho một protein kích thước 116000 dalton, được dịch mã trong dịch ly giải
(lysate) tế bào hồng cầu lưới của thỏ khi có mặt S-methionine. Dịch ly giải chứa
tất cả các thành phần của bộ máy dịch mã của tế bào hồng cầu lưới của thỏ. Cứ
sau một phút, lấy một mẫu để chạy SDS-PAGE. Các sản phẩm dịch mã tách biệt
được hiển thị bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography). Như trong hình dưới đây,

51
polypeptide lớn nhất được phát hiện có kích thước tăng theo thời gian, tới khi
đạt kích thước hoàn chỉnh sau khoảng 25 phút.

Hãy xác định mỗi câu sau đây là Đúng hay Sai.
A. Tốc độ tổng hợp protein TMV tăng theo cấp số mũ theo thời gian.
B. Nếu khối lượng phân tử trung bình của một amino acid là 110 Dalton, tốc độ
trung bình để tổng hợp protein là khoảng 35 đến 40 amino acid trong mỗi phút.
C. Dịch ly giải hồng cầu lưới của thỏ chứa enzyme methionyl-tARN synthetase.
D. mARN đó có thể chứa nhiều hơn 2 bộ ba hiếm gặp (rare codon).
Đáp án
- Phát biểu đúng: C, D
- Phát biểu sai: A, B
Câu 19: Tính trạng lông lang ở chuột với biểu hiện là sọc vàng xen lẫn sọc đen
do alen kiểu dại quy định. Đột biến thêm đoạn ở gene này làm chuột có màu
lông vàng hoàn toàn. Khi lai chuột lang với nhau, đời con luôn thu được toàn
chuột lang. Khi lai chuột lang với chuột vàng, thu được chuột lang và chuột
vàng với tỷ lệ tương đương. Khi lai chuột vàng với chuột vàng, đời con thu được
số chuột vàng gấp 2 lần số chuột lang. Khi nhân bản vùng mang gene quy định
tính trạng màu lông từ mẫu máu của chuột lang và chuột vàng bằng PCR với
cùng cặp mồi đặc hiệu, kết quả thể hiện ở hình dưới đây.

52
Xét trong thí nghiệm này, mỗi phát biểu dưới đây là ĐÚNG hay SAI?
A. So với alen kiểu dại, alen đột biến là trội khi xét tính trạng này nhưng lại là
lặn khi xét tính trạng khác.
B. Liên quan đến tính trạng màu lông, alen đột biến và alen kiểu dại là đồng
trội, do đó chuột lang có sọc vàng và sọc đen.
C. Trong thực tế, không thể thực hiện được phép lai giữa các cá thể có kiểu
gene đồng hợp tử về alen đột biến.
D. Chuột lang có kiểu gene dị hợp tử còn chuột vàng có kiểu gene đồng hợp tử.
Hướng dẫn chấm : Đúng, Sai, Đúng, Sai.

53
 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận
Như vậy, qua chuyên đề này tôi đã giải quyết những vấn đề sau đây:
- Giúp giáo viên và học sinh có cái nhìn khái quát về các kỹ thuật di truyền
và khả năng ứng dụng trong thực tế, hệ thống hóa toàn bộ kiến thức sơ bộ các
nguyên lý cơ bản nhất để giáo viên và học sinh chủ động và có kế hoạch cụ thể
trong nghiên cứu, giảng dạy, ôn tập.
- Có nhiều câu hỏi, bài tập vận dụng dùng trong quá trình hướng dẫn học
sinh nghiên cứu chuyên đề để giúp học sinh vận dụng, giải quyết những vấn đề
thực tiễn và ôn tập, củng cố lại kiến thức.
- Bên cạnh đó nhờ nghiên cứu chuyên đề này tôi cũng rút ra kinh nghiệm
cho việc giảng dạy phần “Di truyền ứng dụng” nói riêng và các chuyên đề khác
của sinh học nói chung.
2. Đề nghị
Việc tìm hiểu, nghiên cứu kỹ thuật di truyền là cần thiết. Qua đó, áp dụng
các kỹ thuật di truyền trong nghiên cứu bệnh di truyền ở người, khoa học hình
sự, công nghệ thực vật… Đặc biệt áp dụng các kỹ thuật di truyền trong việc giải
mã hệ gen ở người.
Với thời gian hạn chế, kiến thức bản thân có hạn nên đề tài không tránh
khỏi những sai sót, rất mong sự góp ý của các đồng nghiệp để đề tài được hoàn
thiện hơn.

54
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đinh Quang Báo, Nguyễn Đức Thành: Lý luận dạy học sinh học, NXB
GD. Hà Nội, 1996.
2. Sách giáo khoa 12, NXBGD. Hà Nội 2008
3. Sách bài tập 12, NXB GD. Hà Nội 2008
4. Tài liệu giáo khoa chuyên sinh học trung học phổ thông, NXB Giáo
dục Việt Nam, 2010 cuốn: Di truyền học và Tiến hóa
5. Đề thi IBO và các đề thi học sinh giỏi cấp quốc gia
6. Campbell & Reece, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam dịch và xuất bản
năm 2011.
7. Albert, Garland Science. Molecular Biology of the Cell, 6th Edition.
8. Leland, MCGraw Hill. Genetics, 4th Edition

55