ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---    ---

Ngô Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)

ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN
GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020
 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---    ---

Ngô Kim Ngân

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI (NGS)

ĐỂ PHÂN TÍCH GEN HBB Ở NGƯỜI NGHI NGỜ MANG ĐỘT BIẾN
GÂY BỆNH β-THALASSEMIA

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. DƯƠNG QUỐC CHÍNH

TS. TRẦN ĐỨC LONG

Hà Nội – 2020
 Lời cảm ơn
Để thực hiện thành công khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu
sắc đến Tiến sĩ Dương Quốc Chính, Trưởng khoa Di truyền - Sinh học phân tử,
Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương cùng với Tiến sĩ Trần Đức Long người
đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian em thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Lê Anh, Thạc sĩ Trần Tuấn Anh
cùng toàn thể nhân viên khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học –
Truyền máu Trung ương đã luôn giúp đỡ chia sẻ những kiến thức chuyên môn,
thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực
hiện luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy
cho em nhiều kiến thức quý báu. Em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau
đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi
cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ.
Xin cảm ơn dự án “Nghiên cứu sản xuất chip sinh học trên nền DNA
microarray để chẩn đoán một số bệnh ở người” mã số 01/2017/CNC_HDKHCN
của công ty BIMEDTECH đã hỗ trợ tôi thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết đã động
viên, bên cạnh em trong thời gian em thực hiện luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2020
Sinh viên

Ngô Kim Ngân

 BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tên đầy đủ và ý nghĩa

bp Base pair

DNA Deoxyribonucleic Acid

Cluster Cụm khuếch đại của DNA khuôn được gắn trên bề mặt flowcell.
Mỗi cụm được khuếch đại từ một sợi DNA khuôn ban đầu cho đến
khi có khoảng 1000 bản sao. Mỗi cluster sẽ tạo ra một trình tự đọc
duy nhất.

HbA Hemoglobin A

HbA2 Hemoglobin A2

HbE Hemoglobin E

HbF Hemoglobin F

Index Là trình tự DNA tag được gắn vào các trình tự đích, cho phép
kết hợp nhiều mẫu trong một bể thư viện và phân tách dữ liệu
sau khi đã hoàn thành lần chạy

kb kilobase = 1000 bp

MCH Mean Cell Hemoglobin: lượng hemoglobin trung bình hồng cầu

MCV Mean Corpuscular Volume: thể tích trung bình hồng cầu

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế thế giới

 MỤC LỤC
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2
1.1. Đại cương về β-thalassemia .......................................................................2
1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia ............................................2
1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia .............................................3
1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia ...............................................................5
1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia ...........................................................6
1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia..................................11
1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia ................13
1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) ...13
1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay) ......15
1.2.3. Giải trình tự ...........................................................................................16
1.3. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq . .......................20
1.3.1. Lịch sử phát triển ...................................................................................20
1.3.2. Nguyên tắc hoạt động ............................................................................21
1.4. Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam.....24
1.4.1. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR ..........................24
1.4.2. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử ..............................................25
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................28
2.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị ................................................................28
2.1.1. Đối tượng ...............................................................................................28
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................28
2.1.3. Trình tự mồi sử dụng .............................................................................29
2.1.4. Thiết bị...................................................................................................29
2.2. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................29
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................29
2.2.2. Quy trình thí nghiệm .............................................................................30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................................37
3.1. Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS ........37

i
 3.1.1. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR ...................................................37
3.1.2. Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu............................................................40
3.2. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu ............42
3.2.1. Thông tin lần chạy máy MiSeq. ............................................................42
3.2.2. Kết quả phân tích đột biến gen HBB .....................................................42
3.2.3. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger ...........................................................................46
3.2.4. Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu ...................................48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................50
PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB ................... a
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG
NGHIÊN CỨU ............................................................................................................b

ii
 DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến gây
ra bệnh β-thalassemia [7]. ...........................................................................................7
Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường
gặp ở Việt Nam. ..........................................................................................................9
Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48]. .............................11
Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16]. ...............................................12
Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR ..............................................14
Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina ...........................................21
Hình 7: Thông tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer ...............23
Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter ..........................................24
Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV ..........................................24
Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................30
Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu .............31
Hình 12: Kết quả blast cặp mồi HBB trên NCBI ......................................................37
Hình 13: Kết quả điện di sản phầm PCR trước tối ưu trên gel agarose 1,5%...........38
Hình 14: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di trên gel agarose 1.5% .................38
Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu................39
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm sau tối ưu trên gel agarose 1,5%. .....................39
Hình 17: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước khi tối ưu ..............40
Hình 18: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau khi tối ưu .................41
Hình 19: Kết quả giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26 ....................................45
Hình 20: Kết quả so sánh đột biến tại codon 26(G→T) và codon 26 (G→A) với ...46
Hình 21: Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger ....................47

iii
 DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31]. .....................................3
Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31]. ........................4
Bảng 3: Trình tự mồi HBB........................................................................................29
Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB .......................................31
Bảng 5: Kết quả phân tích đột biến gen HBB ...........................................................42
Bảng 6: Tỷ lệ các loại đột biến phổ biến ở Việt Nam ...............................................43
Bảng 7: Tỷ lệ các dạng đột biến HbE .......................................................................43
Bảng 8: Tỷ lệ các dạng đột biến ít gặp ở Việt Nam ..................................................44
Bảng 9: Kết quả giải trình tự NGS và Sanger ...........................................................47
Bảng 10: Tỷ lệ phát hiện đột biến của MCH và MCV .............................................49
Bảng 11: Tỷ lệ phát hiện đột biến ở các chỉ số Hb ...................................................49

iv
 ĐẶT VẤN ĐỀ
Beta thalassemia (β-thalassemia) là bệnh thiếu máu, tan máu di truyền gây ra
do giảm hoặc mất tổng hợp hoàn toàn chuỗi β-globin, thành phần chính của
hemoglobin do gen HBB nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 11 quy định. Ở Việt
Nam, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra tình trạng thiếu máu,
tan máu nặng ở trẻ em. Người mắc bệnh β-thalassemia thể nặng đòi hỏi phải được
điều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ. Việc điều trị này
khá tốn kém và lâu dài, là gánh nặng lớn cho gia đình, xã hội và làm tăng chi tiêu
ngân sách nhà nước cho lĩnh vực y tế. Đến nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 200
đột biến gây bệnh β-thalassemia [11], [17], [43]. Vì vậy, rất cần có một chương
trình tầm soát bệnh β-thalassemia trong cộng đồng nhằm hạn chế sự phổ biến của
gen bệnh, trong đó việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định chính
xác loại đột biến và kiểu gen của bệnh
Giải trình tự gen được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện nhiều đột
biến. Next-Generation Sequencing (NGS) là phương pháp giải trình tự thế hệ mới
có ưu thế về hiệu suất, cho phép phát hiện nhiều đột biến cùng lúc và đang dần trở
thành công cụ trong chẩn đoán thường quy [21]. Năm 2011, hãng Illumina đưa ra
thị trường hệ thống giải trình tự thế hệ mới – MiSeq và được sử dụng trong nhiều
phòng xét nghiệm sinh học phân tử với ưu điểm cho phép phân tích ít mẫu hơn
trong mỗi lần chạy, giảm giá thành, thuận lợi hơn cho các xét nghiệm.
Vì vậy, để tăng cường hiệu quả trong việc chẩn đoán bệnh β-thalassemia
chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới
(NGS) để phân tích gen HBB ở người nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-
thalassemia”. Đề tài được thực hiện tại khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương với 2 mục tiêu:
1. Tối ưu quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (Next
Generation Sequencing – NGS) để phân tích gen HBB”.
2. Ứng dụng quy trình NGS để phân tích đột biến gen HBB ở một số người
nghi ngờ mang đột biến gây bệnh β-thalassemia.

1
 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cương về β-thalassemia

1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia
Thalassemia là nhóm bệnh tan máu di truyền, xảy ra do đột biến gen quy
định việc sản xuất hemoglobin – thành phần chính trong hồng cầu, đảm nhiệm việc
vận chuyển oxy trong cơ thể. Cấu trúc của một phân tử Hb bình thường bao gồm 2
chuỗi α-globin liên kết với 2 chuỗi β-globin (α2β2) và bốn nhân Hem, phân tử này
có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy. Bệnh thalassemia gây ra do sự mất
cân bằng tổng hợp giữa chuỗi α-globin và chuỗi β-globin. Nguyên nhân là do rối
loạn quá trình tổng hợp một trong hai chuỗi dẫn đến gây thiếu hụt một loại chuỗi và
thừa lượng chuỗi còn lại làm thay đổi tỷ lệ của các phân tử huyết sắc tố dẫn đến tình
trạng bệnh lý. Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc
tố. Những thể vùi này không có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống
màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, thể
vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng cùng với sự gia
tăng diện tích tiếp xúc, dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa, từ đó dẫn đến hồng
cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương, các thể vùi trên gắn
lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khi
trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy xương làm cho
xương bị biến dạng, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể [13], [14].
Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới với ước tính khoảng 7%
dân số mang gen bệnh [31]. Theo thống kê, ở nước ta, ước tính có khoảng 12 triệu
người đang mang gen bệnh (chiếm khoảng 12% dân số Việt Nam), mỗi năm có trên
8.000 trẻ sinh ra bị bệnh, trong đó có hơn 2.000 trẻ mắc bệnh ở mức độ nặng cần
được điều trị cả đời và hơn 20.000 bệnh nhân đang cần được điều trị theo loại gen
nào bị ảnh hưởng mà phân biệt thành bệnh alpha thalassemia (α-thalassemia) và
beta thalassemia (β-thalassemia) [52].

2
 1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia
Bệnh β-thalassemia xảy ra do đột biến gen HBB dẫn đến không tổng hợp
chuỗi globin β (β0-thalassemia, ký hiệu β0) hoặc giảm tổng hợp (β+-thalassemia, ký
hiệu β+) hoặc giảm rất ít (β++-thalassempia ký hiệu β++).
Theo tổ chức y tế thế giới WHO, hiện nay có tới 1,5% dân số thế giới mang
gen bệnh β-thalassemia [20]. Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số
lượng alen bị đột biến, bệnh β-thalassemia được chia thành ba thể: thể nặng, thể
trung bình và thể nhẹ. Đặc điểm của các thể này được mô tả trong bảng 1.
Bảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3], [31].

Kiểu gen Triệu chứng

Chẩn đoán Huyết đồ Đặc điểm Hb
đột biến đặc trưng
Bệnh nặng, thiếu
β+/β+ Hb < 7g/dL
β-thalassemia HbA2 tăng máu, phụ thuộc
β0/β0 MCV 50-60 fL
thể nặng HbF 70-90% truyền máu lâu
β+/β0 MCH 14-20 pg
dài

β+/β++ HbA2 tăng

β-thalassemia β+/β0 Hb 6-10g/dL Bệnh vừa, mức
HbF tăng đến
thể trung β0/β0+ MCV 55-70 fL độ phụ thuộc
yếu tố 100%
bình MCH 15-23 pg truyền máu thay
ảnh
hưởng đổi

Hb nam 9-15 g/dL

β++/ β
β-thalassemia Hb nữ 9-13 g/dL HbA2> 3,2%
β+/ β
thể nhẹ MCV 55-75 fL HbF 0,5-6%
β0 / β Thiếu máu nhẹ
MCH 19 - 25 pg

β-thalassemia thể nặng: bệnh thường xuất hiện trong vòng 2 năm đầu đời
với tình trạng thiếu máu nặng, cần phải truyền hồng cầu thường xuyên. Biểu hiện ở
những người không được điều trị hoặc truyền máu là chậm phát triển, xanh xao,
vàng da, cơ bắp kém, viêm gan, loét chân, biến dạng hộp sọ và mặt [20].

3
 β-thalassemia thể trung gian: người bệnh có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và
thường xuất hiện muộn hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng truyền
máu [20].
β-thalassemia thể nhẹ: người mắc β-thalassemia thể nhẹ thường không có
triệu chứng lâm sàng hoặc đôi khi bị thiếu máu nhẹ. Khi cả hai cha mẹ đều là người
mắc β-thalassemia thể nhẹ, có nguy cơ 25% ở mỗi lần mang thai có con mắc bệnh
β-thalassemia đồng hợp tử [20].
Ngoài ra, còn có các thể β-thalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E
(HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia.
Thể phối hợp β-thalassemia và Hemoglobin E (HbE): HbE là 1 biến thể
của hemoglobin khi gen HBB bị đột biến ở codon thứ 26 (GAG→AAG), làm thay
đổi acid amin thứ 26 là Glutamic thành Lysin. Người có kiểu gen dị hợp tử hoặc
đồng hợp tử HbE mà không phối hợp với β-thalassemia chỉ có biểu hiện thiếu máu
nhẹ, chậm phát triển ở mức vừa phải. Ở thể phối hợp, tùy vào thể β-thalassemia mà
mức độ biểu hiện của bệnh trở nên đa dạng và được mô tả trong bảng 2.
Bảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31].

Triệu chứng
Thể bệnh Kiểu gen Huyết đồ Đặc điềm Hb
đặc trưng
HbE + HbA2:
HbE phối hợp 25-80% Thiếu máu
HbE/β+ Hb thấp
β+-thalassemia HbF 6-50% nhược sắc vừa
HbA 5-60%

HbE tăng đến

Hb <8 g/dL Giống
HbE phối hợp 85%
HbE/β0 MCV < 60fL β-thalassemia
β -thalassemia
0
HbA2 < 5%
MCH < 22pg thể nặng
HbF 15-25%

4
 Thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia: người có kiểu gen đồng
hợp tử hoặc dị hợp tử β-thalassemia khi kết hợp với α-thalassemia làm giảm chuỗi
α-globin dư thừa làm giảm mức độ nghiêm trọng của β-thalassemia từ thể nặng
sang thể trung gian [8].
1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia
a. β-thalassemia trên thế giới
β -thalassemia là loại bệnh di truyền liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân
tộc, phân bố khắp toàn cầu, song mang tính chất địa dư rõ rệt, số người mang gen
bệnh trên thế giới rất lớn [59]
Những trường hợp thalassemia phát hiện đầu tiên năm 1925 là βthalassemia
ở bờ Địa Trung Hải, là người có nguồn gốc Hy Lạp và Italia. Sau đó bệnh đã được
phát hiện ở rất nhiều nước trên thế giới. Gen bệnh β-thalassemia phân bố rất rộng
trên thế giới, từ vùng Địa Trung Hải, qua khu vực Trung Đông, tới Đông Nam Châu
Á và Bắc Phi. Theo Liên đoàn Thalassemia quốc tế (2005) ước tính có 1,5% dân số
thế giới mang gen β-thalassemia, ít nhất có từ 80-90 triệu người mang gen bệnh, và
cứ mỗi năm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen bệnh. Toàn Châu Á có
trên 60 triệu người mang gen β-thalassemia. Riêng khu vực Đông Nam Châu Á
trong đó có Việt Nam, ước tính số người mang gen βthalassemia chiếm tới 50%
người mang gen toàn cầu, khoảng 40 triệu người. Còn ở các nước phát triển, Châu
Âu và Châu Mỹ, ước tính người mang gen βthalasemia chỉ chiếm 10-13% người
mang gen trên thế giới [51][55].
Tần số mang gen β-thalassemia rất cao ở nhiều nước ở bờ Địa Trung Hải,
Châu Âu, như ở Cyprus là 10%, Hy Lạp là 8%, Albania là 8%, Italia là 4,8%. Ở
Châu Mỹ, tỷ lệ mang gen β-thalassemia ở Guyana tới 10% dân số. Ở khu vực Châu
Á tần số mang gen β-thalassemia ở Ấn Độ từ 3-17% dân số, ở Lào là 9,6%, ở Thái
Lan từ 3-9%, ở Indonesia là 4% [56] [57].
Do gen β-thalassemia phân bố rất rộng rãi trên toàn cầu, đồng thời cùng với
việc lưu hành nhiều bệnh hemoglobin khác như HbE, HbS do đó hàng năm sinh ra
một số lớn trẻ bị thể đồng hợp tử β-thalassemia cũng như thể dị hợp tử kép, phối

5
hợp với một hemoglobin bệnh khác như HbE/β-thalassemia, HbS/β-thalassemia.
Đây là những thể bệnh nặng của β-thalassemia, đòi hỏi phải điều trị suốt đời, số
đông phải phụ thuộc vào truyền máu [50] [58].
b. β-thalassemia ở Việt Nam
Bệnh hemoglobin nói chung và thalassemia nói riêng đã được chú ý khá sớm
ở Việt Nam. Những nghiên cứu ban đầu từ thập kỷ 70, 80 và 90 ở thế kỷ XX, đều
hướng về nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng. Tiếp theo những năm gần đây đã
có một số nghiên cứu tiếp về điều trị, về đột biến gen thalassemia. Các nghiên
cứu cho đến nay ở Việt Nam đều thống nhất bệnh hemoglobin khá phổ biến, phổ
biến là α-thalasemia, β-thalassemia và HbE. Bệnh phát hiện thấy ở tất cả các tỉnh
thành trong cả nước, ở nhiều dân tộc khác nhau [52]. Bệnh phổ biến nhiều hơn ở
dân tộc ít người, ở các tỉnh miền núi và cao nguyên, so với người Kinh và vùng
đồng bằng [5]. β -thalassemia phổ biến ở người dân tộc ít người miền Bắc hơn.
Hemoglobin E phổ biến ở miền Trung và miền Nam hơn [53] [54]. Ở Việt Nam,
β0 - thalassemia phổ biến hơn β+ -thalassemia [52]
1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia
1.1.4.1. Vị trí, cấu trúc gen HBB
HBB là gen mã hóa phân tử β-globin, nó nằm trên cụm gen dài 70kb trên
cánh ngắn NST 11 [10]. Cụm gen bao gồm các gen chức năng 5’- ε – Gγ – Aγ – ψβ
– δ – β – 3’ được sắp xếp theo thứ tự biểu hiện trong quá trình phát triển của cơ thể
[24], [36].
Gen HBB dài 1600bp, mã hóa cho 146 acid amin gồm vùng 5’ không dịch
mã, 3 exon xen kẽ là 2 intron và kết thúc là vùng 3’ không dịch mã (hình 1) [7]
[36], [46]. Exon đầu tiên dài 89bp, exon 2 dài 221bp, exon 3 dài 123bp. Intron 1 có
kích thước nhỏ dài khoảng 130bp nằm giữa nucleotide thứ hai và nucleotide thứ ba
của codon 30, intron 2 có kích thước lớn hơn, dài khoảng 850bp nằm giữa codon
104 và 105 [7], [18].

6
 Hình 1: Cấu trúc của gen HBB, vị trí và mức độ nghiêm trọng của các đột biến
gây ra bệnh β-thalassemia [7].
Trình tự bảo thủ quy định sự biểu hiện của gen HBB được tìm thấy ở các
vùng promoter, vị trí nối intron- exon, vùng 5’ và 3’ không dịch mã.
• Promoter của HBB bao gồm 3 trình tự bảo thủ: TATA box (vị trí
−28 đến −31), CCAAT box (vị trí −72 đến −76) và các trình tự CACCC lặp lại (ở vị
trí từ −86 đến −90 và từ −101 đến −105) [7], [23], [46].
• Vùng 5’ không dịch mã (5′‐UTR) là vùng dài 50bp nằm giữa vị trí
CAP – vị trí bắt đầu phiên mã và codon mở đầu (ATG). Có hai trình tự được bảo
thủ nổi bật là CTTCTG và CACC [7], [46].
• Vùng 3’-UTR dài 132bp nằm giữa codon kết thúc (TAA) và đuôi
poly (A) chứa một trình tự mang tín hiệu để gắn đuôi poly A là ATAAA [7], [46].
Một số đột biến tại các trình tự này là nguyên nhân gây ra β-thalassemia.
1.1.4.2. Cơ chế đột biến trên gen HBB gây bệnh β-thalassemia
Cho đến nay, có khoảng hơn 200 đột biến đã tìm thấy trên gen HBB chủ yếu
là đột biến điểm, rất ít đột biến mất đoạn [7], [36]. Các đột biến này xảy ra ở các
trình tự exon, intron, promoter hoặc vùng 3’-5’ không dịch mã. Những đột biến này
gây ảnh hưởng tới khả năng biểu hiện của chuỗi β-globin, do vậy người ta chia các
đột biến này thành 3 nhóm:
 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình phiên mã:

7
 • Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến
thay thế nucleotide tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp 10 - 25%
lượng chuỗi β-globin so với bình thường, gây β+-thalassemia [48]. Ví dụ: -90
(C→T), -88 (C→T), -28 (A→G); -29 (A→G).
• Đột biến vùng 5’ không dịch mã: làm giảm hiệu suất quá
trình dịch mã [48]. Ví dụ: đột biến tại vị trí +33 (C→G) làm giảm tổng hợp mRNA
33% so với bình thường [41].
 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình cải biến mARN
• Đột biến tại vị trí cắt- nối intron – exon: quá trình cắt nối
intron và exon xảy ra sau phiên mã cần các nucleotide GT (vị trí cho nối) đầu 5’,
AG (vị trí nhận nối) ở đầu 3’ của các intron và vùng bảo thủ xung quanh, gây cản
trở việc nối exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0-thalassemia
[48] như IVS1-1 (G→T).
• Đột biến tạo vị trí ghép nối giả tại vùng intron và exon: Dọc
các exon và intron đều chứa những trình tự giống với trình tự bảo thủ ở vùng biên
intron- exon nhưng thường không được sử dụng cho quá trình cắt nối. Các đột biến
này xảy ra tại các vị trí trên tạo ra các trình tự gần giống với trình tự cắt nối bình
thường. Ví dụ: IVS2-654 (C→T), IVS2-705 (T→G) và IVS2-745 (C→G).
• Đột biến tại vị trí poly A và vùng 3’ không dịch mã: vị trí
AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di
chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm
protein. Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như:
AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA.
 Đột biến ảnh hưởng tới quá trình dịch mã mARN
• Đột biến codon mở đầu: là những đột biến liên quan tới
codon ATG mang tín hiệu mở đầu dịch mã.
• Đột biến vô nghĩa: những đột biến thay thế hoặc thêm, mất
một vài nucleotide tạo ra codon mang tín hiệu kết thúc làm kết thúc sớm chuỗi và
tạo sản phẩm β-globin không bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây β0-thalassemia

8
như: codon17 (AAG→TAG), codon 35 (TAC→TAA), codon 39 (CAG→TAG)
[45].
• Đột biến dịch khung: những đột biến thêm hoặc mất một vài
nucleotide làm thay đổi khung đọc mở, làm kết thúc sớm hoặc thay đổi trình tự các
codon 41/42 (–TTCT), codon 71/72 (+A) gây β0-thalassemia [48].
1.1.4.3. Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam
Ở Việt Nam, có 9 đột biến gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia gồm:
-28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon 26 (GAG→AAG), IVS1-1 (G→T),
IVS1-5 (G→C), codon 41/42(-TCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-654
(C→T) được mô tả ở hình 2 [43]. Những đột biến này được chia làm 2 nhóm như
sau:

Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia
thường gặp ở Việt Nam.
 Nhóm đột biến gây β0-thalassemia:
• Đột biến codon 17 (AAG→TAG): đột biến làm thay đổi bộ ba mã
hóa acid amin lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG) gây β0-thalassemia [15],
[48].
• Đột biến codon 41/42 (-TCTT): đột biến gây mất 4 nucleotide (-
TCTT) làm thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 59, gây β0-
thalassemia [43], [48].

9
 • Đột biến codon 95 (+A): thêm 1 nucleotide A dẫn đến sự thay đổi
khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 101 mới gây β0-thalassemia [49].
• Đột biến codon 71/72 (+A): thêm 1 nucleotide A ở giữa codon 71 và
72 làm thay đổi khung đọc tạo thành bộ ba kết thúc ở vị trí 72 gây β0-thalassemia
[48].
• Đột biến IVS1 -1 (G→T): đột biến ở intron 1 tại vị trí 1 gây biến đổi
G thành T, làm bất hoạt hoàn toàn vị trí mối nối nên không tạo được mRNA, gây
β0-thalassemia [47].
 Nhóm đột biến gây β+- thalassemia:
• Đột biến -28 (A→G): đột biến thay thế nucleotide ở vị trí -28 biến
đổi A thành G làm giảm sự biểu hiện của gen HBB, biểu hiện giảm mức mARN từ 3
đến 5 lần so với mức bình thường, hậu quả làm giảm tổng hợp chuỗi β globin gây
β+-thalassemia [43].
• Đột biến IVS1-5 (G→C): đột biến ở intron 1 tại vị trí thứ 5 biến đổi
G thành C, dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được
chuỗi β-globin, gây đột biến β+-thalassemia.
• Đột biến IVS2-564 (C→T): đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi
thành T (AAGGCAATA→AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới, gây đột biến
β+-thalassemia [43].
• Đột biến codon 26 (GAG→AAG): tại vị trí codon thứ 26 thuộc exon
1 xảy ra đột biến GAG→AAG, sự thay thế một nucleotide này gây ra 2 biểu hiện:
- Quá trình cắt intron nối exon xảy ra bình thường, tạo nên chuỗi β-
globin có sự thay đổi ở acid amin thứ 26 là glutamic thành lysin hình thành nên
Hemoglobin E [48].
- Kích hoạt một vị trí cắt- nối mới trên phân tử tiền mRNA làm ngắn
chuỗi β-globin gây nên β+-thalassemia (hình 3) [48].

10
 Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48].
Đột biến tại codon 26 kích hoạt mối nối mới giữa vị trí cho nối GT của codon 25
trên exon 1 với vị trí nhận nối AG của codon 30 thuộc exon 2 làm mất 16 nucleotide trên
phân tử mRNA, làm ngắn chuỗi β–globin gây ra β+-thalassemia.
Đột biến này vừa tạo nên biến thể HbE vừa gây β+-thalassemia. Chính vì vậy
đột biến tại codon 26 gây bệnh HbE là một thể β-thalassemia đặc biệt.
1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia
Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chia
làm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong quá trình sàng lọc. Một là nhóm
phương pháp sàng lọc ban đầu bao gồm những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, chi
phí thấp, thời gian thao tác nhanh, áp dụng với lượng mẫu ít và có thể dễ dàng áp
dụng ở cả các cơ sở y tế. Hai là nhóm phương pháp phân tích và định lượng
hemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản
và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ba là nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử nhằm xác định cụ thể những đột biến gây bệnh. Sơ đồ sàng lọc cụ thể
được mô tả ở hình 4.

11
 Hình 4: Sơ đồ sàng lọc bệnh β-thalassemia [2], [16].
1.1.5.1. Phân tích tế bào máu ngoại vi
Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử
dụng phương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu để để sàng lọc người mang gen
bệnh thalassemia. Hai chỉ số cần quan tâm là thể tích trung bình hồng cầu (MCV)
và lượng hemoglobin trung bình hồng cầu. MCV < 80 fL trong trường hợp thiếu
máu thiếu sắt hoặc bị thalassemia, MCH < 27pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc.
Khi MCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80fL sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc,
đây là biểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia (hình 4) [16]. Tuy nhiên ở một số
nơi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực còn hạn chế và cơ sở vật chất không đầy
đủ như khu vực nông thôn ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các quốc gia Nam Á thì việc
sử dụng xét nghiệm tủa HbE (Dichlorophenol Indophenol)- DCIP để sàng lọc HbE
là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [13].

12
Tuy vậy, DCIP lại có tỉ lệ dương tính giả rất cao, những người dương tính sẽ phải
tiếp tục tầm soát bằng huyết đồ.
1.1.5.2. Điện di huyết sắc tố
Tất cả những mẫu có kết quả xét nghiệm tế bào máu ngoại vi MCV < 80fL,
MCH < 27 pg phải tiếp tục kiểm tra bằng điện di huyết sắc tố. Kết quả điện di huyết
sắc tố cho biết lượng huyết sắc tố bình thường cũng như sự xuất hiện của các huyết
sắc tố bất thường trong máu.
Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể.
Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, được tạo thành từ
2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2). Sau khi sinh, chuỗi γ không được
tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β tạo hemoglobin ở người trưởng thành gồm
HbA1 (α2β2) và HbA2 (α2δ2) [3]. Trong bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không
được tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảm
HbA1, tăng HbF và HbA2. HbA2 ≥ 4.0% là chỉ số thường được dùng để chẩn đoán
β-thalassemia. Trường hợp có HbA2 ≥ 4,0% và các chỉ số hồng cầu MCH, MCV
đều giảm sẽ nghi ngờ mang gen bệnh β-thalassemia [13]. Còn khi HbA2 > 4.0%
nhưng chỉ số hồng cầu bình thường thì có thể gặp trong trường hợp thiếu vitamin
B12/folate, trong bệnh gan hoặc nhiễm HIV. Các trường hợp có HbA2 từ 3.3-3.9%
cần khẳng định thêm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Đối với các trường hợp có
đột biến codon 26 (G→A) gây thể HbE sẽ xuất hiện HbE ≥ 25%. Do đó, HbA1,
HbF, HbA2 và HbE được coi là các tiêu chuẩn sàng lọc trong điện di hemoglobin
đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia (hình 4) [3].

1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia
1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)
1.2.1.1. Nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR
ARMS-PCR là PCR đặc hiệu alen hay PCR khuếch đại alen đặc hiệu, được
sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện đột biến điểm [33], [42], [44].

13
 Kỹ thuật này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’
của mồi bắt cặp với nucleotide trên sợi khuôn. Nếu nucleotide ở đầu 3’ của trình tự
mồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể kéo dài để tổng
hợp sợi mới được. Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3’ phải mang tính đặc
hiệu [33]. Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thường
và mồi đột biến. Mồi bình thường đặc hiệu cho trình tự DNA bình thường, không
khuếch đại được trình tự DNA đột biến và ngược lại (hình 5). Sự có mặt của đột
biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA được khuếch đại với các kích thước đã biết
trước. Trong phản ứng ARMS-PCR còn có một cặp mồi nội chuẩn nhằm khuếch đại
vùng gen đích không có đột biến để tránh trường hợp âm tính giả do các nguyên
nhân như: quá ít hoặc quá nhiều khuôn DNA, chất lượng DNA không tốt, không có
mồi, không có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức
chế phản ứng PCR [33], [39].

Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR

Hai cặp mồi được thiết kế để khuếch đại kiểu đột biến và kiểu bình thường có một mồi chung
Forward (F) và hai mồi Reverse riêng biệt (Rm và Rw). Sự khác nhau của hai mồi này nằm ở vị trí
đánh dấu X. Mồi dành cho đột biến chỉ khuếch đại được DNA có chứa đột biến X và ngược lại.
1.2.1.2. Ưu điểm
− Phù hợp để phát hiện các đột biến điểm.
− Cho phép phát hiện thể thường với thể đột biến đồng hợp đột biến và dị hợp.

14
 − Nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi phải đánh dấu hay hệ thống phát hiện
phức tạp [33].
1.2.1.3. Nhược điểm
− Kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đa hình đã biết. Do đó,
muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kết hợp với các
phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự.
− Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ có
thể phát hiện được một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém. Để giải quyết
vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã được phát triển cho phép phát
hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [33].
1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay)
1.2.2.1. Nguyên lý:
Các bazơ nitơ giữa hai mạch đơn của sợi DNA liên kết với nhau theo nguyên
tắc bổ sung (A liên kết với T và G liên kết với C) thông qua các mối liên kết hydro
để tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Dưới các yếu tố biến tính như: nhiệt độ cao,
kiềm... liên kết hydro có thể bị phá vỡ, phân tử DNA sợi kép có thể tách thành các
sợi đơn. Khi các yếu tố biến tính bị loại bỏ, hai mạch đơn có thể tái liên kết thành
dạng sợi đôi. Hiện tượng các sợi đơn DNA từ các nguồn khác nhau và có trình tự
tương đồng, chúng có thể bắt cặp với nhau được gọi là hiện tượng lai [50].
Kỹ thuật lai điểm ngược thường được dùng để đột biến điểm. Các cặp đầu dò
(probe) là các oligonucleotide đặc hiệu có trình tự bổ sung với trình tự DNA thường
và DNA đột biến được gắn cố định trên màng. DNA khuôn bao gồm DNA thường
và DNA đột biến được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đánh
dấu bằng biotinylate. Sản phẩm PCR được lai với các oligonucleotide trên màng.
Khi bổ sung streptavidin- horseradish peroxidase lên màng, chất này sẽ tạo màu với
biotinylate và dễ dàng nhận thấy bằng mắt thường [32].
Strip assay là bộ kit xây dựng dựa trên hai kỹ thuật Multiplex PCR và lai
DNA ngược (Reverse hybridization), sử dụng thanh test strip có đính nhiều đầu dò
để phát hiện đồng thời nhiều đột biến và xác định tính đồng hợp/ dị hợp tử của đột

15
biến. Các dầu dò đặc hiệu (Alen specific oligonucleotit –ASO probes) cho alen bình
thường và đầu dò cho alen đột biến được gắn cố định trên các dải nitrocenlullose có
màng nilon. Sản phẩm DNA được đánh dấu bằng biotin-16-dUTP trong phản ứng
khuyếch đại (PCR). Các sản phẩm này được lai với các đầu dò đặc hiệu alen đột
biến (mutant) và alen bình thường (wild type). Sau khi rửa, sản phẩm lai đặc hiệu ở
trên các băng vạch của thanh test trip có thể được phát hiện bằng mắt thường [4].
1.2.2.2. Ưu điểm [4], [38]:
− Dễ thực hiện, có thể cùng lúc phát hiện được nhiều đột biến điểm, đột biến
mất đoạn, xác định được các đột biến đồng hợp tử hay dị hợp tử. Thời gian
nhanh chóng (6 - 8 giờ).
− Lượng mẫu cần ít (10 – 50 ng DNA cho 1 phản ứng PCR duy nhất).
− Phương tiện máy móc đơn giản: phân tích kết quả đơn giản từ các băng vạch
trên thanh phản ứng bằng mắt thường hoặc qua máy đọc tự động.
− Độ chính xác cao.
1.2.2.3. Nhược điểm:
Chỉ xác định được những đột biến đã biết được xây dựng trong bộ kit.
1.2.3. Giải trình tự
1.2.3.1. Nguyên lý chung
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của 2 mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại
nucleotide khác nhau: A, T, G, C. Các nucleotide này sắp xếp theo 1 trình tự xác
định. Giải trình tự có nghĩa là xác định trình tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này
trên phân tử DNA.
1.2.3.2. Các phương pháp giải trình tự
a. Phương pháp giải trình tự Sanger
Giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá
sinh học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977 [35]. Phương pháp này
thường được sử dụng để giải trình tự các đoạn DNA ngắn dưới 1kb.
 Giải trình tự Sanger cổ điển

16
 Giải trình tự DNA theo Sanger thực hiện các bước gần giống kỹ thuật PCR
tuy nhiên giải trình tự chỉ sử dụng một mồi đơn thay vì sử dụng một cặp mồi để
khuếch đại trong PCR. Do đó thành phần của phản ứng cũng bao gồm những chất
cần thiết để nhân bản DNA bao gồm:
− Mạch đơn DNA cần giải trình tự.
− Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự
khởi đầu cho polymerase.
− Enzyme DNA polymerase.
− 4 loại deoxynucleotide (dNTP): dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
− 4 loại dideoxynucleotide (ddNTP): ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP được
đánh dấu đồng vị phóng xạ.
Các ddNTP khác với dNTP tương ứng của chúng ở chỗ tại vị trí C- 3’ của
phân tử đường của các ddNTP chỉ có gốc –H thay cho gốc –OH bình thường dẫn
đến không thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide tiếp theo. Do vậy,
nếu ddNTP gắn vào chuỗi polynucleotide thì phản ứng kéo dài chuỗi sẽ không thể
thể diễn ra. Theo nguyên tắc đó, mỗi khi ddNTP được thêm vào chuỗi
polynucleotide đang kéo dài thì phản ứng tổng hợp chuỗi DNA sẽ dừng lại tại đó
tạo ra 1 loạt các mạch mới có độ dài khác nhau [37]. Do khác nhau về kích thước và
khối lượng, các mạch mới này sẽ tách khỏi nhau trên gel điện di. Trình tự
nucleotide được đọc theo chiều từ đáy bảng điện di tương ứng với chiều 5’-3’ trên
mạch DNA được tổng hợp mới và đây là trình tự bổ sung với mạch cần giải trình tự
ban đầu [26], [37], [40].
 Giải trình tự Sanger cải tiến
Dựa trên nền tảng của kỹ thuật Sanger, ngày nay, người ta sử dụng các máy
giải trình tự động để thay thế cho kỹ thuật này. Kỹ thuật Sanger cải tiến sử dụng các
ddNTP có đánh dấu huỳnh quang thay cho việc đánh dấu phóng xạ như trước đây
đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn. Mỗi
loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau cho
phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất. Hệ thống điện di mao

17
quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động. Cấu tạo của máy gồm
16 mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần
điện di. Hệ thống phát hiện gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận
tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong
suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di
sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng
(peak) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng
của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA [37].
• Tiến bộ:
Khắc phục được nhược điểm của phương pháp Sanger cổ điển: có thể dùng 4
màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải
trình tự có thể thực hiện chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện
di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây. Tăng
công suất: tùy thuộc vào từng số lượng mao quản có thể chạy được một lần.
• Hạn chế
Phương pháp này thường được sử dụng để giải trình tự các đoạn DNA có
kích thước dưới 1kb [26]. Với những đoạn gen kích thước trên 1kb (HBB dài 1.6kb)
thì cần tăng số lượng phản ứng khuếch đại gen vì thế làm giảm số lượng mẫu trong
một lần chạy. Không phù hợp với việc phân tích những gen có nhiều đột biến như
HBB.
b. Giải trình tự thế hệ mới (Next- generation sequencing)
Next- generation sequencing là thuật ngữ được sử dụng để mô tả một số
công nghệ giải trình tự hiện đại khác nhau bao gồm: Pyrosequencing - Roche 454;
SOLiD; Solexa của Illumina; Ion torrent: giải trình tự Proton / PGM [9].
Năm 2005, Roche giới thiệu hệ thống giải trình tự hệ genome 454 – là hệ
thống giải trình tự dữ liệu đầu ra lớn theo phương pháp pyrosequencing đầu tiên
trên thế giới. Hệ thống này có thể tạo ra 200.000 đoạn đọc có độ dài khoảng 110 bp.
Thay vì sử dụng các ddNTP để chấm dứt khuếch đại chuỗi, công nghệ này dựa vào

18
việc phát hiện pyrophosphate được giải phóng trong quá trình kết hợp nucleotide
tạo ra một tín hiệu ánh sáng [34].
Năm 2007, Applied Biosystems (ABI) giới thiệu hệ thống giải trình tự
SOLiD dựa trên công nghệ nối các đoạn oligonucleotide. Dựa trên nguyên lý ghép
nối, toàn bộ genome được cắt thành các đoạn DNA ngắn, sau đó từng đoạn được
gắn với các adapter rồi cố định vào các hạt từ. Quá trình giải trình tự được thực hiện
thông qua các oligonucleotide được đánh dấu huỳnh quang. Độ dài đọc của SOLiD
ban đầu là 35 bp lần đọc và dữ liệu đầu ra là 3G sau mỗi lần chạy. SOLiD có thể đạt
độ chính xác cao 99.85% sau khi lọc. Năm 2010, hệ thống đã cải thiện được độ dài
đoạn đọc là 85 bp và độ chính xác là 99.99%, dữ liệu đầu ra vẫn là 30 Gb mỗi lần
chạy [34].
Cũng trong năm 2007, Illumina cho ra mắt hệ thống giải trình tự Solexa. Hệ
thống này đơn giản hóa phương pháp xây dựng thư viện và đảo đầu bằng phương
pháp huỳnh quang dẫn dến việc tạo ra các đoạn đọc có độ dài 35 bp. Công nghệ giải
trình tự bằng tổng hợp SBS sử dụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang để giải
trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow-cell. Trong mỗi chu trình
giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được thêm vào
chuỗi acid nucleic. Tín hiệu huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò như một khóa
dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau khi mỗi dNTP được tích hợp, dye huỳnh
quang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp
nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có
mặt đồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu
việc tổng hợp mất cân đối [34].
Năm 2010, một hệ thống giải trình tự nhanh hơn, chi phí thấp hơn dựa trên
công nghệ bán dẫn Ion Torrent được giới thiệu. Đây là hệ thống duy nhất xác định
trình tự không dựa vào tín hiệu huỳnh quang mà dựa vào việc đo sự thay đổi pH do
việc giải phóng ra ion H+ khi gắn nucleotide bằng công nghệ bán dẫn [9], [34].
Công nghệ giải trình tự thế hệ mới có hiệu suất cao, giảm chi phí đã phát
triển nhanh chóng trong những năm gần đây và trở thành một công cụ phân tích

19
quan trọng cho nhiều nhà di truyền học. Hàng triệu hoặc hàng tỉ phân tử DNA có
thể được giải trình tự đồng thời. Do đó, làm tăng đáng kể hiệu suất của quá trình
giải trình tự và giảm thiểu việc phải tách dòng trình tự đích giống như phương pháp
Sanger trước đó [34].
 Tiến bộ
Tất cả những phương pháp giải trình tự mới đã dẫn tới ba cải tiến đáng kể so
với công nghệ truyền thống:
− Các công nghệ này không yêu cầu tách dòng các đoạn DNA, mà thay vào đó
dựa vào việc chuẩn bị của các thư viện NGS.
− Thay vì hàng trăm phản ứng giải trình tự thì những công nghệ mới này có thể
đồng thời thực hiện được hàng triệu phản ứng giải trình tự.
− Trình tự được xuất ra trực tiếp mà không cần phải điện di. Số lần đọc của
NGS là vô cùng lớn, cho phép quá trình giải trình tự toàn bộ hệ gen trong thời
gian ngắn và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời
sống
 Hạn chế
Hạn chế của các hệ thống giải trình tự thế hệ mới này là độ dài đoạn đọc
tương đối ngắn, dẫn đến những khó khăn trong việc cắt nối các trình tự, lắp ráp, chú
thích và phân tích tin sinh học.
1.3. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq .
1.3.1. Lịch sử phát triển
Vào năm 1998, Solexa, tiền thân của hệ thống giải trình tự của Illumina,
được thành lập bởi Shankar Balasubramanian và David Klenerman. Trải qua nhiều
giai đoạn nghiên cứu và phát triển, năm 2006, hệ thống máy giải trình tự Solexa đầu
tiên, the Genome Analyzer, được ra mắt và có khả năng giải trình tự 1Gb dữ liệu
cho một lần chạy. Đến năm 2007, Illumia tiến hành mua lại Solexa và tiếp tục phát
triển để đạt được những thành quả như ngày nay [34].

20
 1.3.2. Nguyên tắc hoạt động
Hệ thống máy giải trình tự của Illumina sử dụng công nghệ giải trình tự theo
phương pháp tổng hợp (Sequencing by Synthesis, SBS), kết hợp với việc sử dụng
các nucleotide có gắn tín hiệu huỳnh quang và khóa dừng thuận nghịch để đọc và
nhận biết trình tự một cách trực tiếp. Trong mỗi chu trình, tại nucleotide có sự kết
hợp sẽ được phát hiện bằng các bức xạ huỳnh quang. Công nghệ giải trình tự bằng
phương pháp tổng hợp (SBS) sẽ đưa ra kết quả có sự chính xác cao, tăng tỉ lệ đọc
được của các đoạn DNA [34].
1.3.2.1. Quy trình thực hiện
Quy trình giải trình tự thế hệ mới gồm có 4 bước (hình 6) [29]:

Hình 6: Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina

a. Chuẩn bị thư viện (Library Preparation) [28], [29].
 Phản ứng cắt và gắn index
Các đoạn DNA cần giải trình tự sẽ được cắt thành những đoạn DNA nhỏ
(khoảng 200- 600bp), các đoạn này được gắn các trình tự vào đầu 5’ và 3’. Các
trình tự được thêm vào vào gồm phần trình tự để nhận biết các mẫu riêng biệt phần
trình tự để gắn lên flowcell và mang tín hiệu giải trình tự. Sau khi các đoạn DNA

21
được gắn hoàn thiện sẽ được khuếch đại sử dụng phản ứng PCR và tinh sạch sản
phẩm trước khi đưa vào giải trình tự
 Chuẩn hóa thư viện:
Các mẫu được đưa về cùng một nồng độ như nhau bằng phương pháp
Normalization theo kit của hãng Illumina. Sau đó, tất cả các mẫu được trộn chunglại
trong 1 ống nghiệm để biến tính bằng NaOH và đưa vào máy giải trình tự.
b. Tạo Cluster
Thư viện sau khi biến tính thành các mạch đơn và được máy đưa tự động lên
flow cell – nơi có các giếng phủ đầy các mồi bổ sung với P5 và P7, đã cố định đầu
5’ trên mặt giếng. Mỗi đoạn sẽ khuếch đại riêng biệt và tách thành từng nhóm
cluster thông qua việc tạo cầu (hình 6). Cắt và rửa trôi loại bỏ mạch bổ sung và giữ
lại mạch chính để toàn bộ các trình tự trên cluster là 1 chiều sẵn sàng cho việc giải
trình tự chiều thứ nhất.
Sau khi giải trình tự lần thứ nhất (read 1), các đoạn mạch này tiếp tục tạo cầu
với mồi P5, P7 bên bên cạnh để tạo thành mạch mới và thực hiện bước giải trình tự
thứ 2 (read 2) tương tự như read 1.
c. Giải trình tự
 Lần đọc thứ nhất:
- Thả DNA polymerase và mồi Read1 Seq primer vào cùng với 4 loại
nucleotide gắn huỳnh quang mang gốc khóa ở nhóm 3’-OH. Khi nucleotide này
được gắn vào cũng là lúc phản ứng ngừng lại. Tia Laser chiếu vào để kích thích
phát huỳnh quang và một camera ghi lại tín hiệu huỳnh quang đó (hình 6). Gốc
khóa được cắt ra, tín hiệu huỳnh quang cũng bị loại bỏ và rửa trôi cùng các
nucleotide không gắn. Chu trình này được lặp lại đến hết một nửa độ dài trình tự
thứ nhất. Sản phẩm đọc chiểu 1 được rửa đi.
- Tiếp tục bổ sung Index1 primer và các thành phần PCR, cơ chế giải trình tự
tương tự như trên đến khi hết phần Index, sản phầm đọc được rửa đi.
 Lần đọc thứ hai:

22
 - Tạo cụm và giữ lại trình tự bổ sung. Thả DNA polymerase và mồi Read2
Seq primer vào với 4 loại nucleotide gắn huỳnh quang. Quy trình giải trình tự được
tiếp tục tương tự như lần đọc thứ nhất.
d. Phân tích kết quả
 Thông tin kết quả lần chạy:
Sử dụng phần mềm Sequencing Analysis Viewer (hình 7) để biết thông tin
mẻ chạy và chất lượng mẻ chạy. Một số thông số cần quan tâm để có một mẻ chạy
đạt yêu cầu:
- Mật độ cụm: Cluster density nằm trong khoảng 800 – 1200 K/mm2.
- Tỷ lệ cụm đạt chuẩn: Cluster passing filter: ≥ 90%.
- Độ tin cậy: Qscore (Q30) ≥ 90%.
- Tỉ lệ số sợi DNA có hiện tượng 1 nucleotide giải trình tự chậm hơn 1 chu
kì: phasing < 0,25%.
- Tỉ lệ số sợi DNA có hiện tượng 1 nucleotide giải trình tự nhanh hơn 1 chu
kì: pre-phasing < 0,25%.

Hình 7: Thông tin lần chạy trên phần mềm Sequencing Analysis Viewer
 Các phần mềm phân tích kết quả:

23
 - Miseq Reporter cho biết chất lượng của xét nghiệm giải trình tự và phân
tích dữ liệu NGS ở mức cơ bản (hình 8).

Hình 8: Kết quả phân tích đột biến trên Miseq Reporter
- IGV (Integrative Genomics Viewer) là công cụ tin sinh học mạnh mẽ cho phép
khai thác thông tin sâu hơn như loại bỏ các đoạn đọc ngắn, không đảm bảo chất
lượng, loại bỏ các adapter dư thừa, các biến đổi (variant) có độ tin cậy thấp… (hình
9).

Hình 9: Kết quả phân tích đột biến trên phần mềm IGV
1.4. Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam
1.4.1. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR
Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của Svasti cho thấy có 9 đột biến thường gặp,
chiếm khoảng 95% các trường hợp β-thalassemia bao gồm: -28 (A→G), codon 17

24
(AAG→TAG), c odon 26 (GAG→AAG), IVS1-1 (G→T), IVS1-5 (G→C), codon
41/42(-TCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-654 (C→T) [43].
Năm 2008, Nguyễn Khắc Hân Hoan và cs. đã xây dựng kỹ thuật multiplex
ARMS-PCR ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh đột biến gây bệnh β-thalassemia
cho các cặp vợ chồng có con mắc β-thalassemia khám thai tại Bệnh viện Từ Dũ.
Kết quả cho thấy, kỹ thuật ARMS-PCR có chi phí thấp, thời gian chẩn đoán nhanh
và độ chính xác 100% [1].
Năm 2014, Trần Vân Khánh và cs đã áp dụng multiplex ARMS- PCR để xác
định đồng thời 9 đột biến phổ biến trên gen HBB ở bệnh nhân β-thalassemia cho kết
quả 39/52 trường hợp mang đột biến chiếm tỷ lệ 75% [6].
Với ưu điểm thời gian thực hiện nhanh, chi phí thấp, kỹ thuật này đang được
ứng dụng nhiều trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh β-
thalassemia. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đa
hình đã biết. Do đó, muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kết
hợp với các phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự.
1.4.2. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử
Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một
lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu
để phát hiện đột biến β-thalassemia. Cho tới nay, lai điểm ngược là kỹ thuật duy
nhất được các hãng phát triển thành các kit thương mại để chẩn đoán đột biến β-
thalassemia. Bộ kit StripAssay của ViennaLab cho phép phát hiện đồng thời 21 đột
biến α-thalassaemia và 22 đột biến β-thalassaemia. Kit Strip Asay (ViennaLab, Áo)
có bộ kít α-globin Strip Assay cho phép sàng lọc được 21 đột biến α-thalassemia và
bộ kít β-globin Strip Assay cho phép sàng lọc được 22 đột biến β-thalasemia phổ
biến trong khu vực Đông Nam Á. Những bộ kít này đạt tiêu chuẩn chứng nhận IVD
(In Vitro Diagnostics) cho chẩn đoán bệnh, được phép lưu hành tại Châu Âu và đã
được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới như Malaysia, Iran, Iraq, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai
Cập [4], [38].

25
 Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà (2017) sử dụng bộ kít β-globin
Strip assaycủa ViennaLab trong tổng số 63 alen đột biến được xác định gồm có 9
kiểu đột biến gồm codon 26 (33,3%), codon 17 (17,5%), codon 41/42 (15,9%),
IVS1-1 (11,1%), -28 (7,9%), IVS2-654 (6,4%), codon 71/72 (4,8%), codon 95
(1,6%) và codon 8/9 (1,6%) [4].
Tuy nhiên, kit thương mại này vẫn chỉ cho phép xác định được những đột
biến đã biết được xây dựng trong bộ kit.

26
 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Đối tượng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bảy mươi năm mẫu máu của người
nghi ngờ mang đột biến gen HBB cung cấp bởi Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương. Hầu hết các đối tượng nghiên cứu được sàng lọc dựa trên phân tích
công thức máu ngoại vi, phân tích thành phần huyết sắc tố và sử dụng kỹ thuật
Multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở
Việt Nam bao gồm: -28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon26 (GAG→AAG),
IVS-I-1 (G→T), IVS-I-5 (G→C), codon 41/42 (-TCTT), codon 71/72 (+A), codon
95 (+A), IVS-II-654 (C→T). Trong đó mười một mẫu có xuất hiện HbE trong kết
quả điện di huyết sắc tố và sáu mươi tư mẫu âm tính với 9 đột biến gây bệnh β-
thalassemia nói trên.
2.1.2. Hóa chất
- Hóa chất tách chiết và PCR: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega); KAPA
HiFi HotStart ReadyMix; DMSO (Dimethyl sulfoxide);
- Hóa chất điện di: Agarose LE Biotechnology Grade; RedSafeTM Nucleic Acid
Staining Solution; ExactMark 1kb DNA Ladder (250-10,000bp); Zymoclean Gel
DNA recovery kit (Zymo research); TBE Buffer;
- Hóa chất kiểm tra nồng độ DNA: Quibit dsDNA HS assay kit (Life
technologies); Agencourt Apure XP (Beckman coulter);
- Hóa chất giải trình tự trên hệ thống Miseq: MiSeq Reagent Nano Kit v2- 300
Cycles; Nextera XT library prep kit 24 samples (box 1, box 2) (Illumina); Miseq
reagent kit v2-300 cycles PE (box 1, box 2) (Illumina); Nextera XT index kit 24
indices – 96 samples (Illumina); Tween 20; NaOH 1N.
Và các hóa chất cần thiết khác đạt đủ chất lượng sử dụng trong sinh học phân
tử.

28
 2.1.3. Trình tự mồi sử dụng
Bảng 3: Trình tự mồi HBB

Tên mồi Trình tự Kích thước

HBB-F1 CAGTGCCAGAAGAGCCAAG
1817bp
HBB-R1 CTGACCTCCCACATTCCCT

2.1.4. Thiết bị
Máy PCR Gradient 2 chiều (Eppendoft); Máy giải trình tự thế hệ mới Miseq
Illumina; Máy giải trình tự Sanger 3500 Genetic Analyzers (Thermo Fisher
Scientific). Máy ly tâm 5427R (Eppendoft); máy vortex (Dlab); máy spin (Dlab);
máy đo nồng độ DNA/RNA Qubit 3.0 Fluorometer (Invitrogen). Tủ an toàn sinh
học cấp II; bộ micropipet (Eppendoft) và các thiết bị sinh học phân tử đạt chuẩn sử
dụng khác. Các máy móc, thiết bị trên thuộc khoa Di truyền và Sinh học phân tử -
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Chúng tôi thực hiện nghiên cứu theo sơ đồ minh họa ở hình 10 với các bước
như sau: tách DNA từ mẫu máu của đối tượng nghiên cứu; kiểm tra chất lượng và
nồng độ DNA bằng phương pháp đo mật độ quang học; tối ưu hóa phản ứng khuếch
đại gen HBB ở những mẫu đạt tiêu chuẩn sử dụng cặp mồi HBB-F1/R1; kiểm tra
sản phẩm PCR bằng điện di sau đó tinh sạch sản phẩm; tạo thư viện và chạy giải
trình tự NGS; phân tích kết quả NGS; kiểm chứng một vài mẫu bằng phương pháp
giải trình tự Sanger.

29
 Hình 10: Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Quy trình thí nghiệm
2.2.2.1. Tách DNA tổng số
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit
(Omega) chúng tôi thực hiện quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu theo
quy trình: hút vào mỗi ống 250µl máu toàn phần. Thêm 25 µl OB protease Solution
và 250 µl BL Buffer, vortex mạnh 10 giây, ủ 65ºC, lắc 300 rpm trong 10 phút.
Thêm 260 µl EtOH 96%, invert đều 10 giây. Chuyển toàn bộ dịch lên cột, ly tâm
13.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch qua cột. Thêm 500 µl HBC Buffer, ly tâm
13.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch qua cột. Thêm 700 µl HBC Buffer. Ly tâm
13.000 rpm trong 3 phút. Loại bỏ dịch qua cột. Chuyển cột sang ống hứng 2ml mới.
Chuyển cột sang ống 1.5ml mới, thêm 50µl Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng 5
phút, ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút. Dung dịch thu được là DNA có thể sử dụng
cho phản ứng PCR hoặc bảo quản ở -20ºC.

30
 2.2.2.2. Đo nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thu quang phổ ở
bước sóng A260nm (sử dụng máy Nanodrop)
Để kiểm tra chất lượng và xác định nồng độ DNA, trong nghiên cứu
này chúng tôi sử dụng phương pháp đo quang phổ nhằm xác định nồng độ và độ
sạch của DNA (1,8 < A260/A280 < 2). Phương pháp này dựa trên nguyên lý hấp
phụ ánh sáng cực đại của DNA tại bước sóng 260 nm.
2.2.2.3. Thực hiện phản ứng PCR
Những mẫu có nồng độ trên 50 ng/µl và độ tinh sạch nằm trong khoảng từ
1.8-2.0 được coi là đạt yêu cầu. Những mẫu không đạt yêu cầu sẽ tiến hành tách
chiết lại hoặc tinh sạch nếu cần. Những mẫu đạt yêu cầu được tiến hành khuếch đại
gen HBB theo thành phần phản ứng và điều kiện phản ứng như bàng 4 và hình 11.
Bảng 4: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen HBB
Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ
H2 O 5
HBB- F1 0.5 10nM
HBB- R1 0.5 10nM
DMSO 0.5
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 7.5 1x
DNA 1
Tổng thể tích: 15 µl

Hình 11: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB chưa tối ưu
2.2.2.4. Kiểm tra sản phẩm bằng điện di và tinh sạch sản phẩm
a. Kiểm tra sản phẩm sau PCR bằng điện di:

31
 Điện di là phương pháp phổ biến để phân tách các phân tử axit nucleic. Dưới
tác dụng của điện trường một chiều, DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương
nhờ có nhóm phosphat tích điện âm. Các phân tử DNA được phân tách dựa vào
kích thước và cấu hình phân tử trên giá thể gel agarose. Quá trình phân tách DNA
được thực hiện trong đệm TBE 1x (Tris base, Axit boric, EDTA). Các băng DNA
được phát hiện dưới tia tử ngoại sau khi nhuộm với ethidium bromide. Trong
nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel agarose 1% để phát hiện sản phẩm có kích
thước 1817 bp.
b. Tinh sạch sản phầm:
Sản phẩm PCR sau khi đã xuất hiện băng điện di có kích thước 1817 bp sẽ
được tiến hành tinh sạch sản phẩm trước khi chuẩn bị thư viện theo quy trình sau:
Chuẩn bị: làm ấm hạt bead AmPure XP ở nhiệt độ phòng, pha Ethanol 80%
từ Ethanol tuyệt đối. Ly tâm sản phẩm PCR ở 280g trong 1 phút ở 20ºC. Thêm 40µl
nuclease free water vào mỗi ống chứa 10 µl sản phẩm PCR còn lại sau điện di và
trộn đều. Trộn đều AMPure XP, thêm 50 µl AMPure XP vào mỗi ống chứa mẫu,
hút nhả 10 lần để đảm bảo hạt bead được hoàn toàn trộn đều. Ủ ở nhiêt độ phòng 5
phút để DNA bám vào hạt bead. Đặt ống lên giá từ 2 phút để đảm bảo lực từ giữ
chặt hạt bead cùng DNA bám trên đó, hút toàn bộ dịch nổi trên ống, tránh chạm vào
bead. Giữ nguyên ống trên giá từ, thêm 200 µl Ethanol 80% vào các ống, để trong
30 giây, loại bỏ toàn bộ dịch nổi, tránh chạm vào hạt bead. Lặp lại thêm 1 lần nữa.
Giữ nguyên ống trên giá từ, để khô tự nhiên trong 15 phút. Nhấc các ống ra khỏi giá
từ, thêm 50 µl RSB vào từng ống, hút nhả pipet 10 lần, thay đầu côn sau mỗi lần
thao tác. Để ở nhiệt độ phòng 2 phút để đảm bảo DNA được thôi hết ra khỏi hạt
bead. Đặt các ống lên giá từ trong 2 phút, để lực từ hút hết các hạt bead, lúc này
phần dịch nổi là phần có chứa DNA, chuyển 50 µl dịch nổi sang ống mới và bảo
quản ống sản phẩm sau tinh sạch ở -15 đến -25ºC trong 1 tuần.
Tiến hành đo nồng độ sản phẩm sau tinh sạch bằng Quibit để đảm bảo phản
ứng PCR thành công.

32
 2.2.2.5. Chuẩn bị thư viện giải trình tự
Đo và chuẩn hóa nồng độ DNA: chúng tôi thực hiện chuẩn bị thư viện cho
giải trình tự theo bộ kít Nextera® XT DNA Library Prep của hãng Illumina [30] với
các bước như sau:
a. Kiểm tra nồng độ DNA:
Sự phân mảnh DNA bằng bộ kít Nextera® XT DNA Library Prep có yêu cầu
định lượng chính xác DNA hơn so với sự phân mảnh cơ học. Vì vậy, cần sử dụng
phương pháp dựa trên fluorometric để định lượng DNA đầu vào. Tránh các phương
pháp đo lường tổng acid nucleic như NanoDrop hoặc các phương pháp hấp thụ tia
cực tím khác [30].
Nồng độ sản phẩm khuếch đại được tính bằng cách đo nồng độ của mẫu sản
phẩm pha loãng sau đó nhân với hệ số pha loãng. Các sản phẩm sau PCR được pha
loãng tỷ lệ 1:10 trước khi tiên hành đo. Chuẩn bị dung dịch Quibit working solution
theo tỷ lệ 1 µl reagent (dye): 199 µl buffer. Bổ sung 190µl dung dịch Quibit
working solution vào các ống 0.5ml đã chuẩn bị trước đó. Tiếp tục thêm 10 µl chất
chuẩn 1 và 2 vào 2 ống 0,5ml chứa 190 µl dung dịch Quibit working solution. Các
ống còn lại được bổ sung thêm 10 µl mẫu đã pha loãng tương ứng. Trộn đều các
ống và ly tâm nhanh. Chuẩn máy đo Quibit sử dụng 2 ống chất chuẩn vừa chuẩn bị
và đo các mẫu rồi ghi lại nồng độ các mẫu.

b. Cắt DNA thành các đoạn ngắn (Nextera XT sample Prep kit):
Sản phẩm của quá trình tinh sạch được đưa về nồng độ 0,2 ng/µl trước khi
tiến hành bước chuẩn bị thư viện. Chuẩn bị đĩa PCR mới kí hiện VTA (Veriseq
Tagment Amplicon Plate). Thêm 10 µl TD (Tagment DNA buffer) vào mỗi giếng
trên đĩa VTA sau đó bổ sung 5 µl Amplicon Tagment Mix vào các giếng đã chứa
TD. Cuối cùng thêm 5 µl DNA của từng mẫu đã pha loãng đến nồng độ 0,2 ng/µl,
vào mỗi ống. Hút nhả để trộn đều. Đậy nắp các ống và ly tâm 280 g trong 1 phút để
đảm bảo các hóa chất tập trung ở phần đáy ống. Đưa các ống vào máy PCR và chạy
chương trình sau để kích hoạt enzyme: 55ºC trong 5 phút và giữ ở 10ºC.

33
 Ngay sau khi đạt đến 10ºC, lấy đĩa VTA ra khỏi máy PCR đem ly tâm và tiến
hành bước tiếp theo. Thêm 5 µl NT buffer vào từng ống để vô hiệu hóa enzyme,
hút nhả pipet 5 lần để trộn đều. Đậy nắp và ly tâm 280 g trong 1phút. Ủ các ống
ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để đảm bảo cho enzyme bị bất hoạt hoàn toàn.
 Tổng thể tích ống NTA: 25µl.
c. Chuẩn bị PCR (Nextera XT index kit, 24 index)
Rã đông hóa chất NPM (Nextera PCR Master Mix) và các Index ở nhiệt độ
phòng trong khoảng 20 phút, nhẹ nhàng đảo ngược ống 3-5 lần để trộn đều. Do
Index được gắn và 2 đầu các sợi đơn DNA, theo bộ kit 2 index, sắp xếp các ốn
index trên đĩa TruSeq Index Plate Fixture như sau (ghi lại thứ tự các index này): sắp
xếp các index 1 (mồi I7 có nắp màu cam) để theo chiều ngang, sắp xếp các index 2
(mồi I5 có nắp màu trắng) theo thứ tự theo chiều dọc. Lần lượt thêm: 15 µl Master
mix NPM, 5 µl Index 2 (nắp trắng), 5 µl Index 1 (nắp cam) vào từng ống. Đậy nắp
ống và ly tâm 280g trong 1 phút ở 20ºC để đảm bảo tất cả các hóa chất tập trung ở
đáy ống. Tiến hành phản ứng PCR để gắn Index theo chu trình nhiệt sau: 75ºC trong
3 phút, 95ºC trong 30 giây, 12 chu kỳ 95ºC trong 10 giây, 55ºC trong 30 giây, 72ºC
trong 30 giây; 72ºC trong 5 phút và giữ ở 4ºC.
d. Tinh sạch sản phẩm PCR:
Làm ấm hạt bead AmPure XP ở nhiệt độ phòng, pha Ethanol 80% từ Ethanol
tuyệt đối. Vortex đều AMPure XP, thêm 50µl AMPure XP vào mỗi ống chứa sản
phẩm sau PCR, hút nhả 10 lần để đảm bảo hạt bead được hoàn toàn trộn đều. Ủ ở
nhiêt độ phòng 5 phút để DNA bám vào hạt bead. Đặt ống lên giá từ 2 phút để đảm
bảo lực từ giữ chặt hạt bead cùng DNA bám trên đó, hút toàn bộ dịch nổi trên ống,
tránh chạm vào bead. Giữ nguyên ống trên giá từ, thêm 200µl Ethanol 80% vào các
ống, để trong 30 giây, loại bỏ toàn bộ dịch nổi, tránh chạm vào hạt bead. Lặp lại
thêm 1 lần nữa. Giữ nguyên ống trên giá từ, để khô tự nhiên trong 15 phút. Nhấc
các ống ra khỏi giá từ, thêm 50 µl RSB vào từng ống, hút nhả pipet 10 lần, thay đầu
côn sau mỗi lần thao tác. Để ở nhiệt độ phòng 2 phút để đảm bảo DNA được thôi
hết ra khỏi hạt bead. Đặt các ống lên giá từ trong 2 phút, để lực từ hút hết các hạt

34
bead, lúc này phần dịch nổi là phần có chứa DNA, chuyển 50µl dịch nổi sang ống
mới và bảo quản ống sản phẩm sau tinh sạch ở -15 đến -25ºC trong 1 tuần. Tiến
hành đo nồng độ sản phẩm sau tinh sạch bằng Quibit để đảm bảo phản ứng PCR
thành công. Tiến hành đo nồng độ sản phẩm sau tinh sạch bằng Quibit để đảm bảo
phản ứng PCR thành công. Tiến hành đo nồng độ sản phẩm sau tinh sạch bằng
Quibit để đảm bảo phản ứng PCR thành công.
Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch LNB1 (Library Normalization Beads 1) và
LNA1 (Library Normalization Additives 1). Cho 24 mẫu: 1,1ml LNA1 và 200 µl
LNB1 (đảm bảo rằng đã được trộn đều). Chuyển 45 µl dung dịch LNA1/ LNB1 vào
mỗi giếng trên đĩa mới kí hiệu LNP. Thêm 20 µl sản phẩm PCR đã tinh sạch vào
các giếng trên LNP. Đậy nắp đĩa và lắc ở 1800rpm trong 30 phút rồi chuyển đĩa lên
giá từ trong 2 phút sau đó loại bỏ dịch nổi ở các giếng, nhấc plate ra khỏi giá từ và
tiến hành rửa với LNW1 (Library Normalization Wash 1): thêm 45 µl LNW1 vào
mỗi giếng đã chứa mẫu, đậy nắp và lắc ở 1800 rpm trong 5 phút sau đó ly tâm
nhanh ở 280g, đặt đĩa lên giá từ trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi ở các giếng. Lặp lại 2
lần bước này. Thêm 30 µl NaOH 0,1N vào các giếng rồi đóng nắp và lắc ở 1800
rpm trong 5 phút. Sau đó ly tâm nhanh ở 280g rồi ngay lập tức đặt lên giá từ trong 2
phút. Chuyển 25 µl dịch nổi từ các giếng trên đĩa LNP sang đĩa mới đã hút sẵn 25
µl LNS1 (Library Normalization Storage Buffer 1) ở mỗi giếng. Trộn đều và ly tâm
ở 280g trong 1 phút.

2.2.2.6. Chạy giải trình tự

Chuyển 5 µl từng mẫu ở các giếng vào ống eppendorf 1,5ml mới kí hiệu
POOL. Chuyển 15 µl thư viện DNA từ ống POOL sang ống PCR mới. Thêm 85 µl
HT1 vào ống PCR này sau đó trộn đều và ly tâm nhanh. Chuyển ống DNA/ HT1
trên ủ trong máy PCR ở 96ºC trong 3 phút, 4ºC trong 5 phút và giữ ở 4ºC. Thêm
600 µl HT1 vào một ống eppendorf 1,5ml mới và bảo quản trên đâ. Bổ sung 100 µl
thư viện đã ủ và ống chứa 600 µl HT1 đã chuẩn bị. Sau đó chuyển toàn bộ 700 µl
thư viện này vào khay MiSeq reagent cartridge theo vị trí Load Samples trên khay.
Đưa vào thao tác để giải trình tự trên máy MiSeq.

35
 2.2.2.7. Phân tích kết quả
Sử dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng cho NGS là Sequencing
Analysis Viewer, Miseq Reporter và IGV (Integrative Genomics Viewer). Trong
suốt quá trình giải trình tự, phần mềm Real-time Analysis sẽ tạo ra các file dữ liệu
bao gồm các thông số sử dụng cho phần mềm Sequencing Analysis Viewer và
Miseq Reporter. Sequencing Analysis Viewer cho biết chất lượng của xét nghiệm
giải trình tự. Các chỉ số bao gồm: các cluster đạt yêu cầu, chất lượng trình tự
nucleotide đạt độ chính xác 99,99% (Q30), giá trị phasing và pre-phasing của lần
giải trình tự.
Phần mềm Miseq Reporter 2.5.1 được dùng để phân tích dữ liệu giải trình tự.
Quá trình này bao gồm: phân tách dữ liệu của các mẫu trong cùng 1 lần chạy thành
các file dữ liệu riêng sử dụng trình tự Index được gắn vào các mẫu trong quá trình
chuẩn bị thư viện. Chuyển dữ liệu ảnh chụp thành file trình tự có dạng FASTQ file:
file dữ liệu chữ được tạo ra khi loại bỏ các đoạn trình tự Index ở các mẫu và loại bỏ
các trình tự không đạt độ tin cậy và độ chính xác. Các dữ liệu xuất ra đều phải đạt
độ chính xác 99,99%. So sánh và căn chỉnh trình tự tham chiếu (mã GeneBank:
ENSG00000244734) của các mẫu và những biến đổi đơn nucleotide (SNV), các
chèn đoạn, mất đoạn ngắn (indels) sẽ được nhận diện cùng với tần suất xuất hiện
của từng biến đổi. Với những biến đổi gây bệnh đã biết được tra cứu và đối chiếu
trên cơ sở dữ liệu đột biến ở người là: cơ sở dữ liệu đột biến gen HBB của HbVar
(http://globin.cse.psu.edu/). Integrative Genomics Viewer (IGV) là công cụ tin sinh
học mạnh mẽ cho phép khai thác thông tin sâu hơn như loại bỏ các đoạn đọc ngắn,
không đảm bảo chất lượng, loại bỏ các adapter dư thừa, các biến đổi (variant) có độ
tin cậy thấp…
2.2.2.8. Kiểm chứng những mẫu dương tính bằng phương pháp Sanger
Chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên bảy trong tổng số 44 mẫu dương tính trong
phương pháp NGS để tiến hành kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự
Sanger bằng quy trình đã tối ưu tại khoa Di truyền- Sinh học phân tử - Viện Huyết
học- Truyền máu Trung ương.

36
 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS
3.1.1. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR
3.1.1.1. Thiết kế mồi
Trong phương pháp giải trình tự, việc khuếch đại gen đích để giải trình tự là
vô cùng quan trọng. Gen đích sử dụng ở nghiên cứu này là gen HBB có kích thước
1600 bp. Chúng tôi sử dụng phần mềm Blast primer design để thiết kế cặp mồi
khuếch đại gen hemoglobin subunit beta trình tự như bảng 4. Sản phẩm PCR thu
được có chiều dài 1817 bp từ vị trí 5225408 đến 5227224 trên nhiễm sắc thể số 11
(Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p12 Primary Assembly).
Blast cặp mồi trên NCBI để kiểm tra chất lượng (hình 12):

Hình 12: Kết quả blast cặp mồi HBB trên NCBI
3.1.1.2. Tối ưu phản ứng PCR
DNA được tách chiết từ mẫu bệnh máu ngoại vi theo quy trình của kit
E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega). DNA thu được được đo nồng độ và độ
tinh sạch bằng phương pháp đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280nm.
Sau đó dựa vào đặc điểm và kích thước gen cần nhân lên, chúng tôi thực hiện
phản ứng PCR theo thành phần phản ứng như bảng 4 và điều kiện như hình 11.

37
 4.5 kb

1.8 kb

1.5 kb
1.5 kb

Hình 13: Kết quả điện di sản phầm PCR trước tối ưu trên gel agarose 1,5%
Giếng M: marker 1kb (Thermo), giếng 1-9: sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra (Hình 13). Ngoài sản phẩm PCR mong
đợi có kích thước ~1,8 kb, còn có hai sản phẩm PCR đặc hiệu kích thước 4,5 kb và
1,5 kb. Do đó cần tối ưu phản ứng PCR để thu được sản phẩm đặc hiệu hơn.
Để tối ưu hóa PCR, chúng tôi tiến hành PCR ở một số nhiệt độ gắn mồi khác
nhau là 62,1ºC; 62,6ºC; 63,2ºC; 64ºC; 64,8ºC; 65,6ºC; 66,4ºC; 67,1ºC; 67,7ºC và
68ºC cùng với giảm bớt thời gian các bước trong chu trình nhiệt theo hình 15. Điện
di kiểm tra cho thấy phản ứng PCR với nhiệt độ gắn mồi 64.8ºC cho sản phẩm đặc
hiệu nhất (Hình 14).

Hình 14: Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi điện di trên gel agarose 1.5%
Giếng M: marker 1kb (Biolabs),

38
 Để khẳng định lại, chúng tôi tiến hành khuếch đại 9 mẫu theo điều kiện phản
ứng như bảng 4 và chu trình nhiệt như hình 15. Kết quả điện di thu được ở hình 16.

Hình 15: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen HBB sau tối ưu

1.8kb
1.5kb

Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm sau tối ưu trên gel agarose 1,5%.
Giếng M: marker 1kb (Thermo), giếng 1-5: sản phẩm PCR
Sản phẩm sau tối ưu cho một băng sáng rõ và duy nhất có kích thước khoảng
1,8kb. Như vậy nhiệt độ gắn mồi 65ºC cho sản phẩm đặc hiệu. Chúng tôi tiến hành
thực hiện trên 75 mẫu nghiên cứu với chu trình nhiệt mới (Hình 15) có nhiệt độ gắn
mồi là 65ºC. Kết quả điện di trong phụ lục 1 cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại
thành công, 75/75 mẫu đều thu được sản phẩm sáng rõ và duy nhất. Điều này chứng
tỏ chúng tôi đã thực hiện khuếch đại gen HBB thành công, có thể sử dụng cho bước
chuẩn bị thư viện tiếp theo.

39
 3.1.2. Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu
Khi đã có thư viện DNA đạt tiêu chuẩn thì chất lượng giải trình tự gen NGS
được thể hiện qua các chỉ số: độ tin cậy (Q30), mật độ cụm (cluster density); tỷ lệ
cụm đạt chuẩn (cluster passing filter).

Hình 17: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB trước khi tối ưu
Chú thích: Mật độ cụm (Cluster density): 1381 K/mm2; tỷ lệ cụm đạt chuẩn
(cluster passing filter): 35.7%; độ tin cậy (Q30): 68.4%
Khi chuẩn hóa mẫu cho mẻ NGS theo hướng dẫn của nhà sản xuất [30], kết
quả giải trình tự thu được trong hình 17 có độ tin cậy (Q30) 68,4%; mật độ cụm
1381 K/mm2; tỷ lệ cụm đạt chuẩn 35,7%. Tuy nhiên theo khuyến cáo của Illumina,
một mẻ chạy giải trình tự trên Miseq thành công khi: độ tin cậy (Q30) ≥ 90%; mật
độ cụm 800 – 1200 K/mm2; tỷ lệ cụm đạt chuẩn ≥ 90% [27]. Như vậy, kết quả của
lần thử nghiệm đầu tiên không đáp ứng được tiêu chí kỹ thuật. Vì mật độ cụm quá
cao (1381 K/mm2) nên camera huỳnh quang không thu được hình ảnh rõ ràng; cho
nên độ tin cậy cũng như tỷ lệ cụm đạt chuẩn đều thấp. Chúng tôi xác định nguyên
nhân mật độ cụm cao là do nồng độ mẫu đưa vào chưa được chuẩn hóa đạt yêu cầu.
Phương pháp chuẩn hóa mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất sử dụng hạt từ giúp
loại bỏ các enzyme và các thành phần khác của phản ứng PCR, nhưng không loại
bỏ được mồi và DNA khuôn. Vì vậy, lượng DNA thư viện thực tế đưa vào giải trình
tự không được định lượng chính xác do còn mồi và DNA khuôn. Do đó, để tính
toán chính xác lượng DNA thư viện đầu vào, thư viện DNA cần được chuẩn hóa
theo một phương pháp khác. Tham khảo ý kiến của các chuyên gia hãng Illumina,

40
chúng tôi thực hiện chuẩn hóa mẫu theo phương pháp Standard normalization.
Phương pháp này tính toán nồng độ theo số lượng phân tử và kích thước phân tử
(nM) thay vì nồng độ tính theo độ hấp thụ ở bước sóng 260nm (ng/µl).
Quy đổi nồng độ các mẫu từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM theo công thức
sau:

Trong đó: X: Nồng độ (nM); Y: Nồng độ (ng/µl) của mẫu; M: Kích thước
đoạn DNA.
Nồng độ các mẫu được đưa về 4 nM sau đó được trộn chung lại theo tỷ lệ
như nhau và biến tính bằng NaOH 0,2 N trước khi đưa vào giải trình tự.

Hình 18: Kết quả chất lượng giải trình tự NGS gen HBB sau khi tối ưu
Chú thích: Mật độ cụm (Cluster density): 1164 K/mm2; tỷ lệ cụm đạt chuẩn
(cluster passing filter): 91,34%; độ tin cậy (Q30): 90,7%
Kết quả giải trình tự với phương pháp chuẩn hóa mẫu Standard
normalization được thể hiện trong hình 18 cho thấy chỉ số lượng đã đáp ứng các tiêu
chí kỹ thuật với: độ tin cậy (Q30) 90,7%; mật độ cụm 1164 K/mm2; tỷ lệ cụm đạt
chuẩn 91,34%.
Như vậy, bằng việc thiết kế cặp mồi, tối ưu phản ứng PCR khuếch đại gen
HBB và thay đổi phương pháp chuẩn hóa mẫu chúng tôi đã hoàn thiện được quy

41
trình giải trình tự NGS phân tích gen HBB trong những trường hợp nghi ngờ mang
đột biến gây bệnh β- thalassemia.
3.2. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu
3.2.1. Thông tin lần chạy máy MiSeq.
Lần chạy máy MiSeq trong nghiên cứu này được thể hiện trong hình 18 có
mật độ cluster (cluster density) là 1164 K/mm2. Tổng số cluster qua được bộ lọc
(cluster passing filter) là 91,3%. Những giá trị này chỉ ra những cluster chất lượng
cao đã đi qua bộ lọc, cho phép làm giảm những dữ liệu thô không đáng tin cậy.
Những kết quả này cho phép tin tưởng những kết quả thu nhận được [27]. Trong
một cụm cluster, có tỷ lệ phasing và pre- phasing đều nhỏ hơn 0,25%. Độ tin cậy
(Q30) là 90,7%. Thông qua các chỉ số đánh giá chất lượng lần chạy theo khuyến cáo
của hãng, lần chạy máy cung cấp các dữ liệu đáng tin cậy và đảm bảo chất lượng để
thực hiện những phân tích tiếp theo [27].
3.2.2. Kết quả phân tích đột biến gen HBB
Sau khi có dữ liệu giải trình tự đạt tiêu chuẩn, chúng tôi sử dụng phần mềm
Miseq Reporter 2.5.1 và phần mềm Integrative Genomics Viewer (IGV) để phân
tích đưa ra kết quả (Phụ lục 2).
Bảng 5: Kết quả phân tích đột biến gen HBB
Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ %

β/β 31 41,33

β0/β 24 32

β+/β 3 4

βE/β 5 6,67

βE/βE 4 5,33

βE/β0 2 2,67

Tạo biến thể khác hoặc không rõ ràng 6 8

Tổng số 75 100

42
 Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở bảng 5 cho thấy có 31/75 (chiếm
41,33%) số mẫu nghiên cứu không phát hiện đột biến; 44/75 mẫu (chiếm 58,67%)
phát hiện đột biến, Trong đó, 24 mẫu có kiểu gen β0/β chiếm tỷ lệ cao nhất là 32%.
Các kiểu gen β+/β, βE/β, βE/βE và βE/β0 chiếm tỷ lệ lần lượt là 4%; 6,67%; 5,33%; và
2,67%.
Bảng 6: Tỷ lệ các loại đột biến phổ biến ở Việt Nam

Vị trí đột Tỷ lệ/ 64 mẫu

Đột biến phát hiện Kiểu gen Số lượng
biến (%)

-28 (A→G) promoter β+/β 1 1,5

Codon 41/42 (-CTTT) Exon 1 β0/β 1 1,5

IVS-I-1 (G→T) Intron 1 β0/β 1 1,5

Trong số 64 mẫu đã sàng lọc âm tính bằng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR 9
loại đột biến phổ biến ở Việt Nam phát hiện có 3 mẫu mang đột biến nằm trong 9
loại đột biến này. Đó là các mẫu 6, 17, 41 mang kiểu gen dị hợp tử đột biến -28
(A→G), codon 41/42 (-CTTT), IVS1-1 (G→T). Đây là 3 trường hợp âm tính giả
của kỹ thuật multiplex ARMS- PCR. Nguyên nhân gây âm tính giả có thể là do: quá
ít hoặc quá nhiều khuôn DNA, chất lượng DNA không tốt, không có mồi, không có
Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức chế phản ứng
PCR. Đây là ưu thế của giải trình tự trong việc phát hiện đột biến so với kỹ thuật
multiplex PCR đang được sử dụng.

Bảng 7: Tỷ lệ các dạng đột biến HbE

Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ / 11 mẫu (%)

βE/β 5 45,5
βE/βE 4 36,4
βE/β0 2 18,1

43
 Mười một mẫu (chiếm 14,7%) phát hiện đột biến tại codon 26 (G→A) tạo
Hemoglobin E. Trong đó kiểu gen dị hợp tử HbE chiếm 45,5%, đồng hợp tử HbE
chiếm 36,4% và kiểu gen dị hợp tử kép HbE/ β0- thalassemia chiếm 18,1%.
Bảng 8: Tỷ lệ các dạng đột biến ít gặp ở Việt Nam

Vị trí đột Dạng đột

Đột biến phát hiện Số lượng Tỷ lệ (%)
biến biến

Codon 26 (G→T) Exon 1 β0 18 24

Codon 15 (G→A) Exon 1 β0 6 8

Hb Hope Exon 2 Hb Hope 3 4

β0 hoặc
-30 (T→C) Promoter 3 4
không rõ ràng

-29 (A→G) Promoter β+ 1 1,3

IVS-II-848 (C→G) Intron 2 β+ 1 1,3

Ngoài những đột biến phổ biến ở Việt Nam, chúng tôi còn phát hiện thêm 6
đột biến khác chiếm 42,6% tổng số mẫu như đột biến tại các vị trí: codon 26
(G→T) gây β0-thalasemia [19] ; -30 (T→C) gây β+-thalasemia [12]; -29 (A→G) β+-
thalasemia [12]; codon 15 (G→A) [22]; IVSII-848 (C→G) β+- thalasemia [25] và
đột biến tạo Hemoglobin Hope với tỷ lệ lần lượt là 24%; 4%; 1,3%; 8%; 1,3% và
4%. 6 đột biến này là những đột biến ít gặp ở Việt Nam nhưng lại có đóng góp lớn
trong việc giải thích nguyên nhân thiếu máu của một số bệnh nhân mà không tìm ra
đột biến bằng phản ứng multiplex PCR thường sử dụng.
Đặc biệt, trong đó có hai mẫu 27 và 29 phát hiện đột biến trên hai alen của vị
trí codon 26 G→T và G→A (hình 19). 2 mẫu này kết quả HbE lần lượt là 62,8% và
41,8% trên kết quả điện di huyết sắc tố (Phụ lục 2).

44
 (a)

(b)

Hình 19: Kết quả giải trình tự NGS mẫu đột biến codon 26
(a): kết quả phân tích bằng phần mềm Miseq Reporter; (b): kết quả phân tích bằng phần mềm IGV
Theo hình 19a, phần mềm Miseq Reporter cho thấy ở vị trí 1580 trên gen
tham chiếu xuất hiện 2 alen đột biến trên mẫu phân tích với tần suất (Frequency)
mỗi loại xấp xỉ 0,5. Mỗi biến đổi C thành T hay C thành A được đọc 4198 lần trên
4198 đoạn đọc khác nhau. Do các nucleotide được đọc thông qua các tín hiệu huỳnh
quang gắn trên các nucleotide bổ sung vì thế đây chính là đột biến gây biến đổi G
thành A và G thành T. Đối chiếu với database để chỉ ra vị trí trên chromosome 11
và tham khảo dbSNP trên NCIB và trên HBVar để gọi tên đột biến. Kết quả trên
phần mềm IGV (hình 19b) cho thấy vị trí đột biến và tên đột biến giống như trên
phần mềm Miseq Reporter.

45
Hình 20: Kết quả so sánh đột biến tại codon 26(G→T) và codon 26 (G→A) với
cơ sở dữ liệu HbVar.
Trong trình tự phát hiện thấy có 2 đột biến SNP (khoanh đỏ trên hình 19) đều
nằm trên codon 26. Đột biến ở codon 26 (G→A) thuộc exon 1, làm thay đổi acid
amin Glutamate thành Lysin, tham khảo trên HbVar, đây chính là đột biến tạo biến
thể Hemoglobin E (hình 20). Ngoài ra trong mẫu này còn phát hiện thêm 1 đột biến
cũng ở codon 26 (G→T), làm biến đổi GAG (Glutamate) thành TAG (stop codon),
làm dừng dịch mã tại codon 26, tham khảo trên HbVar đây là loại đột biến β0-
thalassemia. Ở thể HbE, với kiểu gen dị hợp tử chỉ gây ra thiếu máu nhẹ, kiểu gen
đồng hợp tử là rối loạn lành tính. Tuy nhiên trong trường khi HbE kết hợp với thể
β0-thalassemia gây hiện tượng thiếu máu nặng ở bệnh nhân [31].
3.2.3. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger
Để đánh giá độ tương đồng giữa kết quả thực hiện giữa hệ thống giải trình tự
thế hệ mới và phương pháp điện di mao quản truyền thống, chúng tôi cũng đã chọn
bảy mẫu DNA để thực hiện đồng thời giải trình tự Sanger trên máy điện di mao
quản ABI-3500 của hãng Applied Biosystem. Bảy mẫu chúng tôi thực hiện đều thu
được kết quả hoàn toàn có sự tương đồng trong kết quả thu được (Bảng 9 và Hình
21).

46
 Bảng 9: Kết quả giải trình tự NGS và Sanger

Tên mẫu KQ giải trình tự NGS KQ giải trình tự Sanger

6 -28 (A→G) -28 (A→G)

15 -29 (A→G) -29 (A→G)

19 -30 (T→C) -30 (T→C)

31 Codon 26 (G→T); Codon 26 (G→T)

41 IVS-I-1 (G→T) IVS-I-1 (G→T)

60 IVS-II-848 (C→G) IVS-II-848 (C→G)

64 Codon 15 (G→A) Codon 15 (G→A)

Hình 21: Kết quả kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger
(a): đột biến codon 26(G→T); (b): đột biến -30 (T→C)

47
 Trong phương pháp giải trình tự Sanger, việc gọi tên các nucleotide dựa vào
cường độ đỉnh sáng (peak) phát ra khi điện di, sau đó máy sẽ so dòng của các đỉnh
tương ứng với nhau và phân tích thành trình tự của đoạn DNA. Còn trong phương
pháp NGS, mỗi chu kì các nucleotide được đọc thông qua các tín hiệu huỳnh quang
gắn trên các nucleotide bổ sung. Sự khác biệt quan trọng là thay vì giải trình tự từng
đoạn DNA đơn lẻ, có trình tự ngắn thì NGS nâng cấp lên thành thực hiện trên hàng
triệu đoạn đọc trong cùng một thời điểm với độ chính xác cao, dữ liệu đầu ra lớn và
khả năng đọc các nucleotide đạt Qscore 30 (tức là trong 1000 nucleotide thì khả
năng gọi tên sai là 1 nucleotide). Thông qua hệ thống phần mềm phân tích, những
sai khác này sẽ được chỉ rõ với tần suất xuất hiện tương ứng để người phân tích có
thể phát hiện được. Bên cạnh đó, khi giải trình tự nhiều mẫu bằng Sanger việc phân
tích kết quả giải trình tự là thủ công và tốn rất nhiều thời gian. Với NGS, dữ liệu
đưa ra được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng của hãng cho phép phân tích
đồng thời hàng trăm mẫu với các thông số như: vị trí biến đổi, tên biến đổi, tần
suất… từ đó rút ngắn thời gian phân tích và cho kết quả đáng tin cậy.
3.2.4. Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu
3.2.4.1. Giá trị của chỉ số MCH và MCV

Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi dựa vào hai chỉ số là MCV <
80 fl cho biết hồng cầu nhỏ và MCH < 27 pg cho biết hồng cầu nhược sắc. Trong
nghiên cứu của chúng tôi sử dụng 69/75 mẫu có chỉ số MCV < 80 fl, trong đó có 43
trường hợp phát hiện đột biến (chiếm 58.6%). Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nhóm đối
tượng có MCH <27 pg là 58.6%, tỷ lệ này thấp hơn ở nhóm đối tượng có cả MCH <
27 pg và MCV < 80 fl và nhóm đối tượng có MCV< 80 fl. Tỷ lệ phát hiện đột biến
ở nhóm đối tượng có MCV > 80fl, MCH > 27 pg lần lượt là 16.7% và 25% (Bảng
10). Điều này phù hợp với sơ đồ sàng lọc trong bệnh β-thalassemia [15].

48
 Bảng 10: Tỷ lệ phát hiện đột biến của MCH và MCV

Số mẫu phát hiện % phát hiện

Đặc điểm Số mẫu
đột biến đột biến

MCV < 80fl 69 42 60,8

MCH < 27pg 71 43 58,6

MCH < 27pg và MCV < 80fl 69 42 60,8

MCV > 80fl 6 1 16,7

MCH > 27pg 4 1 25

3.2.4.2. Giá trị của các thành phần Hb

Trong xét nghiệm điện di huyết sắc tố, nếu tỷ kệ HbA2 > 4% hoặc HbF > 2%
thì được chẩn đoán là β-thalassemia.
Trong nghiên cứu của chúng tôi có 35/75 mẫu có HbA2 > 4% trong đó có
30/37 mẫu phát hiện đột biến chiếm 85.7%, 39/75 mẫu có HbF > 1% trong đó có
18/39 mẫu phát hiện đột biến chiếm 46.1%. 11 mẫu có xuất hiện HbE trong kết quả
điện di huyết sắc tố đều phát hiện đột biến (Bảng 11).
Bảng 11: Tỷ lệ phát hiện đột biến ở các chỉ số Hb

Số mẫu phát hiện % phát hiện

Đặc điểm Số mẫu
đột biến đột biến
HbA2 > 4% 35 30 85,7

HbF > 1% 39 18 46,1

Có xuất hiện HbE 11 11 100

49
 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu này chúng tôi có một
số kết luận như sau:
1. Đã tối ưu thành công quy trình “ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ
mới (NGS) để phân tích gen HBB”.
2. Sử dụng quy trình đã tối ưu, chúng tôi đã phân tích 75 mẫu nghi ngờ mang
đột biến gây bệnh β-thalassemia phát hiện 44 mẫu (chiếm 58,6%) mang 10 loại đột
biến trong đó 4 loại đột biến phổ biến và 6 loại đột biến ít gặp ở Việt Nam. Phát
hiện tỷ lệ âm tính giả của kỹ thuật multiplex PCR 9 loại đột biến phổ biến ở Việt
Nam là 4,68%.

KIẾN NGHỊ
Với những kết quả thu được về việc tối ưu phương pháp giải trình tự NGS để
phân tích gen HBB và áp dụng thành công trên 75 mẫu bệnh phẩm. Chúng tôi đề
xuất một số hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:
1. Ứng dụng quy trình đã tối ưu để phân tích gen HBB của người nghi ngờ
mắc β-thalassemia ở Viện Huyết học - Truyền máu trung ương hoặc cơ sở y tế khác
có nhiều người nghi ngờ mắc bệnh, hỗ trợ cho chẩn đoán và điều trị β-thalassemia.
2. Ứng dụng quy trình đã thiết lập để phân tích gen HBB của người nghi ngờ
mắc beta thalassemia để phát hiện các loại đột biến và tỉ lệ các đột biến ở người
Việt Nam.

50
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Khắc Hân Hoan, Quách Thị Hoàng Oanh, Phạm Việt Thanh &
Trương Đình Kiệt, (2008),"Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh beta thalassemia tại
Bệnh viện Từ Dũ", Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tập 12 (phụ bản số 1) pp. tr.341-
347.
2. Lê Thị Thu Hà, (2017), Phát hiện các đột biến trên gen Beta globin bằng kỹ
thuật ARMS-PCR và lai điểm ngược (Reverse dot blot) Đại học Khoa học tự nhiên,
Đại học quốc gia Hà Nội, Luận văn thạc sĩ.
3. Nguyễn Khắc Hân Hoan, (2013), Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước
sinh bệnh alpha và bêta thalassemia, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh,
Luận án Tiến sĩ y học.
4. Nguyễn Thị Thu Hà, (2017), Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và
theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học - Truyền máu
Trung Ương giai đoạn 2013 - 2016, Đại học Y Hà Nội, Luận án Tiến sĩ Y học.
5. Trần Thị Thuý Minh, (2015), Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh alpha và beta
thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk, Đại học Y dược Thành
phố Hồ Chí Minh, Luận án Tiến sĩ Y học.
6. Trần Vân Khánh, Phạm Thanh Loan, Hồ Cẩm Tú, Trần Thị Oanh, Nguyễn
Đức Hinh, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn, (2014),"Phát hiện đột biến gen gây
bệnh beta thalassemia bằng kỹ thuật multiplex ARMS-PCR", Tạp chí Nghiên cứu Y
học, 90 (5) pp.17-25.
Tiếng Anh
7. Birgens Henrik and Ljung Rolf, (2007),"The thalassaemia syndromes",
Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation, 67 (1), pp.11-26.
8. BORGNA‐PIGNATTI Caterina, Cappellini M.D., De Stefano P., Del
Vecchio G.C., Forni G.L., Gamberini M.R., Ghilardi R., Origa R., Piga A. and
Romeo M.A., (2005),"Survival and complications in thalassemia", Annals of the
New York Academy of Sciences, 1054 (1), pp.40-47.
9. Buermans HPJ and Den Dunnen JT, (2014),"Next generation sequencing
technology: advances and applications", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-
Molecular Basis of Disease, 1842 (10), pp.1932-1941.
10. Bulger Michael, Bender MA, Van Doorninck J Hikke, Wertman Brett,
Farrell Catherine M, Felsenfeld Gary, Groudine Mark and Hardison Ross,
(2000),"Comparative structural and functional analysis of the olfactory receptor
genes flanking the human and mouse β-globin gene clusters", Proceedings of the
National Academy of Sciences, 97 (26), pp.14560-14565.
11. Cai Liuhong, Bai Hao, Mahairaki Vasiliki, Gao Yongxing, He Chaoxia, Wen
Yanfei, Jin You‐Chuan, Wang You, Pan Rachel L and Qasba Armaan, (2018),"A
universal approach to correct various HBB gene mutations in human stem cells for
gene therapy of beta‐thalassemia and sickle cell disease", Stem cells translational
medicine, 7 (1), pp.87-97.

51
 12. Cai SP, Zhang JZ, Doherty M and Kan YW, (1989),"A new TAT3A box
mutation detected at prenatal diagnosis for beta-thalassemia", American journal of
human genetics, 45 (1), pp.112.
13. Capellini M., Cohen A., Eleftheriou A., Piga A., Porter J. and Taher A.,
(2008),"Guidelines for the clinical management of thalassemia", Thalassaemia
International Federation (TIF) April 2000,
14. Cappellini Maria-Domenica, Cohen A., Porter J., Taher A. and Viprakasit V.,
(2014), Guidelines for the management of transfusion dependent thalassaemia
(TDT), Thalassaemia International Federation Nicosia, Cyprus,
15. Chang Judy C and Kan Yuet Wai, (1979),"beta 0 thalassemia, a nonsense
mutation in man", Proceedings of the National Academy of Sciences, 76 (6),
pp.2886-2889.
16. Colah Roshan, Gorakshakar Ajit and Nadkarni Anita, (2010),"Global burden,
distribution and prevention of β-thalassemias and hemoglobin E disorders", Expert
review of hematology, 3 (1), pp.103-117.
17. Edison Eunice S, Venkatesan Rajkumar S, Govindanattar Sankari Devi,
George Biju and Shaji Ramachandran V, (2012),"A novel 26 bp deletion [HBB: c.
20_45del26bp] in exon 1 of the β-globin gene causing β-thalassemia major",
Hemoglobin, 36 (1), pp.98-102.
18. Efstratiadis Argiris, Posakony James W, Maniatis Tom, Lawn Richard M,
O'Connell Catherine, Spritz Richard A, Deriel Jon K, Forget Bernard G, Weissman
Sherman M and Slightom Jerry L, (1980),"The structure and evolution of the human
β-globin gene family", Cell, 21 (3), pp.653-668.
19. Fucharoen Goonnapa, Fucharoen Supan, Jetsrisuparb Arunee and Fukumaki
Yasuyuki, (1990),"Molecular basis of HbE-β-thalassemia and the origin of HbE in
northeast Thailand: Identification of one novel mutation using amplified DNA from
buffy coat specimens", Biochemical and biophysical research communications, 170
(2), pp.698-704.
20. Galanello Renzo and Origa Raffaella, (2010),"Beta-thalassemia", Orphanet
journal of rare diseases, 5 (1), pp.11.
21. Goodwin Sara, McPherson John D and McCombie W Richard,
(2016),"Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies",
Nature Reviews Genetics, 17 (6), pp.333.
22. Gray GR, Manson HE, Gu L‐H, Ye. Leonova J and Huisman THJ,
(1995),"Hb lulu island (α2β2107 [G9] Gly→ Asp)‐β°‐thalassemia (codon 15;
TGG→ TAG), a form of thalassemia intermedia", American journal of hematology,
50 (1), pp.26-29.
23. Grosso M., Sessa R., Puzone S., Storino M. R. and Izzo P.,
(2012),"Molecular basis of Thalassemia", Anemia,
24. Grosveld Frank, van Assendelft Greet Blom, Greaves David R and Kollias
George, (1987),"Position-independent, high-level expression of the human β-globin
gene in transgenic mice", Cell, 51 (6), pp.975-985.

52
 25. Hattori Y, Yamamoto Ku, Yamashiro Y, Ohba Y, Miyamura S, Yamamoto
Ki, Matsuno Y, Morishita M, Miyaji T and Era T, (1992),"Three β-Thalassemia
Mutations in the Japanese: IVS-II-1 (G→ A). IVS-II-848 (C→ G), and Cooon 90
(GAG→ TAG)", Hemoglobin, 16 (1-2), pp.93-97.
26. Heather James M and Chain Benjamin, (2016),"The sequence of sequencers:
the history of sequencing DNA", Genomics, 107 (1), pp.1-8.
27. Illumina, (2014),"MiSeq® System User Guide",
28. illumina, (2012),"Nextera®XT DNA Sample Preparation Guide",
29. Illumina, An introduction to Next-Generation Sequencing Technology",
30. Illumina, (2016),"Nextera®XT DNA Library Prep Reference Guide", V01
31. Kohne Elisabeth, (2011),"Hemoglobinopathies: clinical manifestations,
diagnosis, and treatment", Deutsches Ärzteblatt International, 108 (31-32), pp.532.
32. Li Dongzhi, Liao Can, Li Jian, Huang Yining, Xie Xingmei, Wei Jiaxue and
Wu Shaoqing, (2006),"Prenatal diagnosis of β-thalassemia by reverse dot-blot
hybridization in southern China", Hemoglobin, 30 (3), pp.365-370.
33. Little Stephen, (1995),"Amplification‐refractory mutation system (ARMS)
analysis of point mutations", Current protocols in human genetics, 7 (1), pp.9.8. 1-
9.8. 12.
34. Liu Lin, Li Yinhu, Li Siliang, Hu Ni, He Yimin, Pong Ray, Lin Danni, Lu
Lihua and Law Maggie, (2012),"Comparison of next-generation sequencing
systems", BioMed Research International, 2012
35. Maxam Allan M and Gilbert Walter, (1977),"A new method for sequencing
DNA", Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 (2), pp.560-564.
36. Olivieri Nancy F, (1999),"The β-thalassemias", New England journal of
medicine, 341 (2), pp.99-109.
37. Passarge Eberhard, (1995), Color atlas of genetics, Georg Thieme Verlag,
38. PK Menon, Nimmakayalu M, Bylappa SK, Kumar M and Abdalhaleem HM,
A comparison of in-house Hemoglobin DNA Mutation analysis for β thalassemia
by ARMS PCR with a Commercial Line Probe Assay", President’s Message, pp.79.
39. Punia P and Saunders NA, (2009),"The Quantitative amplification refractory
mutation system", Real-time PCR: current technology and applications. Norfolk
(VA): Horizon Scientific Press, Inc,
40. Sanger Frederick, Nicklen Steven and Coulson Alan R, (1977),"DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors", Proceedings of the national academy
of sciences, 74 (12), pp.5463-5467.
41. Sgourou Argyro, Routledge Samantha, Antoniou Michael, Papachatzopoulou
Adamantia, Psiouri Lambrini and Athanassiadou Aglaia, (2004),"Thalassaemia
mutations within the 5′ UTR of the human β‐globin gene disrupt transcription",
British journal of haematology, 124 (6), pp.828-835.
42. Steensma David P, (2006),"JAK2 V617F in myeloid disorders: molecular
diagnostic techniques and their clinical utility: a paper from the 2005 William
Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology", The Journal of
Molecular Diagnostics, 8 (4), pp.397-411.

53
 43. Svasti ML Saovaros, Hieu Tran Minh, Munkongdee Thongperm,
Winichagoon Pranee, Van Be Tran, Van Binh Tran and Fucharoen Suthat,
(2002),"Molecular analysis of β‐thalassemia in South Vietnam", American journal
of hematology, 71 (2), pp.85-88.
44. Teimourian Shahram, Khatibi Talayeh, Pourfarzad Farzin, Jalil-Nejad Sayeh
and Azad Maryam, (2001),"Amplification Refractory Mutation System (ARMS)
and reverse hybridization in the detection of beta-thalassemia mutations", Archives
of Iranian Medicine, 4 (4), pp.165.
45. Thein Swee Lay, (2013),"The molecular basis of β-thalassemia", Cold Spring
Harbor perspectives in medicine, 3 (5), pp.a011700.
46. Thein Swee Lay, (2004),"Genetic insights into the clinical diversity of β
thalassaemia", British journal of haematology, 124 (3), pp.264-274.
47. Treisman Richard, Orkin Stuart H and Maniatis Tom, (1983),"Specific
transcription and RNA splicing defects in five cloned β-thalassaemia genes",
Nature, 302 (5909), pp.591.
48. Winichagoon Pranee, Fucharoen Suthat, Wilairat Prapon, Chihara Kazuo,
Fukumaki Yasuyuki and Wasi Prawase, (1992),"Identification of five rare
mutations including a novel frameshift mutation causing β0-thalassemia in Thai
patients with β0-thalassemia/hemoglobin E disease", Biochimica et Biophysica Acta
(BBA)-Molecular Basis of Disease, 1139 (4), pp.280-286.
49. Wolcott Mark J, (1992),"Advances in nucleic acid-based detection methods",
Clinical microbiology reviews, 5 (4), pp.370-386.
50. Nguyễn Công Khanh (2008). Thalassemia-Huyết học lâm sàng Nhi khoa.
Xuất bản lần 2. Nhà xuất bản Y học: 132-146.
51. Galanello R, Eleftheriou A, Old. J.,Petrou M, Angastinictis M. (2005).
Prevention of Thalassemia and other Hemoglobin Disorders. Thalassemia
International Federation Publications. V 1: 10.
52. Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Lý Tuyết Minh và cs (1987). Sự lưu
hành bệnh huyết sắc tố ở một số người dân tộc miền bắc. Y học Việt Nam, 4: 9-15.
53. Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực (1993). Β-thalassemia và hemoglobin
E tại Viện Bảo vệ Sức khỏa Trẻ em: Y học Việt Nam 174 (8): 23-30.
54. Nguyễn Công Khanh (2008). Hemoglobin bình thường và phân loại bệnh
hemoglobin. Huyết học lâm sàng Nhi khoa, XB lần 2, NXB Y học: 124-132.
55. Weatherall DJ, Clegg JB (2001). The Thalassemia syndromes. Oxford
Blackwell Science: 191.
56. Brown JM, Thein SL, Mar KM, Weatherall DJ (1989). The spectrum of β-
thalassemia in Burma. Hemoglobin Switching: 161-169.
57. Laig M, Sanguasermesri T, Wiangnon S (1989). The spectrum of
βthalassemia mutation in Northern Thailand. Human Genetics 84:47-50.
58. Kenvin TM, Arthur WN (1993). The Thalassemia. In : Nathan DG., Oski FA
(eds). Hematology of Infancy and Childhood, 4th ed. Saunders Company : 785-805
59. Modell B (2008). Global epidemiology of haemoglobin disorders and
derived service indicators. Public health reviews. Bulletin of WHO: 480-487.

54
 PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB

Ghi chú: Kết quả điện di 75 mẫu nghiên cứu khuếch đại gen HBB bằng quy trình
PCR đã tối ưu; 1-75: kí hiệu mẫu; M: marker 1kb (ThermoFisher)
 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

TỔNG PHÂN TÍCH

ĐIỆN DI HUYẾT SẮC TỐ GIẢI TRÌNH TỰ NGS
TẾ BÀO MÁU
STT
HbA1 HbA2 HbE HbF
MCV (fL) MCH (pg) Tên đột biến Kiểu gen
(%) (%) (%) (%)
1 72.2 23.2 80.7 4.7 14.60 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
2 72.0 23.0 71.3 4.1 24.60 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
3 68.7 20.6 90.1 2.7 7.10 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
4 92.2 27.8 97.8 2.2 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
5 82.2 27.5 96.4 3.6 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
6 73.0 22.8 92.8 4.8 2.40 -28 (A->G) Dị hợp tử
7 79.9 26.0 95.7 4.3 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
8 76.4 23.2 95.4 4.6 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
9 62.3 18.2 62.5 2.6 34.90 Hb Hope Dị hợp tử
10 66.8 20.3 2.7 3.2 94.10 Hb Hope Đồng hợp tử
11 78.9 25.0 81.3 2.0 16.70 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
12 86.4 27.2 56.3 2.8 40.90 Hb Hope Dị hợp tử
13 72.6 22.8 39.8 18.2 42.00 Hb E Dị hợp tử
14 82.4 25.4 72.6 3.1 24.30 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
15 77.7 24.1 91.5 4.9 3.60 -29 (A→G) Dị hợp tử
16 73.0 24.8 76.6 3.3 20.10 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
 Codons 41/42 (-TTCT);
17 64.4 19.2 94.9 5.1 Dị hợp tử
TTCTTT(Phe-Phe)
18 73.8 23.3 78.2 3.0 18.80 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
19 73.1 23.6 96.0 4.0 -30 (T→C) Dị hợp tử
20 78.4 24.8 95.7 4.3 -30 (T→C) Dị hợp tử
21 82.3 26.2 95.7 4.3 -30 (T→C) Dị hợp tử
Codon 26 (G->T); GAG(Glu)-
22 65.0 19.3 95.0 5.0 Dị hợp tử
>TAG(stop codon)
23 55.1 13.2 11.8 0.8 65.0 22.40 Hb E Dị hợp tử
Codon 26 (G→T);
24 58.5 16.2 95.1 4.9 Dị hợp tử
GAG(Glu→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T); GAG(Glu)
25 62.5 17.4 95.5 4.5 Dị hợp tử
→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
26 69.1 18.9 90.6 5.2 4.20 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
HbE Dị hợp tử
27 55.1 12.4 12.0 62.8 25.20 Codon 26 (G→T);
Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
28 58.7 16.2 94.4 5.6 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
 HbE Dị hợp tử
62.3 16.8 5.9 0.7 41.8 51.60 Codon 26 (G→T);
29 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
30 64.1 17.8 95.6 4.4 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
31 60.4 17.8 95.8 4.2 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
32 75.7 22.8 68.9 1.7 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
33 78.2 24.6 59.6 3.3 26.5 Hb E Dị hợp tử
Codon 26 (G→T);
34 66.7 19.5 95.7 4.3 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
35 69.5 20.5 95.5 4.5 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
36 59.0 17.9 95.1 4.9 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
37 59.7 17.2 97.6 2.4 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
Codon 26 (G→T);
38 61.7 18.5 94.4 5.6 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
39 59.4 17.2 95.1 4.9 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
40 70.0 20.7 95.2 4.8 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
IVS-I-1 (G→T);
41 71.6 21.9 92.3 4.5 3.20 Dị hợp tử
AG^GTTGGT→AGTTTGGT
Codon 26 (G→T);
42 63.2 19.4 94.9 5.1 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
43 81.4 27.1 97.4 2.6 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
Codon 26 (G→T);
44 66.0 19.6 95.0 5.0 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
Codon 26 (G→T);
45 73.3 21.4 95.1 4.9 Dị hợp tử
GAG(Glu)→TAG(stop codon)
46 70.2 16.3 79.9 11.6 2.50 Hb E Dị hợp tử
47 68.6 16.9 71.0 10.7 7.90 Hb E Dị hợp tử
48 77.1 24.8 75.7 1.8 22.50 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
49 71.7 22.3 82.5 2.2 15.30 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
50 71.0 23.3 85.6 1.9 12.50 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
51 76.4 23.6 82.7 2.3 15.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
52 65.2 21.6 6.7 45.7 47.60 Hb E Đồng hợp tử
53 73.5 23.0 84.1 1.9 14.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
54 70.0 21.1 87.5 2.1 10.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
55 71.6 22.3 87.1 2.5 10.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
56 70.4 21.4 83.5 2.1 14.40 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
57 64.8 20.5 6.2 47.2 46.60 Hb E Đồng hợp tử
58 71.3 22.2 81.8 2.4 15.80 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
59 69.8 22.6 6.8 52.2 41.00 Hb E Đồng hợp tử
60 58.1 17.2 95.6 4.4 IVS-II-848 (C→G); beta+ Dị hợp tử
61 67.9 18.5 95.0 5.0 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
62 78.0 23.6 78.4 3.6 18.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
63 71.6 21.8 84.5 1.8 13.70 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)
64 64.3 19.7 95.1 4.9 Dị hợp tử
→TAG(stop codon)
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)
65 69.0 19.4 95.6 4.4 Dị hợp tử
→TAG(stop codon) beta0
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)
66 66.7 19.0 91.9 5.5 2.60 Dị hợp tử
→TAG(stop codon) beta0
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)-
67 63.3 17.8 95.1 4.9 Dị hợp tử
>TAG(stop codon) beta0
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)
68 65.1 19.7 95.5 4.5 Dị hợp tử
→TAG(stop codon) beta0
69 75.7 23.7 79.2 1.7 19.10 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
Codon 15 (G→A); TGG(Trp)
70 56.3 17.1 95.2 4.8 Dị hợp tử
→TAG(stop codon) beta0
71 77.6 25.0 5.7 42.7 51.60 Hb E Đồng hợp tử
72 74.2 23.2 78.2 1.8 20.00 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
73 75.2 24.6 86.1 2.1 11.80 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
74 79.8 24.7 75.2 1.1 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN
75 72.9 22.8 79.0 0.9 KHÔNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN