ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH
CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Khoa: CNSH - CNTP
Khóa học: 2016 - 2020

Thái Nguyên, năm 2020

 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH
CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Lớp: K48 - CNTP
Khoa: CNSH - CNTP
Khóa học: 2016 - 2020
Người hướng dẫn: TS. Lương Hùng Tiến

Thái Nguyên, năm 2020

 i

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu
từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu” là nội dung em
chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chương trình
đai học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông lâm Thái
Nguyên.
Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, đầu tiên em xin chân thành gửi
lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại học Nông
lâm Thái Nguyên, cùng với quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực
phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt bốn năm học
tập và rèn luyện tại trường.
Sáu tháng thực tập là cơ hội cho em tổng hợp thêm và hệ thống hóa lại những
kiến thức đã học, đồng thời kết hợp với thực tế để nâng cao kiến thức chuyên môn.
Qua quá trình thực tập này, từ những chỗ còn bở ngỡ cho đến thiếu kinh nghiệm, em
đã gặp phải rất nhiều khó khăn nhưng với sự giúp đỡ tận tình của thầy TS. Lương
Hùng Tiến đã giúp em có được những kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt kì thực
tập này cũng như viết lên bài báo cáo hoàn chỉnh nhất. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc
nhất đến giáo viên hướng dẫn em - thầy TS. Lương Hùng Tiến, người đã nhiệt tình
giúp đỡ, hướng dẫn em thực hiện bài báo cáo này.
Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS. Phạm Thị Phương đã
tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học cho em.
Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên,
giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình.
Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóa
luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý
báu của các Thầy Cô và các bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2020
Sinh viên
 ii

DANH MỤC VIẾT TẮT

CFU Colony fomat unit

DNA Deoxyribo Nucleic Acid
E. coli Escherichia coli
E. ictaruli Edwardsiella ictaruli
EAEC Enteroadherent E.coli
EHEC Enterohaemorrhagic E.coli
EIEC Enteroinvasive E.coli
EPEC Enteropathogenic E.coli
ETEC Enterotoxigenic E.coli
I Intermediate ( trung gian)
MH Mueller-Hinton
MIC Minimum Inhibitory Concentration
MRSA Methicillin resistance Staphulococcus aureus
PBS Phosphate buffer saline
PPCĐ Phương pháp cổ điển
PPVS Phương pháp vi sóng
R Resistante (đề kháng)
S Susceptible (nhạy cảm)
S. aureus Staphylococus areus
TNF Tumor necrosis factor
TSST Toxic shock syndromme toxin
 iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không ................................................4
Bảng 2.2. Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi .............................................5
Bảng 2.3. Phân loại của Staphylococcus aureus .......................................................18
Bảng 2.4. Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng ....................................................22
Bảng 2.5. Phân loại Escherichia coli ........................................................................26
Bảng 2.6. Phân loại Salmonella ................................................................................31
Bảng 3.1. Danh mục thiết bị sử dụng ........................................................................35
Bảng 3.2. Danh mục hóa chất sử dụng......................................................................35
Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu .............................................................39
Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu từ lá
Trầu không ...............................................................................................40
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh
dầu ............................................................................................................42
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm
lượng tinh dầu ..........................................................................................44
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu
.................................................................................................................45
Bảng 4.4. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ lá
Trầu không ...............................................................................................46
Bảng 4.5. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết tinh dầu từ lá
Trầu không ...............................................................................................47
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tinh dầu đến khả năng kháng khuẩn................................49
 iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Cây Trầu không ...........................................................................................4

Hình 2.2. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus .......................................................19
Hình 2.3. Trực khuẩn Escherichia coli .....................................................................27
Hình 2.4. Tụ cầu khuẩn Salmonella ..........................................................................32
Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu lá Trầu không .................................48
Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu của hàm lượng tinh dầu lá Trầu không48
Hình 4.3. Kích thước vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng
vi sinh vật thử nghiệm .............................................................................50
 v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn dề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ...............................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát ............................................................................................2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
2.1. Tổng quan về Trầu không ....................................................................................4
2.1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không ..........................................4
2.1.2. Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không .......................................5
2.1.3. Một số nghiên cứu về trầu không ......................................................................6
2.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật ..........................................10
2.2.1. Khái niệm và mục đích của chiết ....................................................................10
2.2.2. Các phương pháp tách chiết ............................................................................10
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết ..........................................................12
2.3.1. Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu .............................12
2.3.2. Những yếu tố thuộc về dung môi ....................................................................14
2.3.3. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật ......................................................................15
2.4. Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm.................................................17
2.4.1. Tổng quan về Staphylococus aureus (S. aureus) ...........................................17
 vi

2.4.2. Tổng quan về Escherichia coli (E. coli) .........................................................25

2.4.3. Tổng quan về Salmonella (Sal) ......................................................................30
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU .........35
3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................35
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ..........................................................................36
3.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................36
3.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................36
3.4.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu ......................................................................36
3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III .....36
3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................37
3.5. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................41
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .....................................42
4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá
Trầu không ................................................................................................................42
4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu ...................42
4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu .....43
4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu ...................45
4.1.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không..............................46
4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không ...........48
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................51
5.1. Kết luận ..............................................................................................................51
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52
PHỤ LỤC
 1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn dề
Cây Trầu không có tên khoa học là Piper betle L. thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae),
là một trong những loài thực vật nhiệt đới quan trọng ở khu vực châu Á, được trồng
rộng rãi ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malaysia, Thái Lan, … Tên thường gọi của nó là Trầu
(tiếng Việt) Betle (tiếng Anh), Paan (tiếng Ấn Độ), Phlu (tiếng Thái) và Sirih (tiếng
Bahasa Indonesia) [33]. Lá trầu được nghiên cứu cho thấy trong lá có chứa một số
chất dễ bay hơi [35], khoáng chất [30], glycosid [26], enzym, vitamin, các axit amin
thiết yếu [21] và tanin [34]. Dịch chiết của lá Trầu không có các chất kháng khuẩn,
kháng viêm và chống ung thư [31]. Các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm của
lá trầu được cho là do các thành phần hóa học khác nhau có trong lá. Lá trầu mà có
hàm lượng phenol và flavonoid càng cao thì có hoạt tính chống oxy hóa và chống ung
thư càng cao [36,32]. Chống lở loét cũng là do hàm lượng flavonoid trong lá trầu cao.
Người ta đã thấy rằng khi chiết tách tinh dầu có trong lá Trầu có khả năng chữa lành
vết loét dạ dày [35]. Còn ở nước ta, trong y học cổ truyền Việt Nam, lá trầu được sử
dụng cho nhiều mục đích khác nhau như nhai trầu để chắc răng, chữa viêm mủ chân
răng, nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm,
lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt để chữa bệnh viêm kết mạc... [10]. Ở Việt
Nam PGS.TS. Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự ở Khoa Thủy sản – Đại học
Nông Lâm Huế chế tạo ra hợp chất Bokashi. Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các
vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là Eugenol, Chavicol,
Estradiol, Cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm
Lactobacillus. Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường
vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi
trường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản; khi ao nuôi tôm được bổ
sung chế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không
được bổ sung. Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở
nồng độ 7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn: Vibrio, Aeromonas, E. coli,
 2

Coliform, Staphylococcus. Còn ở nồng độ 5.000 ppm đến 10.000 ppm có khả năng
ức chế các nấm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng:
Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine. Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi
trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium. Còn kết quả nghiên cứu của các
nhà khoa học Trường đại học Cần Thơ cho thấy, tinh dầu lá Trầu không biểu hiện
hoạt tính kháng vi sinh vật tốt. Nó có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương như
Bacillus subtillis và các loại nấm gây hại như Aspergillus niger và Fusarium
oxysporum. Kết quả này cho thấy tiềm năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu
lá Trầu không có thể ứng dụng được vào thực tế.
Qua các nghiên cứu cho ta thấy khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu
nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho tác dụng điều trị các bệnh do nhiễm khuẩn và
nấm của tinh dầu Trầu không, đồng thời tinh dầu Trầu không có giá trị kinh tế cao, là
mặt hàng hiện đang có nhu cầu lớn trên thị trường vì được sử dụng rất nhiều trong
mỹ phẩm, trong y học và cả ngành nông nghiệp. Đồng thời bước đầu được sử dụng
trong thủy hải sản.
Xuất phát từ thực trạng trên em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các
yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá
hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không.
- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu
- Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không
- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
 3

1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá
trầu không
- Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu trầu không trên các vi sinh
vật thử nghiệm
- Đề tài động viên khích lệ sinh viên tham gia công tác nghiên cứu khoa học
- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế, củng
cố các kiến thức đã học.
- Bổ sung kiến thức thông qua hoạt động nghiên cứu thực tiễn, trau dồi kiến
thức bản thân, tích lũy kinh nghiệm thực tế, đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu
khoa học phục vụ cho công việc nghiên cứu và công tác sau này.
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu
khoa học.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sử dụng
trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của
lá Trầu không.
 4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về Trầu không

2.1.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không
Vị trí phân loại thực vật [10]: Trầu không còn có tên gọi khác là cây trầu, trầu
cay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia).
Bảng 2.1. Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không [10]

Giới Plante
Ngành Magnoliophyta
Lớp Magnoliophyta
Bộ Piperales
Họ Piperaceae
Giống Piper
Loài P. betle

Hình 2.1. Cây Trầu không

Đặc điểm thực vật học: Trầu không là một cây mọc leo, thân nhẵn. Lá mọc so
le, cuống có bẹ, dài 1,5 - 3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 - 13cm, rộng 4,59cm,
phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy rất nhiều
điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường có năm gân. Hoa khác gốc mọc thành bông
có cuống dài bằng cuống lá, mọc đối diện với lá, hoa đơn tính. Bông đực dài bằng
phiến lá, trục bông phủ lông, lá bắc không cuống, không có lông, hình tròn hoặc hình
trứng ngược. Nhị hoa, bao phấn hình bầu dục, chỉ nhị ngắn. Bông cái ngắn hơn, trục
phủ lông [4]. Quả mọng, lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh. Toàn cây có mùi thơm
cay.
Phân bố và thu hái: Cây Trầu được trồng khắp nơi ở nước ta để lấy lá, ăn trầu.
Chúng còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á, vùng nhiệt đới như Indonexia,
Philipin [10]. Ở Việt Nam có 2 loại trầu chính là trầu mỡ và trầu quế. Lá trầu mỡ to
 5

bản, dễ trồng. Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu. Trầu
không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta làm giàn cho cây leo lên. Cây
trồng không ưa ẩm và Ca(OH)2, nên người ta thường trồng sát tường, cạnh bể nước
để thuận tiện cho việc tưới và bón thêm vôi cũ. Lá được hái thu hái quanh năm, dùng
tươi hay phơi khô, có khi tán bột dùng dần [3].
2.1.2. Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không
Theo phân tích, cứ 100g lá Trầu không thì có đến 85,4% độ ẩm, 3,1% protein,
0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1% carbohydrat. Hàm lượng
khoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, carotene, thiamin, riboflavin, niacin và
vitamin C [3]. Trong lá trầu không có 0,8 - 1,8%, có khi đến 2,4% tinh dầu, tỷ trọng
0,958 thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng [3]. Theo Phạm Thế Chính và cs [5] tinh
dầu lá trầu có chứa các hợp chất như là eugenol, eugeny acetat, chavicol và
diacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao,
tỷ trọng và chiết suất cao.
Bảng 2.2. Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [3]
Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Nước 85 - 90% Thiamine 10 - 70μg/ 100g
Protein 3 - 3,5% Riboflavin 1,9 - 30μg/ 100g
Chất béo 0,4 - 1% Tanin 0,1 - 1,3%
Chất khóang 2,3 - 3,3% Nitrogen 2 - 7%
Chất xơ 2,3% Photphorus 0,005 - 0,6%
Chlorophyll 0,01 - 0,25% Kali 1,1 - 4,6%
Cacbohydrate 0,5 - 6,1% Canxi 0,2 - 0,5%
Axit Nicotinic 0,63 - 0,89mg/ 100g Iod Sắt 0,005 - 0,007%
Vitamin C 0,005 - 0,01% Tinh dầu 0,08 - 0,2%
Vitamin A 1,99 - 2,99mg/ 100g Năng lượng 44Kcal/ 100g
Nguồn: Từ điển thực vật 2, 2004
Công dụng của lá Trầu không: Ngoài công dụng để ăn trầu (lá Trầu không, vôi
tôi, cau và vỏ cây), dân gian còn dùng nước lá trầu để sát trùng, chống lở loét, chống
 6

viêm nhiễm… [3]. Các hợp chất polyphenol trong lá trầu có khả năng chống oxi hóa
cao, ức chế một số nguyên nhân gây bệnh loét dạ dày. Nước pha lá trầu không còn
được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt của trẻ em.
Có nơi còn giã lá trầu không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa
bệnh tắc sữa [3] Trầu không còn có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các vi trùng:
tụ cầu, Subtilit và trực trùng E. coli [18].
Một số bài thuốc dân gian từ Trầu không [4]
Bài thuốc chữa đau họng: Khi đau họng, dùng trầu không sẽ rất có công hiệu.
Lấy lá trầu không và ít hoa quả xay nhuyễn lấy nước trộn thêm mật ong rồi ngậm thật
lâu, nếu uống được thì càng tốt, sẽ giảm các kích thích gây ho.
Bỏng nước sôi: Lá trầu hơ nhẹ để lá mềm ra rồi phết một lớp thầu dầu rồi đặt
nhẹ lên vết bỏng. Cứ sau vài giờ lại thay một lá trầu mới. Sau vài lần, dịch trong vết
bỏng sẽ tiêu hết, chỗ rộp không mọng nước, không gây mủ. Nên dùng vào ban đêm
và vứt đi vào sáng sớm.
Chữa đau mắt đỏ (viêm kết mạc): Lấy ba lá trầu không, năm đến mười lá dâu
vò nát, cho vào ca, đổ ngập nước sôi để xông hơi con mắt đau. Xông mỗi lần 5 - 10
phút, ngày 2 lần. Thuốc giúp chóng hết viêm, mắt dịu.
Rửa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá trầu không và phèn đen mỗi thứ
20g vò nát hoặc giã nát, đổ 1,5lít nước, sắc lấy 1lít, rửa tại chỗ ngày 1lần.
Ngoài ra Trầu không còn có tác dụng tăng sinh lực, làm sạch răng và làm ngọt miệng.
2.1.3. Một số nghiên cứu về trầu không
2.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Dưới tên gọi Bokashi Trầu, chế phẩm sinh học chiết xuất từ lá Trầu không của
Trung tâm ươm tạo và chuyển giao công nghệ - Đại học Huế đã được Hội sở hữu trí
tuệ Việt Nam trao giấy chứng nhận sản phẩm tin cậy. PGS.TS. Nguyễn Quang Linh,
chủ nhiệm đề tài cho biết, lá trầu sau thu hái được làm sạch, làm khô nước và xay
nhuyễn, ly tâm lấy được dịch chiết xuất lá Trầu. Cho dịch chiết lá Trầu lên men với
các vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là eugenol, chavicol,
estradiol, cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm lactobacillus.
 7

Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi sinh vật có lợi
trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không
gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản. Khi ao nuôi tôm được bổ sung chế phẩm,
tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được bổ sung.
Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng độ 7,5 ppm
có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Vibrio, Aeromonas, E. coli, Coliform,
Staphylococcus. Bokashi trầu ở nồng độ 5.000 đến 10.000 ppm có khả năng ức chế
các nấm Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng Zoothamnium,
Epistylis, Vorticella, Gregarine. Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng
ức chế nấm Lagenium và Fusarium.
Phạm Thị Thắm và cộng sự đã phân lập các hợp chất trong thân cây Trầu không,
kết quả thu được cho thấy các lớp chất trong thân cây Trầu không đã được phân lập
lớp thành 3 chất có độ phân cực khác nhau nhờ sử dụng dung môi chiết theo độ phân
cực tăng dần. Lớp chất kém phân cực được phân bố vào dung môi chiết n-hexan (cặn
chiết H), lớp chất có độ phân cực trung bình được phân bố vào dung môi diclometan
(cặn chiết D), cặn chiết có độ phân cực cao được phân bố trong dung môi etyl acetat
(cặn chiết E). Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết H, D, E đã được
nghiên cứu, kết quả cho thấy hai cặn chiết D và E có hoạt tính kháng khuẩn và kháng
nấm.
Nguyễn Chí Thiện và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng
vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae). Tinh
dầu lá trầu không được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước đạt hiệu suất 0,63%. Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ
(GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá Trầu không được xác định là
hợp chất 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene với hàm lượng 34,55%. Hoạt tính kháng vi
sinh vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác
định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Phạm Thế Chính với bài báo “Thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu (Piper
betle L.) trồng tại Hải Dương”. Trong thí nghiệm sử dụng phương pháp chưng cất lôi
 8

cuốn hơi nước đặc biệt có hiệu ứng muối kết hợp với đun hồi lưu, đã tách thành công
tinh dầu lá trầu được trồng tại Hải Dương với hiệu suất đạt 1,01%. Tinh lá trầu tách
được có tỷ trọng cao là 0,963 và chiết suất lớn là 1,5362. Bằng phương pháp sắc ký
khí ghép nối khối phổ (GC/MS), họ đã khẳng định tinh dầu lá trầu trồng tại Hải Dương
có thành phần hóa học chính là eugenol, với hàm lượng lên tới 77,24%. Từ tinh dầu
này họ đã sử dụng phương pháp sắc ký cột thường nhồi bằng silica gel theo phương
pháp nhồi ướt với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat, 10/1…; đã phân lập
được eugenol tinh khiết và đã khẳng định được cấu trúc của nó bằng các phương pháp
phổ hiện đại IR, MS, 1H&13C-NMR.
2.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Theo nghiên cứu “Steam and Water Distillation of Piper Betle, Ocimum
Basilicum, Cymbopogon Winterianus, and Citrus Hystrix Leaves for Activity of
Insect Repellent against Mosquito” của tác giả Engrid Juni Astuti cho thấy lá trầu, lá
húng quế, lá sả đỏ có chứa tinh dầu có khả năng có hoạt tính đuổi muỗi thay thế một
số chất có hoạt tính đuổi muỗi như DEET. Mục tiêu của đề tài: Để có được loại đuổi
muỗi tự nhiên từ tinh dầu. Phương pháp: Chưng cất hơi nước để thu được tinh dầu,
GC-MS để biết hàm lượng hóa học của nó. Thử nghiệm hoạt tính dễ bay hơi của tinh
dầu đối với côn trùng trong các nồng độ khác nhau để chống muỗi vằn (Aedes aegypti)
sử dụng với đối tượng là chuột trong 6 giờ. Kết quả: Chưng cất hơi nước và nước thu
được dầu với 0,56% v / b (lá trầu), 0,33% v / b (lá húng quế), 1,7025% (lá sả đỏ) và
0,693% (lá chanh). Trong của tinh dầu của lá trầu GC-MS Piper chứa các hợp chất 4-
Allylphenyl acetate (19,284%) và C10H12O2 (Trans-isoeugenol) (18,485%), tinh dầu
của lá húng quế chứa hợp chất z-citral (54,201%), tinh dầu lá sả đỏ chứa các hợp chất
C10H18O (Citronellal) (35,843%) và tinh dầu của lá chanh chứa C10H18O Citronellal
(66,550%). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy rằng sự kết hợp giữa tinh dầu lá Trầu
không và tinh dầu lá Húng quế có hoạt tính đuổi côn trùng không khác với DEET
13%, ngoại trừ nồng độ thấp hơn 50:50. Trong khi sự kết hợp của tinh dầu lá Sả đỏ
và tinh dầu lá chanh cho thấy có sự khác biệt về bảo vệ giữa các nhóm điều trị và có
sự khác biệt về bảo vệ ở khoảng thời gian thử nghiệm vì giá trị p <0,05. Kết luận: Sự
 9

kết hợp của 2 lá: lá Trầu không và lá Húng quế hoặc lá Sả đỏ và lá chanh có khả năng
như một loại thuốc chống côn trùng tự nhiên thay thế DEET. [23]
Trong nghiên cứu này, tinh dầu được chiết tách từ 7 loại lá trầu khác nhau tại
các tỉnh địa phương khác nhau (Bangla, Bagerhati, Manikdanga, Meetha, Kalibangla,
Chhaanchi và Ghanagete) với mục đích cho thấy các loại giống khác nhau thì có các
thành phần hóa học và có tính chất ức chế enzyme của các loại là khác nhau. Các loại
tinh dầu này ức chế glucuronidase, liên quan đến bài tiết xenobamel, và cho thấy các
đặc tính gây độc tế bào. Nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng tiềm năng của tinh
dầu lá Trầu không (Piper betle L.) trong lĩnh vực y tế và mỹ phẩm. [35]
Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới các đặc tính chống oxy hóa và
chống viêm của việc chiết tách lá Trầu không (Piper betle L.) đã được nghiên cứu.
Các dung môi được sử dụng là nước, ethanol, ethyl acetate và hexane. Sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng để xác định cấu hình hóa học và nồng độ của
các hợp chất có trong lá trầu không, cụ thể là hydroxychavicol (HC) và eugenol (EU).
Khả năng chống oxy hóa của các chất có trong lá Trầu không được đánh giá bằng
cách sử dụng hai xét nghiệm quét gốc superoxide-xanthine / xanthine oxyase
superoxide (xét nghiệm SOD) và xét nghiệm diệt gốc tự do 1,2-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH). Các xét nghiệm chống viêm được sử dụng là các xét nghiệm
ức chế hyaluronidase (HYA), xanthine oxyase (XOD) và lipoxygenase (LOX). Kết
quả HPLC cho thấy HC và EU được phát hiện trong tất cả các loại dung môi chiết
nhưng nồng độ cao nhất là trong nước. Năng suất chiết cao nhất thu được bằng cách
sử dụng nước. Tất cả các dung dịch chiết đều có khả năng chống oxy hóa cao nhưng
với việc chiết bằng nước cho thấy sự ức chế là mạnh nhất. Các chất có trong dịch
chiết cũng thể hiện sự ức chế đáng kể trong các xét nghiệm XOD và LOX. Kết quả
chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của dung dịch chiết có liên quan đến HC và EU. [36]
 10

2.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: [16]
2.2.1. Khái niệm và mục đích của chiết
Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyên
liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng
không hòa tan với nó.
Mục đích của chiết: là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích
lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của
các chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. Ngoài ra còn dùng phương pháp
chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp.
Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên.
2.2.2. Các phương pháp tách chiết
Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan
lẫn vào nhau là nước và tinh dầu. Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay
hơi. Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của môi
trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước.
Ưu điểm: Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản. Trong quá
trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời
gian. Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 6 - 10 giờ,
nếu thực hiện liên tục thì mất 30 phút đến 1 giờ. Có thể tiến hành chưng cất với các
cấu tử chịu được nhiệt độ cao.
Nhược điểm: Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàm
lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng
tụ. Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân.
Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi trong các thành phần của nguyên
liệu. Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn.
Tách chiết bằng dung môi:
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp
để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng
 11

thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên
liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình
thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch
nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu
tinh dầu.
Yêu cầu của dung môi chiết: Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn
chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi. Không tương
tác hóa học với tinh dầu. Có khả năng thu hồi tái sử dụng. Độ nhớt thấp để không làm
giảm tốc độ khuếch tán. Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất
không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan
tinh dầu của dung môi. Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không
gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người. Khi bay hơi dung môi không
để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm
của tinh dầu. Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm.
Tách chiết bằng soxlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu
dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra. Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần
liên tục và tiết kiệm dung môi. Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14),
diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH).
Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi với vài ba
lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng. Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm nhiều
lần và ngâm nóng. Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp tách chiết
thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.
Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách
thường xuyên tách các chất chiết ra khỏi nguyên liệu. Phương pháp này thường xuyên
dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian.
Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất. Chiết
siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000Hz. Dùng siêu âm có thể
rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa hai pha
 12

bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng
cường sự xáo trộn của hỗn hợp.
Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di
chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là
phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của
dung môi. Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt
chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng
làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo.
Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại dung môi
hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước
ở trạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng,
hệ hai pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit,
silic oxit và nhôm. Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có
độ tinh khiết, có màu sắc và hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến
đổi như trong các phương pháp chiết khác.
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: [16]
2.3.1. Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu
Màng tế bào dược liệu
Màng tế bào dược liệu có ảnh hưởng nhiều đến quá trình khuếch tán.
Đối với thực vật còn non hay mỏng mềm như cỏ cây, hoa lá, thành phần của
màng tế bào chủ yếu là cellulose. Cellulose có tính chất không tan trong nước và
không tan trong các dung môi khác, bền vững ở nhiệt độ cao, có tính mềm dẻo đàn
hồi. Đối với dược liệu loại này, dung môi dễ thấm vào dược liệu, do đó chỉ cần xay
thô dược liệu. Nếu xay mịn, dễ kéo theo nhiều tạp vào dịch chiết.
Đối với dược liệu đã già, rắn chắc như hạt, gỗ, rễ, vỏ thân... thì màng tế bào có
thể bị hóa bần, hoá cutin, hoặc có thể bị phủ thêm một lớp sáp... đó là những chất có
bản chất lipid, có tính chất không thấm nước và khí, do đó dung môi khó thấm vào
dược liệu. Một số loài thực vật khi già màng tế bào có thể bị hoá gỗ, hoá khoáng, bị
phủ thêm lớp dioxyt silic hoặc canxi carbonat, màng tế bào trở nên dày, rắn chắc, nên
 13

dung môi khó thấm vào dược liệu. hoặc màng tế bào có thể bị phủ thêm lớp chất
nhầy. Chất nhầy tan được trong nước, nhưng khi hút nước nó bị trương nở và trở nên
nhớt, làm bít kín các ống mao quản trên màng tế bào, gây cản trở sự thấm của dung
môi, cản trở quá trình khuếch tán. Do đó với những dược liệu đã già, rắn chắc, nên
xay nhỏ dược liệu, tạo điều kiện cho dung môi dễ thấm ướt dược liệu, chất tan dễ
khuếch tán vào dung môi.
Chất nguyên sinh
Chất nguyên sinh có thành phần hoá học rất phức tạp và không ổn định. Chất
nguyên sinh có tính nhớt, tính đàn hồi, không tan trong nước, không màu và không
bền đối với nhiệt. ở nhiệt độ 50 - 600C, chúng bị mất hoạt tính sinh học (trừ trường
hợp ở những hạt khô, quả khô, chất nguyên sinh có thể chịu được tới 80 - 1050C). Có
thể nói chất nguyên sinh là một môi trường dị thể phức tạp, có thể coi đó là một hệ
keo nhiều pha, tạo thành từ những hợp chất cao phân tử, phân tán trong môi trường
nước (ví dụ: giọt dầu, giọt mỡ, hạt tinh bột, hạt tinh thể ...). Chất nguyên sinh có tính
chất bán thấm, có nghĩa là chỉ thấm đối với dung môi mà không cho chất tan đi qua.
Do đó để chiết được các chất tan trong tế bào, người ta phải tìm cách phá huỷ chất
nguyên sinh bằng cách làm đông vón chúng bằng nhiệt (sấy hoặc phơi khô) hoặc bằng
cồn (hơi hoặc cồn nóng).
Một số tạp chất có thể có trong dược liệu
Đó là sản phẩm của các quá trình trao đổi chất, là chất dự trữ hoặc chất thải của
cây. Các chất này thường gây cản trở hoặc cũng có khi có tác dụng thuận lợi cho quá
trình chiết xuất. Dưới đây là một số ví dụ:
Đối với những dược liệu chứa nhiều pectin, gôm hoặc chất nhầy: Đó là những
chất tan được trong nước, và khi tan trong nước thì bị trương nở, tạo dung dịch keo,
làm tăng độ nhớt, gây cản trở cho quá trình chiết xuất. Có thể loại các chất này bằng
cách cho kết tủa trong cồn cao độ.
Đối với những dược liệu chứa nhiều tinh bột: Tinh bột có tính chất không tan
trong nước lạnh, nhưng ở nhiệt độ cao tinh bột bị hồ hoá, làm tăng độ nhớt của dung
dịch, gây cản trở cho quá trình chiết xuất. Do đó đối với những dược liệu loại này,
 14

không nên xay dược liệu quá mịn, tránh giải phóng ra nhiều tinh bột và không nên
chiết ở nhiệt độ cao để tránh bị hồ hoá.
Đối với những dược liệu chứa chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa: Đó là
những chất không tan trong nước và thường tan trong các dung môi không phân cực.
Nếu dùng dung môi chiết là nước, các chất này sẽ làm dung môi khó thấm vào dược
liệu, gây cản trở quá trình chiết xuất, do đó cần phải loại chúng đi bằng các dung môi
thích hợp trước khi chiết. Nếu dùng dung môi không phân cực để chiết, dịch chiết sẽ
lẫn nhiều tạp, những tạp này sẽ bị loại đi trong giai đoạn tinh chế.
Đối với những dược liệu chứa enzym: Enzym có bản chất là protein, ở nhiệt độ
60 - 700C enzyme bị mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ lạnh enzym chỉ bị ngừng hoạt động,
sau đó nếu nâng đến nhiệt độ thích hợp thì enzym lại được phục hồi. Tuỳ từng trường
hợp cụ thể mà enzym có thể gây cản trở hoặc cũng có khi lại tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình chiết xuất.
Có ba phương pháp để diệt enzym:
Phương pháp nhiệt ướt: nhúng dược liệu vào lỏng sôi (nước sôi hoặc cồn sôi).
Phương pháp nhiệt ẩm: cho dược liệu qua hơi ẩm (hơi nước sôi hay hơi cồn sôi).
Phương pháp nhiệt khô: cho dược liệu qua luồng không khí nóng.
2.3.2. Những yếu tố thuộc về dung môi
Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân
cực, độ nhớt, sức căng bề mặt.
Độ phân cực của dung môi
Nói chung dung môi ít phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khó
hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ
hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất ít phân cực.
Dựa vào độ phân cực của dung môi người ta phân loại như sau:
Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen…
Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, diclorethan, aceton, ethylacetat ...
Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn
(methanol, ethanol, isopropanol...).
 15

Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi

Nói chung, dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏ
thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết
xuất còn nếu dung môi có độ nhớt càng cao hoặc có sức căng bề mặt càng lớn thì
dung môi khó thấm vào dược liệu, làm cho quá trinh chiết xuất gặp khó khăn.
2.3.3. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật
Đó là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau,
nhằm tạo ra những điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất.
Đó có thể là những yếu tố: nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn,
siêu âm ...
Nhiệt độ chiết xuất
Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số
khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên.
Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá
trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:
Đối với những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá
huỷ một số hoạt chất như vitamin, glycosit, alcaloit ...
Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà độ tan
của tạp cũng đồng thời tăng theo, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp. Nhất là đối với một
số tạp như gôm, chất nhầy ... khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở; tinh bột bị hồ hoá, độ
nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế.
Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung
môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi.
Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hoà tan toả nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ
tan của chúng lại bị giảm. Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ.
Từ những phân tích trên ta thấy tuỳ từng trường hợp cụ thể mà cần lựa chọn
nhiệt độ sao cho phù hợp (tuỳ thuộc vào các yếu tố như dược liệu, dung môi, phương
pháp chiết xuất ...).
 16

Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được
hoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng
lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo...). Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không
chiết được hết hoạt chất trong dược liệu; nhưng nếu thời gian chiết dài quá, dịch chiết
sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Tóm lại, cần phải
lựa chọn thời gian chiết xuất sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi,
phương pháp chiết xuất ...
Độ mịn của dược liệu
Khi kích thước dược liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt dược liệu, hoạt
chất khó được chiết vào dung môi. Khi độ mịn dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc
giữa dược liệu và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào
dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn.
Tuy nhiên trong thực tế, nếu xay dược liệu quá mịn sẽ gây ra một số bất lợi cho
quá trình chiết xuất như sau:
Khi ngâm dược liệu vào dung môi, bột dược liệu bị dính bết vào nhau, tạo thành
dạng bột nhão, vón cục. Do đó sẽ khó khuấy trộn giữa dược liệu và dung môi, quá
trình chiết xuất xảy ra bị chậm lại. Mặt khác, vì bột dược liệu bị dính bết vào nhau
nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy được (gọi là hiện
tượng tắc thiết bị).
Khi bột dược liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá huỷ, dịch chiết bị lẫn
nhiều tạp; gây khó khăn cho quá trình tinh chế, bảo quản.
Từ những phân tích trên ta thấy cần phải lựa chọn độ mịn của dược liệu sao cho
thích hợp, tuỳ thuộc vào từng trường hợp hợp cụ thể, tuỳ thuộc vào dược liệu, dung
môi, phương pháp chiết xuất ...
Khuấy trộn
Khi dung môi tiếp xúc với dược liệu, dung môi sẽ thấm vào dược liệu, hoà tan
chất tan, chất tan sẽ khuếch tán từ dược liệu vào dung môi qua màng tế bào. Sau một
thời gian khuếch tán, nồng độ chất tan trong tế bào giảm dần, nồng độ chất tan trong
lớp dung môi tăng dần, chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào giảm dần, tốc
 17

độ quá trình khuếch tán cũng giảm dần, đến một lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân
bằng động giữa hai pha. Như vậy, nếu không có khuấy trộn, quá trình khuếch tán sẽ
xảy ra rất chậm. Theo định luật Fick, chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động lực
của quá trình khuếch tán.
Do đó muốn tăng cường quá trình khuếch tán, cần phải tạo ra chênh lệch nồng
độ bằng cách di chuyển lớp dịch chiết ở phía sát màng tế bào (nơi có nồng độ cao
hơn) ra phía xa hơn và di chuyển lớp dung môi ở phía xa (nơi có nồng độ thấp hơn)
đến sát màng tế bào. Điều này được thực hiện bằng cách khuấy trộn. Như vậy bằng
cách khuấy trộn, người ta đã tăng cường được tốc độ khuếch tán.
Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà người ta chọn loại cấu tạo cánh khuấy và tốc độ
khuấy sao cho phù hợp.
Siêu âm
Năng lượng của siêu âm có tác dụng làm tăng mạnh tính thẩm thấu và khuếch
tán nhờ những tác dụng của siêu âm như sau: Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai
pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ. Phá vỡ một phần màng tế bào.
Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. Có tác dụng làm nóng tại chỗ.
Phương pháp siêu âm có nhiều ưu điểm làm tăng cường quá trình chiết xuất.
Tuy nhiên, phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà
chưa được áp dụng trong sản xuất.
Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá
trình chiết xuất. Ví dụ: áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp
…
2.4. Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm
2.4.1. Tổng quan về Staphylococus aureus (S. aureus)
2.4.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Staphylococus aureus (S. aureus) do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào
năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) nghiên cứu tụ cầu khuẩn
từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học [1].
Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày
tại hội nghị lần thứ 9 của Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử
 18

dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (S. aureus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi
khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng
Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi
khuẩn này. Ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là S. aureus. Năm 1926 Julius von
Daranyi là người đầu tiên phát hiện ra mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt
động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy
nhiên mãi đến năm 1984, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi [1]
Phân loại S. aureus theo khoa học [1]:
Bảng 2.3. Phân loại của Staphylococcus aureus
Giới Eubacteria
Ngành Firmicutes
Lớp Bacilli
Bộ Bacilluales
Họ Staphylococcaceae
Chi Staphylococcus
Loài S. aureus
Nguồn: (Rosenbach, 1884)
Phương pháp phân loại dựa vào kháng nguyên: Các tụ cầu khuẩn có nhiều
loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic.
Acid teichoic: Là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác
dụng hoạt hóa bổ thể. Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid
này gắn vào polysaccharid vách tụ cầu vàng. Đây là thành phần đặc hiệu của kháng
nguyên O.
Protein A: Là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu
chuẩn để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này. Sở dĩ
kháng nguyên này mang tên protein A, vì protein này gắn được phần Fc của IgG.
Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi opsonin hóa
(opsonisation), nên làm giảm thực bào.
Vỏ polysaccharid: Một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được
bằng phương pháp nhuộm vỏ. Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên
 19

và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học. Kháng nguyên
adherin (yếu tố bám), giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc
hiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào. Adherin có thể là các protein:
laminin, fibronectin, colagen.
Phương pháp phân loại bằng phage (phage typing): Các phương pháp phân
loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó khăn, vì vậy việc phân loại tụ cầu
vàng chủ yếu dựa trên phage. Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc hiệu
rất cao. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus, vì đây là
vi khuẩn gây nhiễm trung nhiều nhất trên người.
2.4.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn S. aureus
Là loại cầu khuẩn, Gram dương, có đường kính khoảng 0,8 - 1µm. Các tế bào
thường liên kết với nhau thành hình chùm nho, không có lông, không nha bào và
thường không có vỏ.

Hình 2.2. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

Là loại vi khuẩn yếm khí tùy tiện, không di động, không sinh bào tử [1]. Là loài
có pH phát triển khá rộng, trong khoảng 4 - 9,8, khoảng pH tối ưu là 6 - 7, bị kìm
hãm ở pH < 4,8. Chúng phát triển tốt ở aw = 0,83 - 0,86.
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 370C, tuy nhiên chúng là loài chịu nhiệt
tốt, có thể tồn tại trong 16h ở 600C và pH = 7,3. Có khả năng sống ở nồng độ muối 9
- 10%. Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi
khuẩn không đa bào khác. Tụ cầu vàng bị diệt ở 800C trong 1 giờ (trong khi các vi
khuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút). Khả năng đề kháng với nhiệt độ
 20

của tụ cầu vàng thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà
vi khuẩn có thể phát triển được.
Tụ cầu vàng có khả năng kháng một số kháng sinh như penicillin G do vi khuẩn
này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid. Một số còn kháng được
methicillin resistance Staphylococcus aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra được
các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh. Hiện nay một số rất ít tụ cầu còn
đề kháng được với cephalosporin các thế hệ kháng sinh được dùng trong các trường
hợp này là vancomycin.
Tụ cầu vàng có hệ thống enzyme phong phú, những enzyme được dùng trong
chuẩn đoán là coagulase, có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi
đã được chống đông. Đây là tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với các
tụ cầu khác. Hoạt động coagulase giống như thrombokiase tạo thành một “áo
fibrinogen” trong huyết tương. Coagulase có hai loại: Một loại tiết ra môi trường gọi
là coagulase tự do và một loại bám vào vách tế bào gọi là coagulase cố định
Khi phát triển vi khuẩn này có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến màu vàng
sạm, nhiệt độ 200C - 250C thích hợp nhất cho chúng tạo màu.
Tạo độc tố enterotoxin. Nhiệt độ thích hợp cho chúng tạo ra độc tố 7 0C - 470C,
khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình này là 400C - 450C, các độc tố này bền với nhiệt,
chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút.
Có khả năng phát triển trên nhiều môi trường khác nhau. Trên môi trường thạch
tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, có đường kính từ 1 - 2mm, bề mặt nhẵn. Khuẩn lạc
thường có màu vàng chanh sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 370C. Trên môi trường thạch
máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh tạo tan máu hoàn toàn. Trên môi trường canh thang,
tụ cầu vàng làm đục môi trường và nếu để lâu nó có thể lắng cặn. Tụ cầu vàng có khả
năng chịu được nồng độ muối cao, vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường
chứa đến 15% NaCl. Nguồn nitơ sử dụng là nguồn acid amine. Nếu trong môi trường
có chứa các acid amine như: Arginine, cystine, phenylalanine và các vitamin B3, B5,
B1, H sẽ rất thuận lợi cho S. aureus phát triển. Vi khuẩn sinh thử nghiệm coagulase, có
khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, saccharose.
 21

2.4.1.3. Độc tố S. aureus

Tạo enterotoxin chịu nhiệt tốt: Chúng là những chuỗi protein có khối lượng phân
tử thấp khoảng 25000 - 29000 Da. Có 6 loại enterotoxin là A, B, C, D, E, F. trong đó
độc tố B thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng. Về miễn dịch
6 loại này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có kháng nguyên chéo. Về cơ
chế gây bệnh độc tố enterotoxin kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Xác
định enterotoxin bằng các kỹ thuật miễn dịch.
Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndromme toxin -
TSST): Độc tố gây shock nhiễm độc thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông
dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương. Độc tố này khó phân biệt với
enterotoxin F của tụ cầu vàng. TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor Necrosis
Factor) yếu tố hoại tử u và các interleukin I, II. Cơ chế gây shock của nó tương tự
như của nội độc tố.
Exfoliatin toxin hay epidermolytic toxin: Đây là một ngoại độc tố. Nó gây nên
hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (Scaded Skin Syndrome) ở trẻ em. Hội chứng này đã
được biết khá lâu, nhưng mãi đến năm 1971 người ta mới biết đến exfoliatin. Độc tố này
được tạo bởi gen của 85% các chủng tụ cầu vàng thuộc loại phage nhóm II.
Alphatoxin: Độc tố này gây tan các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ đó
gây ra các ổ áp xe, gây ra hoại tử da và tan máu. Alphatoxin là một protein trọng
lượng phân tử 33000 - 36000 Dalton. Nó gắn trên màng tế bào và thể hiện các thuộc
tính hoạt động bề mặt. Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không
có tác dụng chống nhiễm khuẩn.
Độc tố bạch cầu (Leucocidin): Mặc dù một số staphylosyn chứa độc tố bạch
cầu, nhưng chỉ một độc tố tụ cầu thực sự độc với bạch cầu và được coi là leucocidin.
Độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ và không gây độc cho bạch cầu các
loại động vật khác. Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏ. Leucocidin bao gồm 2 mảnh
F và S và có thể tách rời bằng sắc ký in, trọng lượng phân tử là 32000 và 38000
Dalton. Nếu tách rời 2 mảng này thì mất tác dụng gây độc.
 22

Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): Vào 1979, Schlivent và cộng sự

đã tách biệt được một độc tố từ tụ cầu vàng. Về nhiều phương diện, độc tố này tương
tự độc tố sinh mủ của liên cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân
bào lymphocyt, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về một số phương diện đối với nội
độc tố như gây shock và hoại tử gan và cơ tim. Sau đó, người ta đã phân biệt được 3
loại ngoại độc tố sinh mủ, ký kiệu là A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lượng
phân tử (theo thứ tự: 1200, 1800 và 22000 Dalton) về tính đặc hiệu kháng nguyên
nhưng giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào.
Dung huyết tố (hemolysin còn gọi là staphylokysin): Tụ cầu vàng sinh ra 4
loại hemlysin có các tính chất khác nhau.
Bảng 2.4. Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng
Loại bạch Nguồn
Loại hồng cầu Tác động trên động vật
cầu nhạy gốc vi
nhạy cảm thí nghiệm
cảm khuẩn
Gây hoại tử da thỏ, gây chết
Thỏ, cừu Thỏ, người Người chuột và thỏ, gây độc tế bào
nuôi cấy

Liều cao gây chết thỏ, hoại tử

Cừu, người,bò Không Động vật
từng đám tế bào nuôi cấy

Thỏ, người, cừu, Hoại tử nhẹ da thỏ và da chuột,

Người
chuột, bò, ngựa gây chết thỏ
Làm xơ cứng da thỏ và da
Người, thỏ, Thỏ, người,
Người chuột, gây hoại tử tế bào nuôi
ngựa, cừu, chuột chuột
cấy

Sinh enzyme gây độc cho người: Catalase chuyển hydrogen peroxit thành nước
và oxy, coagulase làm đông huyết tương, hyaluronase làm tan acid hyaluroic giúp vi
khuẩn vào cơ thể.
 23

2.4.1.4. Bệnh do S. aureus

Staphylococcus aureus thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hóa.
Có khoảng 40 - 50% người có Staphylococcus aureus ở trong khoang mũi, ngoài ra
còn thấy chúng ở quần áo, đồ vật. Khi Staphylococcus aureus tiết ra coagulase sẽ làm
thương tổn tạo ra mụn nhọt, làm đông sợi huyết. Từ ổ nhiễm chúng có thể xâm nhập vào
các nơi khác qua đường máu và có thể gây viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm
thận, viên tủy xương [13]. Do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên nó có
thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da. Sau đó gây nên
các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, eczema, hậu bối…Mức
độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi
khuẩn. Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch. Tụ
cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất. Do chúng gây nên nhiều loại
nhiễm khuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đấy vi khuẩn xâm nhập vào máu
gây nên nhiễm khuẩn huyết. Đây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ nhiễm khuẩn huyết,
tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên ổ áp xe (gan, phôi, não, tủy xương...)
hoặc viêm nội tâm mạc. Có thể gây nên các vêm tắc tĩnh mạch. Một số nhiễm trùng khu
trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương,.. Viêm phổi do tụ cầu vàng thường ít
gặp. Nó chỉ xảy ra sau viêm đường hô hấp do virus (như cúm) hoặc sau nhiễm khuẩn
huyết. Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng, ở trẻ em hoặc những
người suy yếu. Tỷ lệ tử vong của bệnh này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nặng.
Ngộ độc thức ăn do phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú
ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh
nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đường
ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng
(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng. Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ
cầu vàng thường rất cấp tính. Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến 8
(giờ), bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn
chủ yếu là nước. Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới shock.
 24

Nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do tụ cầu khuẩn. Đây là trường hợp rất thường
gặp nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng…từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn huyết.
Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng tới
vancomycin. Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao.
2.4.1.5. Cách phòng ngừa
Phòng bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu chủ yếu là vệ sinh môi trường, quần áo và thân
thể vì tụ cầu có rất nhiều ở những nơi này. Đặc biệt là vệ sinh môi trường bệnh viện
để chống nhiễm khuẩn bệnh viện
Rửa tay: Rửa tay đúng cách là một trong những biện pháp phòng ngừa thường
hay sử dụng để chống lại các vi trùng.
Vết cắt, vết trầy phải luôn được giữ sạch sẽ và được băng kín, khô cho đến khi
lành. Mủ từ vết loét bị nhiễm trùng có thể chứa vi khuẩn cầu vàng và việc che vết
thương sẽ giúp ngăn vi khuẩn lây lan.
Giặt quần áo và ga giường bằng nước nóng: Vi khuẩn tụ cầu khuẩn có thể tồn
tại trên quần áo và ga giường không được rửa sạch đúng cách.
Tránh tiêm thuốc bừa bãi, không theo chỉ định của bác sĩ: Người dùng thuốc
tiêm tĩnh mạch có nguy cơ rất cao mắc nhiều loại bệnh nhiễm trùng nguy hiểm bao
gồm nhiễm khuẩn do vi khuẩn tụ cầu vàng.
Tránh dùng chung vật dụng cá nhân như khăn tắm, khăn trải giường, dao cạo,
quần áo và dụng cụ thể thao. Nhiễm tụ cầu khuẩn có thể lây lan qua các vật dụng,
cũng như từ người này sang người khác. Để hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của
vi khuẩn nói chung và tụ cầu vàng nói riêng, không nên tự mua thuốc kháng sinh để
điều trị khi chưa có chỉ định của bác sĩ.
Đối với đội ngũ bác sĩ khám chữa bệnh cần tuân thủ đúng các quy định sử dụng
kháng sinh hợp lý của Bộ Y tế đề ra.
Vệ sinh cá nhân thật tốt bằng cách tắm rửa hàng ngày với nước sạch, nhất là trẻ
nhỏ bụ bẫm có nhiều nếp kẽ, nếp gấp chứa đựng nhiều mồ hôi, bã nhờn.
Cần vệ sinh họng, miệng hàng ngày bằng cách đánh răng và súc họng nước
muối nhạt trước khi đi ngủ và sau khi ngủ dậy.
 25

Điều trị: Kháng sinh trị liệu là biện pháp chủ yếu. Vấn đề khó khăn là tụ cầu rất
kháng thuốc, nên cần phải làm kháng sinh đồ để chọn lọc thuốc thích hợp. Dùng
vacxin gây miễn dịch chống tụ cầu vàng cũng là một biện pháp cần thiết ở những
bệnh nhân dùng kháng sinh ít kết quả. Đây là những vacxin chết và có thể được bào
chế từ chủng tụ cầu vàng phân lập được ở chính bệnh nhân đó (gọi là vacxin tự liệu),
hoặc dùng các chủng tụ cầu vàng mẫu, là những chủng thường gặp (gọi là vacxin trị
liệu).
2.4.1.6. Miễn dịch và chuẩn đoán vi khuẩn học
Miễn dịch: Miễn dịch thu được với tụ cầu nói chung và tụ cầu vàng nói riêng,
trong đó tế bào thực bào đóng vai trò quan trọng nhất. Đáp ứng miễn dịch qua trung
gian tế bào có xảy ra với việc tiết ra các lymmphokin và hoạt hóa đại thực bào. Tuy
vậy nhưng đã không làm tăng được sự diệt khuẩn. Miễn dịch dịch thể cũng xuất hiện
để chống lại các yếu tố độc lực (độc tố và enzyme). Nhưng nó không có vai trò bảo
vệ có ý nghĩa. Vì tụ cầu ít tiếp xúc với kháng thể hoặc tế bào sản xuất kháng thể. Do
vi khuẩn này thường ẩn trú trong các ổ áp xe, trong các cục fibrin và trong các tế bào
bạch cầu. Như vậy miễn dịch tích cực chống nhiễm tụ cầu ít có vai trò bảo vệ.
Chuẩn đoán vi khuẩn học: Phân lập xác định tụ cầu là việc cần thực hiện và
không mấy khó khăn. Bệnh phẩm là máu, mủ, phân…tùy theo loại bệnh của tụ cầu.
Thạch máu là môi trường thích hợp để phân lập. Tụ cầu phát triển rất tốt trên môi
trường này. Có thể sử dụng môi trường lựa chọn chứa 7,5% NaCl, đường mannitol
và có thể có cả kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm, khi bệnh phẩm có nhiều loại vi
khuẩn. Tụ cầu vàng có đặc điểm là: khuẩn lạc S có màu vàng nhẹ, cầu khuẩn gram
dương, hình chùm nho, coagulase dương tính, manitol dương tính, kháng novobiocin,
phosphatase dương tính, catalase dương tính.
2.4.2. Tổng quan về Escherichia coli (E. coli)
2.4.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá
trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí
 26

sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi
khuẩn coli).
Sau khi Theodor Escherich mất (năm 1911), các nhà khoa học đã đổi tên loài
này khá nhiều lần, rồi đến năm 1919 thì được gọi thống nhất toàn thế giới là
Escherichia coli. Từ giữa những năm 1940, các bằng chứng nhận được đã cho thấy
rằng, một số chủng E. coli gây ra tiêu chảy, đặc biệt là ở trẻ em và chúng cũng được
gọi là các E. coli gây bệnh đưòng ruột [1]
Phân loại E. Coli [1]:
Bảng 2.5. Phân loại Escherichia coli
Giới Bacteria
Ngành Proteobacteria
Lớp Gammaproteobacteria
Bộ Enterobacteriales
Họ Enterobacteriaceae
Chi Escherichia
Loài E. coli
Nguồn: (Migula, 1895)
Phương pháp phân loại dựa vào cấu trúc kháng nguyên: kháng nguyên E.
coli được chia thành các type huyết thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên
O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau.
Phương pháp phân loại dựa vào vị trí gây bệnh: các E. coli có khả năng gây
bệnh ở người được chia thành 3 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC
- Intestinal Pathogenie E. coli) hay E. coli gây tiêu chảy (DEC - Diarrheagenic E.
coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (EXPEC - Extraintestinal
Pathogenic E. coli).
Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết đến gồm:
EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột
ETEC (Enterotoxigenie E. coli): E. coli sinh độc tố ruột
EIEC (EnteroIinvasIve E. coli): E. coli xâm nhập ruột
 27

EABC (Enteroaggregative E. coli): E. coli ngưng tập ruột

DABC (Diffusely adherent E. coli): E. coli bám dính phân tán
EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây xuất huyết ruột
Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:
MAEC (Meningitidis-assoclated E. coli): E. coli gây viêm màng não
UPEC (Uropathogenic E. coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu
2.4.2.2. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli
Là trực khuẩn gram âm, có vỏ hoặc không có vỏ, hầu hết đều có lông. Phát triển
dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Kích thước trung bình từ 2 -
3µm.

Hình 2.3. Trực khuẩn Escherichia coli

Là loại kỵ khí không bắt buộc, không di động, ưa ấm. Gặp trong nội chất đường
ruột của người, động vật máu nóng và chim. Nhiều chủng không gây bệnh nhưng một
số gây bệnh đối với người, động vật [1]. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trưởng
nuôi cấy thông thường. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 - 40°C. Nhiệt độ thích hợp
xung quanh 370C. E. coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu
hết E. coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E. coli trơ (inactive) (trong đó có
EIEC) không hoặc lên men rất chậm. E. coli có khả năng sinh indole, không sinh H2S,
không sử dụng được nguồn cacbon của citrate trong môi trường Simmons. E.coli có
3 loại kháng nguyên: Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng
nguyên O của E. coli. Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được
 28

xác định và được chia thành ba loại: A, B và L. Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng
nguyên H đã được xác định.
2.4.2.3. Độc tố, khả năng và cơ chế gây bệnh của Escherichia coli
Trong đường tiêu hóa, E. coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí. Nhưng
E. coli cũng là vi khuẩn gây bênh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây ỉa
chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên
gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm
màng não, nhiễm khuẩn vết thương.
Độc tố và cơ chế gây bệnh của E. coli khác nhau tùy loại:
Enterotoxigenie E. coli (ETEC): Gây bệnh do độc tố ruột, có hai loại: không
chịu nhiệt LT (Heat Labile Enterotoxin) và loại chịu nhiệt ST (Heat Stable Toxin).
Độc tố ruột LT là ngoại độc tố, gồm hai loại LT I được mã hoá bởi gen trên plasmid
và LT II được mã hoá bởi gen trên nhiễm sắc thể. LT bám vào thụ thể GM1 của tế
bào biểu mô ruột non nhờ tiểu phần B. Tiểu phần A được đẩy vào tế bào biểu mô hoạt
hoá enzym adenylate cyclase làm tăng AMP vòng (cAMP - Cyclic Adenosine
Monophosphate), dẫn đến làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết ion Cl-. Hậu quả của quá
trình này là áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng, nước được kéo từ tế bào ra lòng
ruột gây tiêu chảy.
Độc tố ruột ST (Heat Stable Toxin) tác động lên ruột bằng sự hoạt hoá enzym
guanylate cyclase làm tăng GMP vòng (cGMP- Cyclic Guanosine Monophosphate).
GMP vòng gây rối loạn chuyển hoá nước và điện giải giống như AMP vòng. ST còn
làm mất hoặc làm teo một phần nhung mao của tế bào biểu mô ruột.
Enteroadherent E.coli (EAEC): Gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn
thương chức năng ruột, cơ chế chưa sáng tỏ. Những yếu tố độc lực chính của EAEC
được nói đến gồm các diềm bám đính kết tâp AAF (Aggregative Adhesion Fimbriae),
yếu tố điểu hoà bám dính kết tập aggR, prorein Pet và độc tố EAST-I
(EnteroaggregatIve Heat-Stable Toxin-1). Diềm bám dính kết tập được cho là yếu tố
quyết định độc lực. Ba loại AAF đã dược nói đến là AAF/I, AAF/H và AFF/III, trong
đó loại I và II có cấu trúc bó, loại III có dạng sợi riêng biệt. Các AAF tạo nên kiểu
 29

bám dính hình chồng gạch trên tế bào Hep-2. Yếu tố aggR có vai trò điều hoà sự biểu
hiện của các AAF. Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích tụ dịch và
gây độc cho biểu mô tiên hoá. EAST-1 có khả năng phá huỷ tế bào biểu mô. Ngoài
các yếu tố độc lực nêu trên EAEC còn tiết ra một protein có khả năng làm tan máu
và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng.
Enteroadherent E.coli (EAEC): Cơ chế cũng chưa hoàn toàn rõ, nhưng người
ta đã xác định được một loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động
giống với ngoại độc tố của Shiga. Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương
xuất huyết ở ruột. Độc tế Shiga huỷ hoại chọn lọc các vi nhung mao hấp thu của tế
bào biểu mô ruột. Nó cũng xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá
trình tổng hợp protein dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết,
gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột.
Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC): Cơ chế cũng chưa hoàn toàn rõ, nhưng
người ta đã xác định được một loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác
động giống với ngoại độc tố của Shiga. Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn
thương xuất huyết ở ruột. Độc tố Shiga huỷ hoại chọn lọc các vi nhung mao hấp thu
của tế bào biểu mô ruột. Nó cũng xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, ức
chế quá trình tổng hợp protein dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng
xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây
thủng ruột.
Enteropathogenic E. coli (EPEC): EPEC bám dính vào niêm mạc ruột gây ra
tổn thương đặc trưng là sự phá huỷ vi nhung mao ở riềm bàn chải của niêm mạc ruột.
Loại vị khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong viêm dạ dày ruột gây tiêu chảy ở trẻ
em.
2.4.2.4. Nguyên tắc điều trị, phòng bệnh và chẩn đoán
Chẩn đoán trực tiếp: Bệnh phẩm khác nhau tùy bệnh: là phân với nhiễm khuẩn
đường tiêu hóa, nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu, máu nếu là nhiễm khuẩn
máu. Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm
nước tiểu hoặc nước não soi tủy. Phương pháp chẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy
 30

phân lập. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh
vật hoá học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết
thanh mẫu. Để xác định các E. coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương
pháp khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào
nuôi, phương pháp đồng nhưng kết, ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay)…Kỹ thuật khuếch đại gen PCR cũng đã được áp dụng trong chẩn đoán E.
coli. Ở nước ta hiện nay chủ yếu mới sử dụng PCR trong định danh sau khi vi khuẩn
đã được phân lập thuần nhất. Các kỹ thuật PCR xác định E. coli trực tiếp từ bệnh
phẩm đang được nghiên cứu phát triển.
Phòng bệnh: hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu. Để phòng
nhiễm khuẩn đường tiêu hoá do E. coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung
không đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác. Thực hiện các biện
pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viện vì E. coli là một trong các vị khuẩn gây bệnh
cơ hội quan trọng. Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E. coli: thực hiện vệ
sinh vùng hậu môn và bộ phận sinh dục ngoài, thực hiện nghiêm túc nguyên tắc vô
trùng khi phải tiến hành thăm đò hoặc đặt thông đường tiết niệu. Điều trị loại trừ các
yếu tố nguy cơ khác.
Điều trị: E. coli thuộc vào các vì khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các
chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh để chọn kháng sinh
thích hợp. Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điểu
trị như bối phụ nước, điện giải trong trường hợp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai
trò quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rút
ống thông sớm nếu có thể được.
2.4.3. Tổng quan về Salmonella (Sal)
2.4.3.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Lịch sử:
Năm 1874 nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi
khuẩn là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn. Năm 1880 Karl Joseph Eberth và
Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người. Năm 1884, Georg
 31

Gaffky thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi trường nuôi cấy thuần khiết.
Năm 1889, nhóm nghiên cứu dưới quyền bác sĩ thú y Daniel Elmer Salmon tìm thấy
vi khuẩn gây ra bệnh "dịch tả cho heo" và tên vi khuẩn được đặt theo tên của ông.
Trước những năm 1940, Salmonella typhi và Salmonella paratyphi được coi là
nguyên nhân chủ yếu của các bệnh ở người. Từ những năm 1950, các bệnh phát sinh
từ thực phẩm do Salmonella đã được thừa nhận là nguyên nhân chủ yếu của mọi bệnh
phát sinh do thực phẩm do vi khuẩn và virut gây bệnh gây ra. Taưxe (1991) đã chỉ ra
rằng, sự tăng hiện tại của các bệnh do Salmonella gây ra (kể cả các bệnh
salmonellosis) phát sinh từ thực phẩm ở Mỹ.
Phân loại:
Bảng 2.6. Phân loại Salmonella
Giới Bacteria
Ngành Proteobacteria
Lớp Gammaproteobacteria
Bộ Enterobacteriales
Họ Enterobacteriaceae

Chi Salmonella

Loài Salmonella

Nguồn: (Lignieres, 1900)

2.4.3.2. Đặc điểm và sự sinh trưởng của Salmonella
Đặc điểm:
Các tế bào Salmonella là các trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí
không bắt buộc, di động.
 32

Hình 2.4. Tụ cầu khuẩn Salmonella

Chúng tạo thành khí khi di chuyến tới các môi trường chứa glucose. Chúng ưa
ấm, có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu nằm giữa 350C và 370C, có phạm vi sinh trưởng từ
50C đến 460C. Chúng bị chết bởi nhiệt độ và thời gian của khử trùng Pasteur, mẫn
cảm với pH thấp (4,5 hoặc thấp hơn) và không sinh sản ở Aw 0,94, đặc biệt khi kết
hợp với pH 5,5 hoặc thấp hơn.
Tế bào sống sót trong trạng thái đông lạnh và đông khô trong một thời gian dài.
Chúng có thể sinh sản trong nhiều loại thực phẩm mà không làm ảnh hưởng đến chất
lượng được chấp thuận.
2.4.3.3. Độc tố
Sau khi ăn phải các tế bào Salmonella, các tác nhân gây bệnh sẽ xâm nhập vào
màng nhày ruột non, sinh sản trong các tế bào biểu mô và tạo ra độc tố từ đó dẫn đến
sự phản ứng viêm và tích luỹ dịch trong ruột.
Khả năng của các tác nhân gây bệnh xâm nhập và phá huỷ tế bào dựa trên sự
sản xuất một yếu tố gây độc tế bào, bền nhiệt.
Một khi đã nằm bên trong các tế bào biểu mô, các tác nhân gây bệnh sẽ sinh sản
và tạo ra độc tố ruột không bền nhiệt, có liên quan trực tiếp đến sự tiết dịch và các
chất điện giải. Sự sản sinh độc tố ruột có liên quan trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng của
tác nhân gây bệnh.
2.4.3.4. Bệnh và triệu chứng
Salmonellosis ỏ người khác với bệnh sốt thương hàn và α thương hàn gây ra bỏi
Sal. ty phi và Sal. paratyphi. Mặc dù một số serovar của Salmonella cũng chống lại
 33

nhiều loài động vật và chim khác nhau, song tất cả đều được coi là tác nhân gây bệnh
tiểm tàng có khả năng gây bệnh Salmonellosis đối với người.
Đối với các bệnh Salmonellosis có nguồn gốc từ thực phẩm, thì nói chung một
người ăn khoảng 105 - 106 tế bào, nhưng đối với một số chủng độc, thì việc ăn một số
lượng tế bào ít hơn cũng có thể gây bệnh.
Các chủng mẫn cảm với độ axit của dạ dày nói chung cần nhiều tế bào hơn để
thiết lập trong ruột và gây bệnh. Ngược lại các chủng kháng axit có thể cần ít tế bào
hơn để gây ra bệnh. Sau khi ăn phải tác nhân gây bệnh, các triệu chứng xuất hiện trong
vòng 8 giờ đến 42 giờ, nói chung từ 24 giờ đến 36 giờ. Các triệu chứng kéo dài từ 2
ngày đến 3 ngày, nhưng một số người bệnh có thể kéo dài thời gian hơn. Một người
bệnh có thể nằm ỏ trạng thái mang bệnh vài tháng sau khi đã khỏi bệnh. Không phải
tất cả những ai ăn phải thực phẩm bị nhiễm đều xuất hiện các triệu chứng và những ai
xuất hiện các triệu chứng đều ở mức độ trầm trọng như nhau. Tính mẫn cảm thay đổi
tuỳ theo tình trạng sức khỏe và tính đề kháng tự nhiên của một cá thể. Các triệu chứng
chung là sôi bụng, tiêu chảy, buồn nôn, nôn mửa, ớn lạnh, sốt và kiệt sức. Bệnh có thể
gây chết, đặc biệt đối với người ốm, trẻ em và người có tuổi.
2.4.3.5. Cách phòng chống khi nhiễm Salmonella
Rửa sạch tay (với xà bông) sau khi đi vệ sinh, thay tã, chạm vào động vật và
trước khi ăn hoặc chế biến thức ăn.
Chỉ mua và sử dụng các sản phẩm chế biến (bơ, sữa, xúc xích, thịt nguội, pa-
tê…) của những nơi cung ứng đáng tin cậy, có điều kiện bảo quản tốt…
Hạn chế ăn trứng sống và chưa nấu chín, hạn chế hoặc tránh món ăn có chứa
trứng sống. Luộc chín kỹ các loại thịt, đặc biệt là thịt gà (tới khi thịt không còn đỏ
hoặc màu hồng).
Không dùng sữa chưa được tiệt trùng, hay các sản phẩm sữa chưa được tiệt trùng
khác. Không ăn những trái cây và rau quả đã cắt sẵn và không được bảo quản lạnh.
Các thực phẩm thô có nguồn gốc động vật được xử lý nhiệt trước khi ăn có thế
chứa Salmonella. Tuy nhiên, ở Mỹ (và các nước phát triển khác), như một nhu cầu
 34

thông thường, các sản phẩm được xử lý nhiệt và thực phẩm ăn ngay chứa Salmonella
trong các mẫu được thử nghiệm, sẽ bị coi là thực phẩm giả và không được phép bán.
Nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm đã bán ra các chương trình giám
sát Salmonella (và một sô tác nhân gây bệnh khác) tại nhà đế kiểm soát sự có mặt của
Salmonella trong các sản phẩm này.
Các cơ quan điều hành cũng có chương trình để giáo dục những người tiêu dùng
tại nhà và những người xử lý thực phẩm trong các dịch vụ ăn uống để khống chế sự
nhiễm khuẩn Salmonella trong thực phẩm. Các chương trình này bao gồm việc nấu chín
thực phẩm theo đúng quy cách (ít nhất là dùng nhiệt độ và thời gian khử trùng Pasteur,
710C trong 15 giây) và làm lạnh ngay (tới 3 - 40C hoặc làm đông lạnh, nếu không được
sử dụng trong vòng 2 giờ); ngăn ngừa sự nhiễm chéo thức ăn ăn ngay với thực phẩm thô
qua các dụng cụ như thớt, thiết bị, các đồ dụng cụ và bàn tay, vệ sinh cá nhân; ngưòi ốm
không được chế biến thực phẩm, tái xử lý nhiệt lặp lại một cách đúng quy cách các loại
thực phẩm đã được để phòng lạnh một thời gian dài.
 35

PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu
Lá Trầu không được thu hái tại nhà người dân ở Lưu Nhân Chú, Hương Sơn,
Thành phố Thái Nguyên.
Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella được
cung cấp bởi Phòng thí nghiệm vi sinh – Khoa CNSH-CNTP.
Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ:
Bảng 3.1. Danh mục thiết bị sử dụng
Thiết bị Xuất xứ Thiết bị Xuất xứ

Micropipet Mỹ Tủ ấm Trung Quốc

Máy đo pH Hanna Trung Quốc Tủ sấy Trung Quốc

Cân điện tử PA 214 OHAUS Tủ cấy vi sinh LV-
Mỹ Trung Quốc
CORPORATION VC 1200
Máy lắc Shaking
Nồi chiết tinh dầu Trung Quốc Trung Quốc
Incubator NB-205
Nồi hấp thanh trùng Paster Nhật Bản

Các dụng cụ khác: Cuvet thủy tinh, ống nghiệm, bình tam giác, đèn cồn, bình
định mức, các loại cốc đong, ống đong, micropipet, đĩa petri, que trang, que đầu tròn
và dụng cụ đục lỗ thạch.
Hóa chất:
Bảng 3.2. Danh mục hóa chất sử dụng
Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ
NaCl Trung Quốc Agar Trung Quốc
Cao thịt Trung Quốc Pepton Trung Quốc
BaCl2.2H2O Trung Quốc H2SO4 Trung Quốc
 36

3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian: Từ tháng 12/2019 đến tháng 06/2020.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ, thời gian và nồng độ
muối NaCl...) đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không.
Nội dung 2: Nghiên cứu các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá
Trầu không
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu
Lá cây Trầu (Piper betel. L.) được thu hái tại tại nhà người dân ở Lưu Nhân
Chú, Hương Sơn, Thành phố Thái Nguyên. Mẫu sau khi thu hái, chọn lấy những lá
to, dày, đẹp, sau được làm sạch bằng nước. Làm sạch xong đem bọc kín qua ba lớp
túi bóng (tránh hiện tượng làm dập nát lá Trầu và gây tổn thất tinh dầu). Sau đó đem
bảo quản ở tủ lạnh 80C - 120C để sử dụng trong các lần nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III
Lựa chọn lá Trầu không tươi, bánh tẻ, lá dày, lá Trầu không được thu hái vào
buổi sáng sớm hoặc chiều muộn, thí nghiệm được tiến hành sau khi thu hái lá trầu
không quá 24 giờ, lá trầu được sơ chế, làm sạch, để ráo nước, cắt nhỏ tạo điều kiện
cho dung môi thẩm thấu toàn bộ tế bào của lá trầu để thu được hàm lượng tinh dầu
một cách triệt để. Nguyên liệu được tách chiết theo phương pháp chưng cất lôi cuốn
hơi nước, kết hợp với việc sử dụng muối NaCl để hỗ trợ sự khuếch tán của tinh dầu
trong quá trình trưng cất. Hàm lượng tinh dầu (X%) thu được tính theo công thức
của Dược điển Việt Nam III khi tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn 1:
𝑎
𝑋% = × 100%
𝑏
Trong đó:
X: Hàm lương tinh dầu (%)
a: Thể tích tinh dầu đạt được sau khi chưng cất (ml)
b: Khối lượng mẫu đem phân tích – độ ẩm của mẫu (ml)
 37

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh
dầu từ lá Trầu không.
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng. Thí nghiệm sau kế thừa kết
quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.
a. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu. Được bố trí
gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần:
CT1: Nồng độ muối NaCl là 10%
CT2: Nồng độ muối NaCl là 15%
CT3: Nồng độ muối NaCl là 20%
CT4: Nồng độ muối NaCl là 25%
Các thông số khác được giữ cố định bao gồm: nhiệt độ chiết 1000C, thời gian
chiết 3 giờ, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu 2,5/1. Nồng độ NaCl thích hợp cho kết quả
hàm lượng tinh dầu và khả năng kháng khuẩn cao. Để đánh giá ảnh hưởng của nồng
dộ NaCl tới khả năng chưng cất thí nghiệm được bố trí như sau:
Lá trầu không

Trích ly ở các nồng độ NaCl (10%, 15%, 20%, 25%)

Dịch chiết

Phân tích
Kết quả của thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
 38

b. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Thí nghiệm được bố trí gồm 4 công thức được lặp lại 3 lần bao gồm:
CT1: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 2/1
CT2: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 2,5/1
CT3: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 3/1
CT4: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 3,5/1
Thí nghiệm được tiến hành ở nồng độ dung môi tốt nhất được lựa chọn từ thí
nghiệm 1, thời gian chiết 3h, nhiệt độ tách chiết: 1000C. kết thúc thí nghiệm ta xác
định được tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất cho thí nghiệm tiếp theo:
Lá trầu không

Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (2/1, 2,5/1, 3/1, 3,5/1)

Dịch chiết

Phân tích
Kết quả của thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
c. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết
Thời gian chiết cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu. Để đánh
giá ảnh hưởng của thời gian tới hiệu xuất thu hồi tinh dầu thí nghiệm được bố trí như
sau:
CT1: thời gian chiết là 2,5h
CT2: thời gian chiết là 3h
CT3: thời gian chiết là 3,5h
CT4: thời gian chiết là 4h
Thí nghiệm được tiến hành dựa trên kết quả của thí nghiệm 1, 2, nhiệt độ chiết
là 1000C.
 39

Lá trầu không

Trích ly ở các khoảng thời gian (2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ, 4 giờ)

Dịch chiết

Phân tích
Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn loại dung môi tốt nhất. Kết quả của
thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
d. Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không
Lá trầu được chưng cất ở khoảng nhiệt độ 100oC - 105oC trong thời gian 2,5: 3:
3,5; 4 (giờ). Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu lần lượt là: 2; 2,5; 3; 3,5 (v/w). Nồng độ
muối NaCl là: 10; 15; 20; 25 (%). Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng
tôi lựa chọn 03 yếu tố là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng tinh dầu, để
đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ
tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box – Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ.
Sau khi tiển hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố ký hiệu
là A, B, C là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng tinh dầu từ lá Trầu không
để đảnh giá ảnh hưởng của chúng, tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết
kế thí nghiệm của Box-Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ.
Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1

A Thời gian chưng cất h 2.5 3.5

B Nồng độ muối NaCl % 15 25

C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu l/kg 2/1 3/1

Lập ma trận thực nghiệm Box-Behnken: Gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố
với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất), và mức 0 (mức trung bình), trong
đó 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) bảng 3.4:
 40

Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu
từ lá Trầu không
Công Biến mã hóa
thức A. Thời gian B. Nồng độ NaCl C. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
1 2.5 15 2.5
2 3.5 15 2.5
3 2.5 25 2.5
4 3.5 25 2.5
5 2.5 20 2
6 3.5 20 2
7 2.5 20 3
8 3.5 20 3
9 3 15 2
10 3 25 2
11 3 15 3
12 3 25 3
13 3 20 2.5
14 3 20 2.5
15 3 20 2.5
16 3 20 2.5
17 3 20 2.5
Dựa vào kết quả của thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có hàm
lượng tinh dầu là cao nhất.
3.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của
tinh dầu lá Trầu không [9], [19], [27]
Phương pháp nhân giống vi khuẩn
Vi khuẩn được lấy từ ống gốc được đem đi hoạt hóa lại trong 5 ml môi trường
MP lỏng, nuôi cấy trên máy lắc trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 370C để đạt được mật
độ 108 (tế bào/ml). Khi đó độ đục của dịch nuôi cấy sẽ tương ứng với 0,5 McFarland
(Chuẩn bị độ đục chuẩn 0,5 McFarland bằng cách trộn: 0,5ml dung dịch BaCl2.2H2O
1% + 99,5ml dung dịch H2SO4 1%). Nếu dịch vi khuẩn có độ đục cao hơn độ đục
chuẩn có thể điều chỉnh bằng cách cho thêm nước muối sinh lý. Còn nếu đạt độ đục
tương ứng với độ đục tiêu chuẩn thì ta thu dịch vi khuẩn để tiến hành thử khả năng
kháng của dịch chiết.
 41

Phương pháp bảo quản giống

Sử dụng phương pháp bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: vi sinh
vật được hoạt hóa trong môi trường MP, sau đó được cấy chuyển sang môi trường
thạch nghiêng, nuôi 24 giờ ở 370C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp
theo. Cấy chuyển giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần một lần.
Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn
Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch. Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Khi mật
độ vi khuẩn đạt đến nồng độ 108 (tế bào/ml), lắc đều ống nghiệm chứa vi khuẩn, dùng
micropipet hút 100μl dịch vi khuẩn vào giữa đĩa thạch chứa môi trường MPA, dùng
que cấy tam giác trang đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên môi
trường thạch với đường kính 6 mm, đục 5 - 6 giếng, mỗi lỗ cách nhau 2 - 3 cm. Mỗi
giếng thạch nhỏ 10μl tinh dầu bằng Micropipet, sử dụng đối chứng là nước cất, để
các đĩa thạch trong tủ lạnh 30 phút để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy
vi khuẩn, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm ở 370C sau 24 giờ mang ra đo kích thước vòng
kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng
khuẩn (BK) bằng công thức:
BK = D - d (mm)
Trong đó:
+ D là đường kính vòng kháng khuẩn. (mm)
+ d là đường kính giếng thạch. (mm)
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Phần mềm SPSS 20
Phần mềm DX7
Phần mềm bố trí thí nghiệm
 42

PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu
từ lá Trầu không
4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu
Trong quá trình chưng cất, tinh dầu với nước tạo thành hệ nhũ tương, việc cho
muối vào hỗn hợp chưng cất giúp tránh mất mát tinh dầu dưới dạng nhũ và đồng thời
làm giảm độ tan của một số thành phần không phân cực có trong tinh dầu vào nước.
Muối cũng là chất điện ly làm tăng tỷ trọng, độ phân cực của nước giúp tinh dầu dễ
phân lớp [29]. Lượng tinh dầu thu được có thể giảm theo sự tăng nồng độ của muối
do khi môi trường bên ngoài có nồng độ chất tan cao hơn nồng độ chất tan bên trong
tế bào, nước từ tế bào sẽ đi ra ngoài, làm các lớp biểu bì bên ngoài chứa tinh dầu co
lại ngăn cản sự thoát tinh dầu ra ngoài [5]. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm
lượng tinh dầu được trình bày ở bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
đến hàm lượng tinh dầu
Nồng độ NaCl Hàm lượng tinh dầu
Công thức
(%) (%)
CT1 10 0,50d
CT2 15 0,75c
CT3 20 1,13a
CT4 25 0,90b
Ghi chú: các chữ số trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
mức α<0,05
Khi chiết ở các nồng độ NaCl khác nhau thì sẽ cho hàm lượng tinh dầu là khác
nhau. Từ kết quả của bảng 4.1 cho thấy hàm lượng tinh dầu tăng lên rồi giảm xuống khi
chiết ở nồng độ NaCl từ 10% - 25%. Hàm lượng tinh dầu tăng từ 0,50% đến 1,13% khi
chiết ở nồng độ NaCl từ 10% đến 20%. Hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất tại nồng độ
 43

muối NaCl 20% tương ứng với hàm lượng tinh dầu là 1,13% cao hơn khoảng 0,63% so
với hàm lượng tinh dầu chiết tại nồng độ muối NaCl 10% và cao hơn 0,38% so với hàm
lượng tinh dầu chiết tại nồng độ muối NaCl 15%. Do việc thêm muối NaCl vào quá trình
chưng cất nhằm mục đích tăng hiệu suất ly trích do NaCl hòa tan trong nước sẽ tạo thành
dung dịch điện ly dẫn đến làm tăng nhiệt độ sôi của nước, do đó tinh dầu trích ly được
nhiều hơn [29]. Còn nếu ta tăng nồng độ muối NaCl lên đến 25% thì hàm lượng tinh dầu
lại có xu hướng giảm còn 0,90%. Do khi chưng cất với nồng độ NaCl lớn hơn, lượng
tinh dầu thu được sẽ giảm, điều này có thể giải thích là do khi sử dụng muối ở nồng độ
cao thì các lớp biểu bì bên ngoài chứa tinh dầu bị co lại, ngăn cản sự khuếch tán tinh dầu
ra ngoài. Vì vậy, nồng độ muối NaCl thích hợp nhất để thực hiện quá trình tách chiết
tinh dầu từ lá Trầu không là 20%.
4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng tinh dầu thu được.
Trong quá trình trích ly bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, khi gia nhiệt hỗn hợp
nguyên liệu và nước, hơi nước thẩm thấu vào trong các lớp tế bào, làm phá vỡ túi tinh
dầu và lôi cuốn tinh dầu theo hơi nước. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan
các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu, làm tinh dầu không thoát ra
được. Sử dụng càng nhiều dung môi để trích ly thì khả năng khuếch tán của tinh dầu
vào dung môi càng lớn [2]. Dung môi dễ dàng thẩm thấu vào nguyên liệu và hòa tan
các cấu tử cần trích ly nên lượng tinh dầu trong dung môi càng cao [11]. Tuy nhiên,
ở một giới hạn nhất định lượng tinh dầu thu hồi sẽ tăng lên không đáng kể dù tăng
lượng dung môi hoặc có thể giảm do lượng nước nhiều gây tổn thất tinh dầu do chưng
cất quá lâu [5]. Bên cạnh đó nếu dùng lượng dung môi lớn sẽ gây lãng phí, thời gian
chưng cất lâu ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu thu được, tốn kém dung môi, tốn
thời gian và chi phí cao. Cho nên, thí nghiệm này tiến hành để khảo sát sự ảnh hưởng
của thể tích nước cất thêm vào đến hàm lượng tinh dầu trích ly từ lá Trầu tươi bằng
cách tiến hành chưng cất tinh dầu lần lượt với những thể tích nước khác nhau, cố định
nồng độ dung dịch NaCl. Mục đích nhằm xác định thể tích nước tối ưu cho quá trình
chưng cất, tránh sử dụng lượng nước quá dư, không có lợi cho việc chiết tách tinh
 44

dầu do trong tinh dầu chứa nhiều hợp chất dễ tan trong nước. Kết quả được thể hiện
ở Bảng 4.2:
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến
hàm lượng tinh dầu
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu Hàm lượng tinh dầu
Công thức
(l/kg) (%)
CT1 2/1 0,51c

CT2 2,5/1 0,95a

CT3 3/1 1,05a

CT4 3,5/1 0,73b

Ghi chú: các chữ số trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
mức α<0,05
Kết quả của một thí nghiệm cho thấy hàm lượng tinh dầu tăng khi thể tích nước
cất cho vào bình cầu tăng, hàm lượng tinh dầu đạt 0,63% khi lượng nước thêm vào là
500 (ml), với lượng nguyên liệu là 150 (g) và nồng độ muối NaCl là 15% [5]. Từ
bảng 4.2 của thí nghiệm chúng tôi cho thấy: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng
tới hàm lượng tinh dầu. Khi tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu từ 2/1 đến 3/1 cho thấy hàm
lượng tinh dầu lá Trầu không được chiết tách tăng từ 0,51% - 1,05%, còn tỷ lệ dung
môi/ nguyên liệu từ 3/1 đến 3,5/1 thì hàm lượng tinh dầu lá Trầu không có xu hướng
giảm từ 1,05% xuống 0,73%, giảm khoảng 0,32%. Hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất
là 1,05% khi chiết ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 3/1, cao hơn khoảng 0,54% so với
hàm lượng tinh dầu khi chiết ở tỷ lệ dung môi/ nguyên lệu là 2/1 và cao hơn không
đáng kể so với ở công thức 2 là 2,5/1. Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ dung môi/ nguyên
liệu thích hợp là 2,5/1 để tiết kiệm dung môi và không làm tổn thất tinh dầu.
 45

4.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu
Thời gian trích ly phụ thuộc vào các yếu tố: nguyên liệu, tỷ lệ dung môi/ nguyên
liệu, nhiệt độ… thời gian trích ly càng dài thì càng thu được nhiều tinh dầu. Tuy
nhiên, khi kéo dài thời gian trích ly đến một giới hạn nhất định thì lượng tinh dầu thu
hồi không tăng nữa mà còn giảm đi, đồng thời có thể ảnh hưởng đến chất lượng tinh
dầu do một số chất trong tinh dầu có thể bị biến tính do tiếp xúc quá lâu với nhiệt độ
[5]. Đồng thời việc kéo dài thời gian trích ly làm tiêu hao càng nhiều năng lượng cho
quá trình chưng cất, tốn kém chi phí thí nghiệm. Do vậy, cần xác định thời gian trích
ly phù hợp tránh bị thất thoát tinh dầu, em khảo sát thời gian từ 2,5 giờ đến 4 giờ:
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết dến hàm lượng
tinh dầu
Thời gian Hàm lượng tinh dầu
Công thức
(h) (%)
CT1 2,5 0,55c
CT2 3 0.90a
CT3 3,5 0,70b
CT4 4 0,40d
Ghi chú: các chữ số trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
mức α<0,05
Từ kết quả bảng 4.3 cho thấy thời gian chưng cất là yếu tố ảnh hưởng tới hàm
lượng tinh dầu thu được sau quá trình chiết. Nếu càng kéo dài thời gian chưng cất thì
hàm lượng tinh dầu càng giảm do bị thất thoát trong quá trình chưng cất. Khi chiết ở
2,5 giờ cho hàm lượng tinh dầu là 0,55%, Khi tăng thời gian chiết lên đến 3 giờ, hàm
lượng tinh dầu tăng đến 0,90%. Tăng lên 0,35% so với khi chiết ở 2,5 giờ. Tiếp tục
tăng thời gian chiết lên đến 3,5 giờ thì hàm lượng tinh dầu có xu hướng giảm còn
0,70%, giảm mất 0,2% so với khi chiết ở 3 giờ. Còn chiết ở 4 giờ hàm lượng tinh dầu
giảm còn 0,40%. Do đó, chiết bằng công thức 2 (chiết trong 3 giờ) cho hàm lượng tinh
dầu cao nhất là 0,90% cao hơn khoảng 0,35% so với công thức 1 và 0,50% so với công
thức 4, đồng thời cao hơn 0,2% so với công thức 3. Kết quả nghiên cứu phù hợp với
những nghiên cứu tương tự, thời gian nghiên cứu của nhóm nghiên cứu cũng chiết
 46

trong 3 giờ để có được hàm lượng tinh dầu cao nhất là 0,875% [14]. Vì vậy, để tiết
kiệm thời gian chưng cất và thời gian trích ly tinh dầu tối ưu được chọn là 3 giờ.
4.1.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không
Sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box-Behnken
với ba biến ba cấp độ. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực
nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng tinh dầu:
Y = + 1,42 + 0,16*A + 0,076*B + 0,12*C - 0,062*A*B + 0,015*A*C -
0,035*B*C - 0,42*A2 - 0,36*B2 - 0,32*C2
Trong đó Y là hàm lượng tinh dầu trong dịch chiết dự báo thu được.
Bảng 4.4. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố
chiết tinh dầu từ lá Trầu không
Biến thực
Hàm lượng
Thí nghiệm A B C tinh dầu
(Thời gian (Tỷ lệ dung môi/ (Nồng độ (%)
chưng cất) nguyên liệu) NaCl)
1 2.5 2/1 20 0,35
2 3.5 2/1 20 0,75
3 2.5 3/1 20 0,65
4 3.5 3/1 20 0,80
5 2.5 2,5/1 15 0,55
6 3.5 2,5/1 15 0,60
7 2.5 2.5/1 25 0,45
8 3.5 2.5/1 25 1,10
9 3 2/1 15 0,50
10 3 3/1 15 0,70
11 3 2/1 25 0.85
12 3 3/1 25 0.91
13 3 2,5/1 20 1,40
14 3 2,5/1 20 1,45
15 3 2,5/1 20 1,45
16 3 2,5/1 20 1,38
17 3 2,5/1 20 1,40
 47

Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích
ANOVA được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 4.5. Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết tinh dầu
từ lá Trầu không
Sum of Mean
Nguồn DF Chuẩn F Giá trị P
Squares Squares
Model 2,38 9 0,26 166,05 < 0,0001
A 0,20 1 0,20 122,67 < 0,0001
B 0,047 1 0,047 29,21 0,0010
C 0,12 1 0,12 72,36 < 0,0001
AB 0,016 1 0,016 9,81 0,0165
AC 0,090 1 0,090 56,53 0,0001
BC 4,900E-003 1 4,900E-003 3,08 0.1228
A2 0,75 1 0,75 470,40 < 0,0001
B2 0,54 1 0,54 336,58 < 0,0001
C2 0,43 1 0,43 269,54 < 0,0001
Residual 0,011 7 1,592E-003

Lack of Fit 7,025E-003 3 2,342E-003 2,27 0,2221

Sai số
4,120E-003 4 1,030E-003
(Pure Error)

SS tổng số 2,39 16

SS: Tổng phương sai; DF: Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; chuẩn F: Chuẩn
Fisher; Residual: Phần dư; Lack of Fit: Chuẩn đánh giá độ không tương thích của
mô hình với thực nghiệm.
Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác xuất của mô hình P - value =
0,0001 < 0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả cảu thí nghiệm,
Lack of Fit test = 0,2221 (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình.
 48

Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu lá Trầu không
a. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu và thời gian chưng cất
b. Mô hình tương tác giữa thời gian chưng cất và nồng độ NaCl
c. Mô hình tương tác giữa nồng độ NaCl và tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Phương án tốt nhất được dự đoán nồng độ muối NaCl 21,12 (%), tỷ lệ dung
môi/ nguyên liệu là 2,55/1 (v/w), thời gian chưng cất 3,10 (giờ) khi đó hàm lượng
tinh dầu đạt 1,45 (%). Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho kết quả tương ứng.

Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu của hàm lượng tinh dầu lá
Trầu không
4.2. Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
Muốn biết hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không: Chúng tôi đã sử
dụng NaCl để chiết tách các thành phần từ lá của cây Trầu không. Hoạt tính kháng
khuẩn của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch bằng
cách đo đường kính của vùng ức chế tăng trưởng (mm) của tinh dầu trên đĩa thạch.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tinh dầu lá Trầu không ảnh hưởng đến khả
năng kháng khuẩn được thể hiện trong bảng 4.6 và hình 4.4:
 49

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tinh dầu đến khả năng kháng khuẩn
Loại vi khuẩn Kích thước vòng kháng khuẩn (mm)
1. Staphylococcus 13,5 – 15 mm
2. Salmonella 12 – 14 mm
3. Escherichia coli 11 – 12,5 mm

Kết quả cho thấy khi chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không bằng NaCl có hoạt tính
kháng khuẩn chống lại cả 3 loại vi khuẩn thử nghiệm: vi khuẩn gram dương
(Staphylococcus aureus) và vi khuẩn gram âm (Escherichia coli và Salmonella). Qua
bảng trên ta thấy được tinh dầu lá Trầu không ức chế vi khuẩn Gram dương tốt hơn so
với vi khuẩn Gram âm. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu tượng tự như: tinh
dầu lá Trầu không kháng khuẩn tốt đối với cả 2 chủng vi khuẩn gram dương và gram
âm [24]. Còn đối với nghiên cứu của nhóm tác giả Huỳnh Kỳ Trân cho ta thấy tinh dầu
lá Trầu không mà có thành phần phenolic lớn nhất, thì khả năng ức chế vi khuẩn
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibiro Parahaemolyticus), nấm mốc
(Candida albicans) là mạnh nhất. Đặc biệt là mẫu tinh dầu với thành phần phenolic
trên 90% ức chế mạnh Pseudomonas aeruginosa tương đối khó trị nhất và trung hòa
Enterovirus [14]. Kết quả của thí nghiệm cho thấy:
Đối với Staphylococcus: vùng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với
Staphylococcus là nhạy nhất trong khoảng 13.5 - 15 (mm). Hơn khoảng 2 - 2,5 (mm)
so với Escherichia coli và hơn khoảng 1 - 1,5 (mm) so với Salmonella.
Đối với Salmonella: vùng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với
Salmonella trong khoảng 12 – 14 (mm). Hơn khoảng 1 - 1,5 (mm) so với Escherichia
coli.
Đối với Escherichia coli: vùng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với
Escherichia coli là kém nhất trong khoảng 11 - 12,5 (mm).
Từ nghiên cứu này, người ta thấy rằng tinh dầu lá Trầu không đã ức chế thành
công sự phát triển của cả hai nhóm chủng vi khuẩn. Nhưng kháng khuẩn tốt nhất là
Staphylococcus (13,5 - 15 mm) còn đối với Escherichia coli thì kháng khuẩn kém
 50

nhất (11 - 12,5 mm). Lá Trầu không đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước
nghiên cứu và công bố rằng: Lá trầu không có nhiều hợp chất phenolic (chavicol,
hydroxyl chavicol), dầu dễ bay hơi (safrole, eugenol, isoeugenol, eugenol methyl
ester), axit béo… có tính chất kháng khuẩn [24]. Vì vậy, tinh dầu lá Trầu không không
chỉ đem lại cho con người rất nhiều lợi ích và đem chúng còn đem lại giá trị kinh tế
cho người dân.

1. Staphylococcus

2. Escheria coli

3. Salmonella
Hình 4.3. Kích thước vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm
 51

PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận
Việc thay đổi dung môi chiết và điều kiện chiết có ảnh hưởng đến khả năng thu
hồi tinh dầu lá Trầu không. Dung môi chiết tốt trong thí nghiệm này là NaCl với tỷ
lệ 20%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 2,5/1, thời gian chiết là 3 giờ cho ta đạt được
hàm lượng tinh dầu cao.
Phương án tốt nhất khi tối ưu hóa các điều kiện chiết tách: nồng độ muối NaCl
21,12 (%), tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 2,55/1 (v/w), thời gian chưng cất 3,10 (giờ),
khi đó hàm lượng tinh dầu đạt cao nhất 1,45 (%).
Tinh dầu lá trầu không có khả năng kháng các chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Staphylococcus, Escherichia coli, Salmonella. Qua thí nghiệm ta thấy được tinh dầu
lá Trầu không ức chế vi khuẩn gram dương tốt hơn so với vi khuẩn gram âm. Tinh
dầu kháng khuẩn tốt nhất là Staphylococcus (13,5 - 15 mm) còn đối với Escherichia
coli thì kháng khuẩn kém nhất (11 - 12,5 mm).
5.2. Kiến nghị
Trong thời gian làm đề tài khoa học cấp trường này, những kết quả thu được chỉ
là những kết quả của bước đầu. Nếu có thời gian, em xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu
sâu hơn về ảnh hưởng của các điều kiện chiết và dung môi chiết ảnh hưởng đến hàm
lượng tinh dầu lá Trầu không thu được và đánh giá hoạt tính sinh học của tinh dầu lá
Trầu không. Chẳng hạn như:
Nghiên cứu ảnh hưởng của một số dung môi hoặc hỗn hợp một số dung môi
khác đến hàm lượng tinh dầu thu được.
Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện chiết khác nhau như: chiết lò vi sóng,
chiết ngấm kiệt, chiết lạnh, chiết CO2 siêu tới hạn…
Thử nghiệm hoạt tính sinh học của tinh dầu lá Trầu không trên các chủng vi
sinh khác như: Steptococus, Bacillus cereus, nấm men Cadida albican, nấm mốc
Aspergillus niger…
Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá Trầu không.
 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng Việt
1. PGS. TS. Kiều Hữu Ảnh (2012), Vi sinh vật học thực phẩm, Nxb Giáo dục.
2. Nguyễn Bin (2005), Các quá trình thiết bị trong công nghệ hóa chất và thực
phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. Võ Văn Chi (2004), “Từ điển thực vật thông dụng- tập 2”, Nxb Khoa học kỹ thuật,
1386-1387.
4. Võ Văn Chi (2007), Cây rau làm thuốc, Nxb Tổng hợp Đồng Tháp.
5. Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm, Phạm Khánh Ngọc, Đỗ Duy Phúc,
Dương Tùng Kha và Nguyễn Thị Thu Thủy (2016), “Khảo sát thành phần hóa
học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không (Piper betel L.)”,
Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 45(2016), 28-32.
6. GS.TS Lê Huy Chính (2001), Vi sinh vật y học, Nxb Y học.
7. Phạm Thế Chính, Dương Nghĩa Bang, Phan Thanh Phương, Khiếu Thị Tâm, Phạm
Thị Thắm, Lê Thị Xuân, Bùi Thị Thúy (2010), “Thành phần hóa học của tinh
dầu lá trầu (Piper Betle L.) trồng tại Hải Dương”, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ Đại học Thái Nguyên, 72(10), 48-52.
8. Nguyễn Nho Dũng (2011), Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học
tinh dầu và dịch chiết từ lá trầu không, Đại học Đà Nẵng.
9. Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013), “Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn invitro của
dịch chiết tỏi (Allium Sativum L.) đối với E. coli gây bệnh và E. coli kháng
Ampicillin, Kanamycin”, Tạp chí khoa học và phát triển,11(6), 804-808.
10. GS.TS Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.
11. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Quốc Đạt, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Trần Thị Thu Trà (2011),
Công nghệ chế biến thực phẩm, Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
12. Phạm Thị Thắm, Lại Thị Hải Yến, Triệu Thị Hường, Nguyễn Thị Thanh, Hoàng
Thị Thanh Phạm Thế Chính (2010), “Phân lập các hợp chất trong cây Trầu
không (Piper Betle L.)”, Tạp chí Khoa học Và Công nghệ Đại học Thái
Nguyên, 112(12), 27-31.
 53

13. Trần Linh Thước (2009), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo dục.
14. Huỳnh Kỳ Trân, Trần Nguyễn Ngọc Châu, Hà Mỹ Thuận, Nguyễn Khoa Nam,
Đỗ Việt Hà (2015), “Tinh dầu lá trầu Piper Betle L. và hoạt tính sinh học”, Tạp
chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 20(3), 80-90.
15. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, 3, 350.
16. Viện Dược Liệu- Bộ Y Tế (2008), Kỹ Thuật Chiết Xuất Dược Liệu, Nhà Xuất
Bản Khoa Học Và Kỹ Thuật.
17. Vụ Khoa Học Và Đào Tạo- Bộ Y Tế (2006), Dược Học Cổ Truyền, Nhà Xuất
Bản Y Học.
18. Y học tạp chí số 4, tháng 11 năm 2011.
II. Tiếng Anh
19. Ababutain I. M (2011), “Antimicrobial activity of ethanolic extracts from some
medicinal plant”, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(11),
678-683.
20. Amonkar A. J., Nagabhushan M., D’Souza A. V., Bhide S. V (1986),
“Hydroxychavicol: a new phenolic antimutagen from betel leaf.”, Food Chem
Toxicol 24.
21. Anonymous (1969), “The Wealth of India, A Dictionary of Indian Raw Materials
and Industrial Products”, Vol III, Publication and Information Directorate
CSIR: New Delhi.
22. Arambewala LS, Arawwawala LD, Ratansooriya WD (2005), “Antinocepative
activities of aqueous and ethanol extract of Piper Betle leaves in rats”, Journal
of ethanopharmacology, 102(2), 239- 245.
23. Astuti E. J., Basuki S A., Sabrian A., and Fajriyah F (2017), “Steam and Water
Distillation of Piper Betle L., Ocimum Basilicum, Cymbopogon Winterianus,
and Citrus Hystrix Leaves for Activity of Insect Repellent against Mosquito”,
Health Science International Conference, Advances in Health Sciences
Research (AHSR), 2.
 PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu

Lá Trầu không Quá trình

chưng cất tinh dầu lá Trầu không

Tinh dầu lá Trầu không

 Phụ lục 2: Xử lý số liệu
1. Xử lý kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết tinh
dầu
1.1. Xử lý kết quả kháo sát của nồng độ NaCl ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu

ANOVA
hamluongtinhdau

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .629 3 .210 39.399 .000

Within Groups .043 8 .005
Total .672 11

Hamluongtinhdau
Duncan

nongdomuoiNaCl N Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

10 3 .5000
15 3 .7500
25 3 .9000
20 3 1.1300
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.2. Xử lý kết quả khảo sát của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm
lượng tinh dầu

ANOVA
hamluongtinhdau

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .521 3 .174 48.559 .000

Within Groups .029 8 .004
Total .549 11
 Hamluongtinhdau
Duncan

tyledungmoitrennguyenlieu N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

2.0 3 .5100
3.5 3 .7300
2.5 3 .9500
3.0 3 1.0500
Sig. 1.000 1.000 .075

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

1.3. Xử lý kết quả khảo sát của thời gian chiết ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu

ANOVA
hamluongtinhdau

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups .411 3 .137 130.357 .000

Within Groups .008 8 .001
Total .419 11

Hamluongtinhdau
Duncan

thoigianchiet N Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

4.0 3 .4000
2.5 3 .5500
3.5 3 .7000
3.0 3 .9000
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
1.4. Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không