TCT 2010 135902

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG
NGUYÊN CỨU HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN

TỪ VỎ DỨA
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08
Cần thơ, 5/2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGUYÊN CỨU HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN

TỪ VỎ DỨA
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 08
Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Ts. Nguyễn Công Hà Nguyễn Thị Hồng Nhung
MSSV: 2060339
Lớp: CB0608A2
Cần thơ, 5/2010

Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010 Trường Đại Học Cần Thơ
Luận văn đính kèm theo đây, với đề tựa là “NGUYÊN CỨU HOẠT TÍNH ENZYME
BROMELAIN TỪ VỎ DỨA”, do “NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG” thực hiện và
báo cáo, đã được Hội đồng chấm luận văn thông qua.
Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện 1
TS. NGUYỄN CÔNG HÀ Bùi Thị Quỳnh Hoa
Giáo viên phản biện 2
Nguyễn Bảo Lộc
Cần Thơ, ngày 28 tháng 05 năm 2010
Chủ Tịch Hội Đồng
Nguyễn Công Hà
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
luận văn nào trước đây.
Tác giả luận văn
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iii
LỜI CẢM TẠ
Để đạt được kết quả học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp như ngày hôm nay, em
xin được phép gởi lòng biết ơn chân thành của mình đến:
Ba mẹ tôn kính, người đã nuôi nấng, dạy dỗ, động viên ủng hộ và tạo điều kiện tốt
nhất cho con trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống.
Toàn thể quí Thầy Cô trường Đại Học Cần Thơ và đặc biệt là quý Thầy Cô trong Bộ
môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tình
giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho
em trong quá trình thực hiện đề tài cho chúng em trong suốt thời gian học tập.
Thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi và đã nhiệt tình
truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong
quá trình thực hiện đề tài nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn cô cố vấn Tống Thị Ánh Ngọc và tập thể các bạn lớp Công Nghệ
Thực Phẩm khóa 32 đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khóa học vừa qua.
Xin chân thành cảm ơn!
Cần thơ, ngày 17 tháng 5 năm 2010

Sinh viên thực hiện
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iv
TÓM TẮT
Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, vỏ dứa là một trong những phế
phẩm được dùng làm phân bón, thức ăn chăn nuôi. Sau chế biến nguồn vỏ dứa bỏ
ra rất nhiều. Đặc biệt hơn trong vỏ dứa có hệ enzyme dồi dào đáng quan tâm là hệ
enzyme protease-bromelain. Đề tại này được đặt ra với mục đích là lấy nguồn
nguyên liệu vỏ dứa dồi dào có sẵn để sản xuất enzyme bromelain. Sau đó
ứng dụng vào thực tiễn với quy trình rút ngắn thời gian sản xuất mắm cá
lóc phile. Điều đầu tiên là phải nghiên cứu hoạt tính enzyme bromelain
có trong vỏ dứa. Nhưng dứa có nhiều loại và độ chín khác nhau do đó
phải tìm độ chín phù hợp cho quá trình nghiên cứu và sản xuất. Khảo
sát quy luật hoạt động của hệ enzyme bromelain vỏ từ dịch chiết vỏ dứa ở các
điều kiện xử lý pH = 3-9 và nhiệt độ từ 30-800C. Khảo sát động học của enzyme
bromelain, tìm Vmax và Km. Khảo sát ảnh hưởng của muối NaCl lên hoạt tính enzyme
bromelain vỏ.
Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ vỏ dứa được sử dụng cho nghiên
cứu enzyme bromelain tốt nhất là vỏ có độ chín 0% (trái xanh hoàn toàn)
nhưng vì lợi nhuận kinh tế nên chọn trái có độ chín 25-50%.
Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme
bromelain vỏ trong dịch chiết. Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích
trong khoảng nhiệt độ từ 40 – 500C ở môi trường pH 6-7.
Động học của enzyme bromelain có V max = 5,46  mol/ phút và Km = 0,33%
Hoạt tính enzyme bromelain bị giảm bởi muối NaCl.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iv
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... iv
TÓM TẮT ................................................................................................................. iv
MỤC LỤC ..................................................................................................................v
D A N H S Á C H H Ì N H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. viii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU .........................................................................................1
1.1 Tổng quan .................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................2
2.1 Giới thiệu về cây dứa ................................................................................2
2.2 Giới thiệu về enzyme trong cây dứa ..........................................................3
2. 2. 1 Hệ enzyme trong cây dứa ......................................................................... 3
2. 2. 2 Đ ặ c đ iể m e n z y m b r o m e la in . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2. 2. 3 Tính chất của bromelain ........................................................................... 5
2. 2. 4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym bromelain ....................... 7
2.3 Động học phản ứng enzyme ......................................................................9
2. 3. 1 Cơ chế tác động của enzyme .................................................................... 9
2. 3. 2 Phương trình động học Michalelis Menten ............................................. 10
2. 3. 3 Phương trình Line Weaver...................................................................... 12
2. 3. 4 Phương trình Eadie-Hofstee ................................................................... 12
2.4 Giới thiệu về cơ chất casein ....................................................................13
2.5 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serum Albumin (BSA)..............................14
2.6 Một số ứng dụng của enzyme bromelain .................................................15
2. 6. 1 T r o n g c ô n g n g h ệ th ự c p h ẩ m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5
2. 6. 2 T rong y học . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2. 6. 3 Trong một số lĩnh vực khác .................................................................... 16
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 17
3.1 Phương tiện nghiên cứu ..........................................................................17
3 . 1. 1 Đ ị a đ i ể m , t h ờ i g i a n n g h i ê n c ứ u . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3. 1. 2 Nguyên liệu ............................................................................................ 17
3. 1. 3 H ó a c h ấ t th í n g h iệ m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7
3.1.4 T h iế t b ị th í n g h iệ m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 7
3.2 Phương pháp thí nghiệm .........................................................................18
3. 2. 1 Phương pháp trích ly enzyme thô từ vỏ khóm ......................................... 18
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng v
3. 2. 2 P h ư ơ n g p h á p x á c đ ị n h h o ạ t t ín h c ủ a e n z y m e b r o m e l a i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 8
3. 2. 3 X ác đ ịn h h à m l ư ợn g p r ot ei n củ a e nz y m e br o m e l ai n bằ n g C oo m as s i e
Brillant Blue – G250 (phương pháp Bradford) .......................................................... 18
3.3 Bố trí thí nghiệm .....................................................................................19
3. 3. 1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính của enzyme ở các độ chín khác nhau .. 19
3. 3. 2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính
xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain ................................................. 19
3. 3. 3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme
bromelain 20
3. 3. 4 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính enzyme bromealin khi có bổ sung muối
NaCl ở nhiệt độ thường và nhiệt độ tối ưu của enzym bromelin ................................ 21
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN THẢO LUẬN ................................................................. 22
4.1 Ảnh hưởng độ chín dứa đến hoạt tính enzyme bromelain .......................22
4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain .25
4.3 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzym bromelain....................28
4.4 Hoạt tính enzyme bromelain khi có bổ sung muối NaCl .........................30
CH Ư Ơ N G 5 K Ế T LU Ậ N V À Đ Ề N G H Ị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
5.1 Kết luận ..................................................................................................34
5.2 Đề nghị ...................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 35
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ........................................................... vii
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỒNG KÊ ...................................................................... xii
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vi
DANH SÁCH HÌNH
H ìn h 1 : D ứ a Q u e e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Hình 2: Dứa Cayenne ..................................................................................................2
H ìn h 3 : R u ộ n g d ứ a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Hình 4 : Quả dứa (Ananas Comosus) ..........................................................................4
Hình 5 : Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain .................................6
Hình 6: Hình minh họa tác động của pH môi trường lên hoạt tình enzyme ..................8
Hình 7: Đồ thị biểu diễn ph ương trình Michalaelis -Menten .................................... 11
Hình 8: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver .................................................. 12
Hình 9 : Đồ thị biểu diễn ph ương trình Eadie-Hofstee ............................................ 13
Hình 10: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain vỏ (thô) .................................. 18
H ìn h 1 1 : D ứ a ở c á c đ ộ c h ín từ 0 - 1 0 0 % . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2
Hình 12: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme bromelain theo độ chín........ 23
Hình 13: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng protein enzyme bromelain theo độ
c h ín . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4
Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain ở các
p H k h á c n h a u k h i tư ơ n g tá c v ớ i c á c n h iệ t đ ộ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6
H ìn h 1 5 : Đ ồ th ị b i ể u d i ễ n h o ạ t tí n h e n z y m e t h a y đ ổ i t h e o c á c n h i ệ t đ ộ k h á c n h a u k h i
tư ơ n g tá c v ớ i c á c p H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6
Hình 16: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt
tính của enzyme bromelain trong dịch vỏ dứa .......................................................... 27
Hình 17: Ảnh hưởng nồng độ casein lên hoạt tính enzyme bromelain theo Michaelis-
M e n te n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0
Hình 18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain còn lại (%) khi có bổ sung
muối NaCl ở nhiệt độ khác nhau ............................................................................... 32
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein....................................................... 14

Bảng 2: Thành phần acid amin trong phân tử BSA .................................................... 15
Bảng 3: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain theo độ chín .......................... 23
Bảng 4: Kết quả khảo sát hàm lượng protein của enzyme bromelain theo độ chín .... 23
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo pH với từng nhiệt độ ....... 25
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo nồng độ casein ................ 29
Bảng 7: Sự thay đổi hoạt tính enzyme bromelain khi có bổ sung muối NaCl ở nhiệt độ
thường (30oC) ........................................................................................................... 31
tối ưu của enzyme bromelain (50oC) ......................................................................... 31
Bảng 9: Hoạt tính enzyme bromelain còn lại (%) khi có bổ sung muối NaCl ở nhiệt độ
thường (30oC) ........................................................................................................... 32
Bảng 10: Hoạt tính enzyme bromelain còn lại khi có bổ sung muối NaCl ở nhiệt độ tối
ưu của enzyme bromelain (500C) .............................................................................. 32
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng viii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1. 1 T ổn g qu an
Giới khoa học Châu Âu đã đưa ra một khuyến cáo rằng “Với một quả dứa mỗi ngày,
bạn sẽ không cần gặp bác sĩ” (Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên đã được thực
tiễn khoa học xác minh là phù hợp với dược tính đặc biệt của quả dứa. Dứa là cây ăn
quả nhiệt đới, là một trong 3 loại trái cây ăn quả hàng đầu của nước ta. Dứa được
trồng ở nhiều vùng trong cả nước. Ở đồng bằng sông Cửu Long, trên đất phèn dứa là
cây tiên phong, sau đó có thể trồng các loại hoa màu khác như mía, rau đậu,… Quả
dứa được dùng để ăn tươi, làm rượu, làm giấm, làm nước ép, nước cô đặc, làm bột
dứa cho nước giải khát và đặc biệt là chế biến xuất nhập khẩu.
Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài Ananas có khả năng dược lý cao là do
trong thành phần của quả có hệ enzyme bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa.
Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những
cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae.
Dứa là loài thực vật rất đặc biệt, vừa là một loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và rất
được ưa chuộng, vừa là nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị thương
phẩm cao. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra quy trình thu nhận
enzyme bromelin từ các phần khác nhau của cây dứa đặc biệt là từ phế liệu của các
nhà máy dứa đóng hộp. Với vai trò không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả
dứa cũng cần được quan tâm đúng mức. Enzyme bromelain dùng trong thực phẩm y
học, chế biến thực phẩm và một số lĩnh vực khác. Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi
về hoạt tính của enzyme bromelain dứa, cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc
tác. Do đó, phải tìm hiểu về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain
và động học phản ứng của enzyme.
Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain vỏ” cũng chịu
ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được
quan tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm. Từ vấn đề đặt ra trên,
việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của
hệ enzyme bromelain trong vỏ dứa là cần thiết. Bên cạnh đó nghiên cứu động học
enzyme và chất ức chế cũng không kém phần quan trọng. Tạo tiền đề và cơ sở cho
việc nghiên cứu và ứng dụng về hệ enzyme này.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Tìm ra độ chín quả dứa thích hợp cho việc tinh chế enzyme bromelain từ vỏ dứa.
Xác định được nhiệt độ, pH tối ưu và thông số K m, V max của enzyme bromelain
trong chế phẩm dịch vỏ dứa. Nghiên cứu ảnh hưởng của muối NaCl đến hoạt tính
enzyme bromelain.
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây dứa
Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Dứa đã trở thành một
trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả họ citrus.
Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ
Nam Mỹ. Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusa được
sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme và ngoài ra
còn được sử dụng trong một số lĩnh vực như y dược, mỹ phẩm… Phần thân và lá sau
khi thu hoạch quả có thể được sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón.
Hình 1 Hình 2 Hình 3

Hình 1: Dứa Queen
(Nguồn: http://www.rauhoaquavietnam.vn/default.aspx?ID=1&LangID=1&tabID=5&NewsID=1911)
Hình 2: Dứa Cayenne

(Nguồn: http://longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4498&catID=3)
Hình 3: Ruộng dứa

(Nguồn: http://longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4498&catID=3)
Trên thế giới cây dứa được trồng hầu hết các nước nhiệt đới như Philippiens, Thái
Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba,… và một số nước cận nhiệt đới.
Ở nước ta, dứa trồng khắp cả nước, trong đó ở phía Nam chiếm đa số. Các tỉnh trồng
nhiều ở miền Nam là Tiền Giang, Kiên Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Thanh Hóa, Ninh
Bình, Nghệ An, Bình Định, Hậu Giang …
Dứa có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao, được sử dụng trong chế biến thực
phẩm và rất được ưa chuộng.
Trong quả dứa chín, nước chiếm đa số, hàm lượng 80-86%, phần còn lại là
carbohydrate chiếm 10-18% (trong đó có 60-67% saccharose, glucose và fructose
chiếm 30-40%), protein 2-3%, acid hữu cơ 0,1-1,6% (trong đó có acid citric chiếm
87% và 13% còn lại là acid maleic), tro 0,3%, sắc tố 0,03-0,6% và các hợp chất
phenolic (tạo màu), các hợp chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A (0,3mg
carotene/100g thịt quả), B1 và C (8,5mg/100g thịt quả), các chất khoáng Fe, Na, K, P,
Mg,… và enzyme bromeline là một enzyme thủy phân protein. Ngoài ra, ở lá non trên
ngọn thân cây dứa có chứa rất nhiều vitamin C.
2.2 Giới thiệu về enzyme trong cây dứa
2.2.1 Hệ enzyme trong cây dứa
Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức
tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa. Giống như ở
các loại thực vật khác, hệ enzyme trong dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với
các đặc tính khác nhau, trong đó enzyme protease chiếm đa số. Protease trong dứa
gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme
bromelain, ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase,
acid phosphatase.
(Nguồn: http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html)
- Enzyme peroxidase tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển
của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn khoảng 1/3
so với ban đầu (Gortner and Singleton, 1965).
- Cysteine protease là nhóm enzyme proteplytic chủ yếu được tìm thấy trong dịch thân
và quả dứa. Protease trong quả dứa xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần về số
lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng enzyme này
có xu hướng giảm dần (Gortner and Singleton, 1965; Lodh et al., 1972).
- Từ cây dứa Ananas, người ta tìm thấy có tối thiểu 4 loại cysteine protease khác nhau
(Rowan et al., 1990). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ thân dứa là bromelain
thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và comosain. Trong dịch quả dứa,
cysteine protease chủ yếu là bromelain quả.
- Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và
quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa
enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc
tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al.,
1968).
- Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa
học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme này
cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno et al., 2003).
- Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số
enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng
với số lượng rất thấp.
2.2.2 Đặc điểm enzym bromelain
Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ 19. Năm 1892, nhà
khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme
có khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa. Ông đã gọi nó là
“bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromelin” hay “bromelain” đã được dùng để gọi
chung các enzyme thủy phân protein (protease), được tìm thấy từ những giống dứa
thuộc cùng họ Bromeliaceae.
(Nguồn: http://www.en.wikipedia.org/wiki/bromelain)
Bromelian là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfuhydryl, có khả
năng thủy phân protein.
Trước đây, cây dứa được sử dụng như một loại cây làm thuốc. Năm 1957, Heinicke
nhận thấy trong cây dứa có một lượng lớn bromelain và người ta bắt đầu tìm cách
chiết tách nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh.
Bromelain có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều, nó phân cắt protein
trong cơ thể sinh vật. Một trong những lợi ích của nó
được chú ý đến đó là một chất giúp cho tiêu hóa vì nó
hoạt động ở môi trường acid trong dạ dày và cả môi
trường kiềm ở ruột non.
Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài
Ananas. Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa
và quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được gọi là
“enzyme dứa”. Tùy theo nguồn gốc, bromelain được
phân làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân
dứa) bromelain quả (trích từ dịch quả dứa) và
bromelin thân là nhóm enzyme có giá trị kinh Hình 4 : Quả dứa (Ananas Comosus)
tế. Bromelain có hoạt tính xúc tác sự phân (Nguồn :http://doanhnghiep.vinamap.vn/estore.php
giải protein tương tự như papain trong mủ đu ?vportal=product&page=list&cm=597 )
đủ hay facin trong cây thuộc họ Sung. Enzyme bromelain có trọng lượng phân tử
khoảng 33.000Da, lớn gấp 1,5 lần so với papain.
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelain kể từ ba tháng trước khi chín, trong
đó hoạt tính bromelain cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt
tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn.
Trong công nghiệp, phần thân cây dứa dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất ra
enzyme bromelin thương mại, vì đây là nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu
hoạch trái.
Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2.
Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất kỳ
trên mạch polypeptide.
Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lần tổng hợp tương tự như bromelain thân. Tuy
nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-
Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân.
(Nguồn: http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html)
Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23-31kDa tùy thuộc
vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện pI =
4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al.,
1985).
2.2.3 Tính chất của bromelain
Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfuhydryl thủy phân protein.
Trong dịch chiết bromelain còn chứa một ít peroxydase, phosphatase acid và chất cản
protease.
Dịch chiết bromelain toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4,5-9,8. Bromelin được
chiết tách từ các phần khác nhau trên cây dứa và bromelain từ những nguồn khác nhau
sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau.
Bromelain không ổn định với nhiệt độ do đó các động sinh lý của nó sẽ giảm đi nếu
như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp.
Bromelain có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao nhất
bromelain được tìm thấy trong máu sau khi ăn một giờ, tuy nhiên hoạt động thủy phân
protein của nó bị mất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội sinh
và các yếu tố -2-macroglobuline của huyết thanh.
i. C ấ u tạ o h ó a h ọ c
Mã số enzyme
+ Bromelain thân: E.C.3.4.22.32
+ Bromelain quả: E.C.3.4.22.33
Tên gọi khác: bromelain, bromelin, bromeline
Tên khoa học và y học: sulfhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease
Tên thương mại: bromanase, bromelain 2400 Maximum Strength

Enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa chủ yếu là các protease cysteine.
Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như
papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2
glucosamine, 1 xylose và fructose. Sợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi
polypeptide. Trong sợi hydrate carbon này một nữa sợi không liên quan đến cơ chế
xúc tác của phân tử.
Bromelain thân và quả có thành phần acid amin thay đổi khác nhau. Bromelain thân
có khoảng 321-144 acid amin. Còn bromelain quả thì có khoảng 283-161 acid amin.
Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valin và ở đầu
carbonyl là glycine.
Bromelain quả có amino acid ở đầu amine là alanine.
ii. Cấu trúc không gian
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp
amino acid trong phân tử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –
- Gly – Cys – Lys –

Hình 5 : Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có
chứa cysteine và hai sợi polypectide liên kết với nhau bằng cầu nối – S – S. Phân tử có
dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân tử có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và
trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra trong phân tử còn có ion Zn2+
có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme.
iii. Hoạt tính của enzyme bromelain
Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau như: peptidase, amydase, esterase.
Bromelain thân xúc tác phản ứng trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự
nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA – Benzoyl – L –
Arginine amide, BAEM – Benzoyl – L – Arginine Methyl Esther,… (Nguyễn Đức
Lượng, 2004)
Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơn bromelain
quả xanh và bromelain quả chín và hoạt tính phân giải của bromelain quả xanh cao
hơn bromelin quả chín.
Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các
phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng
có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme – cơ chất. Chúng tham gia
vào nhiều biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl
hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp
chuyển điện tích (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh
phản ứng thủy phân protein thành các olygopeptide và các amino acid.
Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 50C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của
bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín. (Nguyễn Đức
Lượng, 2004)
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym bromelain
Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelain chịu ảnh hưởng bởi:
- Nhân tố môi trường: nhiệt độ, pH, ion kim loại, …
- Nhân tố bên trong: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của
enzyme, phương pháp trích ly và độ tinh khiết của enzyme, …
- Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain
không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất,
bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa,…
i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ
Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme.
Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các
enzyme bị mất hoạt tính trên 700C. (Lê Ngọc Tú, 2004)
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian càng dài thì
nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ
enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.
Ở dịch chiết quả (pH = 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt
động nhưng bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ.
Ở 50C, pH = 4,0-10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ.
Ở 550C, pH = 6,1 thì enzyme bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút.
Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng 45-600C. Nhiệt độ quá cao sẽ
làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay
đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cystein, làm vị trí không gian của
nhóm –SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất. Nhiệt độ quá thấp
hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme.
(Phạm Thu Cúc, 1999)
ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Enzyme rất
nhạy cảm với sự thay đổi pH môi trường. Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động
mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích.
pH tối thích của bromelain không ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản
ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch
đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt tính.
Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của
enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ
làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm
giảm hoặc khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do đó hoạt tính của enzyme sẽ bị
giảm hoặc thậm chí mất hẳn.
Hình 6: Hình minh họa tác động của pH môi trường lên hoạt tình enzyme
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Khi thu nhận enzyme thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfate hoặc
molypdenum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định ở pH
4,6-5,4.
Bromelain thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6,0 và pH 8,0,
ổn định ở pH 3,5-5,6 với nhiệt độ 630C. Enzyme bromelain đã tinh sạch chỉ còn lại
60-70% hoạt tính. Bromelain có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của
enzyme là 5-8 tùy thuộc vào cơ chất. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
iii. Ảnh hưởng của nhân tố ion kim loại
Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào
các trung tâm hoạt động của enzyme. Muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến
hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ của muối.
Ngoài ra, còn có những chất tác động ức chế bromelin do chúng kếp hợp với nhóm –
SH của trung tâm phản ứng của eznym.
iv. Ảnh hưởng bởi nhân tố cơ chất
Trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất
là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain 4 lần, cơ chất là
casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain. Đối với các có chất tổng hợp
như BAA (Benzoyl-Argini amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả
năng thủy giải của bromelain yếu hơn papain. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
v. Ảnh hưởng bởi chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong cá phản ứng
enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất
hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng.
Các chất gây kĩm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phần tử vô cơ,
các chất hữu cơ và cả protein.
Các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hay không thuận nghịch.
2.3 Động học phản ứng enzyme
2.3.1 Cơ chế tác động của enzyme
Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng
hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Theo đó, cơ chất tương
tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên
kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia
vào các phản ứng hơn.
Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác, thì năng lượng cần cho phản ứng
nhỏ hơn khi không có enzyme, và cũng nhỏ hơn so các phản ứng được xúc tác bởi các
catalist. Quá trình xúc tác trải qua ba giai đoạn:
Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết quả tạo
thành một phức hợp enzyme-cơ chất, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra
rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng.
Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên kết đồng
hóa trị.
Ở giai đoạn thứ ba: sản phẩm được tạo thành enzyme được giải phóng và trở lại trạng
thái tự do. Liên kết giữa enzyme và cơ chất để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất là
liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác vadervaals.
2.3.2 Phương trình động học Michalelis Menten
Năm 1913 hai nhà khoa học Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ra mô hình
động học để giải thích phản ứng xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh
mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme.
Mô hình chuyển hóa của phản ứng enzyme với một cơ chất như sau.
k1 kcat
E+S ES E+P
k-1
Với k 1 , k-1 , kcat là những hằng số của các phản ứng. E là enzyme, S cơ chất, ES
phức hệ enzyme-cơ chất, nồng độ enzyme ban đầu được ký hiệu là E tot . Giả sử
nồng độ cơ chất ban đầu cũng là nồng độ cơ chất ở trạng thái cân bằng của phản
ứng.
Nếu bỏ qua phản ứng ng ược P + S  ES

Tốc độ phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng: V = dP/dT = kcat [ES].
Phản ứng xấp xỉ trạng thái ổn định (Steady -state) : [ES] là hằng số
Tốc độ xuôi chiều = tốc độ ngược chiều.
K1 [S][E] = k1[S] (Etot – [ES]) = (k-1 + kcat) [ES]
 k1[S] Etot = (k-1 + kcat + k1 [S] ) [ES]
 [ES] = [S] Etot / (K m +[S])

Với K m = ((k-1 + kcat)/k1
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sau cho tất cả enzyme đều tham gia phản ứng tạo phức
hệ ES ta có: [ES] = Etot. Phản ứng sẽ đạt tốc độ cực đại V max = kcat Etot
V = kcat [ES] = kcat [S]Etot /(Km + [S]) V = Vmax [S]/ (K m + [S]) (*)
Phương trình (*) là phương trình Michaelis – Menten. Phương trình này phản ánh
tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độ cực đại của
phản ứng V max , nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số K m .
V0
V0 = Vmax
(µM/phút)
1
Vmax
2
[S] (mM)
Hình 7 : Đồ thị biểu diễn ph ương trình Michalaelis -Menten
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Các giới hạn của phương trình Michaelis – Menten

V = kcat[S]Etot/(Km + [S]) = Vmax[S]/(Km + [S])
Trong trường hợp

[S] >> Km
V  Vmax = kcat Etot
[S] << Km
V  (kcat/Km) [S] [E]
Kcat/Km  109/ (M sec)
[S] = Km
V  (1/2) Vmax = (1/2) kcat Etot
Ý nghĩa của hằng số Michaelis – Menten
K m có đơn vị là Molar, khi [S] = K m thì V = V max /2 và ngược lại.

K m nhỏ chỉ ra rằng, enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt đến trạng thái ổn
định. Vì thế, tốc độ cực đại đạt đến tại một nồng độ cơ chất thấp tương đối. K m lớn
chỉ ra rằng, cần một nồng độ c ơ chất cao để phản ứng có thể đạt đến tốc độ cực đại.
Kcat/Km là hằng số tốc độ phản ứng hai phân tử hiệu quả tại nồng độ cơ chất thấp.
Kcat/Km ~ 109 chỉ ra rằng sự xúc tác gần như hoàn chỉnh: mỗi khi cơ chất gặp
enzyme hầu như nó đều chuyển thành sản phẩm.
2.3.3 Phương trình Line Weaver

V = Vmax[S]/(Km + [S])
Nghịch đảo 2 vế phương trình:

1/V = (1/Vmax) + (Km/Vmax)*(1/[S])
Đây là phương trình được Line Weaver và Burk đưa ra vào năm 1943 có dạng
y= ax + b là phương trình đường thẳng.
Nếu vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/ Vmax và cắt trục hoành ở -1/K m và độ
nghiêng (slope) b ằng K m/V max. Từ phương trình trên ta dễ dàng xác định K m và V max
trong các thí nghiệm.
1/V0
(1/mM/phút)
Độ nghiêng = km/Vmax
1/Vmax
1/S (1/mM)
Hình 8: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.3.4 Phương trình Eadie-Hofstee

Ngoài 2 dạng phương trình động học phổ biến ở trên còn có một dạng phương trình
khác do Eadie và Hofstee đưa ra.
Ta có: V = V = V max [S]/ (Km + [S])
V = V max – K m (V/[S])
Đây cũng là phương trình dạng y= ax + b với tung độ gốc bằng V max còn hoành độ
gốc bằng V max /K m và độ nghiêng là –K m . Phương trình này ít khi được sử dụng tuy
nhiên trong một số trường hợp đặc biệt ng ười ta vẫn sử dụng dạng ph ương trình
này.
v/[S]
Hình 9 : Đồ thị biểu diễn ph ương trình Eadie-Hofstee

(Nguồn: Phạm Thị Trân Châu, 2007)
2.4 Giới thiệu về cơ chất casein

Casein là protein chủ yếu trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Chúng tồn
tại dưới dạng micelle. Casein là những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng
có chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic. Các phân tử casein được
phosphoryl hóa với những mức độ khác nhau trên gốc serine và threonine. Casein có
điểm đẳng điện pI = 4,6. Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau
nên có cấu trúc bậc 1 khác nhau. Casein trong sữa có 4 dạng chính: α (s1) và α (s2)-
casein, β-casein, κ-casein.
α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự
phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại
này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.
α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa
nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl
và gốc cation nhất.
β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo
cao nhất. Phân tử β-casein gồm 10% cấu trúc xoắn α, 13% cấu trúc lá xếp β và 77%
cấu trúc không trật tự.
κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ
chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử protein
thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. κ-casein gồm 23% vùng xoắn α, 31% vùng
lá xếp β và 24% vùng vòng cung β.
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein

Acid amine Tỉ lệ (%)
Glutamic Acid 20,2 %
Proline 10,2 %
Leucine 8,3 %
Lysine 7,4 %
Valine 6,5 %
Aspartic Acid 6,4 %
Serine 5,7 %
Tyrosine 5,7 %
Isoleucine 5,5 %
Phenylalanine 4,5 %
Threonine 4,4 %
Arginine 3,7 %
Histidine 2,8 %
Alanine 2,7 %
Methionine 2,5 %
Glycine 2,4 %
Tryptophan 1,1 %
Cystine 0,3 %
Nguồn: http://www.casein.com/products.htm)
2.5 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serum Albumin (BSA)

Serum albumin là một trong những protein được nghiên cứu rộng rãi và là protein
phong phú nhất trong huyết tương với nồng độ là 5g/100 ml. Nhiều nhà khoa học đã
có nghiên cứu về cấu trúc và những tính chất của serum albumin cũng như những ảnh
hưởng của nó đến những loại protein khác để từ đó hiểu ảnh hưởng của serum
albumin đến chức năng của thực phẩm là như thế nào.
BSA là protein hình cầu lớn (66.000 Da) với những acid amin cần thiết. Nó có đầy đủ
những đặc điểm và tính chất của protein đã được biết đến (Peter, 1975).
Trong thành phần của nó chứa ít tryptophan và methionine nhưng hàm lượng cystein
và acid amin phân cực cao. Hàm lượng glycine và isoleucine phân tử BSA thì thấp
hơn mức trung bình trong protein (Peter, 1985). Thành phần acid amin trong phân tử
BSA được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2: Thành phần acid amin trong phân tử BSA

Loại acid amin Số lượng
Alanine 48
Phenylalanine 30
Lysine 60
Proline 28
Cystein 34
Glycine 35
Valine 17
Aspartic acid 41
Histidine 16
Methionine 5
Arginine 26
Tryptophan 3
Glutamic acid 58
Isoleucine 15
Asparagine 14
Serine 32
Tyrosine 21
Nguồn: (Brown, 1975; Patterson and Geller, 1977; McGillivray et al., 1979; Reed et al., 1980; Hirayama et al.,
1990)
2.6 Một số ứng dụng của enzyme bromelain

2 . 6 . 1 T r o n g c ô n g n g h ệ th ự c p h ẩ m
Ứng dụng enzyme bromelain trong làm mềm thịt.
Ứng dụng enzyme trong chế biến nước mắm: rút ngắn quá trình lên men nước mắm,
người ta cho bromelain vào khối chượp. Nhờ hoạt động của enzyme protein cá được
thủy phân nhanh hơn. Theo cách này có thể sản xuất nước mắm khoảng từ 5 đến 7
tháng thay vì 9 đến 12 tháng.
Sản xuất nước chấm từ đậu tương: làm tăng hương của nước chấm, rút ngắn thời gian
“chín” các dịch lên men 30-50%.
Ứng dụng enzyme trong sản xuất bia, dịch chiết malt bia, thủy phân protein sữa.
Loại da cá, loại màng, làm sạch trứng cá, làm mềm thịt mực
2. 6. 2 T r ong y học
Enzyme bromelain là một vị thuốc tự nhiên có nhiều tác dụng tăng sức đề kháng, giảm
béo, ngừa huyết áp, chữa bệnh khó tiêu hóa, sử dụng trong điều trị bệnh viêm, phân
giải hoại tử bỏng.
Hỗ trợ tiêu hóa, xử lý vết thương.
Việc sử dụng enzyme bromelain từ chồi dứa đã tinh sạch một phần để đắp vào vết
thương bỏng đã làm rụng hoại tử nhanh, giảm dịch xuất tiết, rút ngắn thời gian điều
trị.
2.6.3 Trong một số lĩnh vực khác
Ứng dụng enzyme trong công nghiệp da: sử dụng enzyme quá trình tách lông sạch
hơn, da có chất lượng tốt hơn.
Chăm sóc da: các enzyme bromelain có tác dụng thủy phân giới hạn các tế bào biểu
bì, được sử dụng để lột nhẹ da mặt làm cho da mịn hơn.
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu
3 . 1. 1 Đ ị a đ i ể m , t h ời g i a n ng h i ê n cứ u
- Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
- Thời gian thực hiện: Từ 28/12/2009 đến 17/04/2010
3.1.2 Nguyên liệu
Khóm được mua ở chợ Xuân Khánh
3 . 1 . 3 H ó a c h ấ t th í n g h iệ m
- Casein (Trung Quốc)
- L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)
- Cồn 960
- Coomassie brilliant blue (CBB)
- Acid phosphoric (H3PO4)
- Natri hydroxit (NaOH)
- Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)
- L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck)
- Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc)
- Acid hydrochlorid 0,1N (Trung Quốc)

- Acid citric (Trung Quốc)
3.1.4 Thiết bị thí nghiệm
- Máy ly tâm lạnh
- Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)
- Máy đo quang phổ (Spectrophotometer)
- Cuvette thạch anh, Cuvette nhựa
- Máy đo pH
- Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01
- Micropipette, pipette, nhiệt kế
- Máy xay sinh tố
- Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác

3.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.1 Phương pháp trích ly enzyme thô từ vỏ khóm
Vỏ dứa
Làm sạch
Nghiền ép
Lọc Bã
Ly tâm lạnh, 6000 v/p, 20 phút
Dịch trong
Hình 10: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain vỏ (thô)
(Nguồn: Lại Thị Ngọc Hà, 2009)
3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain
Khảo sát hoạt tính của enzyme bromelain trong v ỏ dứa theo các điều kiện xử lý
khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong
dịch vỏ trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục).
3.2.3 Xác định hàm lượng protein của enzyme bromelain bằng Coomassie Brillant
Blue – G250 (phương pháp Bradford)
Khảo sát hàm lượng protein của enzyme bromelain vỏ dứa được xác định dựa vào sự
thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trong
dung dịch acid. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu da cam
đỏ. Trong môi trường có gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và có
màu xanh xuất hiện.
Dạng không proton hóa của Coomassie Blue G-250 (C47H48N3O7S2Na, trọng lượng
phân tử 854).
3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính của enzyme ở các độ chín khác nhau
i. M ụ c đ íc h
Tìm ra độ chín thích hợp cho quá trình trích ly enzyme bromelain từ vỏ dứa.
ii. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại.
Nhân tố A: Độ chín của khóm
A1: độ chín 1 (trái vẫn còn xanh bóng)
A2: độ chín 2 (25% vỏ trái chuyển màu vàng)
A3: độ chín 3 (50% vỏ trái có màu vàng tươi)
A4: độ chín 4 (75% vỏ trái có màu vàng tươi)
A5: độ chín 5 (100% vỏ trái màu vàng sẫm)
Tổng số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 (lần lặp lại) = 15 mẫu
iii. Tiến trình thí nghiệm
Chuẩn bị dịch vỏ dứa ở các độ chín khác nhau. Các mẫu được tiến hành như cách bố
trí trên. Mẫu thí nghiệm được khảo sát hoạt tính của enzyme bằng phương pháp
Kunitz (phụ lục) với cơ chất là casein điều kiện thí nghiệm pH = 7, nhiệt độ 370C và
khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (phụ lục).
Ứng với mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo
Dựa vào hấp thụ mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định được hoạt tính và hàm
lượng protein tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử dụng làm nguồn enzyme cho các
thí nghiệm sau.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác
phản ứng thủy phân của enzym e brom elain
i. M ụ c đ íc h
Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch vỏ dứa ở những
điều kiện môi trường khác nhau.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố:
- Nhân tố B: pH môi trường
Với khoảng pH khảo sát từ 3÷9; chia làm 7 mức độ
B1: pH = 3 B2: pH = 4 B3: pH = 5 B4: pH = 6

B5: pH = 7 B6: pH = 8 B7: pH = 9
- Nhân tố C: Nhiệt độ môi trường
Khoảng nhiệt độ khảo sát từ 30÷800C; chia làm 6 mức độ
C1: 300C C2: 400C C3: 500C C4: 600C C5: 700C C6: 800C
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, với mỗi nghiệm thức có 1 mẫu đối chứng
Tổng số mẫu thí nghiệm: 7 x 6 x (3 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 168 mẫu
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
Nhân tố B
Nhân tố C
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7
C1 B1C1 B2C1 B3C1 B4C1 B5C1 B6C1 B7C1
C3 B1C3 B2C3 B3C3 B4C3 B5 C3 B6C3 B7C3
C4 B1C4 B2C4 B3C4 B4C4 B5 C4 B6C4 B7C4

Chuẩn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1.
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân
của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein.
Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt tính bằng
phương pháp Kunitz (phụ lục).
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme
b r o m e la in
i. Mục đích
Xác định động học của enzyme, tìm ra Vmax và Km
Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố, 3 lần lặp lại
Mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo
Nhân tố D (nồng độ cơ chất casein) đ ược bố trí ở 9 mức độ ứng với các nồng độ:
0,2 ; 0,3; 0,4; 0;5; 0,6; 0,7; 0,8; 1,0 và 1,4 (%).
Tổng số mẫu thí nghiệm: 9 x (3 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 36 mẫu

Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều xác định hoạt tính enzyme theo phương
pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau, điều kiện thí
nghiệm với pH và nhiệt độ tối ưu xác định ở thí nghiệm 2.
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích ta có th ể xác định đ ược
lượng casein bị thủy phân từ đó t ìm được vận tốc của phản ứng.
3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính enzyme bromealin khi có bổ sung muối NaCl ở
nhiệt độ thường và nhiệt độ tối ưu của enzym bromelin
i. Mục đích
Tìm hiểu sự thay đổi hoạt tính enzyme bromelain khi có bổ sung muối NaCl
Ứng dụng vào thực tế khi bổ sung enzyme bromelain trong sản xuất mắm cá lóc phi lê
Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố, 3 lần lặp lại
Mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo.
- Nhân tố E (nồng độ muối NaCl, muối ăn) được bố trí ở 7 mức độ ứng với các nồng
độ: 0%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%.
- Nhân tố F: nhiệt độ môi trường
Khảo sát ở 2 khoảng nhiệt độ: thường và tối ưu (ở thí nghiệm 2)
Tổng số mẫu thí nghiệm: 6 x 2 x (3 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 48 mẫu
Tiến hành thí nghiệm như bố trí. Mỗi nồng độ muối ta khảo sát ở 2 nhiệt độ. Xác định
hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) trên cơ chất casein ứng với mỗi
nghiệm thức, điều kiện thí nghiệm với pH tối ưu (ở thí nghiệm 2).
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng độ chín dứa đến hoạt tính enzyme bromelain
Dứa sản xuất ở các nhà máy đồ hộp có nhiều độ chín khác nhau, vỏ dứa là trong các
phế phẩm. Nhưng trong vỏ dứa lại có nguồn enzyme bromelain khá dồi dào. Thí
nghiệm này thực hiện ở tất cả độ chín của trái dứa để tìm ra độ chín thích hợp cho
hoạt tính enzyme bromelain cao nhất. Từ đó làm cơ sở cho việc sử dụng phế phẩm vỏ
dứa sản xuất enzyme và tiền đề cho các thí nghiệm sau. Vỏ dứa được lấy từ những độ
chín khác nhau được chia làm 5 mức độ.
Độ chín 1 (trái vẫn còn xanh bóng)
Độ chín 2 (25% vỏ trái chuyển màu vàng)
Độ chín 3 (50% vỏ trái có màu vàng tươi)
Độ chín 4 (75% vỏ trái có màu vàng tươi)
Độ chín 5 (100% vỏ trái màu vàng sẫm)
Hình 11: Dứa ở các độ chín từ 0-100%
Vỏ dứa được xử lý, ép lấy dịch. Dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain vỏ được
tiến hành ly tâm loại bỏ cặn bẩn, lấy dịch trong. Tiến hành khảo sát, chuẩn bị các mẫu
được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz. Ở đây giá trị đo
được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD) chính là nồng độ Tyrosine (µmol) sinh ra
do quá trình thủy phân cơ chất casein bởi 1ml chế phẩm enzyme. Từ giá trị độ hấp thụ
này, ta xác định hoạt tính của chế phẩm enzyme bromelain trong vỏ dứa theo đơn vị
Tu/ml chế phẩm enzyme bán tinh khiết.
Từ các mẫu dịch dứa cũng đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp
Bradford. Từ giá trị độ hấp thụ đo được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD), ta xác
định hàm lượng protein của chế phẩm enzyme bromelain trong vỏ dứa theo đơn vị
mg/ml chế phẩm enzyme bán tinh khiết. Sự thay đổi hoạt tính và hàm lượng protein
của enzyme bromelain ở các độ chín khác nhau được thể hiện ở bảng 3 và 4.
Bảng 3: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain theo độ chín
Độ chín vỏ dứa Hoạt tính (Tu/ml)
Độ chín A1 (0%) 3,975a
Độ chín A2 (25%) 3,208b
Độ chín A3 (50%) 2,989c
Độ chín A4 (75%) 2,259d
Độ chín A5 (100%) 1,494e
Kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%
Bảng 4: Kết quả khảo sát hàm lượng protein của enzyme bromelai
bromelain theo độ chín
Độ chín vỏ dứa Hàm lượng Protein (mg/ml)
Độ chín A1 (0%) 0,964a
Độ chín A2 (25%) 0,877b
Độ chín A3 (50%) 0,783c
Độ chín A4 (75%) 0,722d
Độ chín A5 (100%) 0,641e
Kết quả thể hiện là hàm lượng protein theo đơn vị mg/ml
Hình 12: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính enzyme bromelain theo độ chín
Từ bảng 3 và hình 12 cho thấy hoạt tính của enzyne bromelain ở độ chín 0% (trái
xanh hoàn toàn) là cao nhất, còn độ chín 25-50% thì thấp hơn 0% nhưng cao hơn
so với 75-100%, trái khóm chín hoàn toàn cho hoạt tính thấp nhất. Điều này phù
hợp với tài liệu của Nguyễn Đức Lượng, 2004 đã viết. Protease trong dứa xuất hiện
từ lúc ra hoa, trong thời kì phát triển tăng dần về số lượng, ở giai đoạn chín lượng
enzyme này có xu hướng giảm (Gortner and Singleton, 1965; Loud et al., 1972).
Từ điều này cho thấy kết quả thí nghiệm phù hợp với lý thuyết.
Hình 13: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng protein enzyme bromelain theo độ chín
Tương tự đối với hàm lượng protein cũng giảm (hình 13). Trái xanh (0%) cho hàm
lượng protein cao nhất, trái chín hoàn toàn cho hàm lượng protein thấp nhất. Hàm
lượng protein giảm dần kể từ ngày ra hoa đến khi quả chín (R. E. Paull and C-C.
Chen, 2003). Sự chín của trái đã làm thay đổi cấu trúc, màu sắc, các thành phần
hóa lý trong trái. Một phần khác, các enzyme có sẵn trong vỏ, enzyme protease
thủy phân protein thành các acid amin là giảm hàm lượng protein.
Protein đã xác định số lượng nhưng khác nhau giữa protein trên thân và protein thịt
quả (Yamada et al., 1976).
Từ các kết quả nghiên cứu, enzyme bromelain thân và enzyme bromelain thịt quả
có điểm riêng biệt. Do 2 loại enzyme là 2 protein riêng biệt (Ota et al., 1985), hay
được mô tả với 2 hình thức enzyme đơn lẻ (Iida et al., 1973; Sasaki et al., 1973).do
đó, có thể nghĩ rằng enzyme bromelain vỏ và enzyme protein thân có điểm riêng
biệt.
Từ kết quả thí nghiệm này ta loại dứa có độ chín 100%. Vì thực tế tại các nhà máy chế
biến dứa lấy nguồn nguyên liệu ở tất cả các độ chín. Nhưng độ chín 100% hoạt tính
enzyme bromelain thấp nên không nghiên cứu. Chọn vỏ dứa độ chín 25-75% để khảo
sát, tốt nhất là ở trong khoảng 25-50%.
4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ và pH lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain
Ta sử dụng độ chín chọn lựa ở thí nghiệm 1. Vỏ dứa có độ chín trong khoảng 25-50%
được sử xử lý, ép lấy dịch bỏ bã vỏ dứa đem ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 20 phút
lấy dịch trong bỏ cặn bẩn. Dịch trong chứa enzyme bromelain được xác định hoạt tính
ở các nhiệt độ và pH khác nhau theo phương pháp Kunitz trên cơ chất casein.
Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme trên cơ chất casein được khảo sát theo 2 nhân
tố. Nhân tố A: nhiệt độ với 6 mức độ từ 30-800C, nhân tố B: pH với 7 mức độ từ 3-9.
Ứng với mỗi mẫu thí nghiệm có một mẫu đối chứng.
Kết quả thu nhận được thể hiện qua các bảng số liệu và các đồ thị hình theo sau.
Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme do tác động
trực tiếp tới cấu trúc không gian và hình thể tâm hoạt động của enzyme. Theo động
học phản ứng enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ thúc đẩy vận tốc phản ứng. Nhưng tốc độ
phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Vận tốc
phản ứng đạt cực đại tương ứng với nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động, nếu
vượt qua ngưỡng nhiệt độ này tốc độ phản ứng giảm. Nếu cứ tăng nhiệt độ thì đến
nhiệt độ enzyme bị vô hoạt. Điều này thể hiện tổng quát ở hình 15, hoạt tính enzyme
thay đổi theo các nhiệt độ khác nhau khi tương tác với các pH.
Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo pH với từng nhiệt độ
Nhiệt độ (oC) Trung
pH
30 40 50 60 70 80 bình
3 0, 067 0, 041 0 0 0 0 0, 018e
4 2, 211 4, 244 0, 294 0, 055 0 0 0, 134d
5 2, 396 4, 587 4, 698 2, 218 0 0 2, 317b c
6 2, 812 4, 778 5, 206 4, 436 0, 779 0 3, 002a
7 3, 765 4, 344 4, 822 3, 823 0, 292 0 2, 841a b
8 2, 956 3, 849 4, 055 1, 741 0 0 2, 1c
9 2, 409 3, 694 3, 600 1, 114 0 0 1, 803c
Trung
bình 2, 374b 3, 648a 3, 239a 1, 913b 0. 153c 0c
Kết quả thể hiện là hoạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml.
Hình 14: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain ở các pH khác
nhau khi tương tác với các nhiệt độ
Hình 15: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme thay đổi theo các nhiệt độ khác nhau khi tương tác
vớ i c á c p H
R2 = 72.0412%
R2 (adjusted for d.f.) = 70.8763%
Hoat tinh = -12,1632 + 0,232797 * Nhiet do + 3,40032 * pH – 0,00223918 * Nhiet do *

Nhiet do – 0,218751 * pH * pH – 0,00902452 * pH* Nhiet do
Hình 16: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của
enzyme bromelain trong dịch vỏ dứa
Từ đồ thị hình 14, 15 và 16 nhận thấy có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ lên
hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain vỏ dứa. Ứng với mỗi khoảng nhiệt độ enzyme
này sẽ có khoảng pH hoạt động và giá trị pH tối thích khác nhau và ngược lại.
Về mặt tổng quát, enzyme bromelain tồn tại trong dung dịch vỏ dứa tươi thể hiện
hoạt tính cao nhất ở khoảng nhiệt độ 40-500C với pH dung dịch đệm là 6-7.
Về enzyme bromelain trong dịch dứa quả thể hiện hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 35-
550C, pH = 6,8-7,8 (Lê Kim Thanh, 2007).
Tính hỗn tạp của số lượng protease trong dịch quả dứa còn nghi ngờ (Chittenden et
al., 1892) nên có thể sự khác biệt về hai hệ enzyme này.
Xét về nhiệt độ xử lý, hoạt tính enzyme tăng dần từ 300C đến cực đại ở 500C rồi giảm
dần ở 600C, đến 800C thì mất hoạt tính hoàn toàn. Điều này có thể giải thích dựa vào
động học chung của enzyme, khi nhiệt độ tăng dần thì vận tốc phản ứng cũng tăng
theo, đến nhiệt độ tối thích là 500C.
Giống như các enzyme khác, enzyme bromelain ở dạng tinh khiết rất nhạy cảm với
nhiệt độ, phần lớn enzyme này bị giảm hoạt tính từ 550C và bị vô hoạt ở nhiệt độ
trên 700C (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Dựa vào kết quả thống kê và hình 15, nhiệt độ tối ưu cho enzyme bromelain vỏ dứa
hoạt động thích hợp ở trong khoảng 40-500C.
Xét về pH xử lý, ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được giải thích dựa vào
trạng thái ion hoá của enzyme và cơ chất, đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của
enzyme. Khi pH thay đổi thì đồng thời trạng thái ion hóa enzyme và cơ chất cũng
thay đổi, làm quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất bị ảnh hưởng dẫn đến
việc thay đổi vận tốc phản ứng.
Nhìn chung hoạt tính xúc tác của enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất ở pH 6 và
không khác biệt ý nghĩa 5% so với pH 7, có khác biệt ý nghĩa so với các pH còn
lại. Khoảng pH tối thích của enzyme bromelain vỏ là pH = 6-7.
Trên đồ thị hình 14, tương ứng với các nhiệt độ xử lý 400C, 500C, 600C, 700C
enzyme bromelain thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất ở pH 6. Có thể thấy hoạt tính
xúc tác của enzyme tăng nhanh trong khoảng pH từ 5-6, rồi giảm nhanh trong
khoảng pH từ 7-8. Cụ thể là hoạt tính enzyme ở nhiệt độ xử lý 600C chỉ có giá trị
2,218 Tu/ml (ứng với pH 5) nhưng tăng gấp đôi 4,436 Tu/ml (ứng với pH 6), sau
đó giảm xuống 1,741Tu/ml (ứng với pH 8). Kết quả tương tự khi xử lý ở các nhiệt
độ còn lại.
Sự tương tác giữa pH và nhiệt độ môi trường xử lý enzyme được thể hiện:
bromelain vỏ dứa hoạt động tốt trong môi trường tính acid yếu đến trung tính (pH =
6-7) ở điều kiện nhiệt độ 40-50 0 C (hình 14)
Từ vấn đề này có thể đi đến khuyến cáo, vì phần lớn các sản phẩm từ dứa đều có pH
acid nên trong quá trình xử lý kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp, cần quan tâm
đến hệ enzyme protease trong dịch vỏ vì chúng vẫn hoạt động khá tốt.
Từ bảng 5, enzyme bromelain gần như không hoạt động ở pH = 3. Phù hợp với
nghiên cứu hoạt động của enzyme bromelain trên cơ chất casein nằm trong khoảng
pH 4-9 (Buttle et al., 1989).
4.3 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzym bromel ain
Ứng với mỗi loại cơ chất khác nhau thì tính đặc hiệu của enzyme khác nhau. Đối với
thí nghiệm này tiến hành khảo sát ở mức độ nồng độ casein từ 0,2-1,4%. Phản ứng
thủy phân được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 500C và pH = 6, đây là điều kiện
nằm trong khoảng hoạt động tối ưu của enzyme bromelain vỏ trên cơ chất casein tìm
được ở thí nghiệm 2. Dịch trong chứa enzyme bromelain được xác định hoạt tính theo
phương pháp Kunitz trên cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau. Dựa vào phương
trình Michaelis-Menten tìm thông số động học của enzyme, để giải thích phản ứng
được xúc tác bởi enzyme, và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản
ứng với nồng độ cơ chất và enzyme.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 6 và hình 17
Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo nồng độ casein
Nồng độ casein (%) Hoạt tính (Tu/ml)
0,2 1,92h
0,3 2,65g
0,4 3,01f
0,5 3,30e
0,6 3,55d
0,7 3,72c
0,8 3,85b
1,0 4,24a
1,4 4,24a
Kết quả thể hiện là hoạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml
Giá trị thể hiện ở bảng 6 cho thấy, hoạt tính enzyme bromelain tăng khi nồng độ
casein tăng, đường cong biểu diễn quan hệ giữa hoạt tính bromelain và nồng độ casein
thể hiện ở hình 17.
Qua đồ thị hình 17 cho thấy sự gia tăng hoạt tính enzyme bromelain khi tăng nồng độ
cơ chất casein. Nồng độ casein tăng dẫn đến tăng hoạt tính enzyme khi đến giá trị cao
nhất ở mức nồng độ 1%, ở các mức nồng độ sau thì hoạt tính không thay đổi so với
giá trị cao nhất khi nồng độ casein tiếp tục tăng. Vì nồng độ casein quá cao tạo rào cản
không gian gây khó khăn cho tương tác đúng giữa enzyme và cơ chất, hoặc có thể cơ
chất kết hợp không đúng cách, tạo thành phức ESS không hoạt động (Nguyễn Đức
Lượng, 2004). Điều này thể hiện rõ trên đồ thị khi đường biểu diễn ở mức nồng độ 1-
1,4% gần như đường thẳng song song trục hoành.
Dùng chương trình SAS chạy đồ thị phương trình Michaelis-Menten ta được kết quả
Vmax = 5,46 µmol/ phút và Km = 0,33 %.
Vmax = 5,46 µmol/phút,

Km = 0,33%
Hình 17: Ảnh hưởng nồng độ casein lên hoạt tính enzyme bromelain theo Michaelis-Menten
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nồng độ cơ chất thấp tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến
tính với nồng độ cơ chất. (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo phức hợp
enzyme-cơ chất. Phản ứng sẽ đạt cưc đại.
Phương trình Michaelis-Menten:
Vmax [ S ]
V0 
K m  [S ]
5,46 * [ S ]
V0 
0,33  [ S ]
Km nhỏ chỉ ra rằng, enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt đến trạng thái ổn
định. Vì thế, tốc độ cực đại đạt đến tại một nồng độ cơ chất thấp tương đối.
4.4 Hoạt tính enzyme bromelain khi có bổ sung muối NaCl

Thí nghiệm tiến hành ở 2 khoảng nhiệt độ ứng với các nồng độ muối khác nhau (0%,
10%, 15%, 20%, 25%, 30%). Điều kiện thí nghiệm nhiệt độ thường 300C và nhiệt độ
tối ưu 500C, pH = 6 trên cơ chất thủy phân là casein. Dịch trong chứa enzyme
bromelain có bổ sung muối được xác định hoạt tính theo phương pháp Kunitz.
Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng sau
thường (30oC)
N ồng độ N a C l (% ) Hoạt tính enzyme (Tu/ml)
0 2, 657a
10 2, 586b
15 2, 537c
20 2, 484d
25 2, 445e
30 2, 402f
tối ưu của enzyme bromelain (50oC)
Nồng độ NaCl (%) Hoạt tính enzyme (Tu/ml)
0 5, 995a
10 5,063b
15 5, 003c
20 4,992d
25 4, 939e
30 4,875f
Hoạt tính bị ảnh hưởng khi có bổ sung muối NaCl, hoạt tính giảm so với ban đầu khi
không bổ sung muối.
Muối NaCl là muối vô cơ nên có thể kìm hãm hoạt động của enzyme làm hoạt tính
enzyme giảm. Chất kìm hãm kết với enzyme bằng liên kết đồng hóa trị. Kết quả chất
kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất
lợi cho hoạt động xúc tác, nên làm giảm hoạt tính của enzyme (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Bảng 9: Hoạt tính enzyme bromelain còn lại (%) khi có bổ sung muối NaCl ở nhiệt độ
thường (30oC)
Nồng độ NaCl Hoạt tính còn lại (%)
0 100a
10 97,33b
15 95,48c
20 93,49d
25 92,02e
30 90,40f
Bảng 10: Hoạt tính enzyme bromelain còn lại khi có bổ sung muối NaCl ở nhiệt độ tối
ưu của enzyme bromelain (500C)
Nồng độ NaCl Hoạt tính còn lại (%)
0 100a
10 84,45b
15 83,45c
20 83,27d
25 82,39e
30 81,32f
Hình 18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain còn lại (%) khi có bổ sung muối NaCl ở
nhiệt độ khác nhau
Từ hình 18 và bảng 7,8 khả năng giảm hoạt tính enzyme bromelain ở nhiệt độ tối ưu
nhiều hơn so với nhiệt độ thường ứng với các nồng độ muối NaCl. Nhiệt độ tối ưu
(500C) giảm khoảng 20% còn nhiệt độ thường (300C) thì giảm khoảng 10%.
Hoạt tính enzyme giảm nhiều khi ở nhiệt độ tối ưu có thể do phản ứng với tỷ lệ tăng
nhiệt độ, nhưng với các phản ứng enzyme, một điểm đạt được khi tỷ lệ phản ứng giảm
theo nhiệt độ tăng. Ở nhiệt độ cao một phần protein của enzyme bắt đầu để biến tính,
do đó có chất kìm hãm phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Thí nghiệm này khảo sát hoạt tính của enzyme bromelain vỏ khi có bổ sung muối
NaCl để ứng vào thực tế trong sản xuất mắm cá lóc phile rút ngắn thời gian.
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận
Ở mức độ của đề tài nghiên cứu này, các kết quả khảo sát hệ enzyme bromelain vỏ
(trong dịch chiết) trên chỉ phù hợp với loại dứa thường sử dụng trong công nghiệp
chế biến các sản phẩm từ dứa hiện nay.
Từ thí nghiệm 2 trở đi chọn dứa có độ chín 25-50% để thí nghiệm và kết quả thí
nghiệm chỉ phù hợp với độ chín này.
Từ các kết quả nghiên cứu trên nhận thấy:
- Vỏ dứa có độ chín 0% cho hoạt tính cao nhất, nhưng trong công nghiệp chế biến
vì lợi nhuận kinh tế nên ta loại vỏ có độ chín 100%, lấy các độ chín từ 25-50% để
khảo sát thí nghiệm.
- Có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ của môi trường xử lý lên hoạt tính
của hệ enzyme bromelain vỏ trong dịch chiết từ vỏ dứa. Hệ enzyme bromelain vỏ
tồn tại trong dung dịch dứa tươi thể hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng
nhiệt độ 40 – 500C với pH dung dịch đệm là 6 – 7. Đối với những sản phẩm từ
dứa, trong quá trình tiền xử lý, hệ enzyme protease trong vỏ, điển hình là
bromelain vỏ vẫn có khả năng hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ
nhiệt độ 40 đến 700C.
- Hệ enzyme bromelain từ vỏ dứa khảo sát với cơ chất là casein trong điều kiện tối
thích (nhiệt độ 500C, pH = 6) enzyme cho hoạt tính cao nhất ở nồng độ casein là
1%, Vmax = 5,46 µmol/ phút và Km = 0,33%.
- Enzyme bromelain vỏ dứa bị ảnh hưởng khi có bổ sung muối NaCl. Điều này cho
thầy khi ứng dụng enzyme này vào sản xuất mắm thì phải xem xét lại điều kiện
môi trường để cho được hiệu quả mong muốn tốt nhất.
5.2 Đề nghị
Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên không thể khảo sát đầy đủ những tác nhân ảnh
hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain vỏ. Những nghiên cứu có thể tiếp
tục được đề nghị như sau:
- Khảo sát hệ enzyme pectinase trong dịch vỏ dứa ở độ chín 25-50%.
- Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme bromelain trên các cơ
chất khác nhau.
- Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ cơ chất khác nhau đến hoạt tính enzyme
bromelain.
- Ứng dụng enzyme bromelain vỏ dứa vào quy trình sản xuất mắm cá lóc phile
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Đặng Thị Thu (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật
Lại Thị Ngọc Hà (2009), “Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm enzyme bromelain từ phế phụ phẩm
dứa”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Tập7, (số 2), 203-211.
Lâm Xuân Thanh (2003), Công nghệ s ữ a v à các sản phẩm sữa, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật
Hà Nội.
Lê Kim Thanh (2007), Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme
bromelain trong quả dứa, Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học
Cần thơ.
Lê Ngọc Tú (2003), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật.
Lê Ngọc Tú (2004), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội.
Lê Văn Việt Mẫn (2003), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống (tập 1), Nhà xuất
bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
Nguyễn Công Hà, Bài Giảng Kỹ thuật thực phẩm 3, Trường Đại Học Cần Thơ
Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh.
Phạm Thị Trân Châu (2007), Công nghệ sinh học Enzyme và ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục.
Phạm Thu Cúc (1999), Giáo trình sinh hóa I, Tủ sách Đại Học Cần Thơ, 1999.
Tiếng Anh
Arnord, F. H. a n d Goergiou, G. (2003), Directed enzyme evolution, Methods in molecular biology,

volume 23, Humana Press Inc.
Bartholomew, D. P., Paull, R. E. and Rohrbach, K. G. (2003), The Pineapple: Botany, Cultivation
and Ultilization. Interscience Publishers. New York.
Brown, J. R. (1975), Structure of Bovine Serum Albumin. Fed. Proc. 34; 591-591.
Bruno, M. A., Pardo, M. F., Caffini, N. O., López, L. M. I. and Hieronymain, I. (2003), a New
Cysteine Peptidase Isolated from Unripe Fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae),
Journal of Protein Chemistry, Volume 22, Number 2, pp. 127-134(8), Springer.
Fernander, G. and Pomilio, A. B. (2003), Optimized Growth Conditions and Determination of The
Catalytic Type of The Peptidase Complex From A Novel Callus Culture of Pineapple (Ananas
Comosus), Molecular Medicinal Chemistry, Vol 1, 39-49 p8.
Gerald Reed. (1966), Enzymes in food processing; Academic Press, Inc.
Harvey, M. and Ross, M. D. (1985), Understanding the wonder of bromelain, Reprint from:
BETTER NUTRITION The Consumers’ Guide To A Better, Healthier Life March 1985.
Heinick, R. M. and Gortner, W.A (1957). Stem bromelian from pineapple pant. Econ. Botany11,
225-234.
Paull, R.E., and Chen, C-C. (2003), 10 Postharvest physiology, handling and storage of pineapple,
University of Hawii at Manoa, 253-257.
Peter, T. (1985), Serum Albumin. Adv. Protein Chem. 37; 161-245.
Rowan A.D., D.J. Buttle and A.J. Barrett (1990), The cysteine proteinases of pineapple plant ,
Journal of Biochem. 266, 869 – 875 pp.
Một số địa chỉ website
http://doanhnghiep.vinamap.vn/estore.php?vportal=product&page=list&cm=597
http://longdinh.com/default.asp?act=chitiet&ID=4498&catID=3
http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html
http://www.casein.com/products.html
http://www.en.wikipedia.org/wiki/bromelain
http://www.friedli.com/research/PhD?Chapter5.html#struc
http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html
http://www.rauhoaquavietnam.vn/default.aspx?ID=1&LangID=1&tabID=5&NewsID=1911
http://books.google.com.vn
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Knunitz
(Nguồn: Kunitz (1947), citied by Fernander et al., 2003)
Nguyên tắc
Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein (casein hoặc
hemoglobin) bởi enzyme có trong dung dịch. Phản ứng thủy phân này sẽ được kết
thúc tại một thời điểm nhất định bằng trichloroacetic acid (TCA). Sản phẩm tạo thành
được xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm acid amin sinh ra (chủ yếu
là tyrosine) đo ở bước sóng 280 nm
Đơn vị hoạt tính của enzyme bromelain: được thể hiện qua đơn vị tyrosine (TU:
tyrosine unit). 1TU là lượng sản phẩm sinh ra tương đương với số mol tyrosine do sự
thủy phân casein của enzyme có trong 1 ml dung dịch trong thời gian 1 phút ở điều
kiện nhiệt độ và pH môt trường nhất định
Hoạt tính riêng của enzyme: là số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg protein (TU/mg)
Tiến hành thí nghiệm
 Chuẩn bị hóa chất

Dung dịch đệm Mcvaille: cân 35,85g NaH2PO4.12H2O hoà tan trong 500ml, cân 5,252
g acid citric hòa tan trong 250 ml. Trộn 88,25 ml acid với 411,75 ml muối điều chỉnh
về pH = 7.
Chất hoạt hóa cysteine 0,02M: cân 0,242g cysteine hòa tan với 100ml HCl 0,2N.
Dung dịch trichloroacetic (TCA) 15% (w/v): cân 15g TCA hòa tan với nước cất, sau
đó dùng nước cất định mức đến 100ml
Casein 1%: hòa tan 1g casein với 100ml dung dịch đệm Mc vaille, pH = 7. Dung dịch
này được đun cách thủy ở nhiệt độ 950C khoảng 1 giờ cho đến khi hòa tan hoàn toàn.
Sau đó bảo quản ở 40C và trước khi sử dụng phải ủ ấm dung dịch ở 370C khoảng 30
phút
 Các bước tiến hành thí nghiệm

Làm 2 mẫu thí nghiệm song song, trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực
hiện theo sơ đồ
Mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dung dịch TCA vào trước, casein vào
sau
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vii
Mẫu đối chứng Mẫu thật
200 l cystein 20mM 200 l cystein 20mM

700 l dd đệm pH=7 700 l dd đệm pH=7
100 l enzyme 100 l Enzyme
Ủ 370C, 20 ph Ủ 370C, 20 ph
Bổ sung 3000 l TCA 15% Bổ sung 3000 l casein 1%
Ủ 370C, 10 ph
Ủ 370C, 10 ph
Bổ sung 3000 l casein 1% Bổ sung 3000 l TCA 15%
Ốn định 40C, 10ph Ốn định 40C, 10ph
Lọc Lọc
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm Đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm
 Tính toán kết quả

Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức sau:
X  Vhh
TU = k
T  VE  10 3
Trong đó:
TU: hoạt tính enzyme (TU/ml)
X : nồng độ tyrosine (µmol/ml) *
Vhh : thể tích tổng của dung dịch phản ứng (4 ml)
T : thời gian phản ứng (10 phút)
VE: thể tích enzyme (100 µl)
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng viii
k: hệ số pha loãng (1)
* Nồng độ tyrosine (X) trong công thức trên được xác định dựa vào đường
chuẩn Tyrosine
Xây dựng đường chuẩn Tyrosine
Tyrosine được pha trong dung dịch HCl 0,2N
Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch tyrosine chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,1;
0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 µmol/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Lắc đều các ống nghiệm trên máy Vortex. Sau đó tiến hành đo OD của các dung dịch
ở bước sóng 280 nm
[Tyrosine]
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,8 1 1,2
(µmol/ml)
OD
0 0,128 0,225 0,363 0,467 0,692 0,920 1,124 1,328
(280 nm)
Từ kết quả đo OD, ta thiết lập được mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ
tyrosine trong dung dịch.
1.6
1.4
y = 1.129x
Mật độ quang A
1.2 2
R = 0.9986
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Nồng độ Tyrosine (mmol/l)
Hình 1: Đường chuẩn tyrosine
Phân tích protein bằng phương pháp Bradford
Nguyên tắc
Hàm lượng protein được xác định dựa trên phản ứng tạo màu giữa protein có trong
dung dịch với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue. Cường độ màu của hỗn hợp phản
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ix
ứng ở bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với hàm lượng protein trong một phạm vi nhất
định. Biết được mật độ quang của dung dịch protein nghiên cứu với thuốc thử
Coomassie Brilliant Blue, dựa trên đường chuẩn của protein tinh khiết Bovine Serum
Albumin (BSA) với thuốc thử này tính được lượng protein của mẫu nghiên cứu.
Tiến hành thí nghiệm
 Chuẩn bị hóa chất

Chuẩn bị thuốc thử bằng cách hòa tan 100 mg Coomassie brilliant blue G-250 vào
trong 50 ml ethanol (96%, v/v). Sau đó thêm vào 100 ml H 3PO4 (85%, w/v) và dẫn
nước cất đến 1lít.
 Các bước tiến hành thí nghiệm

 Bật máy Spectrophotometer và cho khởi động ít nhất 10 phút.
 Dùng pipette lấy chính xác 20l mẫu cho vào cuvette nhựa loại 1ml, sau đó thêm
50l NaOH 1M vào trong mẫu.
 Thêm vào 1ml thuốc nhuộm màu, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian
15 phút.
 Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm. Đối chiếu với đường chuẩn ta xác định được
hàm lượng protein có trong mẫu.
Xây dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,03;
0,12; 0,18; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1 mg/ml. Tiến hành xác định hàm lượng
protein của các dung dịch nói trên bằng phương pháp bradford. Thí nghiệm lặp lại 3
lần.
Ghi nhận giá trị OD của các dung dịch nói trên ở bước sóng 595 nm
[BSA] OD
0,03 0,030
0,12 0,101
0,18 0,123
0,3 0,180
0,4 0,279
0,5 0,374
0,6 0,454
0,7 0,528
0,8 0,588
0,9 0,631
1 0,700
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng x
Từ kết quả đo OD, ta thiết lập được mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ BSA
trong dung dịch.
0.8
0.7
y = 0.7193x
Độ truyền quang A 0.6
R 2 = 0.9931
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Nồng độ BSA (mg/ml)
Hình 2: Đường chuẩn protein
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xi
PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỒNG KÊ

1. Thí nghiệm 1
 Hoạt tính enzyme (Tu/ml)
ANOVA Table for Hoat tinh enzyme by Do chin
Analysis of Variance
-----------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 10.7357 4 2.68393 2186.68 0.0000
Within groups 0.012274 10 0.0012274
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 10.748 14
Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme by Do chin

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent LSD
Do chin Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
100 3 1.494 X
75 3 2.25933 X
50 3 2.989 X
25 3 3.20767 X
0 3 3.97467 X
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 25 *0.767 0.0637369
0 - 50 *0.985667 0.0637369
0 - 75 *1.71533 0.0637369
0 - 100 *2.48067 0.0637369
25 - 50 *0.218667 0.0637369
25 - 75 *0.948333 0.0637369
25 - 100 *1.71367 0.0637369
50 - 75 *0.729667 0.0637369
50 - 100 *1.495 0.0637369
75 - 100 *0.765333 0.0637369
--------------------------------------------------------------------------------
 Hàm lượng protein (mg/ml)
ANOVA Table for Ham luong Protein by Do chin
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 0.193328 4 0.0483319 93.21 0.0000
Within groups 0.00518533 10 0.000518533
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 0.198513 14
Multiple Range Tests for Ham luong Protein by Do chin

--------------------------------------------------------------------------------
Do chin Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
100 3 0.641 X
75 3 0.721667 X
50 3 0.783 X
25 3 0.876667 X
0 3 0.964 X
--------------------------------------------------------------------------------
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xii

--------------------------------------------------------------------------------
0 - 25 *0.0873333 0.0414272
0 - 50 *0.181 0.0414272
0 - 75 *0.242333 0.0414272
0 - 100 *0.323 0.0414272
25 - 50 *0.0936667 0.0414272
25 - 75 *0.155 0.0414272
25 - 100 *0.235667 0.0414272
50 - 75 *0.0613333 0.0414272
50 - 100 *0.142 0.0414272
75 - 100 *0.0806667 0.0414272
--------------------------------------------------------------------------------
2. Thí nghiệm 2
Table of Least Squares Means for Hoat tinh
with 95.0 Percent Confidence Intervals
---------------------------------------------------------------------------
Stnd. Lower Upper
Level Count Mean Error Limit Limit
---------------------------------------------------------------------------
-----
GRAND MEAN 126 1.88781
Nhiet do
30 21 2.37381 0.201343 1.97495 2.77267
40 21 3.64819 0.201343 3.24933 4.04705
50 21 3.23929 0.201343 2.84043 3.63814
60 21 1.91252 0.201343 1.51366 2.31138
70 21 0.153048 0.201343 -0.245811
0.551906
80 21 0.0 0.201343 -0.398859
0.398859
pH
3 18 0.0181667 0.217475 -0.41265
0.448983
4 18 1.134 0.217475 0.703183 1.56482
5 18 2.31656 0.217475 1.88574 2.74737
6 18 3.002 0.217475 2.57118 3.43282
7 18 2.84089 0.217475 2.41007 3.27171
8 18 2.10017 0.217475 1.66935 2.53098
9 18 1.80289 0.217475 1.37207 2.23371
---------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nhiet do
--------------------------------------------------------------------------------
Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
80 21 0.0 X
70 21 0.153048 X
60 21 1.91252 X
30 21 2.37381 X
50 21 3.23929 X
40 21 3.64819 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
30 - 40 *-1.27438 0.564072
30 - 50 *-0.865476 0.564072
30 - 60 0.461286 0.564072
30 - 70 *2.22076 0.564072
30 - 80 *2.37381 0.564072
40 - 50 0.408905 0.564072
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xiii
40 - 60 *1.73567 0.564072
40 - 70 *3.49514 0.564072
40 - 80 *3.64819 0.564072
50 - 60 *1.32676 0.564072
50 - 70 *3.08624 0.564072
50 - 80 *3.23929 0.564072
60 - 70 *1.75948 0.564072
60 - 80 *1.91252 0.564072
70 - 80 0.153048 0.564072
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for Hoat tinh by pH
--------------------------------------------------------------------------------
pH Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
3 18 0.0181667 X
4 18 1.134 X
9 18 1.80289 X
8 18 2.10017 X
5 18 2.31656 XX
7 18 2.84089 XX
6 18 3.002 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
3 - 4 *-1.11583 0.609267
3 - 5 *-2.29839 0.609267
3 - 6 *-2.98383 0.609267
3 - 7 *-2.82272 0.609267
3 - 8 *-2.082 0.609267
3 - 9 *-1.78472 0.609267
4 - 5 *-1.18256 0.609267
4 - 6 *-1.868 0.609267
4 - 7 *-1.70689 0.609267
4 - 8 *-0.966167 0.609267
4 - 9 *-0.668889 0.609267
5 - 6 *-0.685444 0.609267
5 - 7 -0.524333 0.609267
5 - 8 0.216389 0.609267
5 - 9 0.513667 0.609267
6 - 7 0.161111 0.609267
6 - 8 *0.901833 0.609267
6 - 9 *1.19911 0.609267
7 - 8 *0.740722 0.609267
7 - 9 *1.038 0.609267
8 - 9 0.297278 0.609267
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Regression Analysis

-----------------------------------------------------------------------------
Dependent variable: Hoat tinh
-----------------------------------------------------------------------------
Standard T
Parameter Estimate Error Statistic P-Value
-----------------------------------------------------------------------------
CONSTANT -12.1632 1.64681 -7.38587 0.0000
Nhiet do 0.232797 0.0440909 5.27993 0.0000
pH 3.40032 0.355162 9.57397 0.0000
Nhiet do*Nhiet do -0.00223918 0.000369569 -6.05891 0.0000
pH*pH -0.218751 0.026612 -8.22 0.0000
Nhiet do*pH -0.00902452 0.00269895 -3.34372 0.0011
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xiv
-----------------------------------------------------------------------------
Model 331.094 5 66.2188 61.84 0.0000
Residual 128.496 120 1.0708
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 459.589 125
R-squared = 72.0412 percent

R-squared (adjusted for d.f.) = 70.8763 percent
Standard Error of Est. = 1.03479
Mean absolute error = 0.853058
Durbin-Watson statistic = 0.405079
3. Thí nghiệm 3
ANOVA Table for Hoat tinh by Nong do Casein
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 13.9593 8 1.74492 1514.88 0.0000
Within groups 0.0207333 18 0.00115185
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 13.9801 26
Multiple Range Tests for Hoat tinh by Nong do Casein
--------------------------------------------------------------------------------
Nong do Casein Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
0.2 3 1.92 X
0.3 3 2.65333 X
0.4 3 3.01333 X
0.5 3 3.29667 X
0.6 3 3.55 X
0.7 3 3.72333 X
0.8 3 3.85 X
1.4 3 4.24 X
1 3 4.24333 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0.2 - 0.3 *-0.733333 0.0582188
0.2 - 0.4 *-1.09333 0.0582188
0.2 - 0.5 *-1.37667 0.0582188
0.2 - 0.6 *-1.63 0.0582188
0.2 - 0.7 *-1.80333 0.0582188
0.2 - 0.8 *-1.93 0.0582188
0.2 - 1 *-2.32333 0.0582188
0.2 - 1.4 *-2.32 0.0582188
0.3 - 0.4 *-0.36 0.0582188
0.3 - 0.5 *-0.643333 0.0582188
0.3 - 0.6 *-0.896667 0.0582188
0.3 - 0.7 *-1.07 0.0582188
0.3 - 0.8 *-1.19667 0.0582188
0.3 - 1 *-1.59 0.0582188
0.3 - 1.4 *-1.58667 0.0582188
0.4 - 0.5 *-0.283333 0.0582188
0.4 - 0.6 *-0.536667 0.0582188
0.4 - 0.7 *-0.71 0.0582188
0.4 - 0.8 *-0.836667 0.0582188
0.4 - 1 *-1.23 0.0582188
0.4 - 1.4 *-1.22667 0.0582188
0.5 - 0.6 *-0.253333 0.0582188
0.5 - 0.7 *-0.426667 0.0582188
0.5 - 0.8 *-0.553333 0.0582188
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xv
0.5 - 1 *-0.946667 0.0582188

0.5 - 1.4 *-0.943333 0.0582188
0.6 - 0.7 *-0.173333 0.0582188
0.6 - 0.8 *-0.3 0.0582188
0.6 - 1 *-0.693333 0.0582188
0.6 - 1.4 *-0.69 0.0582188
0.7 - 0.8 *-0.126667 0.0582188
0.7 - 1 *-0.52 0.0582188
0.7 - 1.4 *-0.516667 0.0582188
0.8 - 1 *-0.393333 0.0582188
0.8 - 1.4 *-0.39 0.0582188
1 - 1.4 0.00333333 0.0582188
--------------------------------------------------------------------------------
Kết quả thống kê ảnh hưởng nồng độ cơ chất casein đến hoạt tính enzyme
bromelain bằng chương trình sas qua phương trình Michaelis-Menten
Approx
Parameter Estimate Std Error Approximate 95% Confidence Limits
vmax 5.4607 0.1411 5.1354 5.7860

Km 0.3309 0.0246 0.2742 0.3876
data Nitofoocmon;
input conc act;
cards;
0 0.000
0.2 1.923
0.3 2.647
0.4 3.013
0.5 3.296
0.6 3.552
0.7 3.719
0.8 3.851
1 4.234
1.4 4.280
;
proc nlin data=Nitofoocmon method=marquardt maxiter=1000;
parms vmax=0.01 to 0.2 by 0.01
Km=0 to 50 by 0.01;
Model act=vmax*(conc/(conc+Km));
Output out=Nitofoocmon p=predict r=residu;
run;
goptions reset=all
gunit=cm
horigin= 4 cm
hsize=11 cm
vorigin=1 cm
vsize=9 cm;
Title1 h=0.45 f=simulate 'Do thi Michaelis-Menten-Bromelain';
symbol1 V=triangle c=black h=0.4 I=none;
symbol2 V=none c=black h=0.3 I=join;
axis1 LABEL = (F=simulate H=0.35 '[Nong do co chat casein](%)')
order=0 to 1.4 by 0.2
VALUE = (F=simulate H=0.35);
axis2 LABEL = (a=90 F=simulate H=0.35 'Tyrosine (micromol/phut)')
order=0 to 5 by 1
VALUE = (F=simulate H=0.35);
proc gplot data=Nitofoocmon;
plot act*conc/ frame haxis=axis1 vaxis=axis2;
plot2 predict*conc/ haxis=axis1 vaxis=axis2 noaxis nolegend;
run;
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xvi
4. Thí nghiệm 4
 Nhiệt độ thường (300C)
ANOVA Table for Nhiet do thuong by Nong do NaCl
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 0.132736 5 0.0265473 26547.30 0.0000
Within groups 0.000012 12 0.000001
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 0.132748 17
Multiple Range Tests for Nhiet do thuong by Nong do NaCl
--------------------------------------------------------------------------------
Nong do NaCl Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
30 3 2.402 X
25 3 2.445 X
20 3 2.484 X
15 3 2.537 X
10 3 2.586 X
0 3 2.657 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 10 *0.071 0.001779
0 - 15 *0.12 0.001779
0 - 20 *0.173 0.001779
0 - 25 *0.212 0.001779
0 - 30 *0.255 0.001779
10 - 15 *0.049 0.001779
10 - 20 *0.102 0.001779
10 - 25 *0.141 0.001779
10 - 30 *0.184 0.001779
15 - 20 *0.053 0.001779
15 - 25 *0.092 0.001779
15 - 30 *0.135 0.001779
20 - 25 *0.039 0.001779
20 - 30 *0.082 0.001779
25 - 30 *0.043 0.001779
--------------------------------------------------------------------------------
 Nhiệt độ tối ưu (500C)
ANOVA Table for Nhiet do toi uu by Nong do NaCl
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 2.66439 5 0.532879 159863.67 0.0000
Within groups 0.00004 120.00000333333
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 2.66443 17
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xvii
Multiple Range Tests for Nhiet do toi uu by Nong do NaCl
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
30 3 4.875 X
25 3 4.939 X
20 3 4.992 X
15 3 5.003 X
10 3 5.063 X
0 3 5.995 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 10 *0.932 0.00324799
0 - 15 *0.992 0.00324799
0 - 20 *1.003 0.00324799
0 - 25 *1.056 0.00324799
0 - 30 *1.12 0.00324799
10 - 15 *0.06 0.00324799
10 - 20 *0.071 0.00324799
10 - 25 *0.124 0.00324799
10 - 30 *0.188 0.00324799
15 - 20 *0.011 0.00324799
15 - 25 *0.064 0.00324799
15 - 30 *0.128 0.00324799
20 - 25 *0.053 0.00324799
20 - 30 *0.117 0.00324799
25 - 30 *0.064 0.00324799
--------------------------------------------------------------------------------
 Hoạt tính còn lại khi bổ sung muối NaCl
 Nhiệt độ thường (300C)

ANOVA Table for Nhiet do thuong by Nong do NaCl
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 188.215 5 37.6431 45171.70 0.0000
Within groups 0.01 12 0.000833333
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 188.225 17
Table of Means for Nhiet do thuong by Nong do NaCl

with 95.0 percent LSD intervals
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. error
Nong do NaCl Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit
--------------------------------------------------------------------------------
0 3 100.0 0.0166667 99.9743 100.026
10 3 97.33 0.0166667 97.3043 97.3557
15 3 95.4833 0.0166667 95.4577 95.509
20 3 93.4867 0.0166667 93.461 93.5123
25 3 92.0167 0.0166667 91.991 92.0423
30 3 90.4 0.0166667 90.3743 90.4257
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 94.7861
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xviii
Multiple Range Tests for Nhiet do thuong by Nong do NaCl
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
30 3 90.4 X
25 3 92.0167 X
20 3 93.4867 X
15 3 95.4833 X
10 3 97.33 X
0 3 100.0 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 10 *2.67 0.0513552
0 - 15 *4.51667 0.0513552
0 - 20 *6.51333 0.0513552
0 - 25 *7.98333 0.0513552
0 - 30 *9.6 0.0513552
10 - 15 *1.84667 0.0513552
10 - 20 *3.84333 0.0513552
10 - 25 *5.31333 0.0513552
10 - 30 *6.93 0.0513552
15 - 20 *1.99667 0.0513552
15 - 25 *3.46667 0.0513552
15 - 30 *5.08333 0.0513552
20 - 25 *1.47 0.0513552
20 - 30 *3.08667 0.0513552
25 - 30 *1.61667 0.0513552
--------------------------------------------------------------------------------
 Nhiệt độ tối ưu (500C)

ANOVA Table for Nhiet do toi uu by Nong do NaCl
-----------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 741.416 5 148.283 92356.29 0.0000
Within groups 0.0192667 12 0.00160556
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 741.435 17
Table of Means for Nhiet do toi uu by Nong do NaCl

with 95.0 percent LSD intervals
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. error
Nong do NaCl Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit
--------------------------------------------------------------------------------
0 3 100.0 0.0231341 99.9644 100.036
10 3 84.4433 0.0231341 84.4077 84.479
15 3 83.4533 0.0231341 83.4177 83.489
20 3 83.27 0.0231341 83.2344 83.3056
25 3 82.3867 0.0231341 82.351 82.4223
30 3 81.3167 0.0231341 81.281 81.3523
--------------------------------------------------------------------------------
Total 18 85.8117
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xix
Multiple Range Tests for Nhiet do toi uu by Nong do NaCl
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
30 3 81.3167 X
25 3 82.3867 X
20 3 83.27 X
15 3 83.4533 X
10 3 84.4433 X
0 3 100.0 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 10 *15.5567 0.0712833
0 - 15 *16.5467 0.0712833
0 - 20 *16.73 0.0712833
0 - 25 *17.6133 0.0712833
0 - 30 *18.6833 0.0712833
10 - 15 *0.99 0.0712833
10 - 20 *1.17333 0.0712833
10 - 25 *2.05667 0.0712833
10 - 30 *3.12667 0.0712833
15 - 20 *0.183333 0.0712833
15 - 25 *1.06667 0.0712833
15 - 30 *2.13667 0.0712833
20 - 25 *0.883333 0.0712833
20 - 30 *1.95333 0.0712833
25 - 30 *1.07 0.0712833
--------------------------------------------------------------------------------
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xx

TCT 2010 135902

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

TCT 2010 135902

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

NGUYÊN CỨU HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ

Cần thơ, 5/2010

NGUYÊN CỨU HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

Cần thơ, 5/2010

Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện 1

TS. NGUYỄN CÔNG HÀ Bùi Thị Quỳnh Hoa

Giáo viên phản biện 2

Nguyễn Bảo Lộc

Cần Thơ, ngày 28 tháng 05 năm 2010

Chủ Tịch Hội Đồng

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

Cần thơ, ngày 17 tháng 5 năm 2010

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

Hoạt tính enzyme bromelain bị giảm bởi muối NaCl.

DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein....................................................... 14

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Hình 1 Hình 2 Hình 3

Hình 2: Dứa Cayenne

Hình 3: Ruộng dứa

Tên thương mại: bromanase, bromelain 2400 Maximum Strength

- Gly – Cys – Lys –

Nếu bỏ qua phản ứng ng ược P + S  ES

 k1[S] Etot = (k-1 + kcat + k1 [S] ) [ES]

 [ES] = [S] Etot / (K m +[S])

Các giới hạn của phương trình Michaelis – Menten

Trong trường hợp

V  (kcat/Km) [S] [E]

Kcat/Km  109/ (M sec)

V  (1/2) Vmax = (1/2) kcat Etot

Ý nghĩa của hằng số Michaelis – Menten

K m có đơn vị là Molar, khi [S] = K m thì V = V max /2 và ngược lại.

2.3.3 Phương trình Line Weaver

Nghịch đảo 2 vế phương trình:

Hình 8: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver

2.3.4 Phương trình Eadie-Hofstee

Hình 9 : Đồ thị biểu diễn ph ương trình Eadie-Hofstee

2.4 Giới thiệu về cơ chất casein

Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein

2.5 Giới thiệu về cơ chất Bovine Serum Albumin (BSA)

Bảng 2: Thành phần acid amin trong phân tử BSA

2.6 Một số ứng dụng của enzyme bromelain

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), (Trung Quốc)

- Acid hydrochlorid 0,1N (Trung Quốc)

- Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác

Ly tâm lạnh, 6000 v/p, 20 phút

3.3 Bố trí thí nghiệm

B1: pH = 3 B2: pH = 4 B3: pH = 5 B4: pH = 6

iii. Tiến trình thí nghiệm

iii. Tiến trình thí nghiệm

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN THẢO LUẬN

Hình 11: Dứa ở các độ chín từ 0-100%