DKC 2016 121826

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TÍNH

CHẤT CỦA ANTHOCYANIN TỪ GẠO ĐEN HỮU CƠ
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Lệ Hà
Sinh viên thực hiện: Đinh Thị Kiều My
MSSV: 1211110099 Lớp: 12DTP01
TP. Hồ Chí Minh, 2016

Đồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Lệ Hà
LỜI CAM ĐOAN
Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh,
nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hoàn tất chương trình học của mình. Tôi cam
đoan đây là nghiên cứu do tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh
học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Những số liệu trong bài hoàn toàn trung thực chưa từng có ai công bố.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm

2016
Sinh viên thực hiện
Đinh Thị Kiều My
1
LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ là người cực
khổ nuôi nấng, dạy dỗ con thành người. Cha mẹ là người đầu tiên dạy con bước đi,
là người thầy giáo đầu tiên dạy con biết từng con chữ, dạy con khi vấp ngã phải biết
đứng lên và những kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống. Cha mẹ luôn dõi theo con
trên bước đường đời, cho dù con ở đâu làm gì con luôn biết cha mẹ luôn ủng hộ cho
con, là chỗ dựa vững chắc cho con.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô
Khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, cùng toàn thể Thầy Cô Trường
Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em
những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước
chân vào giảng đường đại học.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng
kính, đã luôn tận tình chỉ dẫn, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành phần thực nghiệm của đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung
Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa
Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ
Chí Minh.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 12DTP01 đã luôn khích lệ, động viên và giúp đỡ
mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016
SVTH: Đinh Thị Kiều My
2
MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC HÌNH................................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG............................................................................................... vii
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 4
Gạo đen............................................................................................................... 4
1.1.1. Khái niệm..........................................................................................................................................4
1.1.2. Nguồn gốc của gạo đen hữu cơ........................................................................ 4
1.1.3. Công dụng của gạo đen hữu cơ....................................................................... 5
1.2. Anthocyanin....................................................................................................... 6
1.2.1 Giới thiệu............................................................................................................................................6
1.2.2. Sự phân bố của Anthocyanin........................................................................... 7
1.2.3. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin.................................................................. 8
1.2.4. Tính chất của Anthocyanin............................................................................ 12
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của Anthocyanin...................14
1.2.5.1. Cấu trúc...................................................................................................... 14
1.2.5.2. pH............................................................................................................... 18
1.2.5.3. Nhiệt độ...................................................................................................... 20
1.2.5.4. Oxy............................................................................................................. 22
1.2.5.5. Enzyme....................................................................................................... 22
1.2.5.6. Ánh sáng..................................................................................................... 23
1.2.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng.............................................. 24
i
1.2.5.8. Các ion kim loại......................................................................................... 25
1.2.5.9. Sulfurdioxide (SO2)................................................................................... 26
1.2.5.10. Acid ascorbic............................................................................................ 26
1.2.6. Các Anthocyanin đã được thương mại hóa.................................................... 29
1.3. Những kết quả nghiên cứu trong nước và thế giới............................................ 29
1.3.1. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ gạo................................................. 29
1.3.2. Phương pháp trích ly Anthocyanin từ quả dâu Hội An.............................................30
1.3.3. Phương pháp tách triết Anthocyanin từ bắp cải tím...................................................31
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................... 32
2.1. Nguyên vật liệu................................................................................................ 32
2.1.1. Nguồn gạo đen.............................................................................................. 32
2.1.2. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................................... 32
2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm......................................................................... 33
2.2.1. Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen...........33
2.2.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi Nước-EtOH trong quá trình trích ly....................35
2.2.1.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu tấm trong dịch trích ly....................................... 36
2.2.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen................38
2.1.2.4. Xác định thời gian thích hợp trích ly Anthocyanin từ gạo đen...................39
2.2.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen....40
2.2.2.1. Sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở các pH khác nhau..........................40
2.2.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác
nhau......................................................................................................................... 42
2.2.2.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly gạo đen trước khi cô quay
và sau khi cô quay................................................................................................... 43
ii
2.3. Các phương pháp phân tích dùng trong thí nghiệm.......................................... 43
2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................ 43
CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 44
3.1. Xác định các thông số cho quy trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen.............44
3.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi nước: ethanol trong pha chế dung môi trích ly
Anthocyanin từ gạo đen.......................................................................................... 44
3.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trong quá trình trích ly anthocyanin từ
gạo đen.................................................................................................................... 46
3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen. . 47
3.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen...........53
3.3.1. Sự biến đổi của hàm lượng anthocyanin ở những pH khác nhau.........................53
3.3.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác
nhau...............................................................................................................................................................54
3.3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly từ gạo đen...............................................58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ.....................................................................................63
4.1. Kết luận...............................................................................................................................................63
4.2 Kiến nghị.............................................................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 68
PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM...................................................................... 7
iii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Gạo đen...................................................................................................... 4
Hình 1.2 Cấu trúc phổ biến của Anthocyanin.......................................................... 11
Hình 1.3. Cation Flavylium..................................................................................... 12
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước................................15
Hình 1.5 Những màu sắc phổ biến của các loại athocyanin....................................18
Hình 1.6 Sự chuyển đổi cấu trúc của anthocyanin trong điều kiện môi trường pH khác
nhau......................................................................................................................... 20
Hình 1.7 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7...............21
Hình 1.8. Sự biến tính Anthocyanin với phản ứng oxy hóa atechol........................23
Hình1.9. Phản ứng ngưng tụ.................................................................................... 25
Hình 1.10. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và Anthocyanin
(Wiley, 2005).......................................................................................................... 26
Hình 1.11. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa
Ascorbic acid (Wiley, 2005)................................................................................... 27
Hình 1.12. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và Anthocyanin.
27
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm khảo sát các thông số trích ly
34
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ H2O: Ethanol trong pha chế dung môi để
trích ly anthocyanin từ gạo đen hữu cơ................................................................... 35
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu thích hợp để trích ly
anthocyanin từ gạo đen........................................................................................... 37
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ
gạo đen.................................................................................................................... 38
iv
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly anthocyanin từ
gạo đen.................................................................................................................... 39
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm nghiên cứu tính chất của
Anthocyanin............................................................................................................ 40
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của pH đến hàm lượng
Anthocyanin trong dịch trích................................................................................... 41
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của
anthocyanin ở cá nhiệt độ khác nhau....................................................................... 42
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi H2O:EtOH đến hiệu suất trích ly anthocyanin
từ dịch chiết............................................................................................................. 44
Hình 3.2. Dịch trích ly các dung môi ở những tỷ lệ khác nhau...............................45
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi đến hiệu
suất trích ly Anthocyanin từ gạo đen hữu cơ........................................................... 46
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly
Anthocyanin từ dịch chiết....................................................................................... 48
Hình 3.5 Dịch trích ly anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau................................. 50
Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến trích ly đến hiệu suất trích
ly Anthocyanin trong dịch chiết.............................................................................. 51
Hình 3.7 Dịch trích ly anthocyanin ở các thời gian khác nhau................................ 52
Hình 3.8. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi độ hấp thu của anthocyanin ở nhưng mức pH
khác nhau................................................................................................................ 53
0
Hình 3.9. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 0 C.............54
0
Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở 20 C..........55
0
Hình 3.11. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 0 C...........56
v
Hình 3.12. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở các nhiệt độ
khác nhau................................................................................................................ 57
Hình 3.13. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C..............................58
Hình 3.14. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch Anthocyanin được
trích ly từ tấm đen................................................................................................... 59
trích ly từ tấm đen sau cô quay................................................................................ 60
Hình 3.16. Phản ứng màu của dung dịch DPPH khi cho dịch mẫu trích ly anthocyanin
từ gạo đen ............................................................................................................... 61
Hình 3.17. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly Anthocyanin từ
gạo đen.................................................................................................................... 63
Hình 4.1. Dịch chiết Anthocyanin trước cô quay.................................................... 65
Hình 4.2. Dịch chiết sau cô đặc............................................................................... 66
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen.............................................................. 5
Bảng 1.2. Bảng các Anthocyanin có nguồn gốc thực vật.......................................... 8
Bảng 1.3. Một số Anthocyanin phổ biến................................................................... 9
Bảng 1.4 Các nhóm Anthocyanin hiện có............................................................... 10
Bảng 3.1. Giá trị %I à IC50 của vitamin C............................................................... 58
Bảng 3.2. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trước
khi cô quay.............................................................................................................. 59
Bảng 3.3. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen sau cô
quay......................................................................................................................... 60
Bảng 3.4. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và Anthocyanin...........................61
Bảng 4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin………………………63
vii
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Anthocyanin có mặt trong nhiều loại rau quả từ thiên nhiên. Chất màu
Anthocyanin là có độ hòa tan trong nước và trong các dung môi phân cực, nên
chúng có thể dễ dàng trích ly bằng những dung môi trích ly thông thường mà không
độc hại đối với môi trường. Bên cạnh đó màu sắc của chúng trải dài từ màu đỏ, màu
tím và màu xanh, có thể ứng dụng vào việc làm phụ gia tạo màu trong thực phẩm
nhưng không độc hại.
Thêm vào đó Anthocyanin có giá trị sinh học rất cao, chúng được đưa vào chế
độ ăn uống trong nhiều thế kỷ qua, nhờ vào tác dụng sinh học rất tốt như có khả năng
điều trị chứng huyết áp cao, sốt, rối loạn gan, rối loạn tiêu hóa. Với xu hướng của thế
giới hiện nay, mọi người luôn ưa chuộng những sản phẩm có thành phần từ thiên nhiên,
lành mạnh đối với sức khỏe con người. Anthocyanin đã được đưa vào sử dụng dưới
dạng sản phẩm thực phẩm hay chất màu trong thực phẩm của con người.
Với một đất nước nông nghiệp như Việt Nam từ ngàn xưa gạo đã trở thành
nguồn lương thực thiết yếu, nuôi sống biết bao thế hệ. Nhưng ngày nay với cuộc sống
không ngừng phát triển, quá trình đô thị hóa diễn ra mạnh mẽ, môi trường ngày càng bị
ô nhiễm trầm trọng. Những hóa chất độc hại duới danh nghĩa là phụ gia thực phẩm
đang thâm nhập vào cơ thể con người mỗi ngày. Hiện nay Việt Nam là nước thuộc top
2 - những quốc gia dẫn đầu về tỷ lệ mắc bệnh ung thư, mỗi năm có khoảng 70000
người chết vì bệnh ung thư và 200 000 mắc mới về bệnh ung thư. Trong vòng năm năm
nữa ung thư có thể sẽ trở thành đại dịch ở Việt Nam. Bên cạnh đó theo điều tra mới
nhất của hội tim mạch Việt Nam, 2016 có 48% người Việt Nam mắc bệnh tăng huyết
áp, đây là một con số đáng báo động. Trong những năm gần đây các nghiên cứu khoa
học luôn hướng về những nghiên cứu tạo ra sản phẩm được chiết xuất từ thiên nhiên,
cải thiện sức khỏe, chống oxy hóa, nâng cao sức đề kháng của con người.
Với mong muốn có những chất màu từ thiên nhiên thay thế những chất màu
hóa học đang từng ngày thâm nhập vào cơ thể con người, một thức uống giàu hợp
1
chất chống oxy hóa giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng có thể chống lại bệnh ung
thư. Nhóm nghiên cứu quyết định chọn nguồn gạo đen hữu cơ từ thiên nhiên, không
thuốc trừ sâu, không phân bón hóa học làm nguồn trích ly cho đề tài trích ly
Anthocyanin, bên cạnh đó cũng sẽ nghiên cứu những tính chất cơ bản của
Anthocyanin để phục vụ cho quá trình bảo quản Anthocyanin để duy trì những hoạt
tính sinh học của chúng trong quá trình bảo quản.
2. Mục đích nghiên cứu

Đề tài có hai mục đích bản bao gồm:
Xác định các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu
Anthocyanin nhằm tách chiết tối đa Anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục
đích ứng dụng vào thực phẩm.
Nghiên cứu những tính chất của Anthocyanin trong quá trình bảo quản dịch
chiết từ gạo đen.
3. Nội dung nghiên cứu.
Để thực hiện mục đích nghiên cứu đã đề ra, nhóm nghiên cứu thực hiện các
nội dung sau:
 Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocaynin từ gạo đen:
- Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin.
- Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp cho quá trình trích ly
Anthocyanin.
- Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin.
- Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin.
 Xác định những tính chất của dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen:
- Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của Anthocyanin.
- Nghiên cứu những tính chất của Anthocyanin.
2
4. Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở
bố trí thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu.
- Thực hành trong phòng thí nghiệm.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Gạo đen
1.1.1. Khái niệm
Gạo đen là loại gạo thuộc giống Oryza sativa L. “GẠO ĐEN” là loại gạo có
màu tím đậm hoặc đen nhưng khi nấu chín sẽ chuyển sang màu đỏ tía hoặc tím. Lớp
vỏ bên ngoài của gạo này là màu đen nhờ sắc tố Anthocyanin, một chất chống oxi
hóa. Loại gạo này được bán dưới dạng “chưa xay xát”, với lớp vỏ ngoài nguyên
vẹn. Cho đến ngày nay, không dễ dàng có thể mua được gạo đen; loại gạo này rất
đáng giá và được người dân châu Á quan tâm đặc biệt trong nhiều thế kỷ và xu
hướng tiêu thụ ngày càng cao ở Châu Âu, Bắc Mỹ
Hình 1.1 Gạo đen

Ngoài ra trong gạo đen còn có rất nhiều vitamin E giúp tăng cường hệ thống
miễn dịch, giàu chất xơ, chất sắt và các vitamin thiết yếu, đặc biệt hàm lượng đường
trong gạo đen thấp người tiểu đường dùng có thể ổn định lượng đường trong máu.
Theo kết quả nghiên cứu của TS. Zhimin Xu thuộc đại học bang Louisana, Mỹ. Ông
nói rằng trong một muỗng canh gạo đen chứa nhiều chất dinh dưỡng tốt cho sức
khỏe hơn bất cứ “siêu thực phẩm” nào, bởi một muỗng gạo đen chứa nhiều chất
chống oxy hóa (Anthocyanin) hơn một muỗng canh trái việt quất.
1.1.1. Nguồn gốc của gạo đen hữu cơ
4
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen.
Thành phần Tỷ lệ %
Nước 14
Protein 8,2
Lipid 1,5
Glucid 74,9
Acid hữu cơ 0,6
Tro 0,8
Gạo đen là loại gạo đặc biệt được sử dụng nhiều và tìm thấy ở các nước châu
Á Trung Quốc là nước có nhiều giống lúa đen hơn hết, tiếp theo Sri Lanka,
Indonesia, India, Philippines, Bangladesh và Việt Nam. Gạo đen thường tìm thấy ở
loại phôi nhủ đục sáp của các nhóm indica và japonica. Ở Việt Nam, gạo tím hay
đen được dùng làm thuốc và cho tín ngưỡng, chỉ được trồng ở các vùng núi, dưới
dạng gạo tẻ hoặc nếp.
Gạo đen hữu cơ được sản xuất từ phương pháp “canh tác hữu cơ”.
Lúa được trồng theo phương pháp canh tác hữu cơ, không sử dụng phân bón
hóa học, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ…, có sự kiểm soát, tác động của khoa học kỹ
thuật, công nghệ sinh học, sản phẩm được chế biến và đóng gói theo quy trình kép.
Canh tác hữu cơ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng gạo đen hữu cơ, đảm bảo an
toàn sức khỏa cho người tiêu dùng và thân thiện với môi trường.
1.1.2. Công dụng của gạo đen hữu cơ
Trong gạo đen chứa nhiều Anthocyanin, đây là hợp chất chống oxy hóa giúp
cơ thể chống lại nhiều bệnh. Nó giúp cơ thể giảm nguy cơ đau tim bằng cách ngăn
chặn sự tích tụ mảng bám trong động mạch. Ngoài ra nó giúp trung hòa những thiệt
hại của các gốc tự do, ngăn ngừa một số dạng ung thư, hỗ trợ giảm cholesterol trong
máu.
5
Gạo đen chứa nhiều chất xơ gấp 5,9 lần rau cần tây giúp làm giảm nồng độ
cholesterol, kiểm soát hệ thống tiêu hóa. Đối với người suy nhược cơ thể, chất xơ
này có tác dụng kích thích tiêu hóa, tăng hấp thu. Đối với người muốn giảm cân,
chất xơ làm giảm cảm giác đói vì vậy nhanh chóng đạt hiệu quả cần thiết. Ngoài ra
chất xơ có khả năng chống béo phì, ngừa ung thư ruột kết và rất tốt cho bệnh nhân
đái tháo đường.
Trong gạo đen hữu cơ chứa selenium gấp 3,3 lần lòng đỏ trứng. Selenium là
nguyên tố vi lượng chống oxy hóa mạnh, giúp khử các gốc tự do có trong cơ thể, giúp
ngăn ngừa sự phá hủy tế bào, đặc biệt là tế bào gan, tốt cho người uống rượu bia
thường xuyên, người có vấn đề về gan như viêm gan và xơ gan, ngăn ngừa ung thư.
Gạo hữu cơ đen chứa nhiều chất sắt, chất sắc là một phần của tế bào máu, nếu
cơ thể thiếu sắt sẽ dẫn đến thiếu máu. Trong gạo đen hữu cơ cung cấp chất sắt cao hơn
70% so với gạo lức và gấp 1,7 lần thịt bò, do đó gạo đen hữu cơ rất thích hợp cho
những phụ nữ thiếu máu sau khi sinh và những người cần bổ sung chất sắt tự nhiên.
Trong gạo đen hữu cơ còn có hàm lượng mangan (gấp 1,54 lần gạo lứt).
Mangan có tác dụng giúp giải phóng năng lượng từ protein, carbonhydrate, hỗ trợ
hệ thống miễn dịch và điều hòa hàm lượng đường trong máu.
Gạo đen hữu cơ có hàm lượng kẽm gấp 1,7 lần thịt trai. Kẽm tham gia vào
thành phần của hơn 80 loại enzym điển hình như peptidase, đóng vai trò quan trọng
cho quá trình tiêu hóa protein , phòng chống ung thư đường tiêu hóa, tắng cường hệ
thống miễn dịch.
Ngoài ra trong gạo đen hữu cơ còn chứa các thành phần dinh dưỡng: các
amino acid, các nhóm acid béo Omega-3 và Omega-6, hơn 120 chất chống oxy hóa
(acylated steryl glucoside, gama Aminobutyric) tác động mạnh mẽ lên gốc tự do.
Đặc biệt trong gạo đen hữu cơ có chỉ số đường huyết từ thấp đến trung bình
(< 58) nên rất thích hợp cho người tiểu đường.
1.2. Anthocyanin
1.2.1. Giới thiệu
6
Anthocyanin là hợp chất màu hữu cơ có nguồn gốc tự nhiên, thuộc

Flavonoid, là họ màu phổ biến nhất tồn tại ở thực vật bậc cao và tìm thấy được
trong một số loại hoa, quả, hạt như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, hoa
hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ…
Thuật ngữ Anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là
sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên,
không chỉ có màu xanh, Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực
rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Các Anthocyanissn khi mất
hết nhóm đường được gọi là Anthocyanidin hay aglycon. Mỗi Anthocyanidin có thể
bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau.
Vì thế lượng Anthocyanin lớn hơn Anthocyanidin từ 15-20 lần. Chúng được sử
dụng làm phụ gia thực phẩm với ký hiệu là E613.
1.2.2. Sự phân bố của Anthocyanin.
Anthocyanin tập trung ở những cây hạt kín và những loài ra hoa, phần lớn nằm
ở hoa và quả, ngoài ra cũng có ở lá và rễ. Trong những loại thưc vật này, Anthocyanin
được tìm thấy chủ yếu ở các lớp tế bào nằm bên ngoài như biểu bì.
Các hợp chất Anthocyanin xuất hiện rộng rãi trong khoảng ít nhất 27 họ, 73
loài và trong vô số giống thực vật sử dụng làm thực vật (Bridle và Timberiake,
1996). Các họ thực vật như vitaceae (nho) và rosaceae (cherry, dâu tây, mâm xôi,
táo...) là các nguồn Anthocyanin chủ yếu. Bên cạnh đó còn có các họ thực vật khác
như solanceae (cà tím), saxifragaceae (quả lý đỏ và đen), ericaceae (quả việt quất)
và brassicaceae (bắp cải tím). Các loại Anthocyanin phổ biến nhất là các glucoside
của cyanidin, kế đến là pelargonidin, peonidin và delphinidin, sau đó petuidin và
maldivin. Số lượng các 3-glucoside nhiều gấp 2,5 lần các 3,5-glucoside. Loại
Anthocyanin hay gặp nhất chính là Cyanidin-3-glucoside.
7
Bảng 1.2. Bảng các Anthocyanin có nguồn gốc thực vật
Tên thực vật Tên thông thường Loại Anthocyanin
Allium cepa Củ hành tím Cy-3-glucoside, 3-galactoside, 3-

diglucoside và 3-laminarriobiosidc, Pn-3-
glucoside
Brassica Bắp cải tím (red Cy-3-sophoroside-5-glucoside cacyl hóa

oleraea cabbage) với malonoyl, p-coumaroyl, di- p-
coumarol,feruloyl, diferuloyl, sinapoyl và
disinapoyl
Fragaria spp Dâu tây Pg và Cy-3-glucoside

(strawberry)
Glycine Đậu nành (vỏ) Cy và Dp-3-glucoside

maxima
Hibicus Hoa bụt dấm Cy, Pn, mono- và biosides

sabdariffa L
Raphanus Củ cải đỏ (rễ) Pg và Cy-3-sophoroside-5-glucoside acyl

sativus hóa với p-coumaroyl, feruloyl, caffeoyl.
Vitis spp Nho Cy, Pn, Dp, Pt và Mv mono và

diglucoside; dạng tự do và dạng acyl hóa
Cy = cyanidin, Pg= pelagorindin, Pn= peonidin, Dp= delphinidin, Pt =

petunidin, Mv= malvidin.
1.2.3. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin
Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khă năng hòa tan trong
nước và chứa các không bào. Về bản chất, các Anthocyanin là những hợp chất
glycoside của các dẫn xuất polyhydroxy và polymethoxy của 2-phenylbenzopyrylium
8
hoặc muối flavylium. Cho đến nay, người ta xác định được 18 loại aglycon khác
nhau, trong đó 6 loại phổ biến nhất là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, petunidin
và maldivin.
Bảng 1.3. Một số Anthocyanin phổ biến
Anthocyanin Anthocyanidin Đường Có ở cây
Pelargonin Pelargonidin 2 glucose Cúc tây
Cianin Cynanindin 2 glucose Hoa hồng
Ceraxinanin Cynanindin Glucose, galactose Quả mận
Prunixianin Cynanindin Ramnoza, glucose Việt quất
Idain Cyrinhindin 2 glucose Cẩm quỳ
Delfin Peonidin 2 glucose Mẫu đơn
Malvin Enidin glucose Nho
Peonin Hirsutidin 2 glucose Anh thảo
Trong tự nhiên, Anthocyanin rất hiếm gặp khi ở trạng thái tự do (không bị
glycoside hóa). Nhóm tự do ở vị trí C-3 làm cho phân tử anthocyanidin trở nên
không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với các Anthocyanin tương
ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra, đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxy. Nếu có
thêm một phân tử đường sữa, vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-
5. Ngoài ra, sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở các vị trí C-7, C-3’, C-5’. Loại đường
phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài monosaccharide (như galactose,
rammose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu là rutinose, sabubiose hay
sophorose) hoặc trisaccharide tham gia và quá trình glycosyl hóa.
9
Bảng 1.4 Các nhóm Anthocyanin hiện có
Anthocyanin R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Màu sắc E-

number
Apigeninidin -H -OH -H -H -OH -H -OH Cam
Aurantinidin -H -OH -H -OH -OH -OH -OH Cam
Capensinidin -OCH3 -OH - -OH - -H -OH Xanh-đỏ

OCH3 OCH3
Cyanidin -OH -OH -H -OH -OH -H -OH Đỏ sậm E163a
Delphinidin -OH -OH -OH -OH -OH -H -OH Tím, E163b

xanh
Europinidin -OCH3 -OH -OH -OH - -H -OH Xanh-

OCH3 đỏ
Hirsutidin -OCH3 -OH - -OH -OH -H - Xanh-

OCH3 OCH3 đỏ.
Luteolinidin -OH -OH -H -H -OH -H -OH Cam
Pelargonidin -H -OH -H -OH -OH -H -OH Cam, đỏ E163d

cam
Malvidin -OCH3 -OH - -OH -OH -H -OH Tím E163c

OCH3
Peonidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OH Đỏ sậm. E163e
Petunidin -OH -OH - -OH -OH -H -OH Tím E163f

OCH3
Pulchellidin -OH -OH -OH -OH - -H -OH Xanh-

OCH3 đỏ.
10
Rosinidin -OCH3 -OH -H -OH -OH -H - Đỏ

OCH3
Triacetidin -OH -OH -OH -H -OH -H -OH Đỏ
Hình 1.2 Cấu trúc phổ biến của Anthocyanin
(intechopen.com/books/the-mediterranean-genetic-code-grapevine-and-
olive/production-of-anthocyanins-in-grape-cell-cultures-a-potential-source-of-
raw-material-for-pharmaceuti)
Sự methoxyl hóa các Anthocyanin và các glucoside tương ứng diễn ra
thông thường nhất là ở vị trí C-3’, và C-5’, cũng có thể gặp ở vị trí C-5 và C-7. Tuy
nhiên cho đến nay người ta chưa tìm thấy một hợp chất nào bị glycosyl hóa ở tất cả
vị trí C-3,-5,-7,-4 do đó cần thiết phải có ít nhất một nhóm hydroxyl tự do ở C-5, -7
hay - 4’ để thành dạng cấu trúc quinonoidal base (dạng cấu trúc thường tồn tại trong
không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5).
11
Hình 1.3. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc

OCH3, R3 là glucosyl hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl)
(en.wikipedia.org/wiki/Anthocyanin)
Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C-3 của phân tử đường hay ester hóa ở
các nhóm hydroxy C-6. Các nhóm acyl hóa chính thức là các phenolic acid như
beta-coumercic, cafeic, ferulic hay sinap acid và một loạt các acid như acetic,
malonic, axalic và succinic.
1.2.4. Tính chất của Anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá
phân cực nên tan rất tốt trong dung môi hữu cơ phân cực. Anthocyanin hòa tốt trong
nước và trong dung dịch bão hòa. Khi kết hợp với đường làm cho phân tử
Anthocyanin hòa tan nhanh hơn.
Màu sắc Anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều
yếu tố khác,…Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng pyran thì màu càng xanh đậm.
Trong dung dịch acid, Anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ. Khi pH
tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, Anthocyanin chuyển dần sang
dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là quá trình hydrat hóa, yếu tố
chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước. trong dung dịch base, có sự dịch
chuyển của H+ từ -OH trên vòng B, Anthocyanin chuyển sang dạng anion có màu
xanh. Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trong nhóm –OH còn lại bị phân hủy và khi
ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ trở
12
thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch
có màu tím.
Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở trong vòng pyran càng cao thì màu đỏ
càng đậm. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc
cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít.
Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường:

Khi ở pH>7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH< các Anthocyanin
có màu đỏ.

Ở pH=1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến
màu đỏ.

Ở pH = 4-5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ Cacbinol hay bazơ
Chalcon không màu.

Ở pH = 7-8 lại về dạng bazơ Quinoidal Anhydro màu xanh.
Màu sắc của Anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ trên polysaccharide.
Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phá hủy và mất màu.
Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ
cực đại tại bước sóng 510 ÷ 540nm. Độ hấp thu là yếu tố liên quan mật thiết đến
màu sắc của Anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ
Anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ
Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.

Khả năng hòa tan của Anthocyanin:
Athocyanin là những hợp chất phân cực, do đó các dung môi phổ biến nhất
được sử dụng trong các phương pháp nghiên cứu là hỗn hợp dung dịch ethanol,
methanol hoặc acetone (Kahkone, Hopia & Heinoen, 2001). Trong số các phương pháp
phổ biến nhất là những người mà sử dụng chất trích ly là methanol hoặc ethanol
ở pH axit (Amr & Al Tamimi, 2007). Từ những phương pháp này, việc khai thác
với methanol là hiệu quả nhất (Kapasakalidis, Rastall, & Gordon, 2006); trong thực
tế, nó đã được tìm thấy rằng trích ly Anthocyanin từ bột nho, với việc tách chiết với
methanol là 20% hiệu quả hơn so với ethanol, và 73% hiệu quả hơn chỉ có nước
13
(Metivier, Francis, & Clydesdale, 1980). Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực
phẩm ethanol được ưa thích hơn do methanol rất độc. Trong Anthocyanin chiết từ
nho đen, một dung dịch nước. Trong một số nghiên cứu, dung môi với 80% EtOH
bão hòa với SO2 được sử dụng chiết tách Anthocyanin (Romani et al, 1999), trong
nghiên cứu quan sát rằng các loại dung môi, nồng độ SO 2 và nhiệt độ ảnh hưởng
đến quá trình khai thác Anthocyanin. Các Anthocyanin từ lúa miến đen được chiết
xuất với HCl 0,1% trong MeOH và 70% acetone dịch nước (Awika et al, 2005).
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của Anthocyanin.
So với đa số các chất màu thiên nhiên, Anthocyanin là chất màu có độ bền
kém hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid. Ngoài ra, nó có thể phân
hủy tạo thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng
màu nâu cộng với những sản phẩm không tan.
Sự phân hủy Anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế
chúng, đồng thời sự phân hủy này còn xảy ra trong quá trình xử lý và bảo quản các
sản phẩm thực phẩm.
Độ bền của các Anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa
học của Anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy,
acid ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phẩm biến tính của chúng.
Vì vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của Anthocyanin là điều cần
thiết trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm.
1.2.5.1. Cấu trúc
a. Cấu trúc chuyển hóa trong môi trường lỏng.

Trong môi trường nước các Anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH.
đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính và không màu ở pH cao.
14
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong

nước.(Jackman and Smith, 1992)
Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của Anthocyanin và
aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu
đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) không màu.
Khi pH < 2.0, các Anthocyanin tồn tại chủ yếu dạng cation flavylium màu đỏ
(R3=0-đường) hoặc màu vàng (R3 = H).Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh
thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinonoidal thường
tồn tại như một hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 (nếu có) là tương tự.
Khi để yên, sự chuyển hóa hơn nữa sẽ xảy ra đó là sự tách nước của cation
flavylium cho dạng carbinol không màu hay pseudobase (hemiacetal), dạng này cân
bằng với dạng chalcone vòng mở không màu.
Cis (CE) và trans-chalcone (Cz) được tạo thành từ carbinol pseudobase bởi
phản ứng mở vòng nhanh và isomer hóa chậm. Cả 2 chalcone bình thường bởi
chung có nhóm chức carbonyl ở cạnh vòng B, trong đó chalcone bình thường có
nhóm carbonyl ở kế cận vòng A.
Dạng quinonoidal base được tạo thành thông thường ở pH > 3. Cation flavylium
tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3). Trong môi trường trung tính hay acid
yếu, Anthocyanin tồn tại chủ yếu ớ các dạng không màu. Vì vậy, sự ổn định của các
dạng mang màu, đặc biệt là dạng quinonoidal base, một phần là do sự
15
xuất hiện của các gốc acid gắn vào phân tử đường, hay còn gọi là sự co-pigment hóa
nội phân tử. Sở dĩ sự co-pigment hóa nội phân tử giúp tăng độ bền của phân tử
Anthocyanin là do sự xếp chồng của vòng thơm trong gốc acid với vòng pyrylium
của phân tử Anthocyanin, giảm bớt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình
thành các hợp chất carbinol, chalcone không màu. Ngoài ra, hiệu ứng copiment hóa
ngoại phân tử cũng có thể giúp làm bền các cấu trúc quinoldal base hay ion
flavylium do sự có mặt của những phức chất không màu, như các flavone, flavonol.
Trong quá trình xử lý nhiệt và ánh sáng, quá trình co-pigment hóa ngoại phân tử giữ
vai trò quan trọng, ngăn chặn sự mất màu có thể xảy ra. Cơ chế phân hủy do nhiệt
nói chung do chuyển hóa thuận nghịch của các ion flavylium thành các dạng
chalcone. Chalcone là chất trung gian trong cả hai quá trình phân hủy do nhiệt và
ánh sáng của Anthocyanin. Theo các nghiên cứu gần đây (Davis và cộng sự, 1983;
Mazza và Brouiỉìard, 1990) hiệu ứng co-pigment hóa chính là cơ chế làm bền màu
chính của Anthocyanin trong thực vât do, nó làm giảm tỉ lệ giữa dạng không mang
màu (chalcone) và dạng mang màu thông qua việc tạo phức với dạng mang màu,
ngăn chặn quá trình chuyển hóa từ dạng mang màu sang dạng không mang màu.
Trong dung dịch, Anthocyanin dạng không acyl hóa hay acyl hóa một đơn
vị đóng vai trò như một chất chỉ thị pH, tồn tại ở dạng acid hay base tùy thuộc vào
giá trị pH. Ở pH acid (pH < 3), dung dịch Anthocyanin cho màu đỏ đậm. Khi pH
tăng, màu sắc của dung dịch sẽ nhạt dần và chuyển sang không màu và cuối cùng có
màu tím hay xanh dương ở pH cao (pH > 6).
b. Cấu trúc hóa học
Các pigment Anthocyanin thường có độ bền thấp trong tế bào sống của
chúng. Như đã trình bày ở trên, độ bền của các Anthocyanin phụ thuộc vào rất nhiều
yếu tố: Cấu trúc hóa học của Anthocyaninm, pH, nhiệt độ, sự có mặt của phản ứng
co-pigment, ion kim loại, oxy, acid ascorbic, SO 2, ánh sáng, enzyme, đường và các
sản phẩm biến tính của chúng.
16
Độ bền màu và cường độ màu của các Anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và
số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa.
Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng, cực đại hấp thụ ở vùng thấy được dịch
chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương.
Ví dụ: bước sóng hấp thụ cực đại trong dung dịch HCL 0,01% MeOH là 535
nm (cam) đối với pelgonidin, 535 nm (đỏ cam) đối với cyaniding, 545 nm (đỏ xanh)
đối với dephinidin.các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl cho kết quả
ngược lại. Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 đặc biệt có ý nghĩa quan trọng vì nó dịch
chuyển từ màu cam vàng đến màu đỏ nhưng 3 - deoxyAnthocyanin : luteolinidin và
tricetinidin có màu vàng; 3 - deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác
(Mazza và Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983).
Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 bền
hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa dẫn đến dạng
không màu.
Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các Anthocyanin
sẽ giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa,sẽ thu được kết quả ngược lại.
Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa
đáng kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm
giảm độ bền.
Các Anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh. Sự
glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của Anthocyanin. Vì vậy, các
diglucoside bền hơn các monoglusidc của cùng một Anthocyanin.
Ví dụ: thời gian bán sống (giảm 50% độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực
đại) của các cianidin 3 - utinoside là 65 ngày tại nhiệt độ phòng trong dung dịch
acid citric 0,01M, pH = 2,8. Trong khi đó anthocyanidin tự do trong cùng điều kiện
có thời gian bán sống chỉ có 12h.
17
Hình 1.5 Những màu sắc phổ biến của các loại athocyanin
Anthocianin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như tematin, platyconin,
cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc acid
yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong
Anthocyanin và acid vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng
viên (1982-1983) khảo sát rằng các Anthocyanin diacylate hóa được bền hóa bởi sự
liên kết chặt nhờ sự tương tác giữa vòng Anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm.
1.2.5.2. pH
Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của
Anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu,
màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc của
Anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa.
Ở pH < 2.0, dung dịch Anthocyanin có màu hầu như đỏ (R3 = O-đường)
hoặc vàng (R3 = H). Khi tăng pH của dung dịch, màu của các Anthocyanin nhạt
dần. Khi pH trong khoảng 4.0-6.0, hầu hết các Anthocyanin đều có dạng không
màu. Nếu tiếp tục tăng pH, dung dịch sẽ có màu tím hoặc xanh dương và màu này
có thể chuyển sang màu vàng khi để yên hoặc xử lý nhiệt.
18
Sự biến tính của các Anthocyanin tăng mãnh liệt với sự tăng của pH trong
môi trường có oxy.
Chẳng hạn: rubrobraxinin cloma là các Anthocyanin của bắp cải tím là một
triglucozit của xianidin.
Khi: pH = 2,4 - 4,0 có màu đỏ thắm.
pH = 4 - 6 thì có màu tím.
pH = 6 thì có màu xanh lam.
pH là kiềm thì có màu xanh lá cây.
19
Hình 1.6 Sự chuyển đổi cấu trúc của anthocyanin trong điều kiện môi
trường pH khác nhau
1.2.5.3. Nhiệt độ.
Hầu hết, các phản ứng hóa học liên quan đến độ bền Anthocyanin và tốc độ
phân hủy chúng đều phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự tăng theo hàm số logarit của các
Anthocyanin ứng với sự phân hủy Anthocyanin ứng với sự tăng đại số của nhiệt độ.
Tính bền nhiệt của các Anthocyanin phụ thuộc vào cấu trúc của chúng, pH, sự có
mặt của oxy và sự tác động qua lại giữa các thành phần.
20
Hình 1.7 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside

tại pH 3,7 (Zhaohua Hou, 2013)
Khi một cấu trúc của Anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng
bền với sự gia tăng của nhiệt độ. Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền
của Anthocyanin, trong khi sự methoxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả
ngược lại.
Ví dụ: Anthocyanin 3-glycoside có độ bền nhiệt lớn nhất tại pH = 1.8 - 2.0
với sự có mặt của oxy trong khi Anthocyanidin 3,5-diglycoside có độ bền nhiệt lớn
nhất tại pH = 4.0 - 5.0.
Cơ chế của sự phân hủy nhiệt xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà
còn phụ thuộc vào bản thân Anthocyanin đó.
Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của
Anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là: đầu tiên cấu trúc cation
flavylium chuyển thành dạng quinonidal base, tiếp theo là hình thành nhiều dạng
sản phẩm trung gian và cuối cùng thu được dẫn xuất coumarin và thành phần tương
ứng với vòng B của anthocyanidin. Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi
nhiệt độ mà còn bị ảnh hưởng bởi oxy.
Anthocyanidin 3-glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà
bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol
pseudobase không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng
chalcone trước khi thủy phân liên kết glycoside.
21
Adams cho rằng, các anthocyanidin 3-glycoside khi được nung nóng ở pH =
2.0-4.0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100°C) sau đó là sự biến đổi
aglycone thành chalcone. Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phẩm
màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy.
Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc
biệt là các Anthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các Anthocyanin
của phúc bồn tử đen cũng trong điều kiện đó lại không bị thay đổi. Nhìn chung khi
gia nhiệt, các chất màu đỏ dễ dàng bị phân huỷ, còn các chất màu vàng thì khó hơn.
1.2.5.4. Oxy.
Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy
của Anthocyanin, từ đó sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Sự
kết tủa và đóng váng trong nước trái cây có thể gây ra từ sự oxy hóa trực tiếp dạng
carbinol pseudobase.
Oxy hóa mãnh liệt các Anthocyanin khi nung nóng. Oxy và nhiệt độ là
những tác nhân xúc tiến đăc biệt nhất trong nước ép của blueberry, cherry (anh
đào), currant, nho, raspberry và dâu.
Lượng Anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện
chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các pigment của
nho, được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với
nitrogen.
1.2.5.5. Enzyme
Nhiều enzyme nội sinh trong tế bào của cây có khả năng làm mất màu
Anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanase. Dựa vào đặc
tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm: Glycosidase và polyphenol
oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal).
22
+Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin tạo
ra đường tự do và aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có
mặt của catecol (Huang 1955).
+Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên Anthocyanin với sự có mặt của o-
diphenol thông qua cơ chế oxy hóa kết hợp (h 6-6). Theo Gromeck và Markakis, sự
thêm vào glycosidase và PPO xúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy
Anthocyanin.
Hình 1.8. Sự biến tính Anthocyanin với phản ứng oxy hóa atechol
(Wiley, 2005)
Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó o-quinine được tạo
thành bởi sự oxy hóa Anthocyanin (H-17). Blom phân lập được enzyme
Anthocyanin - glycosidase từ Aspergillus niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong
quá trình thủy phân liên kết glycoside của Anthocyanin. PPO là enzyme có ảnh
hưởng yếu lên Anthocyanin dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn
dạng cation flavylium. Tốc độ phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình
của vòng B và mức độ glycosyl hóa.
1.2.5.6. Ánh sáng.
23
Các Anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng
thấy được và các nguồn phóng xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến Anthocyanin:
tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp và xúc tiến sự biến tính của chúng.
Những quả táo giống đỏ sẽ không chín đỏ mà xanh trong bóng tối
(Siegenman, 1964 ). Vanburen và cộng sự (1948) tường trình rằng các diglycoside
được acyl hóa và methyl hóa là các diglycoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và
monoglycoside là kém bền nhất, Palamidis và Markakis (1975) đã tìm thấy rằng ánh
sáng thúc đẩy quá trình phân hủy Anthocyanin trong nước giải khát có CO 2 được
phối màu với Anthocyanin từ xác nho. Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự
quang hóa của Anthocyanin và chỉ ra rằng, Anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-
3 và C-5 là bền hơn các Anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời
chúng bền hơn so với các aglycone tương ứng.
1.2.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng
Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng
thúc đẩy sự phân hủy các Anthocyanin. Fructose, arabinose, lactose và sorbose có
khả năng phân hủy Anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose,và maltose. Tốc độ
phân hủy của Anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm
phân hủy của đường gồm có: furfural, 5-hydroxymethyl furfural và acctaldehyl
được thu từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của acid ascorbic, polyuronic
hoặc ở bản thân các Anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ
với các Anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm. Sự phân
hủy Anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt
độ và rõ nét nhất là trong nước trái cây sự có mặt của oxy làm tăng thêm hiệu quả
phân hủy của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng.
24
Hình1.9. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B:

Cyanidin ketobase và furural (Wiley, 2005)
1.2.5.8. Các ion kim loại.
Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các Anthocyanin có nhóm
OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sâu màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi
kim loại tiếp xúc với Anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho
thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm.
Sistrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu
bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al
tạo thêm sự bảo vệ cho Anthocyanin của nước ép trái việt quất (cranberry), nhưng
sự biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau
cùng là không có lợi.
Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa Anthocyanin
là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và Caldwell, 1972). Trong phản ứng
với thiếc, Anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc anod. Chất khử cực
catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại và acid, còn chất khử
cực anod thường là các Anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl
ở vị trí ortho.
25
1.2.5.9. Sulfurdioxide (SO2)
Các Anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO 2. Hiện tượng này
thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thực phẩm có chứa Anthocyanin
bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây
và nước quả được xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500-2000 ppm), làm mất
màu các Anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desulfit
hóa và màu Anthocyanin được phục hồi. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận
nghịch giữa SO2 và Anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion
bisulphate tạo thành chromene - 2 - (hoặc 4 ) - sulphonic acid.
Hình 1.10. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và
Anthocyanin (Wiley, 2005)
SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do
enzyme của Anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng
(Goodman và Markakis, 1965 ). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình
tẩy quả với lượng lớn SO2 (0.8 - 1.5% ) và soda (0.4 - 1.0%) được dùng trong quá
trình tẩy quả. Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn.
1.2.5.10. Acid ascorbic
Nhiều nhà khảo sát (Beatic và cộng sự 1943; Pederson và cộng sự 1947; Kertesz
1952; Meschter 1953; Markakis và cộng sự 1957; Starr và Francis 1968) quan
26
sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và Anthocyanin trong nước trái cây tồn
trữ và đề nghị một tương tác có thế có giữa 2 hợp chất này. Acid ascorbic hiện diện
trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hóa tạo thành H 2O2 và chính
H2O2 làm mất màu Anthocyanin.
Hình 1.11. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2

tạo thành từ sự oxy hóa Ascorbic acid (Wiley, 2005)
Shrikhande và Francis đã tìm thấy rằng các ion đồng xúc tiến và các
flavonoid làm giảm sự phân hủy của cả hai acid ascorbic và Anthocyanin. Những
sản phẩm không màu ( hình 1.10 ). Acid dehyroascorbic cũng có thể làm mất màu
Anthocyanin nhưng tại tốc độ thấp hơn acid ascorbic.
Hình 1.12. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và
Anthocyanin.
1.2.6. Ứng dụng của Anthocyanin
Anthocyanin được dùng như chất màu thực phẩm với tính an toàn cao và
màu sắc đa dạng đẹp mắt.
27
Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc
chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, chống viêm, chống các tia phóng xạ...
Hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, sự phát triển của các tế bào ung thư.
Athocyanin còn có vai trò thu hút côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây diễn
ra tốt hơn.
Do đặc tính thay đổi màu theo pH, Anthocyanin có thể sử dụng như một chất
chỉ thị:
pH 1-3: màu đỏ
pH 4: màu hồng
pH 5: hồng tím
pH 7: tím
pH 8: xanh dương
pH 9: xanh lá + xanh dương
pH 10-12: xanh lá cây
pH >12: xanh lá mạ
Xác định hàn the :

Mặc dù dung dịch mẫu có chứa hàn the (pH 9.5), nhưng khi cho
Anthocyanin vào dung dịch mẫu, dung dịch không chuyển sang màu xanh mà
chuyển sang màu xám. Nguyên nhân là do hàn the (Natri borate) phản ứng với
nhóm ortho hydroxy trong vòng thơm của Anthocyanin tạo thành muối borate.
(Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, 2007)
Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực
phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, Anthocyanin còn là hợp chất có
nhiều đặc tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để
chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm
28
sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển
của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ.
Những đặc tính quý báu của Anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất
màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một
hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu Anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong
đời sống hằng ngày, đặc biệt trong công nghệ chế biến thực phẩm. Điều đó hoàn
toàn phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai
thác chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an toàn
cao cho người sử dụng.
1.2.7. Các Anthocyanin đã được thương mại hóa
Encolor liqid DS (công ty Reggianna, Antociani, Italy) là dịch trích vỏ nho cô

đặc.
Redberry liqid 88-01 được sản xuất bởi công ty Gillette Food Inc, là dịch
trích quả của alderberry, blackberry, blueberry, blackcurrant.
Sambucus NR 54 được sản xuất bởi công ty Gilette Food Inc, là dịch trích
Anthocyanin từ elderberry.
San Red Liqid RC-EX được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries
( Nhật) là dịch cô đặc từ bắp cải đỏ mà chúng chứa Anthocyanin diacyl hóa.
Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries
là bột sấy khô của dịch tr ích từ bắp cải đỏ.
Powdered San Red PC được sản xuất bởi công ty San Ei Chemical Industries
là bột sấy khô của dịch trích từ bắp cải tím.
1.3. Những kết quả nghiên cứu trong nước và thế giới
1.3.1. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ gạo.
Anthocyanin là hợp chất màu với những hoạt tính sinh học quý giá, người ta
luôn tìm những biện pháp trích ly chúng nhiều nhất từ nhiều nguồn nguyên liệu.
29
Trong gạo tím có thể chứa hàm lượng Anthocyanin cao và trong đó có hai
thành phần chủ yếu: cyanidin và peonidin. Trong những bài nghiên cứu trích ly
Anthocyanin từ gạo đen thường sẽ chọn ra những loại dung môi, thời gian, nhiệt độ
để thu được Anthocyanin cao nhất.
Như bài nghiên cứu về việc trích ly Anthocyanin từ gạo tím Sóc Trăng,
nhóm nghiên cứu đã lựa chọn khảo sát các các yếu tố trong quy trình trích ly: tỷ lệ
dung môi trích ly H2O:EtOH, pH của dung môi trích ly để cho hiệu quả trích ly cao
nhất, nhiệt độ, thời gian để thu hồi lượng Anthocyanin cao nhất.
Ngoài ra còn có nghiên cứu khác sử dụng dung môi MeOH:HCl 1% tỉ lệ

85:15 (v:v) (R.Sompong, 2010).
Với mỗi nghiên cứu sử dụng một dung môi khác nhau sẽ sẽ cho ra hiệu quả
khác nhau. Việc sử dụng dung môi sẽ ảnh hưởng đến các yếu tố nhiệt độ và thời
gian khác nhau.
1.3.2. Phương pháp trích ly Anthocyanin từ quả dâu Hội An.
Trong quả dâu, Anthocyanin được phân bố ở tế bào, với bản chất là một hợp
chất thiên nhiên khá phân cực.
Vì vậy trong quá trình nghiên cứu lựa chọn những hệ dung môi tách chiết
khác nhau để có thu được lượng Anthocyanin nhiều nhất:
+ Methanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl).
+ Ethanol - nước - HCl (tỷ lệ 1:1,1% HCl).
+ Nước - HCl (1%).
+ Nước - formic acid (5%).
+ Nước - acetic acid (5%).
Hệ dung môi tốt cho quá trình tách chiết chất màu Anthocyanin là ethanol-
nước là 1:1 (với 1% HCl). Hệ dung môi này cũng có thể dùng để tách chất màu
30
Anthocyanin từ các loại rau quả tương tự. (Nguyễn Thị Lan, 2010). Màu
Anthocyanin biến động trong các môi trường dung môi trích ly khác nhau.
1.3.3. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ bắp cải tím.
Bằng phương pháp tối ưu hoá thực nghiệm trong quá trình chiết tách, đã xác
định được hàm lượng Anthocyanin trong bắp cải tím Đà Lạt chiếm khoảng 1,11%.
Chất màu trong bắp cải được chiết xuất bằng những hệ dung môi khác nhau:
ethanol - nước, hệ dung môi ethanol – HCl (1%) - nước, acid citric – HCl (1%), hệ
dung môi NaHSO3 – HCl (1%).
Nghiên cứu sử dụng 2 phương pháp: phương pháp trích có sự hỗ trợ của sóng
siêu âm và phương pháp trích ly thông thường với số lần trích ly khác nhau: một
lần, hai lần và ba lần cho hệ dung môi NaHSO3 – HCl (1%).
Nhìn chung ở mỗi nguyên liệu trích ly Anthocyanin có đặc tính khác nhau, sẽ
dẫn đến kết quả trích ly hàm lượng Anthocyanin khác nhau. Ở nguyên liệu gạo tím đã
được sử dụng dung môi H2O:EtOH trong pH=2.2 tỷ lệ đạt cao nhất được 0.083%,
ở nguyên liệu bắp cải tím đạt hiệu quả cao nhất là NaHSO 3-HCl % Anthocyanin trích
ly được là 1,087% ở pH=1, ở nguyên liệu dâu Hội An dung môi trích ly cao nhất là
Ethanol- nước ở tỷ lệ 1:1 có bổ sung HCl thu được 1,047% Anthocyanin. Các kết
quả nghiên cứu điều đạt được hiệu suất thu hồi Anthocyanin cao khi sử dụng đến
HCl vì HCl làm biến tính tế bào giúp Anthocyanin thoát ra dễ dàng hơn bên cạnh đó
đây là môi trường bền nhất của athocyanin. Các dung môi trong các nghiên cứu đều
sử dụng những dung môi có tính phân cực tốt
Ở những phương pháp nghiên cứu sử dụng có hỗ trợ của sóng siêu âm sẽ đạt
được kết quả cao nhất.
31
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguồn gạo đen
Nguyên liệu gạo đen được sử dụng trong nghiên cứu là gạo đen hữu cơ “Hoa
Sữa” của công ty Viễn Phú. Gạo được đóng bao hút chân không và bảo quản ở nhiệt
độ phòng cho đến khi sử dụng.
Gạo đen hữu cơ là gạo có màu tím đậm đến màu đen, được trồng trên vùng
đất U Minh. Gạo đen được canh tác theo phương pháp hữu cơ không thuốc trừ sâu
không phân bón hóa học. Gạo có một số thông số kỹ thuật:
Thành phần Hàm lượng trong 100g Tỉ lệ
Calories 360kcal
Chất béo 4g 4%
Glucid 72g 72%
Protein 9g 9%
Ca 28mg 0,028%
Anthocyanin 39mg
Gạo đen sử dụng trong nghiên cứu phải còn nguyên bao bì, gạo không bị
biến đổi màu sắc và còn thời hạn sử dụng.
2.1.2. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là hóa chất dùng trong phân tích.
Sử dụng một số hóa chất chuẩn trong phân tích của hãng Merck, Sigma.
Ethanol tuyệt đối. HCl.
KCl. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)
CH3COONa.3H2O. Ascorbic acid.
32
2.1.3. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3.1. Dụng cụ
- Ống nghiệm. - Bình tam giác.
- Đũa thủy tinh. - Pipet.
- Nhiệt kế. - Giấy lọc.
- Rây Ø 0.0098 và 0.346 inches. - Ống ly tâm
2.1.3.2. Thiết bị
- Cân phân tích.

- Máy cô quay.
- Bể điều nhiệt.
- Máy quét quang phổ.
- Máy xay nghiền.
2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.1. Xác định các thông số cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen
Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm. Quy trình trích ly Anthocyanin
bao gồm các bước chủ yếu là trích ly Anthocyanin trong dung môi ở những điều kiện
thích hợp sau đó lọc và thu dịch. Các nội dung thí nghiệm chủ yếu được thể hiện trong
sơ đồ hình bên dưới.
33
Gạo đen
Xác định tỷ lệ H2O:EtOH để pha dung môi thích

hợp cho quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi thích hợp cho

quá trình trích ly anthocyanin từ gạo đen
Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin
từ gạo đen
Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly anthocyanin
từ gạo đen
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm khảo sát
các thông số trích ly
34
2.2.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi Nước-EtOH trong quá trình trích ly
Gạo đen
TL 1:9
Nghiền, rây qua lỗ rây
kích thước 0,25mm TL 2:8
Nhiệt độ :60oC Dung môi TL 3:7

Thời gian 60 p Trích ly
TLNL: 1:10
H2O:EtOH
TL 4:6
(w:w)
Lọc
TL 5:5
Cặn
Thu dịch
4000 rpm
Ly tâm
15 phút
Xác định hiệu suất

thu hồi anthocyanin
Chọn tỷ lệ
H2O:EtOH thích
hợp
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ H2O: Ethanol trong pha chế
dung môi để trích ly anthocyanin từ gạo đen hữu cơ.
35
Gạo đen được nghiền nhỏ sau đó rây qua sàng rây kích thước lỗ rây là
0,25mm. Dung môi H2O:EtOH ở những tỷ lệ 1:9; 2:8; 3:7; 4:6; 5:5 , đã được chuẩn bị
0
ở nhiệt độ 60 C. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với tỷ lệ 1:10 (w:w), cho vào trong
các bình chắn sáng chứa dung môi. Cứ 10 phút khuấy đảo hỗn hợp. Quá trình trích ly
0
giữ ổn định nhiệt độ ở 60 C trong bể ủ nhiệt thời 60 phút, sau đó đem hỗn hợp đi lọc
để loại bỏ cặn thu được phần dịch trong, phần dịch này sau đó đem ly tâm trong vòng
15 phút với tốc độ 4000 rpm, để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng
phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin. Tính được hiệu suất thu hồi
sau đó sẽ chọn tỷ lệ dung môi thích hợp nhất.
2.2.1.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu tấm trong dịch trích ly

Gạo đen được nghiền nhỏ sau đó rây qua sàng rây kích thước lỗ là 0,25mm. Kết
0
quả tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở nhiệt độ 60 C. Sau đó cho gạo đã
được cân sẵn với các tỷ lệ gạo và dung môi 1:6; 1:8; 1:10; 1:12, cho nguyên liệu vào trong
các bình chắn sáng chứa dung môi, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Nhiệt độ trích ly luôn
0
giữ ổn định ở 60 C trong bể ủ nhiệt trong vòng 60 phút, sau đó đem dịch đi lọc để loại bỏ
cặn thu dịch sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút, số vòng là 4000rpm để loại bỏ số cặn
nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng
Anthocyanin. Tính được hiệu suất thu hồi sau đó sẽ chọn tỷ lệ dung môi thích hợp nhất.
36
Gạo đen
TLNL1:6 w/w Nghiền, rây qua lỗ rây

kích thước 0,25mm
Dung môi
TLNL:1:8w/w
Thời gian 60p H2O:EtOH 4:6
TLNL:1:10 w/w Trích ly
Nhiệt độ: 600 (v:v)
TLNL:1:12w/w
Lọc Cặn
Thu dịch
4000rpm
Ly tâm
15 phút
Xác dịnh hiệu suất thu hồi

anthocyanin
Chọn tỷ lệ nguyên liệu
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung
môi thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen.
37
2.2.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly Anthocyanin từ gạo đen
Gạo đen được nghiền nhỏ, rây qua sàng rây kích thước lỗ là 0,25 mm. Kết quả
0 0
tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở những nhiệt độ khảo sát 40 C, 50 C,
0 0 0 0
55 C, 60 C, 65 C, 70 C. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với kết quả ở thí nghiệm 2
vào trong các bình chắn sáng chứa dung môi, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Thời gian
trích ly trong vòng 60 phút, sau đó đem dịch đi lọc để loại bỏ cặn thu dịch sau đó đem
ly tâm trong vòng 15 phút, 4000 rpm để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử
dụng phương pháp vi sai để xác định hàm lượng Anthocyanin, tính hiệu xuất trích ly
Anthocyanin và chọn ra được nhiệt thích hợp nhất để trích ly.
Gạo đen
0
40 Nghiền, rây qua lỗ rây
50
0 kích thước 0,25mm
Thời gian 60 p Dung môi
0 Trích ly H2O:EtOH 4:6
55 TLNL:1:8
(w:w) (v:v)
0
60 Lọc
0
65
Thu dịch Cặn
0 4000rpm
70
15 phút
Ly tâm
Tính hiệu suất thu hồi

anthocyanin
Chọn nhiệt độ trích ly
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly
Anthocyanin từ gạo đen
38
2.1.2.4. Xác định thời gian thích hợp trích ly Anthocyanin từ gạo đen.
Gạo đen
60 phút Nghiền, rây qua lỗ rây

90 phút Dung môi

H2O:EtOH 4:6
Nhiệt độ 600C
120 phút Trích ly
TLNL:1:8 (v:v)
(w:w)
150 phút
Lọc
Cặn
Thu dịch
4000rpm
Ly tâm
15 phút
Xác định hiệu suất thu

hồi anthocyanin
Chọn thời gian trích ly
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích ly
anthocyanin từ gạo đen
39
Gạo đen được nghiền nhỏ, sau đó rây qua sàng rây có kích thước lỗ là 0,25mm.
Kết quả tỷ lệ dung môi ở thí nghiệm 1 đã được chuẩn bị ở nhiệt độ khảo sát thí nghiệm
3. Sau đó cho gạo đã được cân sẵn với kết quả ở thí nghiệm 2 vào trong các bình chắn
sáng chứa dung môi. Nhiệt độ trích ly luôn giữ ổn định ở kết quả thí nghiệm 3, trong các
khoảng thời gian khoảng sát từ 1h đến 3h, cứ 10 phút khuấy đảo 3 vòng. Sau đó đem
dịch đi lọc để loại bỏ cặn thu dịch sau đó đem ly tâm trong vòng 15 phút với 4000rpm
để loại bỏ số cặn nhỏ trong dịch. Cuối cùng sử dụng phương pháp vi sai để xác định
hàm lượng Anthocyanin, tính hiệu xuất trích ly Anthocyanin. Từ đó chọn được nhiệt
độ thích hợp để trích ly.
2.2.2 Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly từ gạo đen
Dịch trích ly từ gạo đen
Nghiên cứu những tính chất của anthocyanin từ dịch trích ly

gạo đen.
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của Anthocyanin
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm nghiên
cứu tính chất của Anthocyanin
2.2.2.1. Sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở các pH khác nhau.
40
Dịch trích ly được cho vào các pH đệm khác nhau với tỷ lệ pha loãng, sao cho
pH đệm không bị thay đổi. Dịch này được đem đi đo độ hấp thu.
Dịch trích ly
Pha loãng với dung địch

đệm cho pH không đổi
Đo độ hấp thu
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của pH đến
hàm lượng Anthocyanin trong dịch trích
41
2.2.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác
nhau
Dịch trích ly được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau. Mỗi mốc nhiệt độ được
bảo quản trong khoảng thời gian 5 ngày. Mỗi ngày sẽ xác định hàm lượng Anthocyanin
còn lại trong mẫu thí nghiệm.
Dịch trích ly
anthocyanin
Bảo quản ở các nhiệt

độ khác nhau
0 0 0
0C 20 C 40 C
Xác định hàm lượng

anthocyanin theo thời gian
0 giờ 1giờ 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ
bền của anthocyanin ở cá nhiệt độ khác nhau
42
2.2.2.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly gạo đen trước khi cô quay
và sau khi cô quay.
Cách dựng đường chuẩn Vitamin C: pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ
sau: 0; 0,025: 0,05; 0.01; 0,25; 0,5 (mg/ml). Dùng micropipet hút 50 µl mỗi nồng độ vào
các ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml dung dịch DPPH. Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng.
So màu ở bước sóng 517 nm.
Đối với mẫu nghiên cứu (mẫu trước khi cô quay và sau khi cô quay), pha loãng
mẫu với nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong
khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên. Kết quả đánh giá
thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentraion) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để
ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.
Mẫu Vitamin C được dùng để so sánh thông số giá trị IC50.
2.3. Các phương pháp phân tích dùng trong thí nghiệm
Định lượng Anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai (the pH differrential

method – AOAC 200502).
Thử hoạt tính kháng oxy hóa và xác định giá trị IC50 của Anthocyanin bằng
phương pháp bắt gốc tự do DPPH (Kirby and Schmidt (1997), đựơc bổ sung chỉnh sửa
bởi Haji (2010)).
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
- Vẽ biểu đồ, đồ thị bằng phần mềm Excel 2013.

- Kết quả trong nghiên cứu này là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của 3 lần lặp
lại. Dữ liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sự khác
biệt giữa các mẫu là có ý nghĩa về mặt thống kê khi giá trị p < 0,05.
43
CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định các thông số cho quy trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen
3.1.1. Xác định tỷ lệ dung môi nước: ethanol trong pha chế dung môi trích
ly Anthocyanin từ gạo đen
1.4
1.26
1.2
Hiệu suất trích ly
anthocyanin % 1
0.8 0.68 0.69
0.6
0.44 0.44
0.4
0.2
0
Tỉ lệ 1:9 Tỉ lệ 2:8 Tỉ lệ 3:7 Tỉ lệ 4:6 Tỉ lệ 5:5
Tỉ lệ dung môi Nước : Ethanol (v:v)
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi H2O:EtOH đến hiệu suất
trích ly anthocyanin từ dịch chiết.
Anthocyanin từ gạo đen được tách chiết trong dung môi H 2O:EtOH với các tỷ lệ
khác nhau, kết quả thể hiện trong hình 3.1.
Mặc dù kết quả tham khảo từ các nghiên cứu trước cho thấy rằng dùng methanol
sẽ cho tác dụng tách chiết tốt hơn tuy nhiên mục đích đề tài là tạo ra dịch trích ly sử
dụng trong thực phẩm, cho nên sử dụng methanol là việc không thể, bởi vì vậy ethanol
đã được áp dụng làm chất thay thế. Khi sử dụng ethanol có những lợi ích nhất định,
chúng dễ dàng bay hơi cho việc đuổi ethanol loại ra khỏi dịch trích ly, cô đặc dịch trích
ly sẽ dễ dàng, ethanol này có thể tái sử dụng lại.
Theo kết quả thực nghiệm từ đồ thị hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi anthocyanin
tăng dần tỷ lệ nước khi giảm dần tỷ lệ ethanol, hiệu suất thu hồi đạt cực đại
44
ở tỉ lệ H2O:EtOH 4:6 sau đó tăng tiếp tỷ lệ nước hiệu suất thu hồi giảm một các đột ngột.
Điều này cũng được thể hiện rõ trong màu của dịch triết, màu có xu hướng đậm dần.
Hình 3.2. Dịch trích ly các dung môi ở những tỷ lệ khác nhau
Sự khác nhau về hiệu suất trích ly Anthocyanin khi sử dụng dung môi tỷ lệ 4:6
so với các tỷ lệ còn lại là có ý nghĩa thống kê. Thực nghiệm cho thấy, khi giảm tỷ lệ
ethanol, tăng tỷ lệ nước, thì hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng dần, đạt giá trị cực đại
tại tỷ lệ dung môi H2O:EtOH là 4:6, nhưng khi tăng tỷ lệ nước lên thêm thì liên kết ái
lực giảm xuống làm hiệu suất thu hồi giảm. Ở mỗi tỷ lệ H 2O:EtOH khác nhau sẽ có
liên kết ái lực khác nhau, liên kết ái lực này diễn ra ở các vị trí khác nhau của
Anthocyanin có thể liên kết với nhóm OH cũng như nhóm đường ở những vị trí khác
nhau dẫn đến hiệu suất trích ly khác nhau. Trong thí nghiệm này với tỷ lệ dung môi
EtOH:Nước tỉ lệ 4:6 có hiệu suất trích ly cao nhất.
Ngoài ra khi tỷ lệ H2O:EtOH 4:6 ta có độ cồn gần 60%, ở độ cồn này độ phân
cực của dung môi chiết phù hợp với sự hòa tan của Anthocyanin trong gạo đen.
45
Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Tri Liêm
(2014) trên nguyên liệu là các loại cám gạo có màu với dung môi là EtOH 58% tương
đương với H2O:EtOH tỷ lệ 4:6.
Như vậy sử dụng nồng độ dung môi thấp sẽ hạn chế đến môi trường, đồng thời
hiệu quả kinh tế cũng tăng vì vậy đề tài chọn tỷ lệ dung môi H2O:EtOH 4:6 cho bước
tiếp theo của thí nghiệm.
3.1.2. Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trong quá trình trích ly anthocyanin từ
gạo đen
1.05
Hiệu suất trích ly 1
anthocyanin % 1 0.99
0.98
0.95
0.9
0.87
0.85
0.8
Tỉ lệ 1:6 Tỉ lệ 1:8 Tỉ lệ 1:10 Tỉ lệ 1:12
Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (w:w)
Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi
đến hiệu suất trích ly Anthocyanin từ gạo đen hữu cơ.
Anthocyanin từ gạo đen được tách chiết trong dung môi H2O:EtOH với các tỷ
lệ nguyên liệu khác nhau kết quả thể hiện trong hình 3.3.
Theo kết quả thực nghiệm cho thấy, hiệu su ất thu hồi Anthocyanin thu được thì
ở tỷ lệ nguyên liệu 1:8 có hiệu suất trích ly Anthocyanin cao nhất (1%), tiếp theo đó hiệu
suất trích ly Anthocyanin giảm dần, thấp nhất đạt 0,98%, nhưng xét về mức ý nghĩa của
46
sự khác nhau về các hiệu suất trích ly thì tỷ lệ nguyên liệu 1:8, 1:10, 1:12 là không có
sự khác biệt.
Tỷ lệ nguyên liệu có ảnh hưởng đến quá trình trích ly, khi tỷ lệ dung môi càng
cao, liên kết ái lực với dung môi trích ly càng lớn dễ dàng trích ly Anthocyanin. Ở đây
tỷ lệ gạo càng nhỏ dung môi càng nhiều thì sự chênh lệch nồng độ gradien càng lớn,
dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán và cho phép quá trình trích ly chất rắn bằng dung môi
diễn ra tốt hơn (Cacase và Mazz, 2013). Nhưng đến một mức nào đó, khi tăng thể tích
dung môi thì cũng không làm tăng hiệu suất trích ly.
Kết quả của việc chọn tỷ lệ nguyên liệu trích ly 1:8 có sự chênh lệch so với kết
quả trong kết nghiên cứu của Nguyễn Tri Liêm (2014) và kết quả nghiên cứu trích ly từ
gạo tím Sóc Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015) chọn tỷ lệ gạo 1:10.
Kết quả nghiên cứu chọn ra tỷ lệ nguyên liệu 1:8 cho quy trình tách chiết
anthocyanin từ gạo đen.
3.1.3. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen.
47
1
0.9 0.864
Hiệu suất trích ly 0.8 0.747 0.74
Athocyanin %
0.7 0.68 0.687
0.6
0.519
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
40 50 55 60 65 70
0
Nhiệt độ ( C)
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu
suất trích ly Anthocyanin từ dịch chiết.
Bởi vì bản chất của quá trình trích ly là quá trình khuếch tán, quá trình khuếch tán
phụ thuộc vào yếu tố nhiệt độ. Bởi vậy việc nghiên cứu này được thực hiện khảo sát
0 0
ở các nhiệt độ khác nhau từ 40 C đến 70 C.
0 0
Theo kết quả thực nghiệm ta thấy, khi tăng dần nhiệt độ từ 40 C đến 60 C thì
0
hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng dần và đạt cực đại ở 60 C (0.864%). Nhưng khi
0 0
tăng nhiệt độ đến 65 C và 70 C thì hiệu suất trích ly giảm dần.
Mặc dù nhiệt độ là một trong các yếu tố làm biến tính và mất màu chủ yếu ở
Anthocyanin. Nhiệt độ càng cao, khả năng bị oxy hóa và mất màu của Anthocyanin
tăng dần. Tuy nhiên, trong quá trình trích ly, nhiệt độ lại đóng vai trò khá quan trọng
do nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng hoạt động, sự tương tác, khuếch tán và ái lực của
dung môi đối với Anthocyanin.
48
o
Ở nhiệt độ trích ly ở 40 C, quá trình diễn ra chậm do tốc độ khuếch tán của
Anthocyanin thấp. Nên hiệu suất trích ly Anthocyanin thu được còn thấp.
o
Ở nhiệt độ 60 C, hiệu suất trích ly Anthocyanin là cao nhất. Do ở nhiệt độ này
các phân tử trong tế bào chuyển động nhanh hơn, quá trình anthocyanin tách ra khỏi tế
bào diễn ra nhanh làm hiệu suất đạt được cao hơn. Đồng thời ở nhiệt độ này
Anthocyanin trong dịch trích ít bị biến tính và tốc độ khuếch tán của Anthocyanin vào
dung môi lớn hơn tốc độ phân hủy của Anthocyanin gây ra bởi các tác nhân khác. Có
sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về hàm lượng Anthocyanin giữa nguyên liệu được
o
trích ly ở 60 C và các thang nhiệt độ còn lại. Ở điều kiện nhiệt độ này.
o
Trong khoảng nhiệt độ 65-70 C, phản ứng phân hủy anthocyanin diễn ra nhanh
hơn tốc độ khuếch tán. Bên cạnh đó ở nhiệt độ này nguyên liệu sẽ hút nước trương nở
lớn nhất để làm tiền đề cho quá trình hồ hóa nên Anthocyanin bị giữ lại trong gạo
nhiều, ngoài ra Anthocyanin dưới tác dụng của nhiệt độ và oxy đã diễn ra phản ứng
oxy hóa mạnh. Cho nên ở nhiệt độ này hiệu suất thu hồi Anthocyanin giảm dần
Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu của Huỳnh Thị Kim Cúc
(2004) về trích ly từ dâu tằm Hội An bằng dung môi H2O:EtOH và nghiên cứu trích ly
49
anthocyanin từ gạo tím Sóc Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015) trong dung môi
H2O:EtOH có điều chỉnh pH.
Hình 3.5 Dịch trích ly anthocyanin ở các nhiệt độ khác

o
Ở nhiệt độ 60 C, hàm lượng Anthocyanin trích ly được là cao nhất. Vì vậy các
o
thí nghiệm sau sẽ tiến hành trích ly Anthocyanin ở 60 C.
3.1.4. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin từ gạo đen.
Bản chất khuếch tán cần có thời gian, nên chúng ta cần khảo sát thời gian của quá
trình trích ly, thời gian khảo sát từ 1h đến 3h, kết quả được thể hiện ở trong hình 3.6.
50
1
0.843
0.8
Hiệu suất trích ly 0.657
0.6 0.532 0.371
Anth ocyanin% 0.4
0.228
0.2
0
1h 1h30 2h 2h30 3h
Thời gian
Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến
hiệu suất trích ly Anthocyanin trong dịch chiết.
Từ thực nghiệm cho thấy, hiệu suất trích ly Anthocyanin tăng và đạt cực đại ở
1h30 (0.834%), sau đó hiệu suất giảm dần theo thời gian. Khi trích ly 3h (0.228) hiệu
suất trích ly anthocyanin đạt giá trị nhỏ nhất.
Nguyên nhân hàm lượng anthocyanin trong thời gian đầu (từ 1h đến 1h30) tăng
lên là do đây là thời gian mà quá trình khuếch tán diễn ra nhanh hơn quá trình phá hủy
Anthocyanin, vì thế hàm lượng Anthocynin trong dịch trích sẽ tăng dần. Sự khuếch tán
diễn ra do sự chênh lệch về gradient nồng độ, Anthocyanin trong nguyên liệu có nồng
độ cao hơn trong dung môi, thì Anthocyanin sẽ bị khuếch tán vào dung môi dễ dàng và
hiệu suất trích ly Anthocyanin trong dịch trích sẽ tăng theo thời gian đến khi gradient
nồng độ cân bằng.
Ở thời gian trích ly là 2h30 và 3h thì hiệu suất trích ly Anthocyanin lại giảm mạnh
so với thời gian trích ly là 1h30. Nguyên nhân là do lúc đầu gradient nồng độ lớn, làm cho
Anthocyanin sẽ đi ra dung môi nhiều. Nhưng về sau ở thời gian này, chênh lệch về
gradient nồng độ gần như cân bằng, quá trình khuếch tán này gần như dừng lại. Ở điều
51
o
kiện nhiệt độ 60 C, thời gian trích ly trong dung môi càng lâu thì hiệu suât trích ly
Anthocyanin giảm do bị oxy hóa, Anthocyanin bị phá hủy.
Ở thời gian 1h30, là thời gian đủ cho quá trình khuếch tán xảy ra, đến khi
gradient nồng độ cân bằng, ở thời gian này hiệu suất trích ly Anthocyanin không bị
giảm do tác nhân oxy hóa và nhiệt độ cao. Cho nên hiệu suất trích ly Anthocyanin thu
được từ dịch trích ly là cao nhất.
Thời gian trích ly này phù hợp với kết quả nghiên cứu trích ly gạo tím của Sóc
Trăng của Ninh Lê Thu Thảo (2015).
Thời gian trích ly là 1h30 cho hiệu suất trích ly Anthocyanin là cao nhất, được
chọn để tiến hành các thí nghiệm sau.
Hình 3.7 Dịch trích ly anthocyanin ở các thời gian khác nhau.
52
3.2. Khảo sát một số tính chất của Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen
3.2.1. Sự biến đổi của hàm lượng anthocyanin ở những pH khác nhau
0.500
0.450 0.466
0.400 0.338 0.370
Độ hấp thu (nm) 0.350
0.300
0.250 0.290 0.214
0.200
0.150 0.118
0.100
0.050 0.083 0.033 0.058
0.000
1 3 5 7 9 11
pH
Hình 3.8. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi độ hấp thu của anthocyanin
ở nhưng mức pH khác nhau.
Theo kết quả nghiên cứu ta thấy ở pH có độ hấp thu lớn nhất 0,466 nm nhưng
đến pH =3 độ hấp thu bị giảm xuống còn 0,290 nm. Sau đó từ pH=3-5,2 độ hấp thu có
xu hướng tăng. Từ khoảng pH=5,2-6 độ hấp thu đột ngột giảm mạnh xuống còn
0,083nm, đến pH=6,7 lại tăng trở lại, đến pH=7,3 độ hấp thu giảm xuống tới mức thấp
nhất là 0,033 nm. Ở pH 8,8 độ hấp thu tăng trở lại, cuối cùng đến pH 9,4 độ hấp thu bị
giảm xuống còn 0,058nm.
Từ kết quả cho thấy pH ổn định nhất là pH từ khoảng 3 đến 5,2 ở những
khoảng pH còn lại độ hấp thu không ổn định.
Khoảng pH=1 cao nhất vì Anthocyanin đang ở dạng muối flavylium có màu đỏ
nên sẽ có độ hấp thu lớn nhất, từ khoảng pH=3 đến 5,2 Anthocyanin ở dạng muối
carbinol sẽ không có màu nhưng do ở khoảng pH này có nhiều protein trong dịch trích
53
bị mất nước biến tính làm đục mẫu, độ dục làm độ hấp thu tăng. Khoảng pH từ 5,2-6
giảm mạnh nhất là do ở Anthocyanin vẫn tồn tại ở dạng carbinol không màu chuyển
thành dịch trong nên pH ở mức thấp nhất. Đến pH 6,7 ở pH này có một số protein trong
dịch trích ly bị biến tính làm đục mẫu, làm độ hấp thu tăng lên. Ở khoảng pH=7,4
Anthocyanin chuyển thành dạng chalcone không màu làm cho độ hấp thu đạt mức thấp
nhất.
Kết quả của quá trình nghiên cứu trên có thể ứng dụng vào việc chọn lựa màu
sắc thích hợp cho dịch uống hoặc ứng dụng vào việc chỉnh màu trong thực phẩm từ gốc
Anthocyanin.
Trong kết quả của quá trình cho thấy ở pH từ khoảng 3 đến 5,2 là khoảng có thể
bảo vệ dung dịch trích ly để chúng có thể ít biến đổi nhất.

3.2.2. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của Anthocyanin ở các nhiệt độ khác
nhau.
10 8.93
mg/ml
8 7.79 7.68
6.28
6 5.79
6 5.31
Hàm lượng anthocyanin
0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h

Thời gian bảo quản
0
Hình 3.9. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 0 C
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin ở mức thấp nhất
có 5,31mg/ml, sau đó hàm lượng Anthocyanin tăng dần đến 48h hàm lượng Anthocyanin
54
đạt cực đại 8,93 mg/ml, nhưng đến những giờ tiếp theo hàm lượng Anthocyanin giảm
dần, đến 120h chỉ còn 5,79 mg/ml.
Ở 0h Anthocyanin trong môi trường trung tính ở một số cấu trúc chuyển đổi
thành cấu trúc mở vòng chính là dạng chalcone, nên khi đo ở ở thời gian này có độ hấp thu
nhỏ nhất. Tuy nhiên ở trong môi trường nước các cấu trúc này chuyển đổi qua lại lẫn
nhau khi đến 48h các phân tử xảy ra quá trình co-pigment diễn ra ở một số phân tử còn
lại để chúng tồn tại ở dạng quinonoial base, phản ứng này giúp chúng tăng độ bền của
scác nội phân tử, giảm bởt khả năng bị các phân tử nước tấn công hình thành các hợp
chất không màu.
8 6.84
7
Hàm lượng anthocyanin mg/ml
6 5.33
5 4.43 4.55
3.94
4
3.12 2.73
3
2
1
0
0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h
0
Hình 3.10. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở 20 C
Từ kết quả thực nghiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin là 4,43 mg/ml
sau đó hàm lượng giảm dần khi được 24h chúng ở mức thấp nhất có 2,73mg/ml, sau đó
hàm lượng Anthocyanin tăng dần đến 120h hàm lượng Anthocyanin đạt cực đại 6,84
mg/ml.
Ở thời gian đầu Anthocyanin bị sốc nhiệt một số phân tử trong chúng chuyển
đổi dạng chalcone nên khi đo hàm lượng bằng phương pháp pH vi sai chúng ở mức
55
thấp nhất, những sau đó sự co-pigment diễn ra chung chúng tồn tại ở dạng quinonoial
base để giúp chúng tăng độ bền cuả các nội phân tử, giảm bởt khả năng bị các phân tử
nước tấn công hình thành các hợp chất không màu.
12
mg/ml
10 9.63
8.47
8 6.59
Hàm lượng anthocyanin
6 5.19 5.8
4 2.73 3.01
0
0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h
0
Hình 3.11. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của Anthocyanin ở 0 C
Từ kết quả thực nhiệm cho thấy ở 0h hàm lượng Anthocyanin là 2,73 mg/ml
đạt mức thấp nhất sau đó hàm lượng tăng dần khi ở 96h hàm lượng đạt cực đại 9,63
mg/ml, sau đó hàm lượng Anthocyanin giảm, đến 120h hàm lường Anthocyanin đạt
5,8 mg/ml.
Do nhiệt độ ban đầu của dịch trích ly cũng tương đối, không xảy ra hiện tượng
sốc nhiệt, ở 40 độ là nhiệt độ thích hợp xúc tác cho phản ứng co-pigment diễn ra làm
gia tăng tính bền màu của Anthocyanin, nhưng khi phản ứng xảy ra đến cực đại, theo
thời gian hợp chất này vẫn sẽ bị phân hủy Anthocyanin sẽ tồn tại ở chalcone, làm giảm
hàm lượng Anthocyanin.
56
12
10
Hàm lượng anthocyanin mg/l
0h 1h 24h 48h 72h 96h 120h

0oC 20oC 40oC
Hình 3.12. Biểu đồ biểu thị sự biến đổi hàm lượng của anthocyanin ở
các nhiệt độ khác nhau.
Anthocyanin là một chất nhạy cảm với nhiệt độ. Từ biểu đồ biến đổi
0
Anthocyanin ở các nhiệt độ cho thấy ở 20 C là nhiệt hàm lượng Anthocyanin có thời
0
gian bảo quản lâu nhất sau 120h, hàm lượng vẫn có giá trị tiếp tục tăng. Ở 0 C hàm
lượng Anthocyanin có thời gian bảo quản ngắn nhất chỉ sau 48h thì hàm lượng giá trị
0
Anthocyanin đã giảm. Ở nhiệt độ 40 C thời gian bảo quản cũng tương đối ngắn chỉ sau
96h hàm lượng đã bị giảm mạnh.
0
Ở 20 C có thời gian bảo quản tốt bởi vì ở nhiệt độ này có thể thích hợp nhất
cho phản ứng co-pigment diễn ra làm bền cấu trúc của Anthocyanin, ở nhiệt độ này
Anthocyanin tồn tại ở dạng muối flavylium nhiều nhất.
57
0
Ở nhiệt độ 40 C thời gian bảo quản ngắn nhất, vì ở nhiệt độ cao Anthocyanin sẽ
chuyển về dạng chalcone, đây là sự thoái hóa của Anthocyanin.
3.2.3. Hoạt tính kháng oxy hóa của dịch trích ly từ gạo đen
Dựng đường chuẩn vitamin C với dung dịch DPPH có các nồng độ: 0,025;
0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75. Từ đó ta xác định % ức chế gốc tự do (%I) theo công thức đã
nêu. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị %I à IC50 của vitamin C
Nồng độ vitamin C (µg/ml) % Ức chế (%I) IC50 (µg/ml)
1,21 15,29 ± 0,9

2,43 36,03 ± 2,13
6,09 57,67 ± 0,31 5,39 µg/ml
12,09 93,50 ± 0.09
18,29 94,25 ± 0,75
120 y = 6.6828x + 14.001

R² = 0.9724 93.5
100
80
% I
60 57.67
40 36.03
20 15.29
0.00 5.00 10.00 15.00

Nồng độ mẫu vitamin C (µg/ml)
Hình 3.13. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của vitamin C
58
Bảng 3.2. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen trước khi
cô quay.
Nồng độ dung dịch trích ly % Ức chế (%I) IC50 ( µg/ml)

(µg/ml)
22,98 15,04 ± 3,95
27,47 22,34± 0.94
45,95 32,13± 0,85 71,83 µg/ml
64,33 48,88± 4,76
91,90 61,12± 0,53
70.00
y = 0.6624x + 2.4208
60.00 R² = 0.9794 61.12
50.00 48.88
40.00
%I
32.13
30.00
20.00 22.34
15.04
10.00
0.00
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00

Nồng độ mẫu trích ly (µg/ml)
trích ly từ gạo đen trước cô quay.
59
Bảng 3.3. Giá trị %I và kết quả IC50 của dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen sau cô
quay.
Nồng độ dung dịch trích ly % Ức chế (%I) IC50 ( µg/ml)
sau cô quay(µg/ml)
18,29 48,58 ± 0,25
30,49 49.78± 0.14 29,7 µg/ml
42,68 52.33± 0,08
54,87 57,81± 0.08

60.00
58.00 y = 0.2726x + 41.903
56.00 R² = 0.9481
54.00
%I
52.00
50.00
48.00
46.00
15 25 35 45 55 65
Nồng độ mẫu trích ly sau cô quay (µg/ml)
Hình 3.15. Biểu đồ biểu thị sự ức chế gốc tự do của dung dịch
Anthocyanin được trích ly từ gạo đen sau cô quay.
60
Bảng 3.4. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và Anthocyanin
Mẫu Giá trị IC50 đối với chất chống
oxy hóa DPPH
Dịch trích ly anthocyanin 71,83 µg/ml
từ gạo đen trước cô quay
Dịch trích ly anthocyanin 29,7 µg/ml
từ gạo đen sau cô quay
Vitamin C 5,39 µg/m
Hình 3.16. Phản ứng màu của dung dịch DPPH khi cho dịch mẫu trích ly
anthocyanin từ gạo đen .
Trong thí nghiệm này, giá trị IC 50 của dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen là
71,83 µg/ml cao hơn chất chuẩn đối chứng vitamin C (5,39 µg/ml) gấp 13 lần. Cho
thấy, khả năng kháng oxy hóa của Anthocyanin ở thí nghiệm này còn thấp.
Sau quá trình cô quay nồng độ mẫu được nâng cao, giá trị IC 50 của dịch trích ly
Anthocyanin sau cô quay là 29,7 µg/ml gấp 5,5 lần so với vitamin C.
Trong bài nghiên cứu các hoạt tính chống oxy hóa các loại lúa màu ở miền Bắc
Thái Lan của nhóm nghiên cứu Noppawat (2015), đối với gạo Chiang mai Black rice có
IC50 đối với vitamin C là 6,61 µg, còn dịch trích ly từ gạo là 6,67 µg. Hoạt tính kháng
61
oxy hóa từ dịch trích ly gạo Chiang mai Black rice rất cao, hơn 11 lần so dịch trích ly
chưa cô quay và gấp 4,5 lần dịch trích ly đã cô quay.
Do hàm lượng Anthocyanin trong dịch trích ly thấp dẫn đến hoạt tính kháng
oxy hóa của dịch trích ly. Cần phải nâng cao hiệu suất trích ly để có hoạt tính kháng
oxy hóa cao hơn.
62
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận

a) Trong quá trình nghiên cứu đã xây dựng được quy trình trích ly
anthocyanin theo quy trình sau:
Gạo đen
Nghiền, rây qua lỗ rây
Nhiệt độ 600C Dung môi

TLNL:1:8 (w:w) Trích ly
Thời gian: 1h30 H2O:EtOH 4:6 v:v
Lọc
Cặn
Thu dịch
4000rpm Ly tâm
15 phút
Dịch chiết
anthocyanin
Hình 4.1. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp để trích
ly Anthocyanin từ gạo đen
63
Đã xác định được các thông số thích hợp cho quá trình trích ly chất màu
Anthocyanin nhằm tách chiết tối đa Anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích
ứng dụng vào thực phẩm:
Xác định được tỷ lệ H2O:EtOH pha chế dung môi thích hợp cho quá trình trích
ly Anthocyanin là tỷ lệ 4:6 (v:v).
Xác định được tỷ lệ nguyên liệu và dung môi cho quá trình trích ly
Anthocyanin là tỷ lệ 1:8.
0
Xác định được nhiệt độ cho quá cho quá trình trích ly Anthocyanin là 60 .
Xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly Anthocyanin là 1h30.
b) Trong quá trình nghiên cứu tính chất của Anthocyanin có một số
tính chất sau:
Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của Anthocyanin trong dung dịch
gạo trích ly trước cô quay với giá trị IC50 = 71,83 (µg/ml).
Xác định được khả năng bắt gốc tự do DPPH của Anthocyanin trong dung dịch
gạo trích ly sau cô quay với giá trị IC50 = 29,7 (µg/ml).
Đã xác định được Anthocyanin trong dịch trích ly gạo đen bền ở pH từ 3 đến 5,2
ở thích hợp để bảo dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen.
0
Nhiệt độ trích hợp để bảo quản dịch trích ly Anthocyanin từ gạo đen là 20 C, ở
nhiệt độ này hàm lượng tăng dần, trong lúc bảo quản Anthocyanin, cấu trúc của
Anthocyanin không ổn định, luôn có sự chuyển hóa trong cấu trúc của chúng.
c) Đánh giá cảm quan của dịch chiết.
64
Bảng 4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin
DỊCH CHIẾT MÀU SẮC MÙI TRẠNG THÁI
Đỏ tươi Mùi cồn Trong, không bị vẫn

nặng đục, không kết cặn
Hình 4.1. Dịch chiết

Anthocyanin trước cô
quay.
65
Đỏ đậm Mùicồn
nhẹ
Hình 4.2. Dịch chiết sau cô

đặc.
4.2. Kiến Nghị
Trong gạo đen ngoài Anthocyanin còn có những thành phần khác cũng được
hòa tan khác như protein hòa tan, một số đường và các hợp chất khác. Những thành
phần này ảnh hưởng đến việc xác đinh hàm lượng Anthocyanin nên cần phải loại bỏ
chúng, đặc biệt là protein.
Cần bảo theo dõi sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở những pH khác nhau
theo thời để xem xét việc bảo quản tốt hơn.
0
Nên kéo dài thời gian bảo quản Anthocyanin ở 20 C để xác định thời gian
Anthocyanin bị thoái hóa.
Cần kết hợp giữa việc bảo quản dịch Anthocyanin ở những pH khác nhau với
những nhiệt độ khác nhau trong thời gian kéo dài để xác định được điều kiện tối ưu
nhất bảo quản dịch Anthocyanin trích ly từ gạo đen.
66
Trong dịch trích ly gạo đen có thể nghiên cứu théo hướng làm bột sấy vì trong
dịch trích ly ngoài Anthocyanin còn những thành phần quý báu khác có giá trị dinh
dưỡng cao.
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT.

1. Huỳnh thị Kim Cúc, Lê Văn Hoàng, Lê thị Lệ Hường (2010). Chiết
anthocyanin từ quả dâu bằng nước sulfured và một số đặc tính của chúng.
Trường CĐ LT – TP và ĐH Đà Nẵng
2. Hoàng Thị Lệ Hằng (2014), Nghiên cứu sử dụng enzyme trong quá trình chuẩn
bị dịch lên men lactic từ bột khoai lang tím.
3. Lưu Đàm Cư (2005). Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh
nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số.
4. Nguyễn Thị Lan và Lê Thị Lạc Quyên (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ
dung môi đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả
dâu Hội An. Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Đà Nẵng. Số 2 (6)/2009.
5. Nguyễn Thị Thanh Tuyền (2014), Nghiên cứu tách chiết và khả năng kháng oxy
hóa của anthocyanin từ phế phẩm gạo đen.
6. Nguyễn Thọ. Các phương pháp xác định tính chất lý hoá cơ bản của nguyên
liệu trong công nghệ thực phẩm.
7. Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, (2007). Nghiên cứu ảnh hưởng của
pH đến màu của anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn
trong phân tích thực phẩm và hoá học. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học
Đà Nẵng.Số:3(20)/2007.
8. Trần Thị Ánh Ngọc (2011). Nghiên cứu thành phần của chất màu anthocyanin
chiết từ khoai lang tím.
68
TÀI LIỆU TIẾNG ANH.

1. AOAC (2006). Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit Juices,
Beverages, Natural Colorants, and Wines. AOAC Official Method.
2. Azza A.Abou-Arab, Ferial M.Abu-Salem and Esmat A.bou Arrab (2011).
Physico-chemical properties of natural pigments (anthocyanin) extracted from
Roselle calyces (Hibiscus subdariffa). Department of food technology, national
research centre, Dokki, Cairo, Egypt.
3. Giusti. M. M and Wrolstad, R. E. (2001). Characterization and Measurement of
Anthocyanin by UV-Visible Spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical
Chemistry.
4. John Wiley (2005). Handbook of Food Analytical Chemistry: Pigments,
Colorants, Flavors, Texture, anh biocative food components.
5. Nguyen Ngoc Mai Trinh, Nguyen Manh Duc, Phan Van Hung (2014),
Antioxidant capacity and amylase inhibitory from fresh asiatic pennywort
(Centella asiatica).
6. Oliver-Hoyo, M. Allen, D. Solomon, S. Brook, V. Ciraolo, J. Daly, and Jackson.
(2001). Qualitative analysis of fourteen white solids and two mixtures using
household chemicals. Journal of chemical education 78, 1475-1478.
7. Rodriguez-Saona, L.E and Wrolstad, R.E (2001). Extraction, Isolation, and
Purification of Anthocyanins. Current Protocols in Food Analytical Chemistry.
8. Suhad s. Humadi, viorica istudor (2009). Quantitative analysis of bio- active
compounds in hibiscus sabdariffa l. extracts. II. quantitative analysis and
biological activities of anthocyanins.
9. S.D.SANJA (2009). Characterization and evaluation of antioxidant activity of
portulaca oleracea.
10. Zhaohua Hou (2013). Identification of anthocyanins isolated from black rice
(Oryza sativa L.) and their degradation kinetics.
69
PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN

CỨU
1) Phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin tổng trong dịch trích ly
Dùng phương pháp phân tích pH vi sai để định lượng Anthocyanin trong dịch
trích ly.
a. Chuẩn bị dung dịch đệm
Dung dịch đệm này để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vài tháng. Trước khi
dùng cần hiệu chỉnh lại cho đúng.
Pha buffer pH = 1. Cân 1,86g KCl cho vào becher 1 lít, thêm nước cất để hòa
tan KCl. Đo pH và chỉnh về pH 1 bằng HCl đậm đặc 37%. Sau đó chuyển vào bình
định mức và định mức bằng nước cất.
Pha buffer pH = 4,5. Cân 54,43g CH3COONa.3H2O cho vào becher 1 lít, thêm
960 ml nước cất để hòa tan CH3COONa.3H2O. Đo pH và chỉnh về pH 4,5 bằng HCl
đậm đặc (37%). Sau đó cho vào bình định mức và định mức bằng nước cất.
b. Chuẩn bị mẫu đo
Cho 9 ml dung dịch đệm pH 1 vào ống nghiệm 1, tiếp tục cho 1ml dịch trích
ly, lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó đem đo quang tại 2 bước sóng λmax = 535 nm và λ
= 700 nm.
Làm tương tự cho ống nghiệm 2 với 10 ml dung dịch đệm pH 4,5 và 1 ml dịch
trích ly.
Cho mẫu vào máy đo quang và đọc kết quả.
Lưu ý:
Thời gian từ lúc chuẩn bị xong mẫu đến lúc đo nên nằm trong khoảng 15 – 60
phút để giảm thiểu sai số. Bởi vì thời gian ổn định quá lâu sẽ có xu hướng tăng chỉ số
quan sát (observed readings).
1
Mẫu đo phải đảm bảo không có sương mù (haze) hay cặn lắng (sediment). Tuy
nhiên có thể xuất hiện vài chất keo trong mẫu do sự tán xạ ánh sáng và sự xuất hiện của
sương mù. Sự tán xạ ánh sáng cần được hiệu chỉnh bằng các đọc độ hấp thu ở bước
sóng 700nm (bước sóng mẫu không hấp thu). Mỗi mẫu nghiên cứu lặp lại 3 lần.
Tại pH = 1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavylium có độ hấp
thu cực đại. Tại pH = 4,5 chúng ở dạng carbinol pseudobase không màu.
Đo độ hấp thụ cực đại của 2 mẫu ở pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng của độ
hấp thụ cực đại λmax so với độ hấp thụ tại bước sóng λ = 700 nm (độ đục của mẫu).
(Suhad s. Humadi1, Viorica Istudor, 2009).
Dựa trên công thức của định luật Lambert – Beer:

(1)
Io
Lg =εxlxC
Trong đó:
Io
Lg I đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch (mật độ quang,
A).
I là cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch.
Io là cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch.
C là nồng độ chất nghiên cứu (mol/l).
l là chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua, (cm).
-1 -1 –1 –1
ε là hệ số hấp thụ phân tử, (mol cm ); ε = 26900 (L. mol . cm )
Hàm lượng Anthocyanin đơn tử theo công thức:
a = A x MW x DF x 1000 (mg/l) (2)

εxl
Với:
2
Mật độ quang hay độ hấp thu của Anthocyanin là:
A = (Amax pH1 - A700 pH1) - (Amax pH4,5 - A700 pH4,5)
Amax (pH=1): độ hấp thu cực đại tại bước sóng λmax.
A700 (pH=4,5): độ hấp thu cực đại tại bước sóng 700 nm.
-
MW: khối lượng phân tử Anthocyanin không kể ion Cl hay nước tinh thể hóa
là 449,2 (g/mol).
DF: hệ số pha loãng. Hút 1ml mẫu cho vào 9ml dd đệm
 DF = 10.
V: thể tích Anthocyanin thu được, (lít).
Từ đó ta tính được phần trăm hàm lượng Anthocyanin toàn phần:

a
% Anthocyanin =
100%
m x (100-w) x 10-2
a là lượng Anthocyanin tính theo công thức (2), (g)
m là khối lượng nguyên liệu ban đầu, (g).
w là độ ẩm nguyên liệu, (%).
2) Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết
Anthocayanin từ gạo đen
a. Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch DPPH và Ascorbic acid, dung dịch mẫu nghiên cứu
- Dung dịch DPPH: Cân 2,364 mg DPPH định mức bằng methanol thành 1000
μl được dung dịch trữ DPPH 6.000 μM. Lấy 500 μl dung dịch trữ định mức thành 50ml
dung dịch DPPH 60 μM (dung dịch làm việc).
3
- Dung dịch làm việc của mẫu có nồng độ 50 mg/ml.
- Dung dịch Ascorbic acid có các nồng độ 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml).
Chuẩn bị đường chuẩn Ascorbic acid:

Đường chuẩn ascorbic acid lập ra cần phải có 1 khoảng đủ rộng để có thể đo
được hoạt tính kháng oxi hóa của Anthocyanin.
- Dùng micropipet hút 50 μl mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2
ml dung dịch DPPH.
- Lắc đều các dung dịch trên. Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thu
ở bước sóng 517 nm.
- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp ( nồng độ chất nghiên
cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí
nghiệm như trên. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory
concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50%
gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.
- Mẫu Ascorbic acid được dùng để so sánh thông số giá trị IC50
Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH:
V1 μl mẫu V2 μl ethanol
50 μl dung dịch mẫu
2 ml DPPH (60 μM) trong methanol
Ủ 30 phút trong tối
Đo quang tại bước sóng
Hình 2.6 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
4
− ẫ
Phần trăm ức chế (I%) = ( ) ∗ 100%
Trong đó:
A DPPH là giá trị OD517 nm của dung dịch DPPH ban đầu pha trong methanol.
A mẫu là giá trị OD517 nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu).
Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn y = ax+b theo công thức:
X= 50−
3) Phương pháp pha dung dịch pH đệm

- Chất rắn pha ra dung dịch CM hay CN theo công thức: ∗ ∗ ∗Đ∗
m= 10∗ = 10∗
- Chất rắn pha ra C% theo công thức: %∗

m= 100∗
- Chất rắn ngậm nước ra C% theo công thức:

m= %∗ 100 ậ ướ
100 ℎô ậ ướ
- Chất rắn ngậm nước ra CM hay CN theo công thức:

m = CM * V * M ngậm nước * 100 ậ ướ
∗
ℎô ậ ướ
- Thể tích dung dịch đậm đặc cần hút pha ra C% là: - 2 2 100 1
Vđđ = 100
- Thể tích dung dịch đậm đặc cần hút pha ra CM hay CN là: ∗ ∗ ∗Đ∗
Vđđ = 10∗ ∗ = 10∗ ∗
- Từ C% đồi ra CM theo công thức: CM = 10∗ %∗
ồ độ
pH thỏa quy tắc pH = pHa + log
ồ độ
5
Bảng 2.6 Cách pha các dung dịch đệm pH từ 1 đến 10
pH KCl CH3COONa.3H2O CH3COOH Na2HPO4 Acid citric HCl Na2B4O7.10H2O

0,2M 0,2M 7,15% 2,1% 0,1N
1,1 Hòa tan 1,86g KCl và chỉnh pH bằng HCl đậm đặc (37%) rồi định mức lên 1000ml
3,0 6ml 94ml
4,5 Hòa tan 54,43g CH3COONa.3H2O và chỉnh pH bằng HCl đậm đặc (37%) rồi định mức lên
1000ml
5,2 79ml 21ml
6,0 95ml 5ml
6,7 77,3ml 22,7ml
7,2 82,4ml 13ml
8,0 Hòa tan 0,28g Na2B4O7.10H2O và chỉnh bằng HCl 0,1N rồi định mức lên 100ml
9,7 Hòa tan 8,4g NaHCO3 và 10,6g Na2CO3 rồi định mức lên 500ml
6
PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM.

1. Thí nghiệm 1
Bảng 1. Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi H2O:EtOH thích hợp
cho việc trích ly anthocyanin từ gạo đen.
pH=1 pH=4.5 Hàm

Hệ số Hàm lượng %
Độ hấp %
pha lượng trung Athocyanin
535nm 700nm 535nm 700nm thu Athocyanin
loãng mg/L bình trung bình
mg/L
0.414 0.280 0.390 0.284 20 0.028 9.35 0.53
0.412 0.280 0.400 0.290 20 0.022 7.35 0.41
0.410 0.281 0.401 0.291 20 0.019 6.35 0.36
0.449 0.281 0.410 0.267 20 0.025 8.35 0.47
0.447 0.275 0.425 0.276 20 0.023 7.68 7.83 0.43 0.44 ± 0.05
0.449 0.286 0.415 0.275 20 0.023 7.68 0.43
0.459 0.266 0.425 0.256 20 0.024 8.02 0.45
0.460 0.260 0.425 0.249 20 0.024 8.02 0.45
0.462 0.278 0.421 0.260 20 0.023 7.68 0.43

0.319 0.180 0.275 0.164 20 0.028 9.35 0.67
0.320 0.179 0.280 0.168 20 0.029 9.69 0.69
0.322 0.181 0.276 0.163 20 0.028 9.35 0.67
0.295 0.171 0.256 0.162 20 0.030 10.02 0.72

0.296 0.175 0.252 0.161 20 0.030 10.02 9.57 0.72 0.68 ± 0.06
0.294 0.173 0.250 0.163 20 0.034 11.36 0.81
0.337 0.193 0.296 0.179 20 0.027 9.02 0.64
0.339 0.190 0.297 0.176 20 0.028 9.35 0.67
0.338 0.192 0.294 0.172 20 0.024 8.02 0.57

0.449 0.280 0.393 0.255 20 0.031 10.35 0.68
0.447 0.268 0.403 0.253 20 0.029 9.69 0.63
0.448 0.270 0.402 0.256 20 0.032 10.69 0.70

0.452 0.250 0.406 0.235 20 0.031 10.35 0.68
0.447 0.248 0.403 0.238 20 0.034 11.36 10.61 0.74 0.69 ± 0.03
0.449 0.245 0.408 0.236 20 0.032 10.69 0.70
0.429 0.250 0.419 0.274 20 0.034 11.36 0.74
0.423 0.255 0.415 0.278 20 0.031 10.35 0.68
0.430 0.253 0.420 0.275 20 0.032 10.69 0.70

0.278 0.124 0.204 0.113 20 0.063 21.04 19.07 1.39 1.26±
0.289 0.132 0.206 0.106 20 0.057 19.04 1.25
7
0.290 0.127 0.210 0.102 20 0.055 18.37 1.21
0.280 0.136 0.211 0.124 20 0.057 19.04 1.25
0.283 0.130 0.209 0.119 20 0.063 21.04 1.39
0.276 0.139 0.195 0.115 20 0.057 19.04 1.25
0.273 0.111 0.200 0.096 20 0.058 19.37 1.28
0.276 0.115 0.214 0.102 20 0.049 16.36 1.08
0.280 0.116 0.211 0.102 20 0.055 18.37 1.21

0.084 0.025 0.058 0.025 20 0.026 8.68 0.49
0.083 0.024 0.057 0.027 20 0.029 9.69 0.55
0.080 0.023 0.059 0.026 20 0.024 8.02 0.45
0.111 0.035 0.083 0.028 20 0.021 7.01 0.40
0.105 0.034 0.080 0.031 20 0.022 7.35 7.79 0.42 0.44 ± 0.06
0.112 0.036 0.083 0.032 20 0.025 8.35 0.47
0.097 0.025 0.087 0.035 20 0.020 6.68 0.38
0.099 0.029 0.086 0.038 20 0.022 7.35 0.42
0.100 0.030 0.083 0.034 20 0.021 7.01 0.40
Bảng 2. Multiple Range Tests
Method: 95.0 percent LSD
Tỉ lệ H2O:EtOH Count Mean Homogeneous Groups

Tỉ lệ H2O:EtOH 9 0.44 X
1:9
5:5
2:8
3:7
4:6
2. Thí nghiệm 2
Bảng 3. Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu thích hợp cho
việc trích ly anthocyanin từ gạo đen.
8
pH=1 pH=4.5 Hệ Hàm

Tỉ lệ Độ Hàm lượng lượng %
số %
dung hấp anthocyanin trung Athocyanin
535nm 700nm 535nm 700nm pha Athocyanin
môi thu mg/L bình trung bình
loãng
STT mg/L
1 0.510 0.251 0.464 0.262 20 0.057 19.04 0.88
2 0.513 0.253 0.465 0.260 20 0.055 18.37 0.85
3 0.511 0.256 0.466 0.267 20 0.056 18.70 0.86
4 0.508 0.274 0.429 0.250 20 0.055 18.37 0.85
5 1:06 0.513 0.275 0.432 0.252 20 0.058 19.37 18.81 0.89 0.87 ± 0.02
6 0.514 0.281 0.433 0.256 20 0.056 18.70 0.86
7 0.546 0.301 0.471 0.283 20 0.057 19.04 0.88
8 0.550 0.299 0.468 0.271 20 0.054 18.03 0.83
9 0.551 0.300 0.467 0.275 20 0.059 19.70 0.91
1 0.494 0.266 0.392 0.214 20 0.050 16.70 0.99
2 0.493 0.265 0.391 0.213 20 0.050 16.70 0.99
3 0.494 0.267 0.392 0.218 20 0.053 17.70 1.05
4 0.495 0.280 0.409 0.248 20 0.054 18.03 1.07
5 1:08 0.495 0.283 0.408 0.245 20 0.049 16.36 16.88 0.97 1.00 ± 0.04
6 0.497 0.283 0.408 0.242 20 0.048 16.03 0.95
7 0.480 0.271 0.399 0.241 20 0.051 17.03 1.01
8 0.479 0.273 0.387 0.232 20 0.051 17.03 1.01
9 0.482 0.272 0.400 0.239 20 0.049 16.36 0.97
1 0.410 0.220 0.310 0.160 20 0.040 13.36 0.97
2 0.409 0.221 0.309 0.162 20 0.041 13.69 0.99
3 0.413 0.224 0.309 0.161 20 0.041 13.69 0.99
4 0.399 0.173 0.364 0.179 20 0.041 13.69 0.99
5 1:10 0.402 0.181 0.362 0.184 20 0.043 14.36 13.69 1.04 0.99 ± 0.05
6 0.404 0.184 0.365 0.185 20 0.040 13.36 0.97
7 0.420 0.160 0.402 0.181 20 0.039 13.03 0.94
8 0.425 0.169 0.407 0.196 20 0.045 15.03 1.09
9 0.416 0.157 0.409 0.189 20 0.039 13.03 0.94
1 0.284 0.140 0.227 0.119 20 0.036 12.02 1.03
2 1:12 0.286 0.143 0.225 0.118 20 0.036 12.02 11.50 1.03 0.98 ±0.04
3 0.285 0.145 0.228 0.120 20 0.032 10.69 0.91
4 0.295 0.155 0.253 0.147 20 0.034 11.36 0.97
9
5 0.298 0.157 0.251 0.145 20 0.035 11.69 1.00

6 0.299 0.158 0.250 0.142 20 0.033 11.02 0.94
7 0.324 0.168 0.240 0.120 20 0.036 12.02 1.03
8 0.319 0.159 0.240 0.115 20 0.035 11.69 1.00
9 0.325 0.165 0.245 0.118 20 0.033 11.02 0.94

Tỷ lệ nguyên liệu Count Mean Homogeneous
Groups
Tỷ lệ nguyên liệu 9 0.867778 X
1:6
1:12
1:10
1:8
3. Thí nghiệm 3
Bảng 5 Giá trị OD cùa thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho việc trích
ly anthocyanin từ gạo đen.
pH=1 pH=4.5 Hệ Hàm
Hàm lượng lượng %
Nhiệt số Độ hấp %
anthocyanin trung Anthocyanin
độ 535nm 700nm 535nm 700nm pha thu Anthocyanin
mg/L bình TB
loãng
mg/L
0.630 0.366 0.590 0.359 20 0.033 11.02 0.509
0.642 0.380 0.581 0.349 20 0.030 10.02 0.463
0.643 0.380 0.581 0.354 20 0.036 12.02 0.555
0.530 0.296 0.446 0.244 20 0.032 10.69 0.494
40oC 0.534 0.293 0.449 0.246 20 0.038 12.69 11.24 0.586 0.519 ± 0.04
0.537 0.293 0.455 0.246 20 0.035 11.69 0.540
0.539 0.295 0.473 0.261 20 0.032 10.69 0.494
0.538 0.291 0.475 0.263 20 0.035 11.69 0.540

0.542 0.299 0.476 0.265 20 0.032 10.69 0.494
50oC 0.592 0.320 0.511 0.283 20 0.044 14.70 14.73 0.679 0.680 ± 0.03
10
0.594 0.323 0.511 0.286 20 0.046 15.36 0.710

0.595 0.324 0.512 0.284 20 0.043 14.36 0.663
0.425 0.227 0.349 0.195 20 0.044 14.70 0.679
0.427 0.227 0.350 0.193 20 0.043 14.36 0.663
0.427 0.226 0.349 0.192 20 0.044 14.70 0.679
0.645 0.353 0.542 0.297 20 0.047 15.70 0.725
0.641 0.353 0.540 0.298 20 0.046 15.36 0.710
0.639 0.354 0.541 0.296 20 0.040 13.36 0.617
0.411 0.209 0.339 0.185 20 0.048 16.03 0.740
0.417 0.213 0.344 0.189 20 0.049 16.23 0.750
0.410 0.208 0.339 0.187 20 0.050 16.70 0.771
0.419 0.218 0.331 0.177 20 0.047 15.70 0.725
55oC 0.420 0.221 0.328 0.178 20 0.049 16.36 16.16 0.756 0.747 ± 0.03
0.415 0.217 0.330 0.184 20 0.052 17.37 0.802
0.429 0.229 0.350 0.199 20 0.049 16.36 0.756
0.428 0.231 0.347 0.196 20 0.046 15.36 0.710
0.428 0.233 0.346 0.197 20 0.046 15.36 0.710
0.709 0.389 0.723 0.458 20 0.055 18.37 0.848
0.716 0.390 0.717 0.450 20 0.059 19.70 0.910
0.717 0.403 0.718 0.462 20 0.058 19.37 0.895
0.554 0.265 0.510 0.275 20 0.054 18.03 0.833
60oC 0.555 0.264 0.509 0.274 20 0.056 18.70 18.70 0.864 0.864 ± 0.03
0.557 0.266 0.514 0.278 20 0.055 18.37 0.848
0.548 0.253 0.512 0.273 20 0.056 18.70 0.864
0.549 0.257 0.513 0.275 20 0.054 18.03 0.833
0.551 0.260 0.514 0.280 20 0.057 19.04 0.879
0.279 0.122 0.229 0.119 20 0.047 15.70 0.725
0.280 0.120 0.224 0.113 20 0.049 16.36 0.756
0.274 0.118 0.228 0.117 20 0.045 15.03 0.694
0.312 0.140 0.289 0.165 20 0.048 16.03 0.740
65oC 0.315 0.145 0.286 0.166 20 0.050 16.70 16.03 0.771 0.740 ± 0.04
0.312 0.147 0.283 0.163 20 0.045 15.03 0.694
0.300 0.152 0.287 0.188 20 0.049 16.36 0.756
0.295 0.150 0.294 0.196 20 0.047 15.70 0.725
0.299 0.150 0.290 0.193 20 0.052 17.37 0.802
0.403 0.182 0.329 0.154 20 0.046 15.36 0.710
70oC 0.398 0.194 0.318 0.160 20 0.046 15.36 14.88 0.710 0.687 ± 0.04
0.401 0.196 0.325 0.165 20 0.045 15.03 0.694
0.577 0.313 0.488 0.269 20 0.045 15.03 0.694
11
0.581 0.317 0.487 0.270 20 0.047 15.70 0.725

0.583 0.319 0.491 0.272 20 0.045 15.03 0.694
0.606 0.357 0.555 0.349 20 0.043 14.36 0.663
0.607 0.350 0.554 0.342 20 0.045 15.03 0.694
0.598 0.349 0.563 0.353 20 0.039 13.03 0.602

Nhiệt độ trích ly Count Mean Homogeneous
Groups
Nhiệt độ trích ly 9 0.518889 X
40oC
50oC
70oC
65oC
55oC
60oC
4. Thí nghiệm 4
Bảng 7. Giá trị OD của thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho việc trích
ly anthocyanin từ gạo đen.
Thời pH=1 pH=4.5 Hệ Hàm
Độ Hàm lượng %
gian số %
STT hấp lượng trung Athocyanin
trích 535nm 700nm 535nm 700nm pha Athocyanin
thu (mg/l) bình trung bình
ly loãng
(mg/l)
1 0.417 0.185 0.380 0.188 20 0.040 13.38 0.618
2 0.418 0.186 0.378 0.188 20 0.042 14.05 0.649
3 1h 0.420 0.180 0.378 0.180 20 0.042 14.05 14.23 0.649 0.657 ± 0.03
4 0.460 0.218 0.504 0.302 20 0.040 13.38 0.618
5 0.460 0.220 0.499 0.301 20 0.042 14.05 0.649
12
6 0.459 0.219 0.501 0.304 20 0.043 14.38 0.664

7 0.279 0.125 0.268 0.160 20 0.046 15.39 0.711
8 0.280 0.123 0.273 0.159 20 0.043 14.38 0.664
9 0.285 0.120 0.277 0.157 20 0.045 15.05 0.695
1 0.397 0.217 0.345 0.224 20 0.059 19.74 0.911
2 0.396 0.214 0.343 0.220 20 0.059 19.74 0.911
3 0.398 0.218 0.338 0.212 20 0.054 18.06 0.834
4 0.479 0.244 0.440 0.259 20 0.054 18.06 0.834
5 1h30 0.482 0.245 0.445 0.261 20 0.053 17.73 18.25 0.819 0.843 ± 0.04
6 0.481 0.248 0.443 0.260 20 0.050 16.72 0.772
7 0.407 0.203 0.333 0.184 20 0.055 18.40 0.850
8 0.409 0.196 0.330 0.171 20 0.054 18.06 0.834
9 0.407 0.198 0.334 0.178 20 0.053 17.73 0.819
1 0.389 0.206 0.340 0.194 20 0.037 12.38 0.572
2 0.383 0.197 0.348 0.196 20 0.034 11.37 0.525
3 0.384 0.198 0.350 0.200 20 0.036 12.04 0.556
4 0.444 0.230 0.383 0.203 20 0.034 11.37 0.525
5 2h 0.444 0.233 0.382 0.206 20 0.035 11.71 11.51 0.541 0.532 ± 0.03
6 0.437 0.229 0.383 0.209 20 0.034 11.31 0.522
7 0.420 0.196 0.392 0.204 20 0.036 12.04 0.556
8 0.415 0.199 0.385 0.200 20 0.031 10.37 0.479
9 0.416 0.199 0.380 0.196 20 0.033 11.04 0.510
1 0.399 0.286 0.375 0.285 20 0.023 7.69 0.355
2 0.401 0.287 0.377 0.287 20 0.024 8.03 0.371
3 0.396 0.280 0.371 0.280 20 0.025 8.36 0.386
4 0.461 0.401 0.369 0.330 20 0.021 7.02 0.324
5 2h30 0.458 0.344 0.358 0.268 20 0.024 7.99 8.02 0.369 0.371 ± 0.03
6 0.459 0.336 0.366 0.266 20 0.023 7.69 0.355
7 0.511 0.306 0.474 0.291 20 0.022 7.36 0.340
8 0.512 0.300 0.468 0.282 20 0.026 8.70 0.402
9 0.513 0.305 0.460 0.280 20 0.028 9.37 0.433
1 0.412 0.286 0.366 0.255 20 0.015 5.02 0.232
2 0.416 0.237 0.368 0.202 20 0.013 4.35 0.201
3 0.407 0.213 0.367 0.189 20 0.016 5.35 0.247
4 3h 0.451 0.233 0.498 0.292 20 0.012 4.01 4.94 0.185 0.228 ± 0.03
5 0.471 0.244 0.498 0.285 20 0.014 4.68 0.216
6 0.472 0.234 0.497 0.274 20 0.015 5.02 0.232
7 0.572 0.359 0.496 0.297 20 0.014 4.68 0.216
8 0.579 0.358 0.496 0.290 20 0.015 5.02 0.232
13
9 0.577 0.358 0.491 0.291 20 0.019 6.36 0.294

Thời gian trích ly Count Mean Homogeneous
Groups
Thời gian trích ly 9 0.22888 X
3h 9
2h30 1
2h 3
1h 8
1h30 1
5. Thí nghiệm thứ 5
Bảng 9. Giá trị OD xác định hàm lượng anthocyanin để xác định giá trị IC50 của
vitaminC
Nồng độ đầu ND sau %
(mg/ml) (mg/ml) OD DPPH TB
0.559 16.19
0.05 0.001219512 0.565 15.29 15.29 ± 0.09
0.571 14.39
0.414 37.93
0.1 0.002439024 0.424 36.43 36.03 ± 2.13
0.442 33.73
0.283 57.57
0.25 0.006097561 0.28 58.02 57.67 ± 0.31
0.284 57.42
0.043 93.55
0.5 0.012195122 0.044 93.40 93.50 ± 0.09
0.043 93.55
0.039 94.15
0.75 0.018292683 0.033 95.05 94.25 ± 0.75
0.043 93.55
14
Bảng 10. OD xác định hàm lượng anthocyanin để xác định giá trị IC50 của dịch
trích ly trước cô quay.
Nồng độ đầu (mg/ml) ND sau %
(mg/ml) OD DPPH TB
3.768 0.256 61.62
0.091902439 0.263 60.57 61.12 ± 0.53
0.259 61.17
2.6376 0.377 43.48
0.064331707 0.329 50.67 48.88 ± 4.76
0.317 52.47
1.884 0.459 31.18
0.04595122 0.451 32.38 32.13 ± 0.85
0.448 32.83
1.1304 0.523 21.59
0.027570732 0.52 22.04 22.34 ± 0.94
0.511 23.39
0.942 0.559 16.19
0.02297561 0.596 10.64 15.04 ± 3.95
0.545 18.29
15
Bảng 11. OD xác định hàm lượng anthocyanin để xác định giá trị IC50 của dịch
trích ly sau cô quay.
Nồng độ
đầu ND sau %
(mg/ml) (mg/ml) OD DPPH TB
0.287 57.86
2.75 0.067073 0.288 57.71 57.81 ± 0.08
0.287 57.86
0.249 63.44
2.25 0.054878 0.248 63.58 63.63 ± 0.22
0.246 63.88
0.325 52.28
1.75 0.042683 0.324 52.42 52.33 ± 0.08
0.325 52.28
0.341 49.93
1.25 0.030488 0.343 49.63 49.78 ± 0.15
0.342 49.78
0.355 47.87
0.75 0.018293 0.358 47.43 47.58 ± 0.25
0.358 47.43
6. Thí nghiệm 6
Bảng 12. Giá trị OD của thí nghiệm xác độ hấp thu trong dịch trích ly từ gạo
đen ở những pH khác nhau.
STT pH 535nm 700nm Độ hấp thu (nm)
1 0.467 0.225
2 1 0.466 0.227 0.466
3 0.466 0.228
1 0.288 0.144
2 3 0.289 0.145 0.289
3 0.290 0.143
1 0.341 0.261
2 4.5 0.332 0.238 0.338
3 0.340 0.216
1 5.2 0.368 0.242 0.370
2 0.369 0.212
16
3 0.374 0.199
1 0.083 0.049
2 6 0.082 0.052 0.083
3 0.085 0.048
1 0.211 0.156
2 6.7 0.214 0.157 0.214
3 0.218 0.159
1 0.033 0.010
2 8.8 0.032 0.013 0.033
3 0.035 0.010
1 0.118 0.051
2 9.4 0.119 0.052 0.118
3 0.117 0.054
1 0.058 0.010
2 0.057 0.012 0.058
3 0.059 0.013
7. Thí nghiệm 7
Bảng 13. Giá trị OD của thí nghiệm xác định hàm lượng ahthocyanin khi bảo
quản ở 00C.
pH=1 pH=4.5 Hệ số Hàm Hàm
Nhiệt Độ hấp lượng
STT pha lượng
độ 00C 535nm 700nm 535nm 700nm thu trung bình
loãng mg/L
mg/L
1 0.359 0.186 0.368 0.217 20 0.022 7.35
2 0.348 0.187 0.367 0.220 20 0.014 4.68
3 0.346 0.186 0.365 0.219 20 0.014 4.68
4 0.345 0.186 0.364 0.221 20 0.015 5.12 5.31 ±
5 0 giờ 0.343 0.186 0.362 0.221 20 0.016 5.18 0.93
6 0.342 0.186 0.361 0.223 20 0.017 5.79
7 0.340 0.186 0.359 0.223 20 0.018 5.84
8 0.335 0.186 0.358 0.224 20 0.015 5.01
9 0.330 0.186 0.356 0.225 20 0.013 4.17
1 0.305 0.156 0.308 0.178 20 0.019 6.35
2 0.296 0.155 0.297 0.177 20 0.021 7.01
3 1 giờ 0.290 0.154 0.292 0.178 20 0.022 7.35 6.00 ±
4 0.280 0.153 0.283 0.178 20 0.022 7.24 0.51
5 0.280 0.162 0.275 0.178 20 0.021 6.90
6 0.274 0.161 0.277 0.178 20 0.014 4.56
17
7 0.268 0.160 0.269 0.178 20 0.017 5.57

8 0.265 0.169 0.261 0.178 20 0.013 4.23
9 0.256 0.148 0.263 0.178 20 0.023 7.57
1 0.337 0.175 0.373 0.235 20 0.024 8.02
2 0.333 0.176 0.370 0.237 20 0.024 8.02
3 0.332 0.175 0.370 0.238 20 0.025 8.35
4 0.329 0.175 0.368 0.242 20 0.028 9.35 7.79 ±
5 1 ngày 0.327 0.175 0.367 0.240 20 0.025 8.24
0.63
6 0.324 0.175 0.365 0.240 20 0.024 7.90
7 0.311 0.173 0.363 0.250 20 0.025 8.35
8 0.319 0.180 0.362 0.249 20 0.026 8.68
9 0.310 0.184 0.360 0.255 20 0.021 7.01
1 0.297 0.167 0.335 0.232 20 0.027 8.87
2 0.292 0.167 0.333 0.233 20 0.025 8.42
3 0.294 0.166 0.335 0.234 20 0.027 9.12
4 0.295 0.164 0.329 0.225 20 0.027 9.02 8.93 ±
5 2 ngày 0.291 0.166 0.334 0.236 20 0.027 9.03 0.47
6 0.290 0.160 0.339 0.238 20 0.029 9.69
7 0.288 0.162 0.336 0.239 20 0.029 9.82
8 0.284 0.164 0.334 0.241 20 0.027 8.88
9 0.286 0.163 0.334 0.240 20 0.029 9.71
1 0.528 0.277 0.520 0.291 20 0.022 7.35
2 0.530 0.270 0.528 0.292 20 0.024 8.02
3 0.517 0.297 0.505 0.310 20 0.025 8.35
4 0.520 0.295 0.505 0.305 20 0.025 8.35 7.68 ±
5 3 ngày 0.525 0.305 0.515 0.315 20 0.020 6.68
0.89
6 0.507 0.324 0.484 0.321 20 0.020 6.51
7 0.505 0.325 0.485 0.325 20 0.020 6.65
8 0.502 0.334 0.475 0.325 20 0.018 6.01
9 0.499 0.342 0.458 0.325 20 0.024 8.02
1 0.574 0.360 0.536 0.342 20 0.020 6.75
2 0.592 0.373 0.549 0.349 20 0.020 6.59
3 0.610 0.386 0.562 0.356 20 0.019 6.43
4 0.629 0.399 0.574 0.363 20 0.019 6.27 6.28 ±
5 4 ngày 0.647 0.412 0.587 0.370 20 0.018 6.11 0.43
6 0.665 0.425 0.600 0.377 20 0.018 5.96
7 0.683 0.438 0.612 0.385 20 0.017 5.80
8 0.701 0.451 0.625 0.392 20 0.017 5.64
9 0.719 0.464 0.638 0.399 20 0.016 5.48
18
1 0.202 0.177 0.337 0.330 20 0.018 6.01

2 0.204 0.172 0.338 0.325 20 0.019 6.35
3 0.207 0.170 0.339 0.322 20 0.020 6.68
4 0.300 0.218 0.342 0.278 20 0.018 6.01 5.78 ±
5 5 ngày 0.318 0.230 0.349 0.273 20 0.012 4.01
1.08
6 0.310 0.237 0.340 0.279 20 0.012 4.01
7 0.350 0.252 0.345 0.265 20 0.018 6.01
8 0.382 0.269 0.347 0.253 20 0.019 6.35
9 0.400 0.282 0.349 0.252 20 0.021 7.01
0
quản ở 20 C.
pH=1 pH=4.5 Hệ số Hàm

Nhiệt độ Độ hấp Hàm lượng
pha
200C 535nm 700nm 535nm 700nm thu lượng trung
loãng
bình
0.360 0.219 0.375 0.248 20 0.014 4.68
0.353 0.216 0.371 0.247 20 0.013 4.34
0.352 0.215 0.370 0.248 20 0.015 5.01
0.343 0.213 0.367 0.248 20 0.011 3.67 4.43 ±
0 giờ 0.342 0.211 0.365 0.248 20 0.015 4.84
0.61
0.338 0.209 0.362 0.248 20 0.015 5.01
0.330 0.207 0.360 0.248 20 0.012 3.84
0.329 0.205 0.357 0.248 20 0.015 5.01
0.320 0.203 0.355 0.248 20 0.011 3.51
0.288 0.154 0.275 0.155 20 0.014 4.68
0.287 0.150 0.275 0.149 20 0.011 3.67
0.287 0.149 0.274 0.148 20 0.012 4.01
0.286 0.146 0.274 0.144 20 0.010 3.45
3.12 ±
1 giờ 0.286 0.144 0.273 0.140 20 0.009 3.12
0.51
0.285 0.141 0.273 0.137 20 0.008 2.78
0.285 0.139 0.272 0.133 20 0.007 2.45
0.284 0.136 0.272 0.130 20 0.006 2.12
0.284 0.134 0.271 0.126 20 0.005 1.78
0.303 0.159 0.320 0.186 20 0.010 3.34 2.73 ±
1 ngày 0.301 0.157 0.317 0.183 20 0.010 3.34
0.19
0.300 0.156 0.317 0.182 20 0.009 3.01
19
0.298 0.154 0.315 0.180 20 0.009 2.89

0.297 0.153 0.314 0.178 20 0.008 2.73
0.295 0.151 0.312 0.176 20 0.008 2.56
0.294 0.150 0.311 0.174 20 0.007 2.39
0.292 0.148 0.309 0.172 20 0.007 2.23
0.291 0.147 0.308 0.170 20 0.006 2.06
0.310 0.178 0.308 0.186 20 0.010 3.34
0.310 0.172 0.315 0.187 20 0.010 3.34
0.315 0.172 0.319 0.186 20 0.010 3.34
0.317 0.168 0.319 0.186 20 0.016 5.23 3.94 ±
2 ngày 0.308 0.165 0.319 0.186 20 0.011 3.51
0.76
0.309 0.162 0.318 0.186 20 0.015 5.01
0.310 0.159 0.324 0.186 20 0.013 4.45
0.306 0.160 0.321 0.186 20 0.011 3.79
0.307 0.163 0.320 0.186 20 0.010 3.45
0.287 0.134 0.307 0.167 20 0.013 4.34
0.286 0.136 0.306 0.168 20 0.012 4.01
0.285 0.137 0.305 0.170 20 0.013 4.34
0.284 0.134 0.323 0.186 20 0.013 4.34 4.55 ±
3 ngày 0.287 0.135 0.323 0.185 20 0.014 4.68
0.31
0.289 0.137 0.323 0.185 20 0.014 4.68
0.288 0.136 0.329 0.193 20 0.014 4.76
0.288 0.137 0.334 0.197 20 0.015 4.87
0.288 0.137 0.338 0.202 20 0.015 4.97
0.278 0.124 0.326 0.187 20 0.015 4.87
0.275 0.121 0.327 0.188 20 0.016 5.21
0.273 0.119 0.327 0.189 20 0.016 5.20
0.270 0.116 0.328 0.189 20 0.016 5.19 5.33 ±
4 ngày 0.268 0.113 0.328 0.190 20 0.016 5.40
0.37
0.265 0.110 0.329 0.190 20 0.015 5.17
0.263 0.107 0.330 0.193 20 0.018 6.17
0.260 0.105 0.330 0.190 20 0.015 5.15
0.258 0.102 0.331 0.192 20 0.017 5.60
0.356 0.188 0.366 0.224 20 0.026 8.68
0.350 0.195 0.369 0.235 20 0.021 7.01
5 ngày 0.350 0.187 0.369 0.223 20 0.017 5.68 6.85 ±
0.367 0.274 0.336 0.265 20 0.022 7.35 0.88
0.350 0.268 0.333 0.271 20 0.020 6.68
0.345 0.264 0.329 0.270 20 0.022 7.35
20
0.349 0.298 0.318 0.286 20 0.020 6.52

0.348 0.318 0.308 0.296 20 0.018 6.07
0.347 0.317 0.299 0.288 20 0.019 6.36
21
quản ở 400C.
pH=1 pH=4.5 Hàm
Nhiệt độ Hệ số Độ hấp Hàm lượng
pha lượng trung
40oC 535nm 700nm 535nm 700nm thu
loãng mg/L bình
mg/L
0.249 0.128 0.247 0.132 20 0.006 2.00
0.248 0.126 0.245 0.130 20 0.007 2.34
0.250 0.126 0.245 0.128 20 0.007 2.34
0.250 0.125 0.244 0.126 20 0.008 2.56 2.73 ±
0 giờ 0.251 0.124 0.243 0.124 20 0.008 2.73
0.46
0.251 0.123 0.242 0.122 20 0.009 2.89
0.252 0.122 0.241 0.120 20 0.009 3.06
0.252 0.121 0.240 0.118 20 0.010 3.23
0.253 0.120 0.239 0.116 20 0.010 3.40
0.259 0.139 0.241 0.126 20 0.005 1.67
0.253 0.126 0.243 0.125 20 0.009 3.01
0.254 0.127 0.244 0.126 20 0.009 3.01
0.250 0.120 0.246 0.126 20 0.010 3.45 3.01 ±
1 giờ 0.257 0.124 0.247 0.126 20 0.011 3.73
0.79
0.255 0.123 0.249 0.126 20 0.009 2.89
0.253 0.122 0.250 0.126 20 0.006 2.00
0.260 0.121 0.252 0.126 20 0.013 4.23
0.257 0.120 0.253 0.126 20 0.009 3.06
0.279 0.143 0.266 0.143 20 0.013 4.34
0.270 0.140 0.258 0.141 20 0.013 4.34
0.280 0.146 0.257 0.136 20 0.013 4.34
0.277 0.145 0.255 0.140 20 0.016 5.45 5.19 ±
1 ngày 0.275 0.143 0.254 0.135 20 0.013 4.40
0.84
0.272 0.140 0.252 0.138 20 0.018 5.90
0.270 0.139 0.251 0.137 20 0.017 5.57
0.268 0.135 0.249 0.136 20 0.019 6.46
0.269 0.138 0.248 0.135 20 0.018 5.90
0.315 0.156 0.324 0.188 20 0.023 7.68
0.318 0.157 0.325 0.188 20 0.024 8.02 6.59 ±
2 ngày 0.318 0.159 0.327 0.188 20 0.020 6.68
0.92
0.317 0.160 0.328 0.188 20 0.016 5.34
0.315 0.155 0.330 0.188 20 0.018 6.07
22
0.315 0.163 0.329 0.195 20 0.017 5.79

0.313 0.165 0.327 0.197 20 0.018 6.08
0.320 0.166 0.331 0.196 20 0.019 6.23
0.321 0.168 0.325 0.194 20 0.022 7.40
0.281 0.129 0.300 0.172 20 0.024 8.02
0.279 0.129 0.298 0.171 20 0.023 7.68
0.279 0.120 0.300 0.170 20 0.029 9.69
0.272 0.123 0.285 0.160 20 0.024 8.02 8.47 ±
3 ngày 0.269 0.118 0.284 0.158 20 0.025 8.35
0.72
0.280 0.129 0.282 0.159 20 0.028 9.35
0.270 0.123 0.276 0.153 20 0.024 8.02
0.270 0.121 0.272 0.150 20 0.027 9.08
0.275 0.130 0.268 0.147 20 0.024 8.02
0.262 0.115 0.268 0.148 20 0.027 8.97
0.258 0.113 0.263 0.145 20 0.028 9.23
0.255 0.110 0.259 0.143 20 0.028 9.52
0.251 0.107 0.255 0.139 20 0.028 9.42 9.63 ±
4 ngày 0.248 0.104 0.251 0.136 20 0.029 9.52
0.43
0.244 0.101 0.247 0.133 20 0.029 9.62
0.240 0.098 0.243 0.131 20 0.030 10.05
0.237 0.095 0.239 0.128 20 0.030 10.15
0.233 0.093 0.235 0.125 20 0.031 10.24
0.306 0.181 0.301 0.194 20 0.018 6.01
0.313 0.177 0.306 0.186 20 0.016 5.34
0.317 0.175 0.309 0.186 20 0.019 6.35
0.389 0.206 0.423 0.258 20 0.018 6.01 5.80 ±
5 ngày 0.376 0.199 0.416 0.257 20 0.018 6.01
0.45
0.376 0.195 0.415 0.251 20 0.017 5.68
0.415 0.205 0.470 0.279 20 0.019 6.35
0.428 0.218 0.490 0.295 20 0.015 5.11
0.439 0.210 0.503 0.290 20 0.016 5.34
23

DKC 2016 121826

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

DKC 2016 121826

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TÍNH

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên thực hiện: Đinh Thị Kiều My

MSSV: 1211110099 Lớp: 12DTP01

TP. Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm

Đinh Thị Kiều My

Xin chân thành cảm ơn!

DANH MỤC HÌNH................................................................................................. iv

DANH MỤC BẢNG............................................................................................... vii

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 4

1.1.1. Khái niệm..........................................................................................................................................4

1.1.2. Nguồn gốc của gạo đen hữu cơ........................................................................ 4

1.1.3. Công dụng của gạo đen hữu cơ....................................................................... 5

1.2.1 Giới thiệu............................................................................................................................................6

1.2.2. Sự phân bố của Anthocyanin........................................................................... 7

1.2.3. Cấu trúc hóa học của Anthocyanin.................................................................. 8

1.2.4. Tính chất của Anthocyanin............................................................................ 12

1.2.5.1. Cấu trúc...................................................................................................... 14

1.2.5.3. Nhiệt độ...................................................................................................... 20

1.2.5.6. Ánh sáng..................................................................................................... 23

1.2.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng.............................................. 24

1.2.5.8. Các ion kim loại......................................................................................... 25

1.2.5.9. Sulfurdioxide (SO2)................................................................................... 26

1.2.5.10. Acid ascorbic............................................................................................ 26

1.2.6. Các Anthocyanin đã được thương mại hóa.................................................... 29

1.3.1. Phương pháp tách chiết Anthocyanin từ gạo................................................. 29

1.3.2. Phương pháp trích ly Anthocyanin từ quả dâu Hội An.............................................30

1.3.3. Phương pháp tách triết Anthocyanin từ bắp cải tím...................................................31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................... 32

2.1. Nguyên vật liệu................................................................................................ 32

2.1.1. Nguồn gạo đen.............................................................................................. 32

2.1.2. Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................................... 32

2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm......................................................................... 33

2.2.2.1. Sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin ở các pH khác nhau..........................40

2.4. Phương pháp xử lý số liệu................................................................................ 43

CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ.....................................................................................63

4.1. Kết luận...............................................................................................................................................63

4.2 Kiến nghị.............................................................................................................................................66

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 68

PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM...................................................................... 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Cấu trúc phổ biến của Anthocyanin.......................................................... 11

Hình 1.3. Cation Flavylium..................................................................................... 12

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước................................15

Hình 1.7 Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7...............21

Hình1.9. Phản ứng ngưng tụ.................................................................................... 25

Hình 3.5 Dịch trích ly anthocyanin ở các nhiệt độ khác nhau................................. 50

Hình 4.1. Dịch chiết Anthocyanin trước cô quay.................................................... 65

Hình 4.2. Dịch chiết sau cô đặc............................................................................... 66

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen.............................................................. 5

Bảng 1.2. Bảng các Anthocyanin có nguồn gốc thực vật.......................................... 8

Bảng 1.3. Một số Anthocyanin phổ biến................................................................... 9

Bảng 1.4 Các nhóm Anthocyanin hiện có............................................................... 10

Bảng 3.1. Giá trị %I à IC50 của vitamin C............................................................... 58