Khóa luận tốt nghiệp

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Khóa luận tốt nghiệp
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH

HỌC CỦA NẤM Trichoderma sp. LÊN MỘT
SỐ NẤM GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ
TRÊN CÂY CÓ MÚI
Giáo viên hướng dẫn:
TS. Phạm Minh Tuấn Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Bích Tuyền
MSSV: 2008110342
Lớp 02DHSH1
TP.HCM, ngày 29 tháng 6 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: Phạm Minh Tuấn
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Phạm Minh Tuấn. Em cảm ơn Thầy
trong thời gian vừa qua đã tận tâm hướng dẫn, trao đổi và tạo điều kiện tốt cho em
thực tập tốt nghiệp. Cảm ơn Thầy đã truyền đạt cho em hiểu biết thêm những kiến
thức cơ mà trước đây em còn thiếu sót. Cảm ơn Thầy đã tin tưởng em có thể hoàn
thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn quí Thầy, Cô Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Công Nghiệp Thực Phẩm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến
thức cơ bản nhất để chúng em có đủ kiến thức để thực hiện được đề tài thực tập tốt
nghiệp.
Em xin cảm ơn đến các anh, chị công tác tại Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh
học Tiên Phong đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp,
các kĩ năng, thao tác thực hành và cung các kiến thức chuyên sâu trong quá trình thực
hiện để tài, thường xuyên đóng góp ý kiến và hỗ trợ em trong thời gian thực hiện đề
tài này.
Cuối cùng chúng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên,
chia sẻ cùng chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Trong thời gian thực hiện
đề tài thực tập tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên do thời gian có
hạn và kiến thức, kinh nghiệm còn nhiều hạn chế nên không thể tránh được những sai
sót. Rất mong được sự quan tâm, thông cảm và góp ý của Thầy, Cô và anh chị để đề
tài được hoàn thiện hơn.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện
ii
SVTH: Nguyễn Thị Bích Tuyền
LỜI CAM ĐOAN


Em cam đoan rằng báo cáo thực tập này là do chính em thực hiện. Các số liệu
thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề
tài nghiên cứu khoa học nào.
Ngày …. tháng …. năm …
Sinh viên thực hiện
(ký và ghi họ tên)
iii
MỤC LỤC
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 1
1.1. Bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi ............................................................... 1
1.1.1. Triệu chứng bệnh .................................................................................... 1
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh ........................................................................... 2
1.1.3. Điều kiện phát sinh phát triển bệnh ...................................................... 2
1.1.4. Biện pháp phòng trừ bệnh ..................................................................... 3
1.2. Lịch sử nghiên cứu về bệnh vàng lá thối rễ trong và ngoài nước ................... 3
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................... 3
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài ...................................................... 5
1.2.3. Biện pháp sinh học trong bảo vệ cây trồng .......................................... 6
1.3. Các nấm gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi.......................................... 6
1.3.1. Nấm Fusarium sp. ................................................................................... 6
1.3.2. Pythium sp. và Phythophthora sp............................................................ 9
1.3.3. Tuyến trùng ............................................................................................ 13
1.4. Nấm đối kháng với các chủng nấm gây bệnh trên cây có múi ...................... 15
1.4.1. Nấm Trichoderma sp. ............................................................................ 15
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 19
2.1. Vật liệu nghiên cứu........................................................................................ 19
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................... 19
2.1.2. Nguồn mẫu bệnh và mẫu đối kháng dùng trong nghiên cứu ........... 19
2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ....................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 23
2.2.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 23
2.2.2. Phương pháp phân tích ........................................................................... 24
2.2.2.8. Phương pháp đánh giá tính đối kháng của Trichoderma sp. đối với nấm
bệnh trên môi trường PDA (André Drenth et al, 2004) ....................................... 27
2.2.2.9. Phương pháp xác định vòng phân giải của trên môi trường chứa
cellulose ................................................................................................................ 29
2.2.3. Xử lí số liệu thống kê ............................................................................ 30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................ 31
3.1. Kết quả phân lập nấm bệnh, nấm Trichoderma trên vườn cam .................... 31
3.1.1. Phân lập nấm bệnh từ mẫu cây bệnh thối rễ trên cây có múi .......... 31
3.1.2. Chủng lại nấm bệnh phân lập được vào cây con ............................... 33
iv
3.1.3. Phân lập nấm Trichoderma từ cây có múi khỏe mạnh trong vườn .. 34
3.2. Kết quả cấy đối kháng ................................................................................. 35
3.2.1. So sánh tốc độ phát triển của nấm Trichoderma sp. và nấm
Fusarium sp. ........................................................................................................ 42
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 44
4.1. Kết luận.......................................................................................................... 44
4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 44
Chương 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 45
5.1. Tài liệu tiếng việt.......................................................................................... 45
5.2. Tài tiệu tiếng anh ......................................................................................... 45
5.3. Tài liệu online ............................................................................................... 46
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1 Biểu hiện của bệnh vàng lá thối rễ trên lá của cây có múi............................ 1
Hình 1. 2. Triệu chứng bệnh vàng lá thối rễ xuất hiện trên rễ ...................................... 2
Hình 1. 3. Hình thái bào tử của nấm F. oxysporum .... Error! Bookmark not defined.
Hình 1. 4. Fusarium solani, khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA, 27℃, 7 ngày ......... 9
Hình 1. 5. Đặc điểm hình thái của Pythium senticosum. ............................................ 10
Hình 1. 7 Hình thái khuẩn lạc của Phytophthora trên PDA (bên phải) and V8J (bên
trái) ở 14 ngày. ............................................................................................................ 12
Hình 1. 6. Đặc điểm hình thái của Phytophthora nicotianae..................................... 12
Hình 1. 8 Chu kỳ bệnh đã được đơn giản hoá của tác nhân gây bệnh thuộc lớp nấm
trứng (Burgess et al, 2009) .......................................................................................... 13
Hình 1. 9. Hình dạng của tuyến trùng cái gây hại trên cây có múi, Tylenchulus
semipenetrans (Cobb, 1913), ...................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1. 10. Hình dạng của tuyến trùng đực hại cây có múi, Tylenchulus
semipenitrans (Cobb, 1913). ....................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1. 11 Hình thái bào tử của chủng Trichoderma parareesei sp. CBS 125925 sau
3 ngày trên môi trường CMD (Sigma corn meal agar plus 10% dextrose) ở
25°C.2010, American Society for Microbiology.)...................................................... 16
Hình 1. 12 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma harzianum trên môi trường PDA ........ 17
Hình 2. 1. Kiểm tra khả năng đối kháng của nấm bệnh và Trichoderma trên môi
trường PDA ................................................................................................................. 28
Hình 2. 2. Hình ảnh thể hiện vùng ức chế của nấm Trichoderma sp. lên nấm bệnh .. 29
Hình 3. 1. Hình thái đại thể và vi thể của nấm Fusarium phân lập được từ vườn cam
bị bệnh ......................................................................................................................... 33
Hình 3. 2. Kết quả phân lập trước và kết quả chủng ngược nấm Fusarium sp. lên cây
con ............................................................................................................................... 34
Hình 3. 3. Hình thái đại thể và vi thể của các chủng nấm Trichoderma sp. phân lập từ
mẫu đất của cây cam khỏe mạnh ................................................................................ 35
Hình 3. 4 Nấm Trichoderma sp. đối kháng nấm Fusarium sp. .................................. 37
Hình 3. 5 Hình thái các khuẩn lạc đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm
Fusarium sp. sau 9 ngày cấy đối kháng ...................................................................... 39
Hình 3. 6. Hình ảnh thể hiện vòng phân giải của các chủng nấm Trichoderma trên
môi trường CMC ......................................................... Error! Bookmark not defined.
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1 Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài ................................ 19
Bảng 2. 2 Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài ........................ 20
Bảng 2. 4 Thành phần môi trường PDA ..................................................................... 20
Bảng 2. 5 Thành phần môi trường V-8J-agar ............................................................. 21
Bảng 2. 6 Thành phần môi trường CMA .................................................................... 21
Bảng 2. 7 Thành phần môi trường Water agar (WA) ................................................. 21
Bảng 2. 8 Thành phần môi trường CA ........................................................................ 21
Bảng 2. 9 Thành phần hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn bổ sung vào môi trường phân
lập Phytophthora sp. .................................................................................................... 22
Bảng 3. 1. Các chủng nấm được phân lập từ cây cam bị bệnh ................................... 31
Bảng 3. 2 Kết quả hình thái của nấm Fusarium sp. phân lập được ............................ 32
Bảng 3. 3. Kết quả mô tả đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Trichoderma asperellum
phân lập từ đất của cây cam khỏe mạnh ..................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3. 4 Kết quả đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm Fusarium sp. ........ 37
Bảng 3. 5. Vòng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma sp. ................. Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3. 6 So sánh tốc độ phát triển của nấm Trichoderma (T01, MCB1) và nấm
Fusarium (Fus1) sau 5 ngày cấy .................................................................................. 42
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biều đồ 3. 1. Biểu đồ thể hiện mối quan hệ của vùng ức chế và tỉ lệ ức chế của nấm
Trichoderma sp. đối với nấm Fusarium sp.................. Error! Bookmark not defined.
Biều đồ 3. 2 Tốc độ phát triển của nấm Trichoderma sp. và nấm Fusarium sp .. Error!
Bookmark not defined.
vii
LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay ở Đồng bằng Sông Cửu Long đã hình thành một số vùng chuyên canh
cây có múi với diện tích khá lớn trong đó chủ yếu là cam sành và bưởi. Ở các vùng
này xuất hiện một loại bệnh đã gây thiệt hại nặng nề cho nhiều vườn cam, thậm chí là
hàng loạt các vườn cam đang trong giai đoạn cho trái phải đốn bỏ vì không còn khả
năng phát triển, với việc mở rông diện tích các vườn cây có múi cũng bị các đối
tượng dịch hại tấn công gây hại ngày càng nhiều. Trong đó nguy nhiểm nhất là bệnh
vàng lá thối rễ, bệnh này làm cho nhiều vườn cam bưởi bị chết hàng loạt phải đốn bỏ
gây tổn thất lớn cho các nhà vườn.
Bệnh vàng lá thối rễ đã xuất hiện cách đây khá lâu tuy nhiên hiện nay bệnh này
phát triển rộng rãi hơn, mạnh hơn. Bệnh phát triển tùy theo từng vùng, có những vùng
với điều kiện ngập nước nhiều hơn nên tình trạng gây bệnh nặng hơn. Theo các nhà
chuyên môn có rất nhiều tác nhân gây ra bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi như: đất
đai bị thoái hóa ít màu mỡ và kĩ thuật canh tác kém công thêm sự tấn công gây bệnh
như nấm: Fusarium solani, Phythium, Phytophthora và tuyến trùng,… trong đó nấm
Fusarium solani là quan trọng nhất, chúng có thể kết hợp với tuyến trùng gây thiệt
hại nặng cho cây có múi. Các nấm gây thiệt hại không nhỏ đối với các nông dân trồng
cây ăn quả không chỉ có ở Đồng bằng sông Cửu Long mà còn các khu vực khác ở
Viêt Nam và một số nước ở Đông Nam Á như: Indonesia, Malaysia, Philippines,
Thailand,…( André Drenth et al, 2004).
Việc sử dụng nông dược hiện nay để phòng trị bệnh dường như rất tốn kém,
gây ô nhiễm môi trường và dễ hình thành các chủng mới có khả năng kháng thuốc
(Ahmed et al., 1999). Trong khi đó một số nghiên cứu đã cho thấy khả năng của nấm
Trichoderma trong việc phòng trị nấm bệnh Phytophthora (Harman & Kubicek,
1998; Hoitink & Boehm, 1999) và nấm Fusarium (Patel, 2011), trong đó các chủng
Trichoderma nội địa của đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng đã được nghiên
cứu về tiềm năng phòng trị bệnh do các nấm gây hại trên cây ăn quả (Nguyễn Văn
Tứ, 2005; Dương Minh et al., 2005). Ngoài ra, bón phân hữu cơ có bổ sung nấm
Trichoderma vào đất vườn cũng giúp tăng số trái và năng suất cây ăn trái so với chỉ
bón phân vô cơ (Võ Thị Gương et al., 2006). Khả năng đối kháng giúp Trichoderma
khống chế hiệu quả với nấm gây bệnh là nhờ tiết ra các enzym như: protease,
cellulose, β-glucanase (Harman & Kubicek, 1998; Cruz & Llobell, 1999) để phân hủy
vách tế bào của nấm noãn và nấm thực, gồm β-1,3-glucan và cellulose (Inglis &
Kawechuck, 2002), ngoài các enzyme có thể phân hủy thành tế bào của nấm bệnh thì
nấm Trichoderma còn có khả năng sản sinh các acid hữu cơ như: harzianic acid,
viii
alamethicins, tricholin, peptaibols, 6-penthyl-alpha-pyrone, massoilactone, viridin,

gliovirin, glisoprenins, heptelidic acid và các loại khác (Vey et al., 2001). Trên cơ sở
này, đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng sinh học của nấm Trichoderma sp. lên
một số nấm gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi” được thực hiện nhằm phân
lập, chọn lọc, khảo sát các chủng nấm Trichoderma sp. có khả năng đối kháng hiệu
quả đối với các nấm gây bệnh thối rễ trên cây có múi tại các tỉnh Đồng bằng Sông
Cửu Long. Kết quả nghiên cứu góp phần vào cơ sở khoa học trong ứng dụng các biện
pháp sinh học trong quản lý dịch bệnh tổng hợp (IPM- Integrated Pest Management)
theo hướng bền vững cho các vườn cây ăn trái trong khu vực.
Bệnh hại rễ trên cây có múi, tuy không phải là vấn đề mới xuất hiện gần đây,
nhưng việc hiểu biết về tác nhân gây hại, sự tương tác giữa các tác nhân, v.v. còn rất
hạn chế. Việc hiểu được những cơ chế này này sẽ giúp cho việc quản lý bệnh được
hữu hiệu hơn, sản xuất được bền vững hơn. Trong xu hướng hiện tại của việc ứng
dụng đối kháng sinh học là biện pháp sử dụng giống kháng, kết hợp với các vi sinh
vật có ích trong đất mới giúp việc quản lý bệnh được lâu dài, triệt để và bền vững.
a. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với các nấm gây
bệnh thối rễ trên cây cam quýt phân lập tử mẫu bệnh thu thập ở tỉnh Bến Tre.
b. Nội dung nghiên cứu
Phân lập các chủng nấm trên cây cam quýt bị bệnh và nấm Trichoderma sp.
trên mẫu đất thu thập tại một số vườn cây cam quýt ở tỉnh Bến Tre.
Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. đối với nấm gây bệnh thối
rễ cây cam quýt trên môi trường PDA
Khảo sát hiệu quả đối kháng của Trichoderma sp. trong môi trường đất ở quy
mô nhà lưới.
ix
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi
Bệnh vàng lá thối rễ được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới tử năm 1834,
sau đó lan truyền và được phát hiện ở Bồ Đào Nha, Địa Trung Hải, Châu Mỹ, Châu
Á. Bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây con trong vườn ghép và cây lớn ở vường sản
xuất. Cây bị bệnh chậm lớn và tàn lụi dần, năng suất giảm sút, dần dần cây vàng úa,
lá rụng và có thể chết.
Bệnh có thể xảy ra quanh năm nhưng lẻ tẻ, không đáng kể. Bệnh thường bắt
đầu phát triển thành dịch vào đầu mùa nắng, khoảng tháng 11 và 12 dương lịch hằng
năm. Cây chết hàng loạt vào tháng 1 đến tháng 4 dương lịch và có thể tiếp tục kéo dài
trong mùa mưa năm sau. Với các vườn mới lên liếp trồng cây có múi, cây bắt đầu
chết vì bệnh thối rễ từ năm thứ năm cho đến năm thứ bảy trở về sau, tùy cách canh
tác của từng vườn.
1.1.1. Triệu chứng bệnh

Trên lá, trên thân cây: Khi bệnh mới xuất hiện, lá vẫn bình thường có xuất
hiện nhưng gân lá màu trắng, phiến lá màu vàng cam và dễ rụng có thể vàng một vài
nhánh hay trên toàn cây, các là già rụng trước sau đó đến các lá non, hoa trái kém
phát triển và cũng dễ rụng. Khi cây bị bệnh nặng nhìn vào cành lá thấy trơ trọi, chỉ có
lá ngọn và cây không có khả năng phát triển, nếu cây đang ở thời kì cho trái thì cây
đạt năng suất thấp và trái thường không có giá trị thương phẩm.
Hình 1. 1. Biểu hiện của bệnh vàng lá thối rễ trên lá của cây có múi
1
Bộ rễ: Nhánh cây bị bệnh hướng nào thì rễ cũng thường bị hư thối ở hướng
đó. Đầu rễ non bị thối đen, khi dùng tay vuốt rễ non thì phần vỏ rễ bị tuột ra ngoài
phần gỗ, bên trong có sọc nâu lan dần vào rễ cái, rễ mất khả năng hấp thu nước và
dinh dưỡng nuôi cây, từ đó làm cành bị chết khô, cây sinh trưởng yếu, gây rụng trái.
Khi cây bị bệnh nặng, tất cả rễ đều bị thối đen và chết, cuối cùng là chết toàn cây. Do
bộ rễ bị tổn thương không hút được dinh dưỡng nên cây sinh trưởng kém, nuôi trái
kém, trái chậm lớn, kích thước nhỏ, dễ rụng. Mầm bệnh tấn công chủ yếu vào mùa
mưa đến khoảng 3-4 tháng sau mới thấy biểu hiện trên lá và bắt đầu gây hại nặng
nhất khi bắt đầu mùa nắng và tiếp tục gây hại đến 1-2 tháng vào mùa mưa. Trong
mùa mưa mầm bệnh có khả năng lây lan cao.
Hình 1. 2. Triệu chứng bệnh vàng lá thối rễ xuất hiện trên rễ

a) Vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ; b) sọc nâu trong rễ bị thối
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh
Bệnh vàng lá thối rễ do nhiều tác nhân gây ra, gồm các loài nấm Fusarium,
Phytophthora, Pythium và tuyến trùng. Trong đó, tác nhân chính là nấm Fusarium
solani gây hại trong điều kiện rễ bị oi nước nhiều ngày và có sự tương tác giữa nấm
F. solani với tuyến trùng. Tuyến trùng tấn công làm rễ tổn thương, sau đó nấm
Fusarium mới tấn công vào gây thiệt hại nặng cho cây có múi. Tuy nhiên, mảng rễ bị
thối do oi nước là cửa ngõ chính để nấm F. solani xâm nhập và gây hại.
1.1.3. Điều kiện phát sinh phát triển bệnh

Các nấm gây bệnh luôn hiện diện trong đất nhưng không xâm nhập trực tiếp
vào rễ. Nấm xâm nhập chủ yếu qua các mảng thối ở rễ non khi rễ bị oi nước trong
một thời gian dài.
2
Tuyến trùng và côn trùng tạo ra vết thương cũng là cửa ngõ để nấm xâm nhập
và gây hại.
Đất vườn có thành phần sét, không được bổ sung phân hữu cơ, thừa nước
khiến vườn bị oi nước trong mùa mưa và chai cứng, dễ nứt trong mùa nắng; làm tổn
thương rễ và tạo điều kiện cho các loại dịch hại trong đất tấn công.
Đất bị chua, có độ pH thấp từ 3,9 đến 4,5, thiếu vi lượng, lạm dụng phân hóa
học, ít dùng hữu cơ nên bệnh dễ phát sinh phát triển.
Vườn xử lý ra hoa (nghịch vụ) bằng biện pháp xiết nước khi tưới nước trở lại
hoặc gặp mưa dễ làm cho rễ mẫn cảm với nấm bệnh.
Từ khi nấm bắt đầu xâm nhập cho đến khi triệu chứng bệnh thể hiện cần có
thời gian ủ bệnh vài tháng; do đó, bệnh không xuất hiện ngay trong mùa mưa, lúc đất
bị oi nước, mà bệnh thường xuất hiện nghiêm trọng trong đầu mùa nắng.
Ảnh hưởng của môi trường đất: Đất ở các vườn bệnh thường có thành phần
sét cao trong sa cấu, chai cứng trong mùa nắng và dẻo quánh trong mùa mưa. Ngoài
ra, đất của các vườn có bệnh xảy ra rất chua, pH trong khoảng từ 3,9 đến 4,5. Thường
gặp nhất là pH = 4,3 như trên vườn xa bô bệnh tại Trà Vinh (Phạm Văn Kim, 2000)
và trên vườn quýt Tiều bệnh tại Lai Vung, Đồng Tháp (Lê Thị Thu Hồng, 2002).
Dương Minh và ctv. (2004) báo cáo các vườn cây có múi mắc bệnh tại 5 tỉnh Cần
Thơ, Hậu Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Tiền Giang có pH từ 3,9 đến 4,4.
1.1.4. Biện pháp phòng trừ bệnh
- Tạo điều kiện thoát nước tốt vườn cây, tránh cho cây bị thừa nước.
- Vệ sinh vườn cây, tỉa cành, tạo tán thông thoáng.
- Không trồng quá sâu, nên trồng ở mật độ thích hợp.
- Tránh gây vết thương trên rễ và cây khi chăm sóc.
- Sử dụng gốc ghép kháng bệnh
- Các biện pháp như bón thêm phân hữu cơ hoai mục, sử dụng kết hợp
nấm đối kháng Trichoderma spp. có tác dụng khống chế nguồn bệnh trong đất.
- Sử dụng thuốc trừ nấm như Mexyl-MZ, Ridomil-MZ, Topsin M,
Aliette,…; Có thể phun đều trên tán cây và đất xung quanh cây, hay cạo vết bệnh và
quét dung dịch thuốc.
1.2. Lịch sử nghiên cứu về bệnh vàng lá thối rễ trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Diện tích trồng cây ăn quả của nước ta có xu hướng tăng tử năm 1985-2008.
Theo tổng cục thống kê, tổng diện tích cây ăn quả của cả nước 1985 là 202.500 ha
sau 23 năm (2008) diện tích cây ăn trái tăng 3,83 lần (775.330 ha)
3
Nam Bộ hiện có 415.800 ha cây ăn quả với sản lượng khoảng 4,3 triệu
tấn/năm, chiếm hơn 53% về diện tích và 57% về sản lượng trái cây trong nước.
Hiện nay ở đồng bằng Sông Cửu Long đã hình thành một số vùng chuyên canh
cây có múi (là tên gọi chung của nhóm cây cam, bưởi, quýt, chanh) với diện tích khá
lớn trong đó chủ yếu là cam sành và bưởi. Chúng có thể trồng trên nhiều loại đất khác
nhau, do hiệu quả kinh tế cao nên nhiều năm qua diện tích cây có múi ở đồng bằng
Sông Cửu Long không ngừng gia tăng, ước tính hiện nay toàn khu vực có khoảng
75.000 ha trồng cây có múi các loại trong đó nhiều nhất là cam sành với diện tính
khoảng 28.700 ha và bưởi khoảng 9.200 ha. Bước đầu đã hình thành một số vùng
chuyên canh rộng lớn, đi đôi với việc mở rộng diện tích các vườn cây có múi cũng bị
các đối tượng dịch hại tấn công gây hại ngày càng nhiều. Trong đó nguy nhiểm nhất
là bệnh vàng lá thối rễ, một loại bệnh đã gây thiệt hại nặng nề cho nhiều vườn cam,
thậm chí là hàng loạt các vườn cam đang trong giai đoạn cho trái phải đốn bỏ vì
không còn khả năng phát triển gây tổn thất lớn cho các nhà vườn.
Bệnh thối rễ do nấm Phytophthora citrophthora gây ra trên cây cam ở Đồng
bằng Sông Cửu Long được báo cáo lần đầu tiên vào vào những năm 1950, do không
được kiểm tra theo dõi thường xuyên và một lần nữa bệnh này được tìm thấy trên cây
cam ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam ở những năm 1970. Các tác nhân gây bệnh
từ đó đã lan rộng đáng kể và bây giờ vẫn còn ảnh hưởng hầu hết các diện tích trồng
cây có múi ở cả nước, chẳng hạn như khu vực Thanh Trà tỉnh Thừa Thiên Huế và
Ninh Bình tại Tiền Giang.
Theo André Drenth, (2004) P. citrophthora tấn công vào thân cây và trái cây,
bệnh tiến triển nhanh trong mùa mưa, và cũng là cao nhất trong tháng Bảy và tháng
Tám. Vào tháng Ba năm 2002, tỷ lệ mắc bệnh ở cây cam ở huyện Cao Phong tỉnh
Hòa Bình là 10% nhưng đã tăng lên 20-30% vào tháng Tám. Cây quýt cũng bị ảnh
hưởng nghiêm trọng hơn, với một số vườn cây ăn trái bị tổn thất toàn bộ cây trồng và
gây chết của nhiều loài cây trồng khác. Các mẫu lấy từ các cây có múi bị thối gốc ở
các tỉnh Tiền Giang đã được xác định là do P. nicotianae gây ra.
Bệnh do nấm Phytophthora sp. trên cây có múi chỉ được nghiên cứu ngẫu
nhiên ở Việt Nam và thường giới hạn trong các thí nghiệm khảo sát về tỷ lệ và mức
độ nghiêm trọng của bệnh. Ở những năm 2000-2003 thì nước ta chưa có nghiên cứu
về sự phát triển về các chương trình kiểm soát đối với các bệnh, quản lý vườn ươm,
nhân giống của giống kháng và việc sử dụng gốc ghép kháng. Hiện nay các vườn
trồng cam quýt mới đã được thành lập ở Hà Giang, Tuyên Quang, Vĩnh Long, và các
4
khu vực chuyên canh cây cam quýt tiếp tục tăng. Nghiên cứu các bệnh Phytophthora
và kiểm soát của nấm bệnh này là cần thiết hiện nay để đảm bảo tương lai của ngành
công nghiệp. (André Drenth and David I. Guest, 2004)
Trước tình hình bệnh diễn biến khá phức tạp như vậy các nhà khoa học cũng
đã có những nghiên cứu kĩ hơn về đối tượng cũng như các phương pháp tròng trừ
nấm gây bệnh thối rễ trên các cây ăn quả khác nhau như:
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học Trichoderma spp. phòng trừ bệnh
Phytophthora spp trên cây trồng tại Việt Nam (Lê Phước Thạnh và công sự, 2008)
Tác động của các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp. trong việc phòng
trị bệnh Phytophthora palmivora gây hại sầu riêng tại Cần Thơ và Bến Tre (Dương
Minh và cộng sự, 2006)
Điều tra chọn lọc và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng nấm
Trichoderma spp. đối với bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani trên cam quýt tại tỉnh
Tiền Giang (Lê Phước Thạnh và công sự, 2006)
Phân lập và chọn lọc các chủng nấm Trichoderma spp. có khả năng đối
kháng nấm cao để chống lạc các tác nhân gây bệnh ở Đồng bằng Sông Cửu Long.
(Vu Tiên Khang và cộng sự 2013)
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu rất nhiều các vấn đề
liên quan đến nấm Fusarium sp gây hại trên các loài cây trồng khác nhau như:
Takayuki và cộng sự (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu
sáng khác nhau lên sự hình thành bào tử của F.globosum phân lập từ cây lúa mì ở
vùng cận nhiệt đới Nhật Bản đồng thời cũng đưa ra điều kiện chiếu sáng tối ưu để
phân lập nấm Fusarium.
Ở Ấn Độ, các báo cáo đầu tiên về bệnh trên rễ cây tiêu do Barber công bố
năm 1902, 1903, 1905. Butler (1906) đã tiến hành điều tra bệnh hại ở vùng Wynad là
do nấm Fusarium oxysporum. Venkara Rau (1929) đã phân lập được Phytophthora
sp. từ các mẫu tiêu bị chết héo rũ chủ yếu ở vùng mới khai hoang.
Một số các nhà nghiên cứu như M. Ravi Chandran and M. Reddi Kumar,
2012 đã tiến hành xác định môi trường nuôi cấy thích hợp, xác định hình thái đại thể
và vi thể của nấm Fusarium solani Mart Sacc., phân lập được.
5
Ngoài ra người ta còn nghiên cứu các loài vi sinh vật khác nhau có khả năng
đối kháng với các nấm gây bệnh thối rễ trên cây có múi như: Trichoderma sp., các
chủng Bacillius sp. v à Gliocladium (M.Isabel Trillas, 2006)
Nấm Trichoderma sp. đối kháng là một đề tài được các nhà khoa học
nghiên cứu rất nhiều là một hướng phát triển rộng lớn ứng dụng công nghệ sinh học
trong nông nghiệp hạn nhằm tạo môi trường thân thiện giảm thiểu các sựu ảnh hưởng
của các hóa chất sử dụng trong nông nghiệp gây ra cho môi trường
1.2.3. Biện pháp sinh học trong bảo vệ cây trồng

1.2.3.1. Khái niệm
Biện pháp sinh học trong phòng trị bệnh cây là điều khiển môi trường, cây
trồng và vi sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh
học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại. Nhờ đó
bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng nghiêm trọng
về mặt kinh tế. Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt được toàn bộ tác nhân
gây bệnh và cũng không có khả năng này (Nguyễn Văn Kim và cộng sự, 2000).
Phòng trừ sinh học bệnh cây là việc sử dụng một hoặc một số vi sinh vật để khống
chế mầm bệnh hay làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây
hại nào đó.
Phòng trừ sinh học là một trong những phương pháp mới có khả năng phòng
bệnh do nấm gây hại cao. Phòng trừ sinh học có thể giải quyết một số vấn đề sau:
Sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có trong tự nhiên để cải thiện năng suất cây
trồng.
Hạn chế sự phát sinh tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh.
Hạn chế sự ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiều loại thước hóa học cũng
như sự tồn lưu của chúng trong đất, nước và không khí.
Giúp cân bằng hệ sinh thái.
1.3. Các nấm gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi
1.3.1. Nấm Fusarium sp.
1.3.1.1. Phân loại
 Giới (Kingdom): Fungi
 Ngành (Phylum): Ascomycota
 Lớp (Class) : Sordariomycetes
 Lớp phụ (Subclass): Hypocreomycetidae
 Bộ (Order): Hypocreales
 Họ (Family): Nectriaceae
6
 Giống (Genus): Fusarium

 Chi Fusarium bao gồm nhiều loại gây bệnh chủ yếu cho cây như: héo
do tắc bó mạch, thối rễ, thối cây con và thối củ. Có một số loài cũng sản sinh các độc
tố nấm lẫn lạp trong hạt ngũ cốc.
 Nhiều loài nấm Fusarium sp. khác hoại sinh phổ biến trong đất. Các
loài hoại sinh thường có mặt trên rễ và thân cây bệnh. Những loài hoại sinh này
thường mọc nhanh trên môi trường và được phân lập dễ dàng từ rễ và thân cây bị
bệnh, khiến cho việc phân lập các tác nhân gây bệnh chính trở nên khó khăn
1.3.1.2. Đặc điểm hình thái
Fusarium là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký
sinh trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây
chủ. Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ. Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở
quá trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium sp. cũng sản xuất một số chất độc
tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium tấn
công. Sau đây là vài loài Fusarium sp. gây bệnh héo lá và cây chủ: F. udum (trên đậu
săn Cajanus cajan), F.oxysporum bv. licopersici (trên cà chua Lycospersicon
esculentum), F. lini (trên cây lanh Linum usitatissimum) F. solani (trên khoai tây
Solanum tuberosum) và F.orthaceras (trên đậu mơ-đậu Thổ Nhĩ Kỳ Cicer arietium).
Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển
màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ.
1.3.1.3. Kí chủ
Nấm Fusarium sp. gây hại ở nhiều cây họ đậu, họ cam quýt, khoai tây, cà
chua. Nấm Fusarium sp. gây hại ở tất cả giai đoạn sinh trưởng của cây, nhưng chủ
yếu là thời kì cây con (Porter et al, 1984; Vũ Tiệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)
Fusarium sp. là tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất ở diện rộng ở hầu hết các kí
chủ của nấm.
1.3.1.4. Hình thức sinh sản
Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử
đính lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào
tử - Chlamydospores).
Macroconidia dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống
bào tử. Đầu và cuối bào tử lớn thuôn nhọn; Một vài loài bào tử lớn tách rời và không
gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình (phialide).
Tiểu bào tử đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng
được sinh ra từ một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân
nhánh.Tiểu bào tử đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu bào tử đính của
7
Fusarium rất giống bào tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được qui
vào nấm Cephalosporium.
Bào tử vách dày( bào tử hậu) hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận
cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi,
Hình 1. 3. Hình thái bào tử của nấm F. oxysporum trên môi trường SNA trong 5 ngày
ở 250C
chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu bào tử gặp điều kiện thuận lợi, Hậu bào tử
hay bào tử vách dầy rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài.
(A): đại bào tử (Macroconidia-ma) thường được sinh ra từ các thể bình của nấm (tp) trên cuốn bào tử
(cp). (B) các đại bào tử thường rất được sinh ra từ cuốn bảo tử ở giữa các sợi (ip). (C) các bào tử nhỏ
(microconidia-mi) thường được sinh ra ở các cuốn bào tử giữa sợi nấm giả, (D) bào tử hậu
(Clamydospores-ch) được hình thành từ các sợi nấm. Bar 10µm, (Toshiaki Ohara 2004)
1.3.1.5. Chu kì sống của nấm

Nấm Fusarium có hai giai đoạn tồn tại trong đất: giai đoạn sinh trưởng tích
cực và giai đoạn tiềm sinh (giai đoạn ngủ nghỉ).
Ở điều kiện thích hợp, môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, nấm sẽ sinh
trưởng tích cực, ngược lại khi gặp điều kiện bất lợi lượng dinh dưỡng trong môi
trường còn rất thấp thì nấm sẽ chuyển sang giai đoạn tiềm sinh. Lúc này các loài
Fusarium sẽ hình thành cấu trúc tiềm sinh là bào tử hậu. Cũng trong giai đoạn này,
cường độ hô hấp và nguồn dinh dưỡng dự trữ được tích lũy trong hệ sợi nấm sẽ được
sử dụng ở mức thấp nhất, nhằm đẩm bảo sự tồn tại của chúng trong thời gian dài. Vì
thế, sau khi thu hoạch đối với các vườn bị bệnh do Fusarium sp. thì khả năng trong
đất vần còn mầm bệnh là rất cao.
8
Hình 1. 4. Fusarium solani, khuẩn lạc nấm trên môi trường PDA, 27 ℃, 7 ngày
1.3.2. Pythium sp. và Phythophthora sp.

Các chi Phytophthora và Pythium thuộc lớp Oomycetes trong Giới
Chromista. Như vậy, chúng không phải là nấm thực mà là vi sinh vật giống nấm.
Những chi này sản sinh ra các sợi nấm không vách ngăn, một đặc điểm chính phân
biệt chúng với các chi nấm thực.
1.3.2.1. Các loài Pythium
1.3.2.1.1. Vị trí phân loại (Hawksworth et al 1995)
o Giới (Kingdom): Chromista
o Lớp (Class): Oomycetes
o Bộ (Order): Peronosporales
o Họ (Family): Pythiaceae
o Giống (Genus): Phytophthora/Pythium
9
Hình 1. 5. Đặc điểm hình thái của Pythium senticosum.
A: bào tử trứng lúc mới hình thành; b–c: túi bào tử trứng trưởng thành có gai; d–e: túi bào tử và túi
bào tử động; f: túi bào tử rỗng; g–k: sự kết hợp giữa túi bào tử đực và bào tử cái (túi noãn); l–n: bào
tử noãn trong túi noãn, không phải bào tử trứng. (http://www.mycologia.org)
Pythium thuộc lớp Oomycete (nấm trứng). Chúng không phải là nấm thực
bởi vì lớp này thuộc giới Chromista. Pythium/Phytophthora sản sinh ra các bào tử di
chuyển được, hay còn gọi là du động bào tử, có vai trò rất quan trọng. Đây cũng là
đặc điểm để phân biệt những nấm này với nấm thực trong giới Nấm (Mycota). Du
động bào tử vô tính tạo điều kiện cho những nấm này lan truyền trong đất ướt và
nước tưới.
1.3.2.2. Các loài Phytophthora
1.3.2.2.1. Vị trí phân loại (Hawksworth et al 1995)
o Giới (Kingdom): Chromista
o Lớp (Class): Oomycetes
10
o Bộ (Order): Peronosporales
o Họ (Family): Pythiaceae
o Giống (Genus): Phytophthora
Giống như Pythium sp., Phytophthora sp. thuộc lớp nấm trứng, không phải
nấm thực và sản sinh ra du động bào tử. Vì vậy, phòng trừ Phytophthora sp. và
Pythium sp. khác với phòng trừ các bệnh do nấm thực gây ra và các thuốc trừ nấm
dùng trong phòng trừ cũng khác nhau.
Các bệnh do Phytophthora gây hại cho cây lâu năm, rau và các cây trồng
khác làm tổn thất đáng kể về kinh tế cho vùng Đông Nam Á. Việc phân lập và giám
định các loài Phytophthora cũng như phương pháp quản lí bệnh hại tổng hợp được đề
cập chi tiết trong các tài liệu.
Hình 1. 6 Hình thái khuẩn lạc Phytophthora trên môi trường PDA (phải) và V8J
(trái) sau 14 ngày
11
Hình 1. 7. Đặc điểm hình thái của Phytophthora nicotianae.

(a-e): bào tử động, (f): bào tử vách dày, (g-h): a: túi noãn, b: túi bào tử đực, c: bào tử trứng, Bar =
10 μm
1.3.2.3. Hình thức sinh sản

1.3.2.3.1. Sinh sản vô tính
Sinh sản vô tính tạo thành các cấu trúc gọi là bọc bào tử động, nơi hình thành
và giải phóng du động bào tử. Những du động bào tử này di chuyển được và có vai
trò quan trọng trong chu kỳ bệnh, đặc biệt là chức năng lan truyền trong đất ướt hoặc
trên bề mặt cây trồng. Sự hình thành du động bào tử cũng là một đặc điểm phân biệt
Phytophthora sp. và Pythium sp. với các chi nấm thực. Du động bào tử giúp cho việc
lan truyền bệnh nhanh chóng từ cây bệnh sang cây khỏe.
Các bọc bào tử động của Pythium sp. được hình thành ở đỉnh hoặc đoạn giữa
các sợi nấm, hình tròn (hình cầu) hoặc hình sợi (giống như sợi nấm phình ra). Một
ống tháo được hình thành từ bọc bào tử của Pythium sp., với một bọc giả có thành rất
mỏng hình thành ở cuối ống tháo. Tế bào chất di chuyển từ bọc bào tử qua ống tháo
vào bọc giả. Các du động bào tử sau đó phát triển trong bọc giả và được giải phóng ra
khi màng bọc giả vỡ.
Ngược lại, các loài Phytophthora sp. tạo các túi bào tử có những hình dạng
nhất định một cách rõ rệt trên cành mang bọc bào tử. Các du động bào tử hình thành
trong bọc bào tử và được giải phóng trực tiếp từ bọc bào tử. Một số loài như P.
infestans và P. palmivora tạo các bọc bào tử rất dễ rụng ra khỏi cành mang bọc bào tử
và có thể được phân tán nhờ gió.
Một số loài Phytophthora, như P. cinnamomi, tạo bào tử hậu trên môi trường
nhân tạo. Các bào tử này có chức năng bảo tồn trong đất.
1.3.2.3.2. Sinh sản hữu tính
12
Sinh sản hữu tính liên quan đến sự hình thành các túi noãn (thể 'cái') và túi
đực (thể 'đực'). Sau khi thụ tinh, noãn cầu (giao tử 'cái') trong túi noãn phát triển
thành bào tử trứng có vách dày. Bào tử trứng là bào tử bảo tồn và có vai trò quan
trọng trong chu kỳ bệnh. Bào tử trứng của Pythium sp. có thể có vách mịn hoặc dạng
trang trí như sừng. Bào tử trứng của Phytophthora sp. có vách mịn.
Sterol là chất cần thiết cho việc sản xuất túi noãn. Vì vậy, những nấm này
cần được nuôi cấy trên môi trường PCA (thạch cà rốt khoai tây) bởi vì chất chiết từ
cà rốt chứa sterol. Môi trường PCA nên có một số vụn chiết cà rốt.
Một số loài Pythium sp. có đặc tính dị tản; tuy nhiên, nhiều tác nhân gây
bệnh thông thường là đồng tản và tạo các cấu trúc sinh sản hữu tính ngay trong một
mẫu cấy đã làm thuần từ đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm. Sinh sản hữu tính ở loài
đồng tản chỉ cần một cá thể. Sinh sản hữu tính ở loài dị tản đòi hỏi sự kết hợp của hai
cá thể có dạng giới tính khác nhau.
Khoảng 50% loài Phytophthora sp. là khác tản và đòi hỏi sự kết hợp của hai
cá thể có dạng giới tính khác nhau (A1 và A2) để việc sinh sản hữu tính xảy ra.
Hình 1. 8 Chu kỳ bệnh đã được đơn giản hoá của tác nhân gây bệnh thuộc lớp nấm
trứng (Burgess et al, 2009)
1.3.3. Tuyến trùng

Tuyến trùng là giống giun tròn, có kích thước rất nhỏ, mắt thường chúng ta
không nhìn thấy được, chúng có khoảng hơn ngàn loài, được phân ra làm hai loại
chính đó là:
13
Tuyến trùng nội ký sinh Meloidogyne incognita gây bướu rễ, tạo tổn thương
cho các loại nấm Fusarium sp, Phytopthora, Rhizoctonia sp, Pythium gây hại..
Tuyến trùng ngoại ký sinh Pratylenchus, Xiphinema truyền bệnh virus...
Chúng gây hại cho nhiều loại cây trồng đặc biệt Cà phê, Thanh long, Hồ
Tiêu…, , trong đó giống Meloydogyne. sp, nội ký sinh là chủ yếu chúng thuộc Giới:
Animalia. Ngành: Nematoda. Lớp:Secernentea. Bộ: Tylenchida. Họ: Heteroderidae.
Vòng đời của Tuyến trùng được chia làm 5 giai đoạn . Trứng Tuyến trùng
tuổi 1, tuổi 2, tuổi 3, tuổi 4 và trưởng thành. Tùy vào cây ký chủ và nhiệt độ mà vòng
đời của tuyến trùng kéo dài từ 40-60 ngày. Hoạt động chủ yếu ở độ sâu từ 5-30 cm.
Con cái đẻ hàng loạt trứng trong túi gelatin do chúng tự tiết ra trong trong
quá trình sinh sản, để bảo vệ trứng khỏi yếu tố bất lợi bên ngoài, túi trứng nằm ngoài
nốt sần, đôi khi nằm trong nốt sần (bướu rễ), túi trứng tồn tại 1 năm nếu gặp điều kiện
thuận lợi, bên trong chứa từ 1 đến 2 ngàn trứng, khi tiếp xúc với axit yếu của rễ cây
chúng nở ra 200-600 tuyến trùng tuổi 1 và chui ra thành tuyến trùng tuổi 2, từ tuổi 2
chúng bắt đầu hình thành kim chích và xâm nhập vào nốt sần hay rễ mới. Khi sinh
dưỡng chúng tiết ra men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý, hóa của mô rễ thay đổi,
hình thành tế bào khổng lồ, vùng dinh dưỡng của tuyến trùng gồm 5-6 tế bào khổng
lồ. Từ tuổi 2 đến tuổi 3 cũng là giai đoạn biến đổi quan trọng phân giới tính của
Tuyến Trùng, con cái phát triển chiều ngang và thành hình bầu dục hay hình giọt
nước, con đực phát triển chiều dài sau đó đi ra ngoài chứ không nằm trong mô rễ .
pH đất không ảnh hưởng nhiều đến tuyến trùng. Độ ẩm thích hợp là 60%
cao hơn hay thấp hơn đều ảnh hưởng lớn đến tuyến trùng. Vì thế vào mùa khô hay
những tháng mưa dầm mật độ tuyến trùng giảm rõ rệt. Nhiệt độ có ảnh lớn đến Tuyến
Trùng, 50-600C trong 30’- 1h hoặc từ 30 – 400C trong nhiều ngày tuyến trùng sẽ
chết. Tuyến trùng có mặt ở rất nhiều nơi xâm hại trên nhiều loại cây trồng đặc biệt
trong đó có cây có múi là loại cây mang lại nhiều giá trị kinh tế cao nó làm ảnh
hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây có múi. Tuyến trùng sâm nhập
vào rễ, là phá hủy hoàn toàn bộ rễ từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm bệnh
gây hại như nấm Phytopthora sp. Fusarium sp. Pythium sp…, gây bệnh cho cây, làm
cho cây bị chết nhanh, chết chậm. Chúng không chỉ xâm nhập ở những cây bị vàng,
mà ngay cả những cây đang còn xanh tốt, nhưng đang trong giai đoạn đầu, chức năng
của rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều. Còn những cây bị vàng lá, rụng lá, lá nhỏ, quăn
queo, khuyết tật…là do bệnh phát triển ở giai đoạn cuối.
14
Hình 1. 9. Hình dạng của tuyến trùng đực cái gây hại trên cây có múi,
Tylenchulus semipenetrans (Cobb, 1913),
1.4. Nấm đối kháng với các chủng nấm gây bệnh trên cây có múi
1.4.1. Nấm Trichoderma sp.
1.4.1.1. Vị trí phân loại
o Giới (Kingdom): Nấm
o Ngành (Division): Ascomycota
o Ngành phụ (Suddivision): Pezizomycotina
o Lớp (Class): Sordariomycetes
o Bộ (Order): Hypocreales
o Họ (Family): Hypocreaceae
o Giống (Genus): Trichoderma
1.4.1.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố của nấm Trichoderma sp. (Loekas
Soesanto, 2011)
Đặc điểm khuẩn lạc của Trichoderma sp. trên môi trường PDA: khuẩn
lạc tạo thành các vòng tròn đồng tâm, nhẹ, trắng như bông, có dạng bột, khuẩn lạc
bên trên môi trường có màu xanh nhạt từ ngày 2- 4 ngày sau đó chuyển dần thành
màu xanh đậm trên đĩa petri, mép rìa khuẩn lạc có dạng hình tròn và lan rộng màu sắc
khuẩn lạc bên dưới môi trường có màu xanh nhạt.
Đặc diểm khuẩn lạc trên môi trường MEA: trong 5 ngày đầu khuẩn lạc
tạo các vòng đồng tâm, giống như bông, có dạng bột. Khuẩn lạc ở bên trên môi
trường 5 ngày đầu khuẩn lạc có màu trắng chuyển dần sang màu xanh và sang màu
xám. Có mép khuẩn lạc dạng vòng, mật độ cao hơn so với khuẩn lạc trên môi trường
PDA. Màu sắc khuẩn lạc bên dưới môi trường có màu xanh đen
Bào tử thường hình thành dày đặc, tạo lớp bông màu xanh. Bào tử màu xanh
lá cây hình gần cầu (subglobos) đến hình trứng (ovoid), mịn, trơn nhẵn, kích thước
(3-3.8)x(2.8-3.5)µm tỉ lệ dài/rộng khoảng 1-1.3, khô. Cuống đính bào tử
(conidophores) có thể mọc đơn nhưng thường mọc thành cặp. Các nhánh phát sinh
15
vuông góc hoặc gần vuông góc với trục chính. Sự phân nhánh thành cặp đối xứng khá
phổ biến.
Thể bình (Phialides) dài 6-9.7µm, tỉ lệ dài/rộng 2.5-3.5 điểm rộng nhất ở
phần gốc 1.7-2.5 µm tế bào hỗ trợ hình thành thể bình kích thước 2.3-3.3 µm; tỉ lệ
chiều dài/chiều rộng tế bào hỗ trợ là 1.8-3.5, thẳng hoặc uốn lượn. Thể bình mọc đôi
hoặc xen vào giữa.
Bào tử hậu (Chlamydospores) hình thành nhiều sau khoảng 7 ngày hình
gần cầu (subglobose), đường kính 8.5-12 µm.
Hình 1. 10 Hình thái bào tử của chủng Trichoderma parareesei sp. sau 3 ngày trên
môi trường CMD (Sigma corn meal agar plus 10% dextrose) ở 25°C.2010, American
Society for Microbiology.)
Khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA sau 72 giờ ở 250C bán kính đạt
khoảng 42,8-60.5mm, ở 350C đạt 1.7-6mm. Nhiệt độ tối ưu trên môi trường nuôi cấy
trên PDA là 25-300C sau 96 giờ ở 300C trong bóng tối trên môi trường PDA khuẩn
lạc phát triển nhanh chóng, bào tử nấm phát triển bao phủ gần như hoàn toàn bề mặt
đĩa petri đường kính khoảng 9cm, bào tử hình thành có mật độ khá dày đặc, tạo
những vòng tròn đồng tâm hướng ra ngoài mép đĩa. Bào tử màu xanh lá thường xuất
hiện trong vòng 57-66 giờ trên môi trường PDA trong bóng tối.
16
Hình 1. 11 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma harzianum trên môi trường PDA
Khuẩn lạc màu trắng không chứa bào của nấm, khuẩn lạc trên môi trường có xuất
hiện màu xanh có chứa bào tử trong khuẩn lạc (conidia).
 Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có thể ức chế
nhiều nấm gây hại trên rễ là chủ yếu như: Pythium sp., Rhizotonia sp. và Fusarium
sp. Quá trình này còn được gọi là quá trình kí sinh nấm (mycoparasitism).
1.4.1.3. Tính đối kháng của nấm Trichoderma sp. trong phòng trừ bệnh hại cây
trồng
Nấm Trichoderma sp. phát triển cực nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh
về số lượng so với các loại nấm khác (Saksena, 1960)
Nấm Trichoderma sp. phân bố trên nhiều loại đất khác nhau và chúng kí sinh
trên nhiều lạo nấm gây hại cây trồng như: Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia
solani, Slecrotium rolfsii, Fusarium,… (Cook and Baker, 1983).
Trong hoạt động sống kí sinh của nấm Trichoderma sp. thì enzyme thủy phân
chitinase và β-glucanase đóng vai trò rất quan trọng (Cruz et al, 1995). Nấm
Trichoderma hazianum có khả năng sản xuất enzyme phân hủy vách tế bào như
chitinase, β-1-3-glucanase đây là hai loại enzyme quan trọng trong quá trình kí sinh
lên nấm gây hại (Muhammad và Amusa, 2003)
Những chất do Trichoderma tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase,

N-acetyl- β-glucosamidase (NADase), trypsin, chymotrypsin, glucan, 1,3-β-
glucosidase, cellulase, protease, lypase (Marco,2002; Kredisc et al, 2003)
Khả năng tiết enzyme của Trichoderma sp. còn chịu ảnh hưởng của độ yếm
khí, lượng oxy hòa tan, tốc độ lắc (Marco et al, 2002).
17
Một vấn đề quan trọng trong sự hình thành cơ chế đối kháng được trình bày ở
nhiều bào cáo là: tùy vào dòng vi sinh vật đối kháng, nguồn gốc của chúng và điều
kiện môi trường, vì thế khi chọn một tác nhân sinh học nên quan tâm đến hướng áp
dụng, nguồn gốc của mầm bệnh (Kubicek và Harman, 1998).
Cơ chế kí sinh nấm: Trichoderma sp. tiết ra các enzyme làm tan vách tế bào
của các loài nấm khác. Sau đó chúng có thể tấn công vào bên trong của loài nấm gây
hại và tiêu diệt chúng.
18
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
 Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm công ty Tiên Phong. Địa chỉ: lô
23 Đường Tân Tạo, Khu Công nghiệp Tân Tạo, quận Bình Tân TP.HCM
 Thời gian thực hiện: 3/2/2015 – 29/6/2015
2.1.2. Nguồn mẫu bệnh và mẫu đối kháng dùng trong nghiên cứu
 Nguồn gốc mẫu
Mẫu bệnh cây và mẫu đất tại các khu vực trồng cây ăn quả (cam quýt)
được lấy tại huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre
Đối tượng phân lập mẫu là nấm Trichoderma sp. và chủng gây bệnh
thối trên đối tượng cây cam quýt đang nhiễm bệnh và cây cam quýt khỏe mạnh.
 Vi sinh vật gây bệnh
Được phân lập từ mẫu rễ cây và đất ở khu vực cây bị bệnh ở các nhà
vườn huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre.
 Nấm đối kháng
Được phân lập từ các mẫu cây khỏe ở các nhà vườn cùng địa điểm với
khu vực lấy mẫu phân lập nấm gây bệnh. Ngoài ra còn sử dụng các chủng T01, T24,
T29 để đánh giá khả năng của nấm phân lập được ở vườn với chủng nấm có sẵn trong
ngân hàng giống của công ty cổ phần công nghệ sinh học Tiên Phong.
2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3.1. Dụng cụ
Bảng 2. 1 Các dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài
Stt Dụng cụ DVT Stt Dụng cụ DVT

1 Đĩa petri Cái 9 Ống nghiệm Cái
2 Cốc thủy tinh Cái 10 Chai thủy tinh Cái
3 Pippet 1,2,5,10 ml Cái 11 Micro pippet Cái
4 Que trang Cái 12 Que cấy mốc Cái
5 Que cấy vòng Cái 13 Quả bóp cao su Cái
6 Đèn cồn Cái 14 Panh kẹp Cái
7 Ống nhỏ giọt Cái 15 Lame+lamelle Hộp
8 Ống đong Cái 16 Phễu Cái
19
2.1.3.2. Thiết bị
Bảng 2. 2 Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài
Stt Thiết bị Xuất xứ

1 Tủ cấy Đài Loan
2 Tủ ấm Memmert Đức
3 Tủ lạnh sanyo Nhật
5 Kính hiển vi Novex Holland Hà Lan
6 Cân phân tích hai số AI
7 Máy khuấy từ VELP Italia
9 Nồi hấp khử trùng Nga
10 Máy vortex KIA
2.1.3.3. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài được thể hiện trực tiếp bên dưới các môi
trường sử dụng
2.1.3.4. Các môi trường sử dụng trong đề tài nghiên cứu (Jeffers, 2006)
a) Môi trường phân lập và giữ giống nấm Trichoderma sp. là môi trường
PDA (Potato Dextrose Agar)
Bảng 2. 3 Thành phần môi trường PDA
Thành phần Hàm lượng

Khoai tây 400 g
Đường dextrose 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1000ml
Cách pha môi trường: cân 400g khoai tây đem gọt vỏ cắt nhỏ cho vào
500ml nước cất đem đun sôi trong sau đó để nguội và đem lọc lấy nước bỏ xác, cân
20g dextrose, 20g agar cho vào môi trường và dùng nước cất định mức cho đủ 1 lít
môi trường sau đó đem hấp. Sau khi hấp trước khi đổ đĩa bổ sung vào môi trường
stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) vào trong môi trường (nếu phân lập
Phytophthora).
b) Môi trường phân lập Phytophthora sp. là môi trường nước quả V-8-
agar (V8J) nước V-8 có thể thay thế bằng nước sinh tố cà chua, cà rốt, cần tây
lớn,…(Uchida, J.Y. et al. 1986)
20
Bảng 2. 4 Thành phần môi trường V-8J-agar

Nước V8 (nước cà rốt) đã lọc 200ml
CaCO3 3g
Agar 20 g
Bổ sung cho đủ
Nước cất
1000ml
c) Môi trường phân lập Phytophthora Cornmeal Agar (CMA) (McGinnis,

M. 2008)
Bảng 2. 5 Thành phần môi trường CMA

Bột bắp 50 g
Agar 15g
Nước 1000ml
Cách pha môi trường: cân 50g bột bắp thô (có màu vàng) pha với 500ml
nước cất đem đun nhỏ lửa trong 30 phút sau đó để nguội và đem lọc lấy nước bỏ xác
bột bắp, cân 15g agar cho vào môi trường và dùng nước cất định mức cho đủ 1 lít
môi trường sau đó đem hấp. Sau khi hấp trước khi đổ đĩa bổ sung vào môi trường
stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) vào trong môi trường
d) Môi trường thu nhận bào tử của nấm Phytophthora sp là môi trường
thạch nước cất agar WA (Harris, J. 1986)
Bảng 2. 6 Thành phần môi trường Water agar (WA)

Agar 20g
e) Môi trường phân lập nấm Phytophthora Carot Agar (CA)
Bảng 2. 7 Thành phần môi trường CA

Carot 400g
Agar 15g
21
Cách pha môi trường: gọt vỏ carot sau đó cân 400g carrot cắt nhỏ ra rồi
cho vào 500ml nước cất đem đun nhỏ lửa trong 30 phút sau đó để nguội và đem lọc
lấy nước bỏ xác, cân 15g agar cho vào môi trường và dùng nước cất định mức cho đủ
1 lít môi trường sau đó đem hấp. Sau khi hấp trước khi đổ đĩa, nếu phân lập
Phytophthora sp. bổ sung vào môi trường stock kháng sinh, kháng khuẩn (3P) vào
trong môi trường.
f) Hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn bổ sung vào môi trường phân lập
Phytophthora sp.
Bảng 2. 8 Thành phần hỗn hợp kháng sinh kháng khuẩn bổ sung vào môi trường
phân lập Phytophthora sp.
Lượng ml bổ
Nồng độ cuối
Thành phần Stock (mg/ml) sung vào môi
cùng (μl/ml)
trường
Penicillin G (kháng vi
25 4 50-100
khuẩn G+)
Piramicin/Nystatin
50 1 10-100
(kháng nấm)
Polymixin B (kháng vi
50 1 20-50
khuẩn G-)
g) Môi trường nhân giống nấm bệnh để ra vườn và chủng ngược trên mẫu cây
con. Môi trường hạt kê vỏ trấu
Hạt kê 50%
Vỏ trấu 50%
Cách pha môi trường: ngâm hạt kê và vở trấu 24 h để khô nước sau đó tiến
hành phối trộn với tỉ lệ 1:1 dùng phểu cho thành phần môi trường đã phối trộn vào
chai nhỏ 250ml sau đó đậy nút bông đem đi hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0C với áp
suất 1atm trong 15 phút.
h) Thành phần môi trường thạch CMC định tính khả năng sinh enzyme cellulase
CMC (Carboxymethyl cellulose) 1%
22
Agar 2%
Nước cất Thêm vào vừa đủ 1000ml
Cách pha môi trường: CMC được cân chính xác 1% cho từ từ vào trong
nước cất tránh vón cục, cho agar vào trong môi trường với hàm lượng 2%. Sau đó
tiến hành hấp khử trùng ở 1210C ở 1 atm trong 15 phút sau đó tiến hành đổ đĩa trên
đĩa petrii. Chú ý lựa chọn các đĩa đồng đều về kích thước
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Bố trí thí nghiệm
2.2.1.1. Phân lập mẫu bệnh (Mohsin Tariq et al,2009)
Mẫu bệnh (mẫu rễ, lá và mẫu đất) sau khi được lấy về từ vườn cam có bệnh
ta tiến hành lấy phân lập nấm bệnh. Đất lấy về được xử lí sơ bộ trước khi phân lập,
mẫu rễ thu nhận được ta tiến hành khử trùng mẫu bệnh và sau đó cấy trên môi trường
PDA có bổ sung kháng khuẩn tùy vào từng đối tượng cần phân lập. Sau khi phân lập
ta cấy chuyền các nấm bệnh phân lập được trên môi trường WA để quan sát hình thái
vi thể của nấm. Sau khi xác định được các chủng nấm bệnh ta tiến hành chủng ngược
giống nấm bệnh lên cây con xác định chủng nấm là nguyên nhân chính gây bệnh
vàng lá thối rễ trên cây có múi.
2.2.1.2. Phân lập nấm Trichoderma sp. (Mohsin Tariq et al,2009)
Mẫu đất sau khi được thu về từ cây cam khỏe mạnh ta tiến hành phân lập
theo phương pháp pha loãng mẫu sau đó cấy mẫu trên môi trường PDA có bổ sung
kháng sinh diệt vi khuẩn sau đó đem ủ ở nhiệt độ tử 20-250C sau 4 ngày ta tiến hành
lựa chọn các chủng nấm thích hợp, cấy chuyền trên môi trường WA để quan sát hình
thái, bào tử của nấm. Sau khi phân lập được ta giữ giống trên môi trường PDA.
2.2.1.3. Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm bệnh
Sau khi phân lập được 3 chủng nấm bệnh và 2 chủng nấm Trichoderma sp.
cùng với 3 chủng nấm thuộc bộ sưu tập giống của công ty Tiên Phong ta tiến hành
cấy đối kháng trên môi trường PDA với các đĩa đồng nhất về kích thước và đem ử ở
cùng điều kiện môi trường nuôi ta tiến hành đo các số liệu hằng ngày sau 14 ngày
nuôi cấy ta có thể tính được tỉ lệ ức chế (hay chỉ số đối kháng), tốc độ tăng trưởng
của nấm trong giai đoạn đối kháng và thời gian đối kháng. Các mẫu đối chúng là các
nấm bệnh và nấm Trichoderma sp. được nuôi riêng rẽ ở cùng thời gian và điều kiện
nuôi cấy.
2.2.1.4. Đánh giá hiệu quả đối kháng của Trichoderma sp. đối với nấm gây
bệnh thối trên cây cam quýt trong điều kiện nhà lưới
23
Tiến hành gieo cây con trước khi thí nghiệm. Ta thực hiện bố trí các nghiệm
như bảng 2.9
Bảng 2. 9 Bảng bố trí thí nghiệm cấy đối kháng ra vườn
STT Nghiệm thức 0 ngày 7 ngày

1 DC0
2 DC1 MCB
3 DC2 TPTN
4 DC3 Fus
5 DK1 MCB Fus
6 DK2 TPTN Fus
7 DK3 Fus MCB
8 DK4 Fus TPTN
9 DK5 MCB + TPTN Fus
10 DK6 Fus MCB + TPTN
11 DK7 MCB + TPTN + Fus
Tiến hành quan sát mức độ gây hại của nấm bệnh ở các thời điểm 2, 4, 6 ngày
sau khi cấy nguồn bệnh vào. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và lặp lại 3
lần.
Chỉ tiêu theo dõi: ghi nhận tỉ lệ cây bệnh, tỉ lệ cây chết tình trạng bệnh của cây tại
các thời điểm 2, 4, 6 ngày sau khi cấy nguồn bệnh
2.2.2. Phương pháp phân tích

2.2.2.1. Phương pháp thu mẫu đất
Dùng ống nhựa với đường kính vừa đủ cắt nhọn đầu để có thể dễ dàng lấy
mẫu đất ở lớp sâu dưới gốc cam quýt bị bệnh để phân lập nguồn bệnh từ đất của cây
bệnh và đất ở cây khỏe để phân lập nấm bệnh và nấm Trichoderma sp. sâu khoảng
15-30 cm đo ở độ sâu này các vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất vừa đảm bảo
mẫu đất không quá khô và không quá ẩm ướt. Ta thực hiện lấy mẫu ở vùng cây bị
nhiễm bệnh và ở những cây không nhiễm bệnh. Mỗi mẫu ta thực hiện lấy khoảng
100-200g đất vào trong túi nhựa sau đó tiến hành phơi mẫu đất dưới ánh nắng mặt
trời sau đó mẫu đất được đem đi pha loãng phân lập trên môi trường chọn lọc.
2.2.2.2. Phương pháp thu nhận mẫu rễ bị nhiễm bệnh
Sau khi quan sát cây có các triệu chứng bị vàng lá thối rễ ta tiến hành thu
mẫu phần rễ của cây bị bệnh, mẫu rễ bệnh sau đó cho vào túi nhựa ghi rõ ngày và địa
24
điểm phân lập mẫu và tiến hành phân lập mẫu trong phòng thí nghiệm càng sớm càng
tốt.
Trong quá trình phân lập mẫu từ rễ, lá không được khử trùng quá mức bởi vì
chất khử trùng có thể tiêu diệt cả nấm bệnh cần phân lập.
2.2.2.3. Phương pháp khử trùng mẫu

 Mẫu bệnh sau khi được phân lập về phòng thí nghiệm ta rửa sơ bộ mẫu
trên nước máy, tiến hành cắt nhỏ mẫu nơi có chứa nấm các vết bệnh có kích thước
khoảng (0.5 x 0.5) cm, tiến hành khử trùng mẫu bằng cồn 70 0 trong 1 phút để loại bỏ
các vi khuẩn trên mẫu bệnh dùng bông thấm nước thấm khô cồn trên mẫu phân lập
sau đó ta rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng (có thể rửa lại 2 đến 3 lần để rửa sạch
cồn trên bề mặt của mẫu bệnh) dùng bông thấm nước thấm khô nước còn sót lại trên
mẫu sau đó cấy mẫu trên môi trường PDA có bổ sung kháng khuẩn.
2.2.2.4. Phương pháp phân lập nấm bệnh từ mẫu rễ cây và mẫu lá bị bệnh
(Mohsin Tariq et al, 2009)
- Rửa sạch cát bụi dính trên mẫu lá và rễ cây bệnh
- Ngâm mẫu rễ bệnh ngập trong cồn 70% khoảng 1 phút để loại bỏ các vi
khuẩn bám trên rễ.
- Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng (thực hiện 2-3 lần)
- Thấm khô nước bằng bông thấm, cắt mẫu rễ, lá thành từng đoạn nhỏ dài
khoảng 0.5 cm
- Đặt các đoạn rễ, lá vừa cắt vào môi trường phân lập (PDA/CMA)
- Đem ủ môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 280C trong 2-4 ngày.
- Quan sát kết quả hình thái khuẩn lạc trên đĩa môi trường
- Quan sát vi thể nấm trên kính hiển vi
- Chủng ngược mẫu nấm bệnh phân lập được lên trên cây con khỏe mạnh
quan sát triệu chứng bệnh của cây. (thực hiện phương pháp lây bệnh nhân tạo mục
2.2.1.3)
- Cấy chuyền giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo
2.2.2.5. Phương pháp pha loãng mẫu
Phương pháp này dùng cho các mẫu đất:

Trước hết các mẫu đất phải đưuọc xử lí trước bằng cách phơi khô dưới ánh
nắng mặt trời 2-3 ngày sau đó dùng rây để loại bỏ các hạt cát, sạn có kích thước lớn
hơn 2-3 mm.
Tiến hành cân 1g đất đã xử lí cho vào 9 ml nước cất vô trùng. Dùng máy
vortex để hoàn tan hoàn toàn đất vào nước. Để yên khoảng 30 phút để hoạt hóa các
bào tử của nấm có trong đất.
25
Pha loãng mẫu với các nồng độ pha loãng khác nhau khoảng 10 -4, 10-5 là
hai nồng độ thích hợp để phân lập mẫu trong đất ở Việt Nam.
Hút 0.1 ml dịch pha loãng ở hai nồng độ trên cấy trang trên đĩa petri chứa
môi trường PDA có bổ sung chất kháng khuẩn.
Đem ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Phân lập các nấm sợi từ những khuẩn lạc
riêng lẻ trên đĩa thạch sau 4-10 ngày.
2.2.2.6. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Nhân gống cây con trước 1 tháng với số lượng vừa đủ thí nghiệm.
Nhân các giống nấm bệnh Fusarium sp. trên môi trường hạt kê vỏ trấu để
giữ được hoạt tính gây bệnh của nấm bệnh.
Cấy mẫu nấm bệnh lên cây con bằng phương pháp lây bệnh hỗn hợp (Phan
Thu Hiền, 2009)
Quan sát các triệu chứng biểu hiện ở các cây con đã được lây bệnh, các
triệu chứng phải giống như hình thái quan sát ban đầu trên cây trồng bị bệnh.
Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ các bộ phận cây mới bị bệnh, mẫu cấy
phải giống như mẫu cấy được làm thuần ban đầu.
Khi chọn lựa những cây khỏe mạnh để lây bệnh nhân tạo theo quy tắc
Koch, nên lưu ý dùng cùng một giống với cây bị bệnh mà từ đó tác nhân gây bệnh
được phân lập. Như vậy các triệu chứng biểu hiện khi lây bệnh nhân tạo sẽ rất gần
với các triệu chứng bệnh ban đầu ngoài tự nhiên - các giống cây trồng có thể có độ
mẫn cảm khác nhau đáng kể đối với một tác nhân gây bệnh.
 Kết quả phân lập Fusarium sp. được đánh giá thông qua các chỉ
tiêu như sau: hình thái khuẩn lạc trên môi trương PDA, hình thái kích thước, số
vách ngăn, màu sắc của các dạng bào tử như: macroconidia, microconidia,
clamydospore.
2.2.2.7. Phân lập các chủng nấm Trichoderma spp.
Sau khi thu mẫu đất sau khi để khô dưới ánh nắng mặt trời khoảng 7-14
ngày ta tiến hành phân lập mẫu để loại bỏ sự có mặt của các vi khuẩn trong mẫu đất
chỉ còn lại bào tử nấm. Tiến hành pha loãng mẫu sau đó cấy trang dịch pha loãng lên
môi tường PDA có bổ sung kháng khuẩn. Đem ủ khoảng 7 ngày ở nhệt độ khoảng
260C. Kiểm tra hình thái khuẩn lạc và quan sát vi thể xác định các chủng nấm phân
lập được Tiến hành phân lập làm thuần giống và giữ giống cho các thí nghiệm tiếp
theo
 Kết quả phân lập được đánh giá thông qua các chỉ tiêu như: hình
thái khuẩn lạc trên môi trường PDA, hình tháp phát sinh, kích thước, màu sắc của
cuốn đính bào tử, thể bình, bào tử đính…
26
2.2.2.8. Phương pháp đánh giá tính đối kháng của Trichoderma sp. đối với nấm
bệnh trên môi trường PDA (André Drenth et al, 2004)
 Nguyên tắc
Tác động đối kháng của Trichoderma sp. với tác nhân gây bệnh nhờ cơ chế
cạnh tranh chất dinh dưỡng, cơ chế kí sinh hay tạo chất kháng sinh do chúng tiết ra
trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
 Cách tiến hành
Đầu tiên, chuẩn bị môi trường PDA vào các đĩa petri có khích thước bằng
nhau. Cấy điểm nấm Trichoderma spp. trên thạch PDA sau đó tiếp tục cấy nấm bệnh
vào đĩa khoảng cách giữ nấm bệnh và Trichoderma khoảng 3 cm. Đem ủ ở nhiệt độ
phòng và quan sát và ghi nhận sự phát triển của nấm Trichoderma sp. và cả nấm bệnh
từng ngày (1-14 ngày). Ta tiến hành ghi nhận sự phát triển về kích thước (đường kính
khuẩn lạc, thời gian tiếp xúc, ức chế) của các nấm để tính toán khả năng ức chế của
nấm Trichoderma sp. đối với nấm Fusarium sp.. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lập
lại 3 lần.
Theo (Ahmed Imtiaj, Tae Soo Le, 2008; Sallam, 2009) thì tỉ lệ ức chế của
nấm được tính theo công thức sau:
𝑅 −𝑅
𝑃𝐼𝑀𝐺 = × 100%
𝑅
Trong đó:
R1: bán kính khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. ở thí nghiệm đối chứng
R1: bán kính khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. ở thí nghiệm đối kháng của
nấm Trichoderma sp.
PIMG (Percent Inhibition of Mycelial Growth): chỉ số đối kháng của nấm
Trichoderma sp.
27
Trichoderma spp
3 cm 3 cm 3 cm
Nấm Fusarium sp
Hình 2. 1. Kiểm tra khả năng đối kháng của nấm bệnh và Trichoderma
trên môi trường PDA
 Ta bố trí thí nghiệm lần lượt cho 5 chủng nấm Trichoderma sp. đối
kháng với 3 chủng nấm Fusarium sp. và cấy mẫu đối chứng lần lượt của các
chủng nấm Trichoderma sp. và Fusarium sp.
 Sau khi cấy ta tiến hành đo đường kính khuẩn lạc của nấm từng ngày để
theo dõi khả năng đối kháng của các chủng nấm sau đó đo vùng ức chế, tính phần
trăm ức chế và đánh giá mức độ đối kháng vào các thời điểm 7, 9 ngày sau khi
cấy nấm.
 Vùng ức chế: được hiểu là khoảng cách mà nấm Trichoderma sp. bao
phủ lấn át nấm bệnh trong quá trình đối kháng.
28
Hình 2. 2. Hình ảnh thể hiện vùng ức chế của nấm Trichoderma sp. lên nấm bệnh
Cách đánh giá mức độ đối kháng:
(+++): đối kháng mạnh, nấm Trichoderma sp. phát triển rất mạnh, mọc trùm lên
lấn át sự phát triển của nấm bệnh, làm cho sợi nấm bệnh bị chết lụi dần và đường
kính khuẩn lạc giảm dần theo thời gian.
(++): đối kháng trung bình, nấm Trichoderma sp. phát triển mạnh, mọc trùm lên
lấn át sự phát triển của nấm bệnh nhưng sợi nấm không bị chết lụi.
(+): đối kháng yếu, nấm Trichoderma sp. lúc đầu phát triển mạnh nhưng lại bị
chậm lại và không phủ lên khi tiếp xúc với nấm bệnh
(-): không đối kháng, nấm bệnh phát triển mạnh phủ lên nấm Trichoderma sp.
2.2.2.9. Phương pháp xác định vòng phân giải của trên môi trường chứa
cellulose
Phương pháp này dựa khả năng phân giải của dịch thu nhận từ nấm
Trichoderma sp. sau bốn ngày nuôi cấy trên môi trường PDB lỏng lên môi trường chỉ
có CMC. Sau 16 -24 giờ thì đọc kết quả. Khả năng phân giải cellulose được xác định
bằng sự hiện diện của vòng phân giải cellulose xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng
kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6mm thì được xem là có khả năng ức chế tích cực.
Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau:
H=D–d
Trong đó H: đường kính vùng hân giải cellulose xung quanh lỗ
D: đường kính vùng hân giải (bao gồm đường kính lỗ)
29
d: đường kính lỗ
2.2.3. Xử lí số liệu thống kê
Sối liệu thí nghiệm là kết quả trung bình cộng của 3 lần lặp lại. Kết quả được
xử lí bằng phần mềm hỗ trợ như Stargraphics XV.I và Microsoft Excel
30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả phân lập nấm bệnh, nấm Trichoderma trên vườn cam
3.1.1. Phân lập nấm bệnh từ mẫu cây bệnh thối rễ trên cây có múi
Kết quả sau 2 tuần phân lập mẫu nấm bệnh ta phân lập được 7 khuẩn lạc
khác nhau từ môi trường PDA có bổ sung chất kháng khuẩn. Sau khi quan sát hình
thái đại thể và vi thể chọn được 5 mẫu nấm bệnh có 3 chủng Fusarium solani, và 2
chủng nghi ngờ là nấm Phytophthora sp.
Bảng 3. 1. Các chủng nấm được phân lập từ cây cam bị bệnh
Nấm trứng Nấm trứng
Kí hiệu chủng Nấm Fusarium
Pythium Phytophthora
MCB4 - - -
MCB5 + - -
MCB6 - - -
MCB7 + - -
MCB8 + - -
MCB9 - - +
MCB10 - - +
Khuẩn lạc nấm phân lập được nghi ngờ là nấm có đặc điểm hình thái gần
giống nhau: khuẩn lạc có màu trắng đục, các sợi nắm tơi nhỏ, có chủng làm vàng môi
trường tùy vào từng loài. Loài MCB5 tiết ra ngoài môi trường có vàng xanh đậm,
MCB7 tiết ra ngoài môi trường có màu vàng nhạt, MCB8 tiết ra ngoài một trường có
màu vàng tươi. Khuẩn lạc nấm nghi ngờ là nấm Trứng Phytophthora khuẩn lạc có
màu trắng sữa, sợi nấm mỏng, mọc thưa thớt, có dạng hạt cát mịn trên bề mặt môi
trường, không làm đổi màu môi trường.
Hình thái vi thể của các chủng nấm MCB5, MCB7, MCB8 là nấm Fusarium
sp. có dạng hình sợi, kích thước khoảng (10-15) µm, có vách ngăn, các cuốn bào tử
chứa các bào tử macroconidia, và microconidia tạo thành hình cụm tròn. Bào tử lớn
macroconidia có hình sợi dài, một số cong hình liềm, số vách ngăn khoảng 2-5 vách
ngăn. Bào tử nhỏ microconidia có dạng hình oval đầu tròn, số vách ngăn khoảng 0-2
vách ngăn. Tương tự như hình thái của nấm Fusarium solani được miêu tả trong báo
cáo của M. Ravi Chandran, 2012. (Thể hiện ở bảng 3.2, Hình 3.1)
31
Bảng 3. 2.Bảng thể hình thái đại thể và vi thể của nấm bệnh phân lập
MCB3 MCB4 MCB5

Sợi nấm màu Sợi nấm màu Sợi nấm màu
trắng kem, tơi trắng đục, tơi trắng đục, tơi
xốp, sợi rất xốp, sợi mỏng, xốp, sợi mỏng,
Hình thái khuẩn lạc
mỏng, có 2 viền thưa thớt, có 1 thưa thớt có 2
trêm môi trường PDA
vòng viền vòng viền vòng
Mặt dưới có màu Mặt dưới có màu Mặt dưới có màu
vàng nâu vàng nâu đậm vàng nhạt
Macroconidia
- Kích thước (5-7) x (1-2) (5-7) x (2-3) (7-9) x (1-2)
(µm) 1-4 1-3 1-4
- Số vách ngăn Hình sợi dài hơi Có dạng sợi dài Có dạng sợi dài
- Hình dạng cong hình liềm và hơi cong hình thẳng hoặc hơi
dạng sợi thẳng , liềm và dạng cong hình liềm,
đầu tròn thẳng, đầu tròn đầu tròn
Không màu Không màu Không màu
- Màu sắc
Microconidia (1-3) x (1-2) (1-3) x (1-2)

(1-3) x (1-2)
- Kích thước
(µm) 0-1 0-1
0-1
- Số vách ngăn Có dạng hình Có dạng hình
Có dạng hình
- Hình dạng oval oval
oval
- Màu sắc Không màu Không màu
Không màu
Clamydospore
(bào tử hậu)
- Kích thước 2-3 2-3 2-3
(đường kính, µm)
- Hình dạng Hình cầu Hình cầu Hình cầu
- Màu sắc Không màu Không màu Không màu
Các chủng nấm (MCB9, MCB10) được cho là nấm Trứng Phytophthora do có
hình thái rất khó phân biệt với nấm Pythium nên tôi tiến hành đem mẫu đi định danh
bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA kết quả cho thấy không phải là loài
32
nấm trứng Phytophthora mà là chủng nấm Byssochlamys nivea nên loại bỏ hai chủng
nấm này.
Chỉ phân lập được 3 chủng nấm Fusarium sp. và không phân lập được các
nấm khác như Pythium, Phytophthora hay Tuyến trùng.
Hình 3. 1. Hình thái đại thể và vi thể của nấm Fusarium phân lập được từ vườn cam
bị bệnh
a-c: hình thái khuẩn lạc của nấm Fusarium sp.; d-f: hình thái cuốn bào tử của nấm Fusarium sp.; g-i:
hình thái macroconidia, microconidia và clamydospores của nấm Fusarium sp.
3.1.2. Chủng lại nấm bệnh phân lập được vào cây con
Sau 10 ngày chủng ngược nấm gây bệnh phân lập được lên cây con. Cây con
có biểu hiện héo rũ làm chết cây con (Hình 3.2d).
33
Tiến hành phân lập từ mẫu cây con bị bệnh ta thu được nấm có hình thái tương
tự với chủng nấm bệnh ban đầu (xem hình 3.2 b, c, e, f). Kết luận nấm này là một
trong những nguyên nhân gây bệnh thối rễ trên cây có múi.
Hình 3. 2. Kết quả phân lập trước và kết quả chủng ngược nấm Fusarium sp. lên cây
con
a, d là cây con trước và sau khi chủng ngược nấm bệnh; b, c: hình đại thể và vi thể của nấm
Fusarium phân lập từ cây cam ở vườn; e, f: hình thái đại thể và vi thể của nấm Fusarium sau khi
chủng ngược vào cây con
3.1.3. Phân lập nấm Trichoderma từ cây có múi khỏe mạnh trong vườn
Nấm Trichoderma khuẩn lạc ban đầu sợi nấm phát triển rất nhanh sợi nấm
có màu trắng, sau 2 ngày nấm tạo ra bào tử có màu xanh đen sau khoảng 7 ngày nuôi
cấy nấm tạo ra các đường tròn đồng tâm. Quan sát hình thái vi thể nấm có vách ngăn,
cuống sinh bào tử phân nhánh dạng hình nón hoặc kim tự tháp. Quan sát được thể
bình tạo thành ở đỉnh cuốn sinh bào tử. Các bào tử đính tạo ra ở đầu mút của thể bình
(Bảng 3.3, Hình 3.3).
34
Chủng MCB1 MCB2

phân lập
Tiêu chuẩn
Hình 3. 3. Hình thái đại thể và vi thể của các chủng nấm Trichoderma sp. phân lập từ
mẫu đất của cây cam khỏe mạnh
Sau khi quan sát đại thể và vi thể nhận định sơ bộ nấm. Để biết chính xác có
phải nấm Trichoderma hay không tôi đem mẫu đi định danh bằng phương pháp giải
trình tự gen 28S rRNA và kết quả định danh đúng là nấm Trichodderma với tên nấm
là Trichoderma asperellum.
3.2. Kết quả cấy đối kháng
35
Hình 3.thái
Bảng khuẩn
3. Kết lạctảtrên
quả mô đặc điểmKhuẩn
đại thểlạc
và có hệ sợi
vi thể của nấmKhuẩn lạc có hệ
Trichoderma sợi
asperellum
môi trường PDA phân lậpphát triển
từ đất củamạnh và dày
cây cam khỏe phát
mạnhtriển mạnh và dày
đặc. 2 ngày đầu sợi đặc. 2 ngày đầu sợi
nấm có màu trắng, sau nấm có màu trắng, sau
đó khuẩn lạc có màu đó khuẩn lạc có màu
xanh đen. Tạo thành xanh đen. Tạo thành
các vòng tròn đồng tâm các vòng tròn đồng tâm
Bào tử đính (conidium)
 Hình thái Hình gần cầu đến Hình gần cầu đến
hình trứng hình trứng
 Kích thước (μm) (3-4) x (2-3) (2.5-3) x (1.5-2)
 Màu sắc Xanh nhạt Xanh nhạt
Thể bình (phialide) Hình bình có cổ Hình bình có cổ
 Dài (μm) 6-9 5-8
 Cuốn đính bào tử Mọc đối xứng thành Mọc đối xứng từng
(conidiospore) cặp, mọc hơi xiên góc cặp và gần như vuông
khoảng 60-800 góc với sợi chính
Bào tử hậu (clamydospore) Không quan sát được Không quan sát được
Ta tiến hành cấy đối kháng với 5 chủng Trichoderma sp. và 3 chủng nấm
Fusarium sp. gây bệnh thối rễ trên cây có múi và ta được kết quả cấy đối kháng như
sau:
Hầu hết các chủng Trichoderma sp. đều có khả năng đối kháng cao tùy theo
từng loại nấm Trichoderma sp. mà khả năng đối kháng của chúng đối với nấm
Fusarium sp. cũng khác nhau.
Các chủng nấm phân lập từ ngoài vườn có khả năng đối kháng tốt. Chúng có
khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh, bao phủ lên khuẩn lạc của nấm bệnh làm
cho nấm bệnh tàn lụi dần sau 8 ngày cấy.
Các chủng nấm do phòng thí nghiệm công nghệ sinh học Tiên Phong cung
cấp khả năng đối kháng mạnh, trong quá trình đối kháng ức chế nhanh sự phát triển
của nấm bệnh trong những ngày đầu nhưng chúng không làm giảm đường kính của
nấm bệnh, khuẩn lạc nấm không bị các sợi nấm của Trichoderma làm giảm được diện
tích ban đầu, không làm tàn lụi nấm như 2 chủng nấm phân lập được ở ngoài vườn
trồng cây có múi.
36
Hình 3. 4. Nấm Trichoderma sp. đối kháng nấm Fusarium sp.

Khi quan sát hình thái sợi nấm tại vùng tiếp xúc của nấm Trichoderm sp. và
nấm Fusarium sp. trên kính hiển vi cho thấy các sợi nấm Trichoderma sp. quấn
quanh sợi nấm bệnh.
Vách tế bào của nấm Fusarium sp. mờ đi (Hình 3.4) điều này có thể là do
Trichoderma sp. tiết enzyme phân giải vách tế bào của nấm Fusarium sp.
Kết quả định tính khả năng sinh enzyme cellulase trên 5 chủng Trichoderma
sp. điều cho kết quả dương tính.
Bảng 3. 4. Kết quả đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm Fusarium sp.
Tỉ lệ ức chế của nấm

STT Kí hiệu Vùng ức chế, Z (cm) Trichoderma lên nấm
Fusarium (%)
a,b,c
1 T01-Fus1 0.567[U1]± 0.033 75.4 ±1.8a,b
2 T01-Fus2 0.967 ± 0.088c 82.1 ±1.3b,c
3 T01-Fus3 0.533 ± 0.033a,b,c 84.7 ±2.1c
4 T24-Fus1 0.367 ± 0.033a 86.2 ±2.7c
5 T24-Fus2 0.7 ±0.12 94.7 ± 3d,e
6 T24-Fus3 0.567 ± 0.088a,b,c 83.8 ± 1c
7 T29-Fus1 0.4 ± 0.058a,b 74.6 ± 1.9a
8 T29-Fus2 0.767 ± 0.033 b,c 73 ±3.6a
9 T29-Fus3 0.6 ± 0.058a,b,c 83.8 ±2.5c
37
10 MCB1-Fus1 1.43 ±0.067d 93.8 ± 3.6d,e

11 MCB1-Fus2 2.2 ± 0.208f 95.4 ± 2.5e
12 MCB1-Fus3 1.73 ± 0.12d,e 95.9 ± 2.2e
13 MCB2-Fus1 2.267 ± 0.145f 88 ±2.2c,d
14 MCB2-Fus2 1.833 ±0.12e 97.3 ± 1.5e
15 MCB2-Fus3 2.033 ± 0.088e,f 94.5 ± 2.9d,e
Thí nghiệm đối chứng
Nấm Trichoderma sp. Nấm Fusarium sp.
STT Chủng Kích thước (bán kính, STT Chủng Kích thước (bán kính,
cm) cm)
1 T01 Mọc lên trên thành 1 Fus1
3.2
petri
3.1
petri
3.5
petri
4 MCB1 Mọc lên trên thành
petri
5 MCB2 Mọc lên trên thành
petri
38
Hình 3. 5 Hình thái các khuẩn lạc đối kháng của nấm Trichoderma sp. với nấm
Fusarium sp. sau 9 ngày cấy đối kháng
Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế của các chủng nấm Trichoderm sp. với
nấm Fusarium sp.
120
Tỉ lệc ức chế (%)
100
80
60
40
20
Biều đồ 3. 1[U2]. Biểu đồ thể hiện tỉ lệc ức chế của nấm Trichoderma sp. với nấm
Fusarium sp.
 Phân tích kết quả cấy đối kháng ta có:
39
Tất cả các chủng nấm Trichoderma sp. đều có khả năng đối kháng cao
với nấm Fusarium (>50%) chủng có khả năng đối kháng thấp nhất là 73% cao nhất là
đối kháng gần như hoàn toàn 97.3%
 Từ bảng số liệu và biểu đồ vùng ức chế của các nấm ta rút ra được các
Biểu đồ thể hiện vùng ức chế của các chủng nấm Trichoderm sp.
3 với nấm Fusarium sp.
2.5
vùng ức chế (cm)
1.5
0.5
Biều đồ 3. 2 Biểu đồ thể hiện vùng ức chế cảu các nghiệm thức cấy đối kháng của
nấm Trichoderm sp. với nấm Fusarium sp.
khả năng sau:
Trên biểu đồ 3.2 có thể thấy rằng các chủng MCB có vùng ức chế lớn
hơn so với các chủng Trichoderma sp. từ phòng thí nghiệm. Vùng ức chế được định
nghĩa là vùng bao phủ của nấm Trichoderma sp. lên nấm bênh trong đĩa cấy đối
kháng. Do đó mặc dù tốc độ phát triển chậm hơn nhưng các chủng MCB có khả năng
bao phủ tốt hơn các chủng nấm Trichoderma sp. trong phòng thí nghiệm cung
cấp.Tuy nhiên các chủng MCB có khả năng sinh enzyme cellulase thấp. Nên ta thấy
kết quả tỉ lệ ức chế chung không vượt trội hơn so với các chủng nấm Trichoderma
trong phòng thí nghiệm (xét về mạt thống kê học). Bảng 3.4, Biều đồ 3.1)
Hình 3. 6. Vòng phân giải cellulose của các chủng Trichoderma sp.
STT Chủng Vòng phân giải (mm)
1 T01 8.333± 0.333b
2 T24 13.0 ± 0.577c
3 T29 8.667 ± 0.333b
4 MCB1 5.667 ± 0.667a
40
5 MCB2 5.667 ± 0.333a

Kiểm tra khả năng sinh enzyme cellulase cho thấy rằng hầu hết các
chủng có khả năng sinh enzyme.
Khả năng sinh enzyme có thể phân huỷ vách tế bào của nấm làm hạn chế
sự phát triển của nấm khi nấm Trichoderma có thể tiếp xúc và bao phủ được nấm
bệnh.[U3]
Chủng nấm T24 tạo ra vòng phân giải cellulose cao nhất, đến các chủng
T01, T29 tạo ra vòng phân giải nhỏ hơn chủng T24 gần như tương đương nhau (không
có sự khác biệt về khả năng sinh enzyme giữa 2 nấm T01, T29 trong thống kê học).
Các nấm MCB có khả năng sinh enzyme thấp hơn so với 2 chủng T01, T24, T29 và
cũng không có sự khác biệt về khả năng sinh enzyme của hai chủng MCB này trong
thống kê học.
Hình 3. 7. Hình ảnh thể hiện vòng phân giải của các chủng nấm Trichoderma trên
môi trường CMC
Chủng Trichoderma T01, T29 có khả năng phát triển rất nhanh, ức chế
ngay từ 2 ngày đầu làm cho nấm Fusarium sp. chỉ mọc được với đường kính nhỏ so
với các chủng MCB (0.7-1.9 cm) nhưng nấm này không thể lấn át được nấm bệnh
hoàn toàn. Khả năng nấm T01, T29 ăn sâu vào khuẩn lạc của nấm bệnh rất ít, sau 9
ngày nấm bệnh Fusarium sp. có thể phát triển thêm so với trạng thái ban đầu. Các đĩa
đối kháng được tô màu vàng ta có thể quan sát trên hình 3.5.
Nấm T24 có khả năng vượt trội hơn so với các nấm trên. Ban đầu T24 phát
triển rất nhanh ức chế sự phát triển của nấm bệnh, khuẩn lạc phát triển chậm mọc
nhỏ, sau 4 ngày nấm T24 bắt đầu ăn sâu vào khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. lấn át
nấm bệnh rất tốt. Sau 11 ngày nấm đã ăn sâu hầu như toàn bộ khuẩn lạc của nấm
bệnh và bị tàn lụi sau 13 ngày. Đĩa đối kháng đưuọc đánh dấu màu đỏ trên hình 3.5.
Chủng MCB1, MCB2 khả năng phát triển chậm hơn, đến 4 ngày nấm
MCB mới mọc hết đĩa bao hoàn toàn khuẩn lạc của nấm bệnh (0.7- 2.5 cm), ngược
lại nấm này có khả năng mọc lấn át nấm bệnh rất tốt sau 9 ngày nấm MCB có khả
năng mọc ăn sâu vào bên trong khuẩn lạc của nấm Fusarium sp. ức chế sự phát triển
41
của nấm Fusarium sp. và tàn lụi sau 13 ngày. Các đĩa đối kháng được đánh dấu màu
xanh lá quan sát trên hình 3.5
Từ hai kết quả này ta có thể rút ra được một số điều [U4] như sau: có hai cơ chế
đối kháng của nấm Trichoderma được thể hiện trong kết quả này:
o Thứ nhất: các chủng nấm Trichoderma sp. có khả năng đối kháng
bằng cơ chế cạnh tranh chất dinh dưỡng làm cho nấm không thể phát triển được nếu
như có mặt của nấm Trichoderma sp. các chủng Trichoderma sp. có khả năng đối
kháng theo cơ chế này có thể được sử dụng để bón cho cây trong quá trình chăm sóc
nhằm phòng trị bệnh một cách hiệu quả.
o Thứ hai: các chủng nấm vừa có khả năng sinh ra các enzyme phân giải
sợi của các nấm bệnh như (cellulase, protease, β-glucanase[U5]) và có khả năng cạnh
tranh chất dinh dưỡng với nấm bệnh cao thì có thể được ứng dụng để sản xuất các chể
phẩm dùng để xử lí khi bệnh vừa mới phát (khi mật độ của nấm bệnh trong đất cao).
3.2.1. So sánh tốc độ phát triển của nấm Trichoderma sp. và nấm Fusarium sp.
Bảng 3. 5 So sánh tốc độ phát triển của nấm Trichoderma (T01, MCB1) và nấm
Fusarium (Fus1) sau 5 ngày cấy
Nấm Trichoderma Nấm Trichoderma

Thời gian Nấm Fusarium
T01 MCB1
(h) (bán kính, cm)
(bán kính, cm) (bán kính, cm)
0 0 0 0
24 1,767 1,5 0,7
48 4 3 1
72 5,3 4,9 1.5
96 Mọc hết đĩa Mọc hết đĩa 2,3
Mọc lan lên thành Mọc lan lên thành
120 3,5
đĩa petri đĩa petri
42
Tốc độ phát triển của nấm Trichoderma sp. và nấm Fusarium sp.
6
Bán kính nấm (cm)

5
4
3
2
1
0
0 24 48 72 (giờ)
Nấm Trichoderma T01 Nấm Trichoderma MCB Nấm Fusarium sp.
Biều đồ 3. 3. Tốc độ phát triển của nấm Trichoderma sp. và nấm Fusarium sp
Kết quả khảo sát này được thực hiện trên đĩa petri có cùng kích thước 9cm,
cùng điều kiện môi trường về nhiệt độ, ánh sáng. Tốc độ tăng trưởng của nấm
Trichoderma (T01) trên môi trường 5,3 cm/72h tương đương với 736,11 μm/h. Tốc
độ tăng trưởng của nấm Trichoderma (MCB1) trên môi trường là 4,9cm/72h tương
đương với 680,55 μm/h. Tốc độ tăng trưởng của nấm Fusarium (Fus1) trên môi
trường là 1,5 cm/72h tương đương với 208,33 μm/h. Tốc độ tăng trưởng của nấm
Trichoderma (T01) so với nấm Fusarium gấp 3,53 lần và của nấm Trichoderma
(MCB1) so với nấm Fusarium là 3,267 lần. Tốc độ tăng trưởng nhanh của nấm
Trichoderma sp. cũng là một lợi thế trong việc đối kháng sinh học với các nấm bệnh
khác trong môi trường[U6].
43
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1.Kết luận
Sau khi thực hiện để tài ta thu nhận được một số vấn đề như sau:
 Phân lập được 3 chủng nấm Fusarium sp. tương tự như hình thái của
nấm Fusarium solani. Sau khi chủng ngược trên mẫu cây con xác định được 3 chủng
này chính là nguyên nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam.
 Không phân lập được các loài nấm khác như Pythium sp., Phytophthora
sp. trong mẫu bệnh lấy ở vườn.
 Phân lập được 2 chủng nấm Trichoderma asperellum từ mẫu đất lấy ở
những cây cam khỏe mạnh trong vườn.
 Kết quả cấy đối kháng, tất cả các chủng nấm đều có khả năng đối kháng
với nấm Fusarium sp gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi. Ta có ba cấp bậc đối
kháng trong thí nghiệm này: có 2 chủng (T01, T29) có khả năng phát triển nhanh ức
chế mạnh nấm bệnh từ ban đầu nhưng khả năng bao phủ của nấm không cao không
lấn át hoàn toàn được nấm bệnh, 2 chủng (MCB1, MCB2) khả năng phát triển chậm
hơn các chủng còn lại nhưng có khả năng bao phủ tốt có thể tiêu diệt được nấm bệnh
nhưng chậm hơn các chủng nấm thuộc dòng của công ty Tiên Phong cung cấp.
Chủng nấm T24 vừa có khả năng phát triển nhanh chóng ở giai đoạn đầu ức chế sự
phát triển của nấm (đường kính khuẩn lạc nhỏ tương tự các nấm T 01, T29) và có khả
năng bao phủ tốt khả năng tiêu diệt nấm bệnh cao.
 Tốc độ phát triển của nấm Trichoderma (phòng thí nghiệm cung cấp)
nhanh hơn gấp 3.55 lần so với nấm Fusarium, và các nấm MCB nhanh gấp 3.267 lần
so với nấm Fusarium sp. là một lợi thế trong việc đối kháng với nấm bệnh.
4.2. Kiến nghị
 Nên thử nghiệm lại khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp. với
nấm Fusarium sp. ngoài vườn. Để kết quả được tốt hơn nên tiến hành bước ra vườn
nếu điều kiện cho phép.
 Có thể khảo sát thêm điều kiện khác nhau như độ yếm khí, ánh sáng
cao và nhiệt độ cao để phù hợp hơn với điều kiện thực tế bên ngoài môi trường.
 Nghiên cứu sâu hơn về các chất mà nấm Trichoderma sp. sinh ra đối
kháng hiệu quả với nấm Fusarium sp. và các loài nấm gây bệnh thối rễ khác.
 Có thể đưa các chủng nấm có khả năng đối kháng tốt vào sản xuất các
chế phẩm Trichoderma sp. phòng trừ và đặc trị các loài nấm gây bệnh thối rễ trên cây
có múi và các loài cây khác.
44
Chương 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO

5.1.Tài liệu tiếng việt
[1] Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Hien P.T 2009. Cẩm
nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp.
ACIAR: Canberra.
5.2.Tài tiệu tiếng anh
[1] André Drenth and David I. Guest, 2004. Diversity and Management
of Phytophthora in Southeast Asia. Australian Centre for International
Agricultural Research Canberra.
[2] André Drenth and Barbara Sendall Brisbane, 2001. Practical guide
to detection and identification of Phytophthora. CRC for Tropical Plant
Protection Brisbane Australia.
[3] Ahmed Imtiaj, Tae Soo Le, 2008. World Journal of Agricaltural
Sciences, 4 (1): 13-14
[4] Azher Mustafa, M. Aslam Khan, M. Inam-ul-Haq, M. Aslam
Pervez and Ummad-ud-Din Umar, 2009. Usefulness of different culture media
for in-vitro evaluation of Trichoderma spp. against seed-borne fungi of economic
importance. Pak. J. Phytopathol., Vol. 21(1): 83-88.
[5] Elizabeth A. Bush and Erik L. Stromberg, 2006. Illustration of Key
Morphological Characteristics of Phytophthora Species Identified in Virginia
Nursery Irrigation Water. Plant Management Network.
[6] Jeffers S. N., 2006. Identifying Species of Phytophthora. Department
of Entomology, Soils, & Plant Sciences Clemson University—Clemson, SC
[7] Harris J. L., 1986. Modified methods for fungal slide culture. J. Clin.
Microbiol. 9:460-461
[8] McGinnis M., 2008. Laboratory handbook of medical mycology.
Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich, New York.
[9] Mohsin Tariq, Sumera Yasmin, Fauzia Y. Hafeez, 2009 Biological
control of potato black scurf by rhizosphere associated bacteria. Brazilian Journal
of Microbiology.
[10] M. Ravi Chandran and M. Reddi Kumar, 2012. Studies on cultural,
morphological variability in isolates of Fusarium solani (Mart.) Sacc., incitant of
dry root-rot of Citrus. Current Biotica 6(2): 152-162.
[11] Patel s. I, Patel R. L., Desai A. G. and Patel D.S., 2011. Biocontrol of
Fusarium Udum through Trichoderma. Journal of Pharma and Bio Sciences.Vol
2, Issue 4.[U7]
45
[12] Poornima Sharma, 2011. Complexity of Trichoderma-Fusarium

interaction and manifestation of biological control. Australian Journal of Crop
Science.
[13] Sallam. N, Abd Elrazik A. A., Hassan M. & Koch E., 2009. Powder
formulations of Bacillus subtilis, Trichoderma spp and Coniothyrium minitans for
biocontrol of Onion White Rot. Archives of Phytopathology and Plant Protection,
42(2):142 - 147
[14] Uchida J. Y., Aragaki M. and Yahata P. S., 1986. Basidiospore
formation by Ceratobasidium sp. on agar. Mycological Society of America 78:587-
592.
5.3.Tài liệu online
[15] http://entnemdept.ufl.edu
[16] http://www.forestphytophthoras.org
[17] http://vietsciences.free.fr
46
PHỤ LỤC
Kết quả xử lí trong phần mềm stagrapthics.

[1] Bảng xử lí 1 nhân tố: Hoat do cellulase do các chủng nấm tạo ra
Dependent variable: Hoat do cellulase
Factor: Chung VSV
Number of observations: 15
Number of levels: 5
Summary Statistics for Hoat do cellulase
Chung Count Averag Standard Coeff. of Standard Minimum Maximu Rang
VSV e deviation variation error m e
MCB1 3 5.66667 1.1547 20.3771% 0.666667 5.0 7.0 2.0
MCB2 3 5.66667 0.57735 10.1885% 0.333333 5.0 6.0 1.0
T01 3 8.33333 0.57735 6.9282% 0.333333 8.0 9.0 1.0
T24 3 13.0 1.0 7.69231% 0.57735 12.0 14.0 2.0
T29 3 8.66667 0.57735 6.66173% 0.333333 8.0 9.0 1.0
Total 15 8.26667 2.86523 34.66% 0.739798 5.0 14.0 9.0
ANOVA Table for Hoat do cellulase by Chung VSV

Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value
Squares Square
Between 108.267 4 27.0667 40.60 0.0000
groups
Within groups 6.66667 10 0.666667
Total (Corr.) 114.933 14
Multiple Range Tests for Hoat do cellulase by Chung VSV
Method: 95.0 percent LSD

Chung VSV Count Mean Homogeneous
Groups
MCB1 3 5.66667 X
MCB2 3 5.66667 X
T01 3 8.33333 X
T29 3 8.66667 X
T24 3 13.0 X
[2] Bảng phân tích 1 nhân tố - Ti le uc che của các chủng nấm đối kháng
Dependent variable: Ti le uc che
Factor: Chung nam doi khang
Number of levels: 15
Summary Statistics for Ti le uc che
Chung nam doi Count Average Standard Coeff. of Standard Minimum Maximum
khang deviation variation error
MCB1-FUS1 3 0.937667 0.0625007 6.66555% 0.0360848 0.875 1.0
MCB1-FUS2 3 0.954333 0.0432474 4.53168% 0.0249689 0.914 1.0
MCB1-FUS3 3 0.959 0.0379868 3.96109% 0.0219317 0.925 1.0
MCB2-FUS1 3 0.88 0.0387427 4.40258% 0.0223681 0.844 0.921
MCB2-FUS2 3 0.972667 0.0265393 2.72851% 0.0153225 0.947 1.0
MCB2-FUS3 3 0.944667 0.0493997 5.22933% 0.0285209 0.905 1.0
47
T01-FUS1 3 0.754333 0.0318957 4.22832% 0.018415 0.719 0.781

T01-FUS2 3 0.820667 0.0233524 2.84554% 0.0134825 0.8 0.846
T01-FUS3 3 0.847 0.0355949 4.20247% 0.0205508 0.81 0.881
T24-FUS1 3 0.862333 0.0467582 5.42229% 0.0269959 0.813 0.906
T24-FUS2 3 0.946667 0.0515978 5.45047% 0.02979 0.897 1.0
T24-FUS3 3 0.838333 0.0166533 1.98648% 0.0096148 0.825 0.857
T29-FUS1 3 0.745667 0.0318957 4.27747% 0.018415 0.719 0.781
T29-FUS2 3 0.729667 0.0630026 8.63444% 0.0363746 0.657 0.769
T29-FUS3 3 0.838 0.0407308 4.86048% 0.023516 0.8 0.881
Total 45 0.868733 0.0877386 10.0996% 0.0130793 0.657 1.0
ANOVA Table for Ti le uc che by Chung nam doi khang

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 0.285781 14 0.020413 11.57 0.0000
Within groups 0.0529333 30 0.00176444
Total (Corr.) 0.338715 44
Multiple Range Tests for Ti le uc che by Chung nam doi khang
[3] Bảng phân tích 1 nhân tố so sánh vùng ức chế của các chủng nấm cấy đối kháng
Dependent variable: Vung uc che
Factor: Chung nam doi khang
Number of levels: 15
Summary Statistics for Vung uc che
Chung nam doi Count Average Standard Coeff. of Standard Minimum Maximum
khang deviation variation error
MCB1-FUS1 3 1.43333 0.11547 8.05605% 0.0666667 1.3 1.5
MCB1-FUS2 3 2.2 0.360555 16.3889% 0.208167 1.8 2.5
MCB1-FUS3 3 1.73333 0.208167 12.0096% 0.120185 1.5 1.9
MCB2-FUS1 3 2.26667 0.251661 11.1027% 0.145297 2.0 2.5
MCB2-FUS2 3 1.83333 0.208167 11.3545% 0.120185 1.6 2.0
MCB2-FUS3 3 2.03333 0.152753 7.51242% 0.0881917 1.9 2.2
T01-FUS1 3 0.566667 0.057735 10.1885% 0.0333333 0.5 0.6
T01-FUS2 3 0.966667 0.152753 15.802% 0.0881917 0.8 1.1
T01-FUS3 3 0.533333 0.057735 10.8253% 0.0333333 0.5 0.6
T24-FUS1 3 0.366667 0.152753 41.6598% 0.0881917 0.2 0.5
T24-FUS2 3 0.7 0.1 14.2857% 0.057735 0.6 0.8
T24-FUS3 3 0.566667 0.057735 10.1885% 0.0333333 0.5 0.6
T29-FUS1 3 0.4 0.2 50.0% 0.11547 0.2 0.6
T29-FUS2 3 0.766667 0.23094 30.1226% 0.133333 0.5 0.9
T29-FUS3 3 0.6 0.1 16.6667% 0.057735 0.5 0.7
Total 45 1.13111 0.703505 62.1959% 0.104872 0.2 2.5
Chung nam doi Range Stnd. skewness Stnd. kurtosis

khang
ANOVA Table for Vung uc che by Chung nam doi khang

Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value
Squares Square
Between 20.8031 14 1.48594 45.80 0.0000
groups
Within groups 0.973333 30 0.0324444
48
Total (Corr.) 21.7764 44

Multiple Range Tests for Vung uc che by Chung nam doi khang
Method: 95.0 percent LSD

Level Count Mean Homogeneous
Groups
T24-FUS1 3 0.366667 X
T29-FUS1 3 0.4 XX
T01-FUS3 3 0.533333 XXX
T01-FUS1 3 0.566667 XXX
T24-FUS3 3 0.566667 XXX
T29-FUS3 3 0.6 XXX
T24-FUS2 3 0.7 XXX
T29-FUS2 3 0.766667 XX
T01-FUS2 3 0.966667 X
MCB1-FUS1 3 1.43333 X
MCB1-FUS3 3 1.73333 XX
MCB2-FUS2 3 1.83333 X
MCB2-FUS3 3 2.03333 XX
MCB1-FUS2 3 2.2 X
MCB2-FUS1 3 2.26667 X
49

Khóa luận tốt nghiệp

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Khóa luận tốt nghiệp

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ CÔNG THƯƠNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

Khóa luận tốt nghiệp

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG SINH

TS. Phạm Minh Tuấn Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Bích Tuyền

TP.HCM, ngày 29 tháng 6 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Bích Tuyền

LỜI CAM ĐOAN

Ngày …. tháng …. năm …

Sinh viên thực hiện

(ký và ghi họ tên)

Nguyễn Thị Bích Tuyền

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

alamethicins, tricholin, peptaibols, 6-penthyl-alpha-pyrone, massoilactone, viridin,

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1. Triệu chứng bệnh

Hình 1. 2. Triệu chứng bệnh vàng lá thối rễ xuất hiện trên rễ

1.1.3. Điều kiện phát sinh phát triển bệnh

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.3. Biện pháp sinh học trong bảo vệ cây trồng

 Giống (Genus): Fusarium

1.3.1.5. Chu kì sống của nấm

1.3.2. Pythium sp. và Phythophthora sp.

Hình 1. 5. Đặc điểm hình thái của Pythium senticosum.

Hình 1. 7. Đặc điểm hình thái của Phytophthora nicotianae.

1.3.2.3. Hình thức sinh sản

1.3.3. Tuyến trùng

Tuyến trùng ngoại ký sinh Pratylenchus, Xiphinema truyền bệnh virus...

Những chất do Trichoderma tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase,

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Vi sinh vật gây bệnh

 Nấm đối kháng

2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Stt Dụng cụ DVT Stt Dụng cụ DVT

Stt Thiết bị Xuất xứ

Bảng 2. 3 Thành phần môi trường PDA

Thành phần Hàm lượng

Bảng 2. 4 Thành phần môi trường V-8J-agar

Thành phần Hàm lượng

c) Môi trường phân lập Phytophthora Cornmeal Agar (CMA) (McGinnis,

Bảng 2. 5 Thành phần môi trường CMA

Thành phần Hàm lượng

Bảng 2. 6 Thành phần môi trường Water agar (WA)

Thành phần Hàm lượng

e) Môi trường phân lập nấm Phytophthora Carot Agar (CA)

Bảng 2. 7 Thành phần môi trường CA

Thành phần Hàm lượng

Nước cất 1000ml

2.2.1.2. Phân lập nấm Trichoderma sp. (Mohsin Tariq et al,2009)

Bảng 2. 9 Bảng bố trí thí nghiệm cấy đối kháng ra vườn

STT Nghiệm thức 0 ngày 7 ngày

2.2.2. Phương pháp phân tích

2.2.2.2. Phương pháp thu nhận mẫu rễ bị nhiễm bệnh

2.2.2.3. Phương pháp khử trùng mẫu

Phương pháp này dùng cho các mẫu đất:

Cách đánh giá mức độ đối kháng:

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

MCB3 MCB4 MCB5

Microconidia (1-3) x (1-2) (1-3) x (1-2)

(Bảng 3.3, Hình 3.3).

Chủng MCB1 MCB2