BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN MÔN HỌC
KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
THIẾT KỂ QUY TRÌNH NUÔI CẤY LỎNG THU NHẬN
ENZYME LIPASE TỪ BACILLUS SUBTILIS VỚI NĂNG SUẤT
200 TẤN/NĂM

HÀ TẤN TÀI MSSV: 2008202034

VÕ ĐÔNG QUỐC THỊNH MSSV: 2008200058
VÕ THỊ PHƯƠNG THỦY MSSV: 2008200083

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. PHẠM MINH TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 11 NĂM 2023

 MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................................5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...............................................................................................8
1.1 Sơ lược về enzyme lipase...........................................................................................8
1.1.1 Khái niệm enzyme lipase.....................................................................................8
1.1.2 Cấu trúc enzyme lipase........................................................................................9
1.1.3 Tính chất enzyme lipase.....................................................................................10
1.1.4 Cơ chế xúc tác....................................................................................................11
1.1.5 Nguồn thu nhận enzyme lipase..........................................................................12
1.1.6 Ứng dụng của enzyme lipase.............................................................................12
1.2 Giới thiệu về Bacillus subtilis..................................................................................13
1.2.1 Lịch sử phát hiện................................................................................................13
1.2.2 Đặc điểm phân bố..............................................................................................14
1.2.3 Đặc điểm hình thái.............................................................................................15
1.2.4 Đặc điểm sinh hóa..............................................................................................15
1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy.............................................................................................16
CHƯƠNG 2: LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ.........................17
2.1 Lựa chọn công nghệ.................................................................................................17
2.1.1 Phương pháp lọc................................................................................................17
2.1.2 Phương pháp ly tâm...........................................................................................20
2.1.3 Phương pháp sấy................................................................................................21
2.2 Lựa chọn nguồn nuôi cấy Bacillus subtilis..............................................................24
2.2.1 Nguồn cacbon....................................................................................................24
2.2.2 Nguồn nitơ.........................................................................................................25
2.2.3 Nguồn khoáng và các yếu tố khác.....................................................................25
Môi trường nuôi cấy....................................................................................................26
2.3 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy..............................................................................26
2.4 Phương pháp thu nhận enzyme lipase......................................................................28
2.5 Quy trình công nghệ.................................................................................................31
2.6 Thuyết minh quy trình..............................................................................................32
2.6.1 Nguyên liệu........................................................................................................32
 2.6.2 Giống vi sinh vật................................................................................................33
2.6.3 Lên men.............................................................................................................33
2.6.4 Lọc tách sinh khối..............................................................................................33
2.6.5 Kết tủa enzyme..................................................................................................35
2.6.6 Ly tâm................................................................................................................35
2.6.7 Sấy......................................................................................................................35
CHƯƠNG 3: CÂN BẰNG VẬT CHẤT...........................................................................36
3.1. Kế hoạch sản xuất....................................................................................................36
3.2 Sấy............................................................................................................................37
3.3 Ly tâm.......................................................................................................................37
3.4 Quá trình kết tủa.......................................................................................................38
3.5 Quá trình lọc loại bỏ sinh khối.................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................39
 DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1: Enzym lipase.......................................................................................................8
Hình 1. 2: Phản úng thủy phân triacylgycerol thành glycerol và các acid béo....................9
Hình 1. 3:Cấu trúc phân tử.................................................................................................10
Hình 1. 4: Cơ chế xúc tác của lipase (Jaeger et al.,1999)..................................................11
Hình 1. 5: Vi khuẩn Bacillus subtilis.................................................................................15

CHƯƠNG 1.
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1: Phân loại theo Bergey......................................................................................14

Bảng 2. 1: So sánh dung môi dùng để kết tủa enzyme......................................................30

Bảng 2. 2: Thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis...........................................32

Bảng 3. 1: Thống kê hiệu suất của các quá trình...............................................................36

 LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đồ án, chúng em đã có cơ hội được cập nhật và áp
dụng những kiến thức lý thuyết từ những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước vào
thực nghiệm. Và kết quả từ đồ án đem lại cho chúng em nhiều hiểu biết mới về lĩnh vực
khoa học, kinh nghiệm thực tế để có thể vận dụng vào công việc cho chúng em sau này.
Để hoàn thành đồ án một cách tốt nhất chúng em đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều của
thầy cô và bạn bè. Nay chung em xin trân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm và các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, đặc biệt
thầy trưởng khoa, Phòng quản lý khoa học và Đào tạo sau đại học, Trường Đại học Công
Thương TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và trang bị cho chúng em
thực hiện đề tài này.

Thầy Phạm Minh Tuấn - Giáo viên hướng dẫn đã luôn bên cạnh, động viên và chia
sẽ những kinh nghiệm để chúng em có thêm những kiến thức quý báu trong suốt quá
trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và thầy cô luôn
quan tâm theo dõi, ủng hộ động viên chúng em trong suốt quá trình học tập và làm việc
tại trường.

Do thời gian hạn chế và kiến thức còn chưa sâu, nên đồ án này còn có nhiều thiếu
sót, vì vậy chúng em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để đề tài được hoàn
thiện hơn.
 ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiềm năng sử dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp đã được công nhận và phát
triển trong những năm gần đây. Enzyme lipase từ Bacillus subtilis là một trong những
nguồn cung cấp chất lượng cao và tiềm năng lớn. Tuy nhiên, quy trình nuôi cấy lỏng và
thu nhận enzyme lipase từ vi khuẩn này vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết để đạt
được năng suất sản xuất ổn định và cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.

Enzyme lipase đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân lipid thành axit béo và
glycerol. Nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, hóa chất, y tế, và nhiều
lĩnh vực khác. Việc nghiên cứu và sản xuất enzyme lipase từ Bacillus subtilis có thể đáp
ứng nhu cầu ngày càng tăng về sản phẩm này. Với năng suất 200 tấn/năm, việc sản xuất
enzyme lipase từ vi khuẩn có thể đáp ứng nhu cầu thị trường và mang lại lợi nhuận kinh
tế cho doanh nghiệp. Với sự đóng góp cho phát triển bền vững enzyme lipase có thể thay
thế các phương pháp hóa học trong việc chuyển đổi lipid, giúp giảm tác động tiêu cực
đến môi trường.

Vấn đề đầu tiên đối mặt trong quy trình nuôi cấy lỏng là điều kiện nuôi cấy lý tưởng. Vi
khuẩn Bacillus subtilis cần một môi trường nuôi cấy hoàn hảo, bao gồm thành phần chính
xác của chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH và các yếu tố khác. Việc điều chỉnh các yếu tố này
để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và sản xuất enzyme lipase là một thách thức lớn. Đồng
thời, quy trình nuôi cấy cần được tối ưu hóa để đạt được năng suất ổn định và cao, đồng
thời giảm chi phí hợp lý.

Vấn đề thứ hai liên quan đến phương pháp thu nhận enzyme lipase từ Bacillus subtilis.
Hiện nay, các phương pháp thu nhận enzyme lipase từ nuôi cấy lỏng gặp nhiều khó khăn.
Quá trình tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác của việc nuôi cấy là một thách
thức lớn, đòi hỏi các kỹ thuật tách cao cấp và độ tinh khiết cao. Ngoài ra, quy trình thu
nhận cần đảm bảo hiệu quả cao, tiết kiệm thời gian và đáp ứng nhu cầu sản xuất hàng loạt
lớn.
Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển một quy trình nuôi cấy lỏng và thu nhận enzyme
lipase từ Bacillus subtilis với năng suất 200 tấn/năm là cần thiết. Mục tiêu của nghiên cứu
là nâng cao hiệu quả nuôi cấy và giảm chi phí sản xuất, tạo ra một phương pháp thu nhận
enzyme lipase hiệu quả, đảm bảo độ tinh khiết và năng suất cao. Kết quả của nghiên cứu
này sẽ có thể đóng góp vào phát triển ngành công nghiệp enzyme lipase và đáp ứng nhu
cầu thị trường ngày càng tăng trong tương lai. Nghiên cứu này có thể đóng góp vào phát
triển công nghiệp enzyme và giúp tạo ra sản phẩm có giá trị thương mại và sử dụng
enzyme lipase thay thế các phương pháp hóa học có thể giảm tác động tiêu cực đến môi
trường.

Vì thế, chúng tôi chọn đề tài: "Thiết kể quy trình nuôi cấy lỏng thu nhận enzyme
lipase từ Bacillus subtilis với năng suất 200 tấn/năm"
 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
1.1 Sơ lược về enzyme lipase
1.1.1 Khái niệm enzyme lipase
Enzym lipase là một enzym do tụy sản xuất, giúp chuyển hóa mỡ và triglycerid thành
glycerol và acid béo. Bình thường, tuyến tụy chỉ sản xuất đủ lượng enzyme lipase để tiêu
hóa thức ăn, lipase hiện diện trong máu với nồng độ thấp.

Lipase (EC 3.1.1.3) được gọi là triacylglycerol acylhydrolase hoạt động trên các liên kết
este carboxylic là một phần của họ hydrolase. Triglyceride được thủy phân thành
diglyceride, monoglyceride, axit béo và glycerol bằng cách sử dụng lipase tự nhiên.
Ngoài lipase, các liên kết este cacboxylic có thể bị thủy phân bởi các este và lipase.

Hình 1. 1: Enzym lipase

 Hình 1. 2: Phản úng thủy phân triacylgycerol thành glycerol và các acid béo
1.1.2 Cấu trúc enzyme lipase
Lipase được đặc trưng là hydrolase serine trong đó Ser xúc tác được tìm thấy trong một
trình tự liên ứng (Gly-X1-Ser-X2-Gly), trình tự này có thể có các biến thể, cùng với
nguồn gốc sinh học của enzyme, sẽ xác định sự phân loại. Chất xúc tác Ser là một phần
của bộ ba axit amin cùng với gốc His và Asp (hoặc Glam), được gọi là bộ ba xúc tác.
Trong cấu trúc sơ cấp, Ser này nằm gần đầu N hơn, trong khi His thường nằm gần đầu C.

Về mặt cấu trúc thứ cấp, trình tự liên ứng cùng với bộ ba xúc tác được chứa trong nếp
gấp α/β hydrolase: bao gồm một tấm beta trung tâm bao gồm tám chuỗi beta song song (1
đến 8) được kết nối bởi tối đa sáu chuỗi xoắn alpha (A–F). Nhìn chung, trong nếp gấp
này, Ser nằm ở đầu C của chuỗi β5 (trong pentapeptide đồng thuận) được đặc trưng bởi
mô típ beta-turn-alpha(αC) được gọi là “khuỷu tay nucleophilic”. Gần khuỷu tay này có
các thành phần khác của bộ ba: Asp (hoặc Glam) giữa αE và β8, là một phần của vòng lặp
dài độc lập, trong khi His thường nằm giữa αF và β8 như một phần của vòng lặp dài.

Trong quá trình kích hoạt, cấu trúc “nắp” này sẽ bị di dời, điều này mở ra các “túi ràng
buộc”, và vị trí hoạt động sẽ trở nên dễ tiếp cận với cơ chất.
 Hình 1. 3:Cấu trúc phân tử
1.1.3 Tính chất enzyme lipase
Lipase nằm trong khoảng 19–60 kDa và được báo cáo là protein đơn phân. Vị trí của axit
béo trong khung glycerol, độ dài chuỗi của axit béo và mức độ không bão hòa. Các giá trị
cảm quan và dinh dưỡng của chất béo trung tính nhất định cũng bị ảnh hưởng bởi những
đặc điểm. Một số lipase xúc tác một số phản ứng hữu ích như quá trình este hóa do hoạt
tính của chúng trong dung môi hữu cơ.

Lipase thể hiện hoạt động phụ thuộc vào độ pH, thường ở pH trung tính 7,0 hoặc lên đến
pH 4,0 và 8,0 lipase ổn định, Chromobacter viscosum, A. niger và Rhizophus sp., được
tạo ra, lipase ngoại bào hoạt động ở pH axit, và P. nitroaeducens tạo ra lipase kiềm và
hoạt động ở pH 11,0. Trong những điều kiện thí nghiệm nhất định, lipase có khả năng đảo
ngược các phản ứng dẫn đến quá trình este hóa và este hóa khi không có nước.

Để biểu hiện hoạt động lipase, các đồng yếu tố là không cần thiết nhưng canxi là cation
hóa trị hai kích thích hoạt động. Co, Ni 2+, Hg 2+ và Sn 2+ ức chế mạnh hoạt động lipase
và Zn 2+, Mg 2+, EDTA và SDS bị ức chế nhẹ. Theo vùng đặc hiệu lipase được chia
thành hai nhóm với chất nền acyl glycerol. Nếu không thể hiện đặc tính vùng, chỉ các axit
béo được thải ra từ cả ba vị trí của glycerol trong nhóm lipase đầu tiên. Các axit béo đặc
biệt được thải ra từ vị trí 1, 3 của acylglycerol trong nhóm lipase thứ hai. Triacylglycerol
bị thủy phân bởi lipase và tạo thành 2-monoacylglycerol và axit béo tự do 1, 2-(2, 3)-
diacylglycerol.

1.1.4 Cơ chế xúc tác

Hình 1. 4: Cơ chế xúc tác của lipase (Jaeger et al.,1999)

Các cơ chế xúc tác liên quan đến lipase của vi sinh vật dựa trên bộ ba xúc tác rất giống
với các cơ chế được xác định trong hydrolase serine (Schreck và Grunden, 2014). Cơ chế
xúc tác của lipase có thể được chia thành bốn bước, như trong Hình 1.4: (a) ở bộ ba xúc
tác, dư lượng histidine loại bỏ hydro trên nhóm hydroxyl serine, tạo ra phân tử oxy tích
điện âm có thể trải qua tương tác ái nhân với cacbonyl cacbon tích điện dương, dẫn đến
sự hình thành liên kết cộng hóa trị, tiếp theo là (b) vùng ái điện tử lipase (tức là lỗ anion
oxy) được hình thành, tiếp theo là trạng thái chuyển tiếp tứ diện enzyme-cơ chất ổn định,
tiếp theo là (c) sau đó liên kết este bị phá vỡ, dẫn đến giải phóng rượu axit béo, hình
thành phức chất trung gian cộng hóa trị acyl. cuối cùng (d) các liên kết tạm thời giữa
serine và cơ chất sau đó bị phá vỡ, dẫn đến giải phóng cơ chất acyl.

1.1.5 Nguồn thu nhận enzyme lipase

Lipase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn như động vật, thực vật và vi sinh vật

+ Động vật: lipase từ tuyến tụy của gia súc, bò lợn… tụy lợn chứa trypsin, tạo ra amino
axit vị đắng và chứa nhiều virus động vật, hoocmon…

+ Thực vật: lipase được tìm thấy ở mô dự trữ của các hạt có dầu như: hạt đậu nành, đậu
phộng, hạt hướng dương, hạt của các cây cải dầu, dừa, hạnh nhân, các lipase được hình
thành trong quá trình nảy hạt.

+ Vi sinh vật: Lipase có thể được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn.
Một số loài nấm mốc có khả năng sinh enzyme lipase như: Rhizopus sp.,
Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Fusarium sp.,... Đối với nấm men có:
Candida sp., Yarrowia sp., Saccharomyces sp.,...Vi khuẩn có khả năng tổng hợp
lipase gồm: Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp.,...
và xạ khuẩn có Streptomyces sp.

1.1.6 Ứng dụng của enzyme lipase

+ Trong sản xuất phô mai: Chất béo sữa tạo ra axit béo tự do thông qua hoạt động của
lipase, có thể được sử dụng trong nhiều sản phẩm từ sữa, đặc biệt là các loại phô mai
mềm có hương vị đặc trưng.

+ Trong sản xuất bánh mì: việc sử dụng lipase có thể kéo dài thời hạn sử dụng, kiểm soát
quá trình hóa nâu không do enzyme, tăng thể tích bánh mì và cải thiện cấu trúc của bánh
mì.

+ Trong ngành dầu mỡ: Lipase có thể thay đổi tính chất của lipid bằng cách thay đổi vị trí
của axit béo hoặc thay thế một (hoặc nhiều) axit béo. Quá trình transester hóa xúc tác của
lipase trong dung dịch hữu cơ có nhiều ứng dụng: mô phỏng chất béo sữa mẹ trong sữa
bột dành cho trẻ sơ sinh, sản xuất một số axit béo không bão hòa đa quan trọng, lipid có
hàm lượng calo thấp, sản xuất dầu diesel sinh học từ dầu thực vật. Ngoài ra, lipase còn
được sử dụng trong sản xuất dầu ngô, dầu hướng dương, dầu đậu phộng, dầu ôliu và dầu
đậu nành.

+ Trong công nghiệp sản xuất giấy, nhựa thông và các thành phần kỵ nước của gỗ (chủ
yếu là triglyceride và sáp) là vấn đề nghiêm trọng trong quá trình sản xuất giấy và bột
giấy bổ sung vào để loại bỏ nhựa thông ra khỏi nguyên liệu hoặc kiểm soát nó ở mức thấp
nhất và xúc tác thủy phân triglyceride của gỗ đạt hiệu suất đến 90%.

+ Trong nuôi trồng thủy sản: là hệ enzyme thuộc nhóm hydrolase với tác dụng chính là
thủy phân các liên kết este và xuất ra thành phẩm cuối cùng gồm các axit béo kèm theo
glycerol. Nhờ có enzyme này mà các vật nuôi thủy sản có thể dễ dàng hấp thu được các
chất béo trong môi trường nuôi lẫn thức ăn.

+ Trong y học: enzym lipase giúp chuyển đổi mỡ và triglycerid trong cơ thể thành các
acid béo và glycerol. Thận là nơi lọc enzym lipase và các ống lượn gần tái hấp thu hoàn
toàn enzym này. Enzym này được vận chuyển qua các ống tụy vào tá tràng sau đó thực
hiện chức năng chuyển đổi chất béo trung tính trong cơ thể thành các acid béo.

1.2 Giới thiệu về Bacillus subtilis

1.2.1 Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg và tên
của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtili”. Gần 30 năm sau, Casimir Davaine
đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridiu”.

Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là
Bacillus subtilis. B. Loại vi khuẩn mới được xác định này được phân loại điều quan
trọng là bacteriocin thô của loài Bacillus subtilis này có thể ức chế sự phát triển của
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus và Salmonella.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của
Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu
ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của
Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế
giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng
phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các
chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy.
Bộ gen của Bacillus subtilis
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus subtilis và
lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ
4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là
thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào.

- Phân loại khoa học

Bảng 1. 1: Phân loại theo Bergey

Giới (Kingdom) Bacteria

Ngành (Phylum) Bacillota
Lớp (Class) Bacilli
Bộ (Order) Bacillales
Họ (Family) Bacillaceae
Giống (Genus) Bacillus
Loài (Species) Subtilis

1.2.2 Đặc điểm phân bố

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Chúng
phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ, cỏ khô,
nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”. Thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107
triệu CFU/g, đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì rất hiếm. Ngoài ra,
chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì, bột gạo, trong các thực
phẩm như mắm, tương, chao...

1.2.3 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 –
0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 –
12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ
0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng
acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có những
chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200 – 300 năm.

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa

– Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose và arabinose.

– Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+),
casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

Hình 1. 5: Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.2.5 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển
được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:

+ Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng
cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo,
màu hơi nâu.

+ Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi
trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.

+ Trên môi trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan
rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4cm sau 72 giờ nuôi cấy.

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi
lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như
glucose) và nitơ (như peptone).
 CHƯƠNG 2: LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

2.1 Lựa chọn công nghệ

2.1.1 Phương pháp lọc
 Lọc khung bản

Cấu tạo:

Máy lọc ép khung bản là một thiết bị làm việc theo nguyên tắc nén áp suất. Thiết bị lọc
gồm 2 phần chính, phần thứ nhất là bộ phận lọc và phần thứ 2 là bộ phận bơm để hút và
nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc.

Phần thứ nhất của thiết bị lọc bao gồm các khung và các tấm lọc (tấm vải lọc khung
bản) được ép lại với nhau nhờ một đĩa quay bằng tay. Số tấm lọc sử dụng tối đa có thể
đến 50 – 100 tấm. Tấm vải lọc khung bản hay còn gọi là vải lọc khung bản này được làm
bằng vật liệu polypropylene (PP), có độ bền, khả năng chịu trong môi trường hóa chất
cao.

Phần thứ hai là bộ phận hút và nén dung dịch lọc gồm bơm nén áp suất cao và hai thùng
chứa bằng thép không rỉ. Mỗi thùng có dung tích 200 lít, có chỉ thị mức dung dịch trong
thùng. Một thùng đựng dung dịch đục (hỗn hợp lọc), một thùng đựng dịch lọc (Filtrat).
Ngoài ra, còn có thùng thứ 3 cũng được nối với máy dùng để chứa hỗn hợp nước và
diatomit, chất này nhằm phủ lên màng lọc một lớp màng cho chất lỏng đi qua được dễ
dàng.
Nguyên lý hoạt động:
Đây là thiết bị lọc áp lực làm việc gián đoạn nghĩa là nhập liệu vào liêu tục, nước lọc tháo
ra liên tục nhưng bã được tháo ra chu kì.

Nó được cấu tạo chủ yếu là khung và bản. Khung giữ vai trò chứa bã lọc và là nơi nhập
huyền phù vào. Bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nước lọc hoặc là các lỗ lọc. Khung
và bản thường được chế tạo dạng hình vuông và phải có sự bịt kín tốt khi ghép khung và
bản. Khung và bản được xếp liên tiếp nhau trên giá đỡ. Giữa khung và bản là vách ngăn
lọc. Ép chặt khung và bản nhờ cơ cấu đai vít xoắn nhờ tay quay. Lỗ dẫn huyền phù nhập
liệu của khung và bản được nối liền tạo thành ống dẫn nhô ra để ghép với hệ thống cấp
liệu. Nước lọc chảy ra từ bản qua hệ thống đường ống và lấy ra ngoài. Bã được giữ lại
trên bề mặt vách ngăn lọc và được chứa trong khung. Khi bã trong khung đầy thì dừng
quá trình lọc để tiến hành rửa và tháo bã.Trong quá trình lọc, chất rắn trong huyền phù
được giữ lại nhờ một lớp vật liệu lọc (vải lọc bùn khung bản).

Màng lọc hoạt động trên cơ chế chuyển động của các phần tử nước nhờ lực nén của máy
bơm tạo ra một dòng chảy mạnh. Trong khi đó, các phần tử cần lọc sẽ lọt qua mạng lọc
với kích cỡ trung bình 0.001µm nhờ áp lực, với kích thước này thì các thành phần như
sinh khối, kim loại…sẽ không qua được.

 Lọc màng
Cấu tạo:

Máy lọc màng làm việc ở áp suất dư gồm có thân hình trụ, bên trong đặt các tấm hình
chữ nhật được gắn chặt vào nắp. Nắp và tấm có thể di động được nhờ hai con lăn chạy
trên hai đường ray đặt ở bên trong thân hình trụ. Mỗi tấm có ống tháo và van để tháo
nước lọc. Có cửa huyền phù vào, cửa đẩy không khí.

Ngoài ra còn có thiết bị lọc màng làm việc ở áp suất chân không. Loại này dùng để lọc
huyền phù có độ pha rắn nhỏ. Cấu tạo gồm nhiều tấm lọc lắp trên một khung, bể chứa
huyền phù, bể rửa, bể tháo bã có vít tải để tháo bã. Toàn bộ khung lọc treo trên con chạy.

Nguyên lý làm việc:

Máy lọc tấm làm việc ở áp suất dư:

Huyền phù được hay nhờ không khí nén đưa vào thiết bị qua ống, không khí trong
thùng bị đẩy qua cửa qua van tự động.

Khi thùng chứa đầy huyền phù thì van tự động đóng lại, trong thùng có áp suất dư,
dưới tác dụng của áp suất chất lỏng chảy qua vách lọc, theo ống tháo ra ngoài. Khi lớp bã
đạt đến chiều dài yêu cầu người ta dùng không khí nén đẩy huyền phù dư ra ngoài, dùng
nước rửa hay không khí để tách bả.
Máy lọc tấm làm việc ở áp suất chân không:

Khi nhúng vào bể huyền phù khung được hút chân không, nước trong qua vải lọc,
đi vào phía trong khung rồi theo đường ống dẫn đến bộ phận chứa, còn bã bám trên vãi
và đạt đến bề dày cần thiết (khoảng 5 đến 33mm), khung được đưa sang bể rửa nhưng
vẫn tiếp tục hút chân không. Sau khi rửa xong chuyển khung sang ể để tháo bã bằng
không khí hoặc chất lỏng.
Lọc khung bản Lọc bằng màng

Ưu điểm Bề mặt lọc trên một đơn vị diện tích Tốn ít nước rửa
sản xuất lớn. Vải lọc ít bị hao mòn
Động lực quá trình lọc (hiệu số áp suất) Năng suất cao
lớn.
Có thể kiểm tra quy trình làm việc
được.
Có thể ngừng không cho một vài bản
làm việc (khi thấy nước lọc chảy ra qua
van của bản nào bị đục thì ta đóng van
đó lại).

Nhược Thao tác bằng tay nhiều Giá thành thiết bị cao
điểm Rửa bã chưa thật tốt Khó kiểm tra bề dày bã

Vải lọc nhanh bị rách Khó thay vải lọc.

 Từ các đặc điểm của các máy lọc sử dụng máy lọc khung bản có bột trợ lọc là tốt
nhất.

2.1.2 Phương pháp ly tâm

 Ly tâm là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng (ρ) khác nhau,
thường tách các pha rắn ra khỏi pha lỏng khi nồng độ pha rắn lớn nhờ lực ly tâm. Vật liệu
đưa vào quá trình là một hỗn hợp không đồng nhất. Trong công nghiệp chủ yếu là hỗn
hợp rắn -lỏng, hoặc lỏng-lỏng có khối lượng riêng khác nhau. Vật liệu đưa vào ly tâm
phải dễ phân ly, có khả năng tách khỏi nhau, tính keo và độ nhớt của dung dịch không
quá lớn, pha rắn ở dạng to và chắc. Sản phẩm sau quá trình là chất rắn có độ tinh khiết
cao nhưng còn ẩm. Các chất lỏng có khối lương riêng khác nhau.

Sau quá trình ly tâm hỗn hợp được tách biệt chủ yếu là thay đổi trạng thái, không
có biến đổi hóa học, hóa lý, hóa sinh đáng kể. Tuy nhiên chất lượng của sản phẩm được
tăng lên tách được các tạp chất hòa tan không phải dạng tinh thể, đặc biệt là các chất
màu, nên sau khi ly tâm sản phẩm sẽ sạch hơn, chất lượng được nâng cao.

Trong công nghiệp, phương pháp ly tâm liên tục thường được ứng dụng khá rộng
rãi, có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục và không gây ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme. Phương pháp ly tâm liên tục để thu nhận dung dịch này
chứa các enzyme ngoại bào, còn zyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật muốn thu nhận
ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.

Cấu tạo thiết bị ly tâm dạng đĩa gồm có thùng quay, bên trong có gắn hình nón cụt.
Dòng chất lỏng đi vào đi qua đường ống xuống phần dưới của thùng rồi qua lỗ ở các đĩa
phân thành lớp mỏng. Chất rắn (protein tủa) trong chất lỏng theo lực ly tâm sẽ lắng xuống
đáy đĩa và được đưa ra ngoài để thực hiện quá trình sau, phần chất lỏng phía trên được
tháo bỏ ra ngoài theo ống dẫn.

2.1.3 Phương pháp sấy

Sấy là một trong những công đoạn cuối cùng trong quá trình sản xuất, giúp giảm
độ ẩm của chế phẩm enzyme, dễ dàng hơn trong việc bảo quản và vận chuyển. Các sản
phẩm có hoạt tính sinh học như enzyme, sinh khối vi sinh vật... đòi hỏi phương pháp sấy
phức tạp hơn. Việc lựa chọn phương pháp sấy phù hợp với sản đặc tính sản phẩm và có
tính kinh tế cần được quan tâm (Lê Văn Hoàng, 2004).
 Sấy phun và sấy thăng hoa là hai phương pháp được áp dụng đối với chế phẩm
enzyme, mỗi dạng đều có ưu và nhược điểm khác nhau, việc lựa chọn thiết bị phù hợp
phụ thuộc vào tính chất sản phẩm, chất lượng sản phẩm yêu cầu và tính kinh tế.

Sấy thăng hoa là quá trình tách ẩm từ các sản phẩm bằng phương pháp lạnh đông
và tiếp theo là chuyển đá làm lạnh đông được tạo thành trong sản phẩm thành hơi. Tốc độ
lạnh đông của các sản phẩm phải được xác định bằng thực nghiệm vì các vật liệu có độ
ẩm khác nhau. Quá trình thăng hoa xảy ra ở những giá trị áp suất hơi trên bề mặt vật liệu
và giá trị nhiệt độ trong các điểm nằm ở dưới điểm ba cân bằng pha của dung môi. Năng
suất của thiết bị thăng hoa tác động liên tục tính theo độ ẩm bốc hơi lớn hơn 200 kg/h.
Thời gian có mặt của sản phẩm trong máy từ 40 đến 110 phút, nhiệt độ cáo nhất của sản
phẩm lúc cuối quá trình sấy nhỏ hơn 27oC. Ta thấy một số ưu điểm như nhiệt độ sấy thấp,
chất lượng sản phẩm sấy được bảo toàn. Tuy nhiên phải duy trì áp suất chân không, tốc
độ sấy chậm, chi phí cho thiết bị cao (Lê Văn Hoàng, 2004).

Chú thích:

1 Phòng sấy 7 Bộ trao đổi nhiệt

2 Giàn ống rỗng 8 Bơm chân không
3 Bộ trao đổi nhiệt 9 Thiết bị làm lạnh
 4 Thiết bị làm lạnh 10 Bộ ngưng tụ
5 Bơm 11 Các ống
6 Bơm

Sấy phun được sử dụng khi nguyên liệu ở dạng lỏng hoặc huyền phù, còn sản phẩm
thu được ở dạng bột. Hiện nay phương pháp sấy phun rất phổ biến trong các ngành công
nghiệp. Nguyên tắc sấy phun gồm có 3 giai đoạn: giai đoạn 1 chuyển nguyên liệu cần sấy
thành dạng sương mù (các hạt lỏng phân tán trong môi trường khí); giai đoạn 2 hòa trộn
sương mù với dòng tác nhân sấy trong buồng sấy, đây là giai đoạn tách ẩm ra khỏi
nguyên liệu, nguyên liệu được phun sương nên diện tích tiếp xúc của các giọt lỏng và tác
nhân sấy rất lớn, nhờ đó ẩm trong nguyên liệu bay hơi nhanh chóng, sản phẩm tạo thành
bột mịn, thời gian tách ẩm diễn ra trong vòng vài giây đến vài chục giây; giai đoạn 3 là
tách sản phẩm ra khỏi dòng tác nhân sấy thường dùng cyclone. HIệu suất thu hồi sản
phẩm trong thiết bị sấy phun giao động 90-98% (Lê Văn Việt Mẫn, 2011).

Ưu điểm của máy sấy phun là thời gian sấy ngắn, nhiệt độ của vật liệu sấy thấp, sản
phẩm ở dạng bột nhỏ không cần phải nghiền lại và có độ hòa tan lớn. Ngược lại máy sấy
phun cũng có những nhược điểm như kích thước phòng sấy tương đối lớn, cơ cấu thiết bị
phức tạp (Lê Văn Hoàng, 2004).

1 Buồng sấy 5 Cơ cấu phun sương

 2 Caloriphe 6 Cyclone thu hồi sản phẩm
3 Bồn chứa nguyên liệu cần sấy 7 Cyclone thu hồi sản phẩm
4 Bơm nhập liệu 8 Quạt hút

Theo nghiên cứu của (Alloue et al., 2007) cho thấy hiệu quả tuyệt vời của phương
pháp sấy phun với sự kết hợp các chất trợ sấy maltodextrin, gum arabic, CaCl 2 có hiệu
suất giữ hoạt tính lipase lên đến 143% với thành phần tương ứng (12%, 6%, 1%). Ion Ca
2+
là chất kích thích hoạt tính của lipase, nó làm giảm điện tích của các giọt chất béo và
loại bỏ axit béo hình thành trong quá trình thủy phân triglycerides. Do vậy sự hiện diện
của canxi làm tăng khả năng chịu nhiệt hoặc hoạt tính xúc tác của một số lipase.
Maltodextrin và gum arabic tạo một lớp phủ để bảo vệ bề mặt của sản phẩm khỏi quá
trình oxy hóa trong khi sấy.

Trong quá trình sản xuất bột khô enzyme lipase phải đảm bảo được hoạt tính của
enzyme cao nhất là yếu tố quan trọng, được đặt lên hàng đầu. Bên cạnh đó yếu tố kinh tế
cũng được quan tâm không kém khi lựa chọn phương pháp. Và sau khi so sánh cũng như
phân tích các yếu tố chúng tôi nhận thấy rằng phương pháp sấy phun có bổ sung 12%
maltodextrin, 6% gum arabic và 1% CaCl 2 là phương pháp sấy tối ưu nhất để sản xuất bột
enzyme lipase.

2.2 Lựa chọn nguồn nuôi cấy Bacillus subtilis

2.2.1 Nguồn cacbon
Nguồn carbon có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi
sinh vật, đóng vai trò là một nguồn dinh dưỡng, đồng thời còn là nguồn năng lượng cho
vi sinh vật. Theo (Mohammed Al Mohaini và cộng sự, 25/2/2022) đã công bố rằng khi
nuôi cấy chủng Bacillus.sp với các nguồn cacbon và chất hoạt động bề mặt khác nhau sẽ
cho ra kết quả khác nhau. Chẳng hạn như: Dầu ô liu được sử dụng làm nguồn cung cấp
cacbon có hoạt tính lipase cao nhất so với dầu hướng dương và dầu ăn thải.
 Có nhiều nguồn carbon để sử dụng nhưng do các yếu tố về lợi nhuận kinh tế, giá
thành nguyên liệu rẻ nên phụ phẩm nông nghiệp là sự lựa phù hợp trong quy mô công
nghiệp. Mật rỉ đường là nguồn nguyên liệu dồi dào và sẵn có nên nếu có thể tận dụng
được thì chi phí sẽ giảm đáng kể, đây là một nguyên liệu lí tưởng. Mật rỉ đường còn gọi
là rỉ đường, phụ phẩm trong quá trình sản xuất đường hoặc củ cải đường. Mật rỉ đường là
chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô đặc và kết tinh.

Thành phần Tỉ lệ (%)

Nước 18-30

Saccharose 40

Glucose và fructose 20

Hợp chất hữu cơ 30-32

Hợp chất vô cơ 6-10

Không những thế, mật rỉ đường còn chứa một số vitamin như:

Vitamin Số lượng (μg/g)

Thiamin 8.3

Riboflavin 2.5

Acid nicotinic 21

Biotin 0.038

Acid pentotenic 21.4

2.2.2 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ là thành phần quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hóa năng
lượng và cấu tạo nên vật chất trong tế bào như acid nucleic, protein, enzyme. Nguồn nitơ
tồn tại ở dạng vô cơ và hữu cơ, nguồn nitơ hữu cơ tồn tại ở dạng phức tạp vi sinh vật cần
chuyển về dạng đơn giản để dễ hấp thụ và sử dụng hiệu quả nguồn cơ chất. Nguồn nitơ vi
sinh vật thường sử dụng như muối nitrat, protein, ure, pepton... ngoài ra vi sinh vật có thể
sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp để làm nguồn nitơ như bã mía, bã dừa, bã đậu
nành...Theo (Cihangir & Sarikaya, 2004) muối, ure và protein là nguồn nitơ có khoảng
1% trong môi trường bổ sung với 1% dầu oliu. Kinsoula và Liakopoulou-Kyriakides
(2007) cho rằng tryptone là nguồn nitơ kích thích sinh tổng hợp amylase của chủng
Bacillus. sp.

2.2.3 Nguồn khoáng và các yếu tố khác

Khoáng là thành phần không thể thiếu trong quá trình phát triển của vi sinh vật
chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô của tế bào. Khoáng thường được bổ sung ở dạng
muối sunphat, cacbonat, clorua...và trong tế bào vi sinh vật tồn tại ở dang ion như Na +,
Mg2+, K+, Ca2+ hoặc Cl-, HCO3-, (HPO4)2-...

Hàm lượng chất khoáng sẽ thay đổi vào từng giai đoạn phát triển của vi sinh vật
và môi trường nuôi cấy. Khi môi trường bổ sung chất khoáng sẽ giúp vi sinh vật phát
triển tốt hơn, đặc biệt phospho có vai trò quan trọng là chất đệm cho môi trường.

Ngoài ra, các chất khoáng sẽ tồn tại trong các chế phẩm được sử dụng làm cơ chất
như bã mía, bã dừa, bã đậu nành, mật rỉ đường... Khi sử dụng các cơ chất đó thì lượng
khoáng cần bổ sung vào môi trường sẽ giảm đi đáng kể.

Môi trường nuôi cấy

B. subtilis có nguồn carbon và nito đa dạng nên sẽ có rất nhiều môi trường nuôi
cấy có thể sử dụng như PGA, PDA, Czapek Dox, mật rỉ đường, bã mía... Để lựa chọn
môi trường cấy B. subtilis ở quy mô công nghiệp cần đảm bảo giá thành rẻ, dễ tìm, hiệu
suất thu hồi cao,...

2.3 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

 Hiện nay có 3 phương pháp dùng để nuôi cấy vi sinh vật gồm phương pháp nuôi
cấy gián đoạn, phương pháp nuôi cấy liên tục bổ sung cơ chất và phương pháp nuôi cấy
liên tục.

Trong 3 phương pháp này đều có ưu và nhược điểm riêng, nhưng phương pháp
nuôi cấy liên tục có những ưu điểm như hiệu suất sinh khối cao nhất, rút ngắn được thời
gian lên men, giảm bớt được thể tích của toàn bộ thiết bị, thao tác đơn giản và thực hiện
quá trình tự động hóa, giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị khử khuẩn và làm nguội,
mật độ tế bào được tạo ra cao do khả năng phục hồi và tái sử dụng tế bào. Ngoài ra,
phương pháp lên men liên tục có những hạn chế như cần điều kiện vô trùng tuyệt đối vì
trong quá trình nuôi liên tục đã tạo ra môi trường tối ưu cho chủng nuôi cấy nhưng các vi
khuẩn khác có điều kiện tương tự sẽ nhiễm vào, dễ bị nhiễm khuẩn và khó xử lí, cần nhân
viên chuyên nghiệp có tay nghề cao để vận hành thiết bị, cần nhiều nguồn năng lượng
cho quá trình vận hành và chi phí thiết bị cao cho tự động hóa.

Còn đối với phương pháp nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất hiệu suất thu hồi
sinh khối sẽ ít hơn phương pháp nuôi cấy liên tục. Tuy nhiên phương pháp này có nguy
cơ ngoại nhiễm rất cao trong giai đoạn bổ sung cơ chất vào môi trường. Vì vậy đối với
phương pháp này cần đội ngũ nhân viên có tay nghề cao và đảm bảo điều kiện vô trùng
tiệt đối ở các giai đoạn. Đối với phương pháp này cần chi phí cao cho các trang thiết bị và
vận hành thiết bị.

Đối với phương pháp nuôi cấy gián đoạn thì hiệu suất thu hồi thấp hơn 2 phương
pháp còn lại. Tuy nhiên phương pháp này đơn giản dễ vận hành và chi phí cho thiết bị
thấp, vi sinh vật không bi ức chế bởi nồng độ môi trường cao, phù hợp với quy mô công
nghiệp mà không cần yêu cầu kỹ thuật quá cao. (Lê Văn Hoàng, 2004)

Lựa chọn phương pháp nuôi cấy ở quy mô công nghiệp phải đáp ứng các yếu tố về
chi phí đầu tư trang thiết bị thấp, yêu cầu về trình độ nhân viên không quá cao, thiết bị
đơn giản dễ vận hành và dễ khắc phục khi sự cố xảy ra...Từ đó, phương pháp nuôi cấy B.
subtillis phù hợp ở quy mô công nghiệp là nuôi cấy gián đoạn.
 Để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp được ưu tiên
hàng đầu để sản xuất một enzyme như lipase. Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn
(SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể được sử dụng để sản xuất enzyme này. Nhưng ở
quy mô công nhiệp cần phải xác định hình thức nuôi cấy nào phù hợp.

Theo (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007) trong phương pháp nuôi bề mặt, các vi sinh vật
được cấy trực tiếp trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng. Đối với môi trường rắn thì trước
khi nuôi cấy vi sinh vật, cần phải được làm ẩm. Các vi sinh sẽ sử dụng những chất dinh
dưỡng trong môi trường và oxy của không khí để hô hấp, sinh trưởng và phát triển. Nhằm
giúp cho các vi sinh vật phân tán đều trên bề mặt môi trường và có thể sử dụng được
nhiều chất dinh dưỡng sinh ra enzyme, những lớp môi trường rắn cần phải mỏng (chỉ dày
khoảng 2-5 cm), do đó chúng tiếp xúc trực tiếp với không khí nên được cung cấp đầy đủ
oxy.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn với mục đích sản xuất enzyme
thích hợp cho một số loại nấm mốc và vi khuẩn, một vài trường hợp thì có thể dùng môi
trường lỏng. Quá trình nuôi cấy thường được tiến hành trên các khay phẳng, xếp chồng
lên nhau và ủ trong các buồng chứa vô trùng kín, giống vi sinh vật được cấy vào bằng
cách thổi bào tử vào bên trong buồng chứa. Môi trường rắn thường dùng các nguyên liệu
tự nhiên như cám, gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô… hoặc cũng
có thể sử dụng hỗn hợp những nguyên liệu này. Môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch
thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… đồng thời còn có pha thêm muối khoáng.
(Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)

Để đảm bảo các chất dinh dưỡng trong môi trường được đầy đủ, người ta có thể bổ
sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trưởng (nước khoai tây…). Độ ẩm thích hợp
để nuôi cấy bề mặt trên khay hở đối với nhiều chủng nấm mốc là 58-60%. Tuy nhiên, vi
khuẩn dễ phát triển ở độ ẩm 60%, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí. Trường hợp độ ẩm từ
45-50%, môi trường nuôi cấy sẽ khô nhanh, tuy nhiên điều đó dẫn đến việc sinh bào tử
yếu và làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành. Trong thời gian nuôi cấy, nên giữ độ ẩm
của môi trường ở 50- 60%, độ ẩm không khí phòng nuôi cấy ở 90-100%. Tuy rằng, nuôi
cấy bề mặt không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối nhưng môi trường nhân giống cần
được vô trùng để cho giống phát triển bình thường quan trọng, nhất là giai đoạn đầu.
(Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)

Trong sản xuất môi trường rắn cần phải vô trùng ở 1-1,5 atm bằng hơi nóng trong
45- 60 phút. Nếu môi trường trước khi vô trùng được trộn với chlohydric acid hoặc
sulfuric acid đến pH thích hợp, hay thêm một ít formalin hoặc một số chất sát trùng khác
thì chỉ cần vô trùng dưới ở 0,2-0,3 atm. Việc thêm acid và giữ môi trường ở pH nhất định
nhằm giúp cho enzyme được tạo ra nhiều hơn. Môi trường được dàn mỏng ra các khay đã
vô trùng dày khoảng 2- 2,5 cm, để nguội tới 30 oC thì tiến hành cấy giống. Giống được
nhân cũng theo phương pháp bề mặt hoặc bằng bào tử thu được theo phương pháp tách
bào tử khỏi môi trường nhân giống, sau đó chúng được chứa vào các bình nút kín hoặc
trong các túi. (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)

2.4 Phương pháp thu nhận enzyme lipase

Dịch enzyme thô trong canh trường sau khi lên men chứa những thành phần cơ
bản như nước chiếm khối lượng lớn nhất, protein không có hoạt tính sinh học, các tạp
chất từ môi trường nuôi cấy và các loại enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học). Như
vậy để thu được sản phẩm cuối cùng có nồng độ enzyme cần thiết cao thì cần phải loại bỏ
các thành phần khác. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Lipase từ vi sinh vật chủ yếu là
enzyme ngoại bào (RK Saxena, 2003), để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật thường
được sử dụng trong công thức chất tẩy rửa, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa là
chính. Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng trong ngành dược phẩm, thực phẩm và da thì
cần thêm các biện pháp tính sạch khác như sắc ký lọc gel, săc ký trao đổi ion, sắc ký ái
lực,...(Abhishek Kumar Singh, 2012)

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme
trong phòng thi nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp, 80%
công nghệ tinh sạch chế phẩm enzyme sử dụng phương pháp kết tủa, trong đó kết tủa
bằng muối ammonium sulphate chiếm 60%, kết tủa bằng ethanol, acetone hoặc axit
(thường sử dụng HCl) chiếm 35%. (RK Saxena, 2003)
 Phương pháp kết tủa muối dựa trên nguyên tắc là khi bổ sung muối vào dung dịch
enzyme, muối sẽ lôi kéo các phân tử nước chen giữa các phân tử protein, làm chuyển hóa
điện tích và độ hòa tan của enzyme giảm nhanh và protein enzyme có thể kết tủa. Với
mỗi enzyme sẽ có một khoảng nồng độ muối mà protein enzyme đó bị kết tủa hoàn toàn
là không giống nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp
của chúng. (Đặng Thị Thu & Ngô Tiến Hiển, 2004)

Ammonium sulphate khá rẻ và phổ biến, trọng lượng phân tử thấp và độ hòa tan
rất cao, có khả năng giữ hoạt tính cho protein enzyme, tuy nhiên các thiết bị dễ bị ăn mòn
bởi muối. Người ta thường dùng muối ở dạng rắn, hòa tan từ từ vào canh trường cho đến
khi đạt nồng độ 30 – 70%, thực hiện ở nhiệt độ lạnh 4oC. (Da cam Kumar 2012)

Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ như ethanol, acetone, .... Khi cho
dung môi vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm tăng
lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, làm cho các phân tử protein kết hợp lại tạo
thành tủa. Enzyme rất nhảy cảm với nhiệt độ trong dung môi hữu cơ. Tùy tính chất của
từng loại protein enzyme, được tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau. (Đặng Thị
Thu & Ngô Tiến Hiển, 2004)

Nghiên cứu của Kumar et al., 2012 tinh sạch lipase bằng muối Ammonium
sulphate (30 – 70%) từ canh trường nuôi cấy Bacillus sp. DVL43. Và nghiện cứu của
Ameri et al., 2015 tinh sạch lipase bằng muối (0-80%) từ canh trường nuôi cấy Bacillus
atrophaeus FSHM.

Bảng 2. 1: So sánh dung môi dùng để kết tủa enzyme

Ammonium sulphate Ethanol

Hoạt tính trong dung dịch

enzyme thô chưa kết tủa 1,9 1,73
(U/mg)
 Hiệu suất thu hồi enzyme
70 40,12
(%)

Hiệu quả tinh sạch (lần) 11,5 7,12

Thời gian (phút) 60 30

Amonium sulfate Ethanol:

Chi phí hóa chất (NH4)2SO4: 1lit: 20 000 VNĐ
1kg: 4 000 VNĐ

Nhận xét:

Xét về hiệu suất thu hồi: Từ dung dịch enzyme thô của hai nghiên cứu trên có hoạt
tính enzyme gần như nhau, sau khi tiến hành tinh sạch bằng phương pháp kết tủa phân
đoạn với hai hóa chất khác nhau ta thấy được hiệu suất thu hồi cũng như hoạt tính
enzyme sau kết tủa khi sử dụng Ammonium sulphate cao hơn so với ethanol. Mặt khác ta
thấy kết tủa với Ammonium sulphate mất nhiều thời gian hơn, số mẻ thực hiện được sẽ ít
hơn.

Xét về chi phí hóa chất: giá thành của ethanol cao hơn Ammonium sulphate, từ đó
giá thành sản phẩm cũng cao hơn.

Từ những so sánh trên chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa bằng muối
ammonium sulphate để sản xuất lipase

2.5 Quy trình công nghệ

Giống
Bacillus
subtilis Môi trường
 Lên men

Nhân
giống

Lọc màng Loại

cặn

Kết tủa enzyme

Ly tâm

Sấy phun

Enzyme
lipase

2.6 Thuyết minh quy trình

2.6.1 Nguyên liệu
 Nguyên liệu đầu vào là mật rỉ đường phụ phẩm từ ngành công nghiệp đường, phải
đảm bảo nguồn thu mua nguyên liệu ổn định, giá thành hợp lí, có uy tín về chất lượng.

Chuẩn bị môi trường

Mục đích: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis sinh trưởng
và phát triển để thu được nhiều enzyme lipase nhất.

Các thành phần môi trường được phối trộn vào nhau, sau đó đem môi trường vào
thiết bị thanh trùng ở ở t = 121 oC trong 15 phút và làm nguội trực tiếp trong bể lên men
xuống 30 oC.

Bảng 2. 2: Thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis

Thành phần Khối lượng(g/L)
Tryptone 10
Cao nấm men 5
NaCl 5
Nước cất 1

2.6.2 Giống vi sinh vật

Giống sử dụng: chủng Bacillus subtilis tự nhiên mua từ giống công nghiệp.

Mục đích nuôi cấy: Sinh nhiều enzyme lipase trong quá trình lên men.

Lượng giống cấy phải phù hợp với môi trường để tạo sinh khối. Nếu lượng cấy giống ban
đầu quá ít sẽ kéo dài thời gian tạo sinh khối từ đó ảnh hưởng tới hiệu suất tạo ra sản
phẩm. Ngược lại, nếu giống cấy quá nhiều làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống.

2.6.3 Lên men

Mục đích là tạo điều kiện tối ưu cho Bacillus subtillis sinh trưởng và sinh tổng hợp
nhiều enzyme lipase. Sử dụng môi trường nuôi cấy mật rỉ đường lên men chìm và nuôi
cấy gián đoạn theo mẻ (đã phân tích).
 Môi trường nuôi cấy và vi khuẩn sau khi nhân giống đủ số lượng sẽ được chuyển
vào thiết bị lên men chính. Trong bể lên men có lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống
cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH, nhiệt độ để theo dõi các yếu tố ảnh hưởng đến quá
trình lên men nhằm duy trì môi trường tối ưu cho Bacillus subtillis tăng sinh và các sản
phẩm phụ có thể sinh ra gây ức chế vi sinh vật. Bacillus subtillis là sinh vật hiếu khí thì
kiểm soát nồng độ oxy cung cấp là rất cần thiết qua cánh khuấy và thiết bị cấp khí oxy
giúp xáo trộn môi trường để vi sinh vật phân bố đều trong bể, tăng diện tích tiếp xúc cơ
chất-vi sinh vật.

2.6.4 Lọc tách sinh khối

Mục đích: loại bỏ sinh khối khỏi canh trường, sử dụng dịch lọc (có chứa enzyme)
vào các khâu sau.

Thiết bị sử dụng: lọc khung bản

Cấu tạo:

Máy lọc ép khung bản là một thiết bị làm việc theo nguyên tắc nén áp suất. Thiết
bị lọc gồm 2 phần chính, phần thứ nhất là bộ phận lọc và phần thứ 2 là bộ phận bơm để
hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc.

Phần thứ nhất của thiết bị lọc bao gồm các khung và các tấm lọc (tấm vải
lọc khung bản) được ép lại với nhau nhờ một đĩa quay bằng tay. Số tấm lọc sử dụng tối
đa có thể đến 50 – 100 tấm. Tấm vải lọc khung bản hay còn gọi là vải lọc khung bản này
được làm bằng vật liệu polypropylene (PP), có độ bền, khả năng chịu trong môi trường
hóa chất cao.

Phần thứ hai là bộ phận hút và nén dung dịch lọc gồm bơm nén áp suất cao và hai
thùng chứa bằng thép không rỉ. Mỗi thùng có dung tích 200 lít, có chỉ thị mức dung dịch
trong thùng. Một thùng đựng dung dịch đục (hỗn hợp lọc), một thùng đựng dịch lọc
(Filtrat).
 Ngoài ra, còn có thùng thứ 3 cũng được nối với máy dùng để chứa hỗn hợp nước
và diatomit, chất này nhằm phủ lên màng lọc một lớp màng cho chất lỏng đi qua được dễ
dàng.

Nguyên lý hoạt động:

Đây là thiết bị lọc áp lực làm việc gián đoạn nghĩa là nhập liệu vào liêu tục, nước
lọc tháo ra liên tục nhưng bã được tháo ra chu kì.

Nó được cấu tạo chủ yếu là khung và bản. Khung giữ vai trò chứa bã lọc và là nơi
nhập huyền phù vào. Bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nước lọc hoặc là các lỗ lọc.
Khung và bản thường được chế tạo dạng hình vuông và phải có sự bịt kín tốt khi ghép
khung và bản. Khung và bản được xếp liên tiếp nhau trên giá đỡ. Giữa khung và bản là
vách ngăn lọc. Ép chặt khung và bản nhờ cơ cấu đai vít xoắn nhờ tay quay. Lỗ dẫn huyền
phù nhập liệu của khung và bản được nối liền tạo thành ống dẫn nhô ra để ghép với hệ
thống cấp liệu. Nước lọc chảy ra từ bản qua hệ thống đường ống và lấy ra ngoài. Bã được
giữ lại trên bề mặt vách ngăn lọc và được chứa trong khung. Khi bã trong khung đầy thì
dừng quá trình lọc để tiến hành rửa và tháo bã.Trong quá trình lọc, chất rắn trong huyền
phù được giữ lại nhờ một lớp vật liệu lọc (vải lọc bùn khung bản).

Màng lọc hoạt động trên cơ chế chuyển động của các phần tử nước nhờ lực nén
của máy bơm tạo ra một dòng chảy mạnh. Trong khi đó, các phần tử cần lọc sẽ lọt qua
mạng lọc với kích cỡ trung bình 0.001µm nhờ áp lực, với kích thước này thì các thành
phần như sinh khối, kim loại,…sẽ không qua được.

2.6.5 Kết tủa enzyme

Mục đích: Thu nhận enzyme có hoạt tính cao hơn.

Các bước tiến hành: Bổ sung muối ammonium sulphate vào dung dịch enzyme
một cách từ từ, kết hợp với khuấy trộn, quá trình kết tủa thực hiện ở nhiệt độ thấp (4 0C)
để tránh làm mất hoạt tính enzyme cho đến khi đạt nồng độ muối bảo hòa 70% và giữ
trong vòng 5 giờ, thiết bị sử dụng được làm từ thép không rỉ để tránh sự ăn mòn của
muối. (Silvana Menoncin, 2010)
2.6.6 Ly tâm
Mục đích: ly tâm tách riêng tủa protein với nước, loại bỏ nước và thu nhận tủa có
chứa enzyme nồng độ cao.

Enzyme dễ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ quá cao, quá trình ly tâm sẽ sinh ra nhiệt dễ
gây biến tính enzyme. Để đảm bảo hoạt tính cho amylase nên thực hiện ly tâm lạnh ở
nhiệt độ thấp (<5oC).

2.6.7 Sấy
Mục đích: giảm độ ẩm của chế phẩm enzyme, thường độ ẩm sau khi sấy phải dưới
10%. (Lê Văn Hoàng, 2004)

Cách tiến hành: sau khi kết thúc quá trình ly tâm hòa trộn cặn lắng thu được với
12% maltodextrin, 6% gum arabic và 1% CaCl 2, sau đó chuyển hỗ hợp này vào thiết bị
sấy phun liên tục, và thực hiện quá trình sấy ở 160 oC là nhiệt độ đầu vào, nhiệt độ đầu ra
85oC. (Waze Aimée Mireille Alloue, 2007)
 CHƯƠNG 3: CÂN BẰNG VẬT CHẤT

Kế hoạch sản xuất.

Năng suất nhà máy sản xuất enzyme lipase từ Bacillus subtilis là 200 tấn
lipase/năm.

Một năm 365 ngày, trừ các ngày lễ (15 ngày) và thời gian bảo trì máy móc thiết bị
(20 ngày). Số ngày làm việc của công ty trong 1 năm:

Tlàm việc = 365 – (15 + 20) = 330 (ngày) = 7920 giờ

Thời gian nuôi cấy để thu được enzyme lipase cao nhất đối với Bacillus subtilis
48h tại 400C (2 ngày). (Trần Đăng Khoa, Lê Quang Huy, Ngô Đại Nghiệp., 2011).

Thời gian nghỉ giữa các mẻ để vệ sinh thiết bị là 0,5 ngày

 Thời gian của 1 mẻ là 2,5 ngày = 60 giờ

7920
Vậy số mẻ một năm là: = 132 mẻ/năm
60

200
Năng suất của nhà máy là: ≈ 1,5 (tấn/mẻ) = 1500kg/mẻ.
132

Hoạt lực của enzyme lipase trong chế phẩm enzyme thương mại với mức độ tinh sạch
được sử dụng ở các lĩnh vực: 185 IU/mg = 185000 IU/g (Bùi Xuân Đông, Phạm Thị
Mỹ, Huỳnh Văn Anh Thi., 2018).

HLtổng = 185000 × 1500 × 103 = 2,775 × 1011 (UI)

Tính toán câng bằng vật chất cho từng giai đoạn.

Bảng 3. 1: Thống kê hiệu suất của các quá trình

Công đoạn Hiệu suất Tài liệu tham khảo
Sấy 96% (Alya Sellami-Kamoun, et al., 2008)
Ly tâm 95% (Rajiv Datar, 1987)
Kết tủa 95% (King, 1972)
Lọc 97% (Bilad et al., 2013)
Quá trình sấy

Hiệu suất chuyển hóa của quá trình sấy để thu chế phẩm enzyme là 96%. Qua mỗi quá
trình tinh sạch thì hoạt tính enzyme sẽ giảm, để đảm bảo hoạt tính enzyme lipase không
giảm, đã có nghiên cứu bổ sung chất trợ sấy vào quá trình sấy phun để làm tăng hoạt tính
enzyme tăng lên 1,5 lần (Alloue và cộng sự, 2007)

Gđ, Wđ Sấy Gc, Wc

Ghh

Năng suất thực tế của nhà máy khi bước vào quá trình sấy:

Hiệu suất là 96%, hao hụt 4%

Độ ẩm đầu: 80%

Độ ẩm cuối: 5% (Nguyễn Phú Thọ, et al., 2011)

Phương trình cân bằng vật chất:

Gđ (100-Wđ) = Gc (100 - Wc) + 0,04 [Gđ (100-Wđ)]

Gđ (100- 80) = 1500(100 - 5) + 0,04 [Gđ (100-80)]

Gđ = 7421.86 kg/mẻ

Tổng hoạt lực thu được trước quá trình sấy:

100
HL1 = (2,775 × 1011) × 140 = 1,982 × 1011 (UI).

Thể tích canh trường lên men:

Tổng hoạt lực trong sản phẩm
V ¿ ( Tích hiệu suất thu hồi ) x ( Hoạt lực của một đơn vị thể tích canh trường )
 185
V = ( 96 %x95 %x95 %x97 % ) x ( 32 ,2 /1000 ) =6836.37(L)

Quá trình lọc

Gđ Lọc Gc

Ghh

Dựa vào hiệu suất thu hồi là 97%  Tỷ lệ hao hụt là 3%.
Phương trình cân bằng vật chất của lọc
Gđ = Gc + Ghh
Gđ = Gc + 0,03 Gđ
 (1 – 0,03) Gđ = Gc
 Gc = 0,97 x6836.37 = 6631.28 (L)
 Ghh = 205.09 (L)
Giả sử:
Nồng độ sinh khối khi kết thúc quá trình lên men là 15g/L
Hàm lượng nước trong bả lọc là 55%
Nồng độ sinh khối khikết thúc quá trình lênmen x Tổng thể tích lên men
V dịch vi khuẩn =
Hàm lượng chất rắn trong bã lọc
15 x 6836.37
V dịch vi khuẩn = 45 %
=227.879 (L)

Quá trình kết tủa

Độ bão hòa của muối sử dụng để kết tủa là 70%


Quá trình ly tâm
Hiệu suất chuyển hóa của quá trình ly tâm để thu enzyme thô là 95%, tỉ lệ hao hụt là 5%
do quá trình ly tâm không thể tách hoàn toàn nước ra khỏi canh trường. (Rajiv Datar,
1987).

100
M trước lý tâm = 7421.86 x =7812.48 kg /mẻ
95

Tổng hoạt lực thu được trước quá trình sấy:

100
HL2 = (27,75 × 1010) × = 33,43 × 1010 (UI)
83

Quá trình lọc loại bỏ sinh khối

Hiệu suất chuyển hóa của quá trình lọc để thu nhận enzyme là 97% (Bilad et al., 2013)

Tỉ lệ hao hụt trong quá trình lọc: 3%

Năng suất thực tế của nhà máy trước khi bước vào quá trình lọc:

100
Mlọc = 8223.66 × = 8478.00 kg/mẻ = M lên men
97

Hoạt lực enzyme lipase thu được trước khi bước vào quá trình lọc:

100
HL4 = 35,19 × 1010 × = 36,28 × 1010 (UI)
97
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Gopinath, S. C., et al., Strategies to characterize fungal lipases for applications in
medicine and dairy industry. BioMed research international, 2013. 2013: p.

2.Mehta, A., et al., Fungal lipases: a review. Journal of Biotech Research, 2017. 8: p.

3.Alsberg, E., et al., Cell-interactive alginate hydrogels for bone tissue engineering.
Journal of dental research, 2001. 80(11): p. 2025-2029.
4.Carpen A, Bonomi F, Iametti S, Marengo M. Effects of starch addition on the activity
and specificity of food-grade lipases. Biotechnol Appl Biochem. 2019;66(4):607–16.

5.Tong X, Busk PK, Lange L. Characterization of a new sn-1, 3-regioselective

triacylglycerol lipase from Malbranchea cinnamomea. Biotechnol Appl Biochem.
2016;63(4):471–8.

6.Ekinci AP, Dinçer B, Baltaş N, Adıgüzel A. Partial purification, and characterization of

lipase from Geobacillus stearothermophilus AH22. J Enzym Inhibit Med Chem.
2016;31(2):325–31.

7. Gaschler MM, Stockwell BR. Peroxid hóa lipid trong tế bào chết. Biochem Biophys
Res Cộng đồng. 2017;482(3):419–25.

8.Wentao Yao, Kaiquan Liu, Hongling Liu, Yi Jiang, Ruiming Wang, Wei Wangand
Tengfei Wang. A Valuable Product of Microbial CellFactories: Microbial Lipase. 2021

9. Vakhlu, J., Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene
cloning. Electronic Journal of Biotechnology, 2006. 9(1): p. 0-0.

10. Barros, M., et al., Seed lipases: sources, applications and properties-a review.
Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2010. 27(1): p. 15-29.

11. Sharma, R., et al., Production, purification, characterization, and applications of

lipases. Biotechnology advances, 2001. 19(8): p. 627-662.

12. Aravindan, R., et al., Lipase applications in food industry. 2007. p.

13. Masui, A., Fujiwara, N., Takagi, M. and Imanaka, T. (1999). Feasibility study for
decomposition of gelatin layers on X-ray films by thermostable alkaline protease from
alkaliphilic Bacillus sp. Biotechnological Techniques, 13:813-815.

14. Eman Zakaria Gomaa (2014). Production of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) By

Bacillus subtilis and Escherichia coli Grown on Cane Molasses Fortified with Ethanol.
Brazilian archives of biology and technology, 57: 145 – 154.