DO-AN-B.SUBTILIC Full

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
Giáo viên hướng dẫn:

Th.S. Đỗ Thị Hiền
Sinh viên thực hiện:

LÊ CÔNG TRÀ MY
LÊ CHÂU THỦY TIÊN
PHẠM HOÀNG TIẾN
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT

CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Th.S. Đỗ Thị Hiền LÊ CÔNG TRÀ MY
LÊ CHÂU THỦY TIÊN
PHẠM HOÀNG TIẾN
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn:
ii
Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền
- GVHD Th.S. Đỗ Thị Hiền, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ chúng
tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
- Chúng tôi xin cảm ơn quý thầy, cô trong khoa Công nghệ sinh học và Kỹ
thuật môi trường của trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM đã dạy dỗ và
truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt khóa học.
- Các thầy, cô phụ trách tại Trung tâm thí nghiệm thực hành trường ĐH Công
Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM đã tạo điều kiện giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình
làm thí nghiệm.
Tp.HCM, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thực hiện
Lê Công Trà My
Lê Châu Thủy Tiên
Phạm Hoàng Tiến
iii
LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi cam đoan rằng báo cáo đồ án tốt nghiệp này là do chính chúng tôi
thực hiện. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực,
không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào.
Sinh viên thực hiện
Lê Công Trà My
Lê Châu Thủy Tiên
Phạm Hoàng Tiến
iv
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN..........................................................................................................iii

LỜI CAM ĐOAN.....................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH...............................................................................................viii
PHẦN MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài.............................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài.................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.........................................................................................2
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis..........................................................................2
1.1.1. Lịch sử phát hiện...................................................................................2
1.1.2. Đặc điểm phân loại................................................................................2
1.1.3. Đặc điểm hình thái................................................................................2
1.1.4. Đặc điểm sinh hóa.................................................................................2
1.1.5. Tính đối kháng của B.subtilis đối với một số vi sinh vật gây bệnh........3
1.1.6. Khả năng sinh enzyme...........................................................................3
1.2. Giới thiệu chung về probiotic.......................................................................5
1.2.1. Định nghĩa.............................................................................................5
1.2.2. Vai trò của probiotic..............................................................................5
1.3. Sơ lược về một số vi sinh vật gây bệnh trong chăn nuôi..............................6
1.3.1. E.coli.....................................................................................................6
1.3.2. Salmonella.............................................................................................7
1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn B.subtilis.......7
1.5. Quy trình tạo chế phẩm và các vấn đề liên quan..........................................8
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................11
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện.................................................................11
2.2. Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy..........................................................11
2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất..........................................................................12
v
2.3.1. Dụng cụ, thiết bị..................................................................................12
2.3.2. Hóa chất..............................................................................................12
2.4. Phương pháp..............................................................................................13
2.4.1. Quy trình sản xuất...............................................................................13
2.4.2. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis.....................................15
2.4.3. Kiểm tra hoạt lực enzyme....................................................................19
2.4.4. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men............................................21
2.4.5. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang...........................22
2.4.6. Kiểm tra đặc tính sản phẩm.................................................................23
2.4.7. Xử lý số liệu........................................................................................23
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.................................................................24
3.1. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis............................................24
3.1.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella.....................24
3.1.2. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày......................................27
3.1.3. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật.............................................29
3.2. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men......................................................32
3.3. Kiểm tra số lượng tế bào B.subtilis sau sấy...................................................34
3.4. Kiểm tra các chỉ tiêu của chế phẩm tạo ra.....................................................35
3.4.1. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang..............................35
3.4.2. Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của sản phẩm.......................................36
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................41
4.1. Kết luận.........................................................................................................41
4.2. Kiến nghị.......................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................42
PHỤ LỤC I: SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM..................................................43
PHỤ LỤC II: HÌNH ĐẾM KHUẨN LẠC..............................................................60
vi
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các phản ứng sinh hóa của B.subtilis..................................................... 2
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên E.coli và
Salmonella .............................................................................................................24
Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis ở pH 2, pH 2.5, pH 3.........................28
Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis ở nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5%,
2% ......................................................................................................................... 29
Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis .........................31
Bảng 3.5. Số lượng tế bào sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ lên men
(x1015 CFU/g).........................................................................................................33
Bảng 3.6. Số lượng tế bào theo các tỷ lệ phối trộn sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày
(x1011 CFU/g).........................................................................................................35
Bảng 3.7. Đường kính vòng kháng E.coli và Salmonella ở các tỷ lệ phối trộn khác
nhau........................................................................................................................ 36
vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Quy trình tạo chế phẩm..........................................................................9
Hình 2.1. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi.....................................................14
Hình 2.2. Quy trình thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis với E.coli.......15
Hình 2.3. Quy trình thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis với Salmonella
................................................................................................................................ 17
Hình 3.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên E.coli....................26
Hình 3.2. Thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên Salmonella............27
Hình 3.3. Tỷ lệ sống sót của Bacillus subtilis ở các pH khác nhau........................28
Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis ở các nồng độ muối mật khác nhau....30
Hình 3.5. Vòng phân giải amylase trước và sau khi nhỏ thuốc thử........................32
Hình 3.6. Vòng phân giải cellulase trước và sau khi nhỏ thuốc thử.......................32
Hình 3.7. Vòng phân giải protease trước và sau khi nhỏ thuốc thử........................32
Hình 3.8. Số lượng tế bào B.subtilis ở các khoảng thời gian lên men khác nhau
(x1015 CFU/g)..........................................................................................................33
Hình 3.9. Thử nghiệm khả năng đối kháng của tỷ lệ phối trộn 10:85:5 trên E.coli
................................................................................................................................ 37
Hình 3.10. Thử nghiệm khả năng đối kháng của tỷ lệ phối trộn 10:85:5
trên Salmonella.......................................................................................................37
................................................................................................................................ 38
trên Salmonella.......................................................................................................38
................................................................................................................................ 38
trên Salmonella.......................................................................................................39
trên E.coli...............................................................................................................39
trên Salmonella.......................................................................................................39
viii
................................................................................................................................ 40
trên Salmonella.......................................................................................................40
ix
PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng
những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá… Việc
sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong
muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm
bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư
kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây
thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi.
Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực
tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng
minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số
bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại
những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Thử nghiệm sản
xuất thức ăn chăn nuôi từ Bacillus subtilis”.
2. Mục tiêu đề tài
Sản xuất chế phẩm chăn nuôi thô với mật độ vi sinh vật sống cao, hoạt lực
enzyme cao từ môi trường sản xuất rẻ tiền.
Khảo sát các đặc tính probiotic của B.subtilis:
- Khả năng chịu pH thấp của dạ dày
- Khả năng chịu muối mật
- Khả năng kháng khuẩn (E.coli, Salmonella)
- Khả năng sinh enzyme
Khảo sát thời gian lên men và khảo sát tỷ lệ phối trộn để cho ra sản phẩm tốt
nhất.
1
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis
1.1.1. Lịch sử phát hiện
B.subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức Y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến những năm 1949 – 1957, khi Henrry, Albot và các
cộng sự tách được chủng B.subtilis thuần khiết thì ứng dụng của vi khuẩn này mới
trở nên rộng rãi. Từ đó, thuật ngữ “subtilic therapy” ra đời. B.subtilis được sử dụng
ngày càng phổ biến và được xem như là sinh vật phòng và điều trị các bệnh về rối
loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy…[4]
Ngày nay, B.subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi và nhiều tiềm năng
ứng dụng hiệu quả trong y học, chăn nuôi, công nghiệp…
1.1.2. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillace
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
1.1.3. Đặc điểm hình thái
B.subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kích
thước 0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có
khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi
khuẩn và nằm giữa tế bào. Bào tử B.subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt
của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ…
1.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Bảng 1.1. Các phản ứng sinh hóa của B.subtilis
Các phản ứng sinh hóa Kết quả
Hoạt tính catalase +

Sinh indol -
MR +
2
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy gelatin +
Di dộng +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Manitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(The Holt, 1992) [4]

1.1.5. Tính đối kháng của B.subtilis đối với một số vi sinh vật gây bệnh
Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều
kiện môi trường khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi
là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh
vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của B.subtilis với
một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh
sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (24 giờ) sẽ sử dụng
phần lớn các chất dinh dưỡngtrong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng
sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế. [9]
1.1.6. Khả năng sinh enzyme
B. subtilis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzym ngoại bào có hoạt tính
cao như: amylase, protease và cellulase…
1.1.6.1. Enzyme amylase
Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với
nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế
bào hay ngoài môi trường.
Amylase là các enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các
polyose tương tự như dextrin, glucogen. Ở vi khuẩn Bacillus enzyme chủ yếu trong
3
nhóm này là α-amylase, α-amylase có khả năng thủy phân tinh bột mạnh và tạo
thành những dextrin cao phân tử tạo màu với iot, α-amylase vi khuẩn được ổn định
bằng ion canxi.
Phạm vi pH tác dụng tối thích là khoảng 6,5 – 7, α-amylase vi khuẩn bền
vững với nhiệt độ cao và có thể giữ được hoạt tính ở cả nhiệt độ trên 70 oC. Nó có
thể dịch hóa tinh bột nhanh ở 75 oC và thậm chí ở cả 100 oC. α-amylase xúc tác cho
quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucozit nội mạch ở bất kỳ vị trí nào bên trong
phân tử tinh bột với cơ chất là amylose. Với những tính chất này mà α-amylase của
vi khuẩn được dùng để dịch hóa tinh bột, làm giảm độ nhớt của dịch hồ và chủ yếu
trong chế biến dextrin. Nó cũng được dùng phối hợp với glucoamylase sản xuất
đường mật ngô và chocolate, trong sản xuất bia, với hỗn hợp đường để sản xuất
thức ăn trẻ con, để sản xuất nước quả và được ứng dụng rộng rãi trong y học.
Amylase của B.subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc
đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản
thân tế bào vi khuẩn “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được
tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. [9]
1.1.6.2. Enzyme cellulase
Cellulase là một phức hợp enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua
việc thủy phân liên kết β – 1,4 – glucoside trong cellulose.
Cellulase có khả năng thủy phân cellulose thành đường. Nó có giá trị làm
tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa.
1.1.6.3. Enzyme protease
Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptit (-CO-NH-) trong
phân tử protein hoặc các polypeptit. Protease có thể chia thành: proteinase và
peptidase. Proteinase thủy phân protein thành polypeptit, pepton. Chúng có tính đặc
hiệu tương đối rộng. Tiếp theo đó là sự phân hủy các peptit có phân tử nhỏ này
(pepton, polypeptit) thành các axit amin tự do dưới tác dụng của peptidase. Các
peptitdase có tính đặc hiệu hơn, chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở những
vị trí nhất định.
Protease của vi khuẩn hoạt động chủ yếu ở vùng pH 7 – 9. Protease nói
chung được dùng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thịt cá, thủy phân protein của
sữa để chế những món ăn kiêng đặc biệt và được dùng trong thuộc da, chế bột giặt,
phim ảnh, tơ sợi, len dạ, cũng như dùng trong y học. Protease vi sinh vật có thể sử
dụng với amylase trong sản xuất thức ăn gia súc. [9]
4
1.2. Giới thiệu chung về probiotic

1.2.1. Định nghĩa
Theo Fuller (1989), probiotic là chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp
cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ.
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là các vi sinh vật sống khi
đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho
vật chủ.
1.2.2. Vai trò của probiotic
1.2.2.1. Tác động kháng khuẩn
Giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là:
- Tiết ra các chất kháng khuẩn: Vi khuẩn Probiotic tạo ra các chất đa dạng có
thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-), gồm có các acid hữu cơ, hydrogen
peroxide và chất diệt khuẩn. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những
sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất
của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH
khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là
acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic.
- Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột
và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh.
1.2.2.2. Tác động trên mô biểu bì ruột
- Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô.
- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm
vi khuẩn.
- Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy.
1.2.2.3. Tác động miễn dịch
Probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm
cho đường ruột. Cụ thể:
- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm.
- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng.
- Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
1.2.2.4. Tác động đến vi khuẩn đường ruột
Điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột. Sự sống sót của
probiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhau
giữa các giống. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời
5
của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi
bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của
giống vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư
một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật
probiotic sẽ giảm xuống. Điều này thì đúng cho tất cả các loại probiotic.
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột.
Probiotic có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây
cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của sinh vật đường ruột. Đồng thời tăng sự
dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi và giảm vi
khuẩn gây hại.
1.2.2.5. Một số vai trò khác đối với cơ thể
Chống dị ứng: thực phẩm probiotic góp phần chống lại một số dị ứng của cơ
thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như (folic acid, niacin, riboflavin,
vitamin B6 và B12).
Chống ung thư: nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm
giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra còn có tác dụng
khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u
bướu.
Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm
giảm huyết áp cao. Ngoài ra còn giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu
chảy và sử dụng nhiều kháng sinh.
1.3. Sơ lược về một số vi sinh vật gây bệnh trong chăn nuôi
1.3.1. E.coli
1.3.1.1. Đặc tính gây bệnh
E.coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề
kháng của con vật sút kém đi, lúc động vật gầy yếu, chăm sóc, quản lý chăn nuôi
kém, bị cảm lạnh hay cảm nắng, bệnh giun sán.
E.coli thường gây bệnh cho súc vật mới sinh từ 2 – 3 ngày tuổi có khi 4 – 8
ngày tuổi, gây bệnh đường ruột cho lợn con, gia cầm non. Ở động vật trưởng thành,
E.coli có thể gây một số bệnh như viêm giác mạc, viêm gan, thận, bàng quang, túi
mật…
Trong phòng thí nghiệm, tiêm dưới da chuột lang, chuột bạch có thể gây viêm
cục bộ, nếu liều lớn có thể sinh ra bại huyết gây chết cho con vật
1.3.1.2. Khả năng gây bệnh
6
E.coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con theo heo mẹ hầu hết đều thuộc lớp sản
sinh độc tố ruột.
Các tác động sinh hóa của các độc tố này kết dính lên các thụ thể khác nhau
trên bề mặt ruột và tác động lên sự chuyển hóa của các tế bào này. LT hoạt hóa chu
trình adenylate, cylase kích thích sự sản sinh ra các cyclic adenine 5’
monophosphate (cAMP) gây tăng tiết Na+, Cl-, HCO3- và nước, nó còn có thể cản
trở sự hấp thụ Na+ bởi các tế bào ruột trưởng thành. STa cũng hoạt hóa tương tự chu
trình guanylate, kích thích sự sản sinh cyclic guanosine 5’ monophosphate (cGMP),
từ đây sự hấp thu các chất điện giải và nước từ ruột sẽ giảm nhanh. Tác động của
STế bào chưa được biết rõ, nhưng hiệu quả tác động chung của LT, STa và STế bào
là làm mất nước và mất bão hòa ion.
1.3.2. Salmonella
Theo Quinn và cộng sự (2002), sự lây truyền Salmonella thường qua con
đường phân – miệng, nhưng nhiễm trùng qua niêm mạc của kết mạc mắt và đường
hô hấp trên cũng có khả năng xảy ra.
Cũng theo Quinn và cộng sự (2002), Salmonella cần xâm nhập vào ruột non
và kết tràng để gây bệnh đường ruột. Tuy nhiên, những acid hữu cơ bay hơi được
sản sinh bởi vi sinh vật yếm khí bình thường trong đường ruột có khả năng ức chế
sự phát triển Salmonella. Hệ vi sinh vật hiếu khí bình thường cũng có thể ngăn cản
việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài Salmonella. Sự rối loạn của hệ vi
sinh vật do các yếu tố như: Dùng kháng sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả
năng mẫn cảm của vật chủ với sự nhiễm trùng. Nhu động ruột giảm, stress do vận
chuyển và chật chội cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập đường ruột của
Salmonella.
Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hóa, nhanh chóng đi vào hệ lâm ba
của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn gây bại huyết, làm cho lá lách
sưng to, lúc đầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội độc tố, gây viêm hoại
tử gan và hạch.
Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm
trùng huyết do S.choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do
S.typhimurium.
1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn
B.subtilis
- Trong nước:
+ Theo Nguyễn Văn Đông (1993) đã khảo sát một số tính chất của vi khuẩn
B.subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl để phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo
7
con. Ghi nhận vi khuẩn B.subtilis không có độc lực khi truyền qua đường tiêu hóa,
có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh: E.coli, Staphylococcus aureus.
+ Năm 2001, Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chí Quốc đã
nghiên cứu một số đặc tính trợ sinh học (probiotic) của B.subtilis trong phòng bệnh
đường tiêu hóa của gà và ghi nhận rằng B.subtilis có khă năng ức chế sự sinh trưởng
và phát triển của E.coli invitro. Gà được ăn chế phẩm B.subtilis ở lượng 106 CFU/g
có thể ổn định hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đặc biệt là E.coli, và có thể tồn tại
trong chế phẩm với thời gian bảo quản là 6 tháng.
+ Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm
Vitom3 (B.subtilis chủng VI KHUẨN PMV – 7092) để phòng trị bệnh phân trắng
cho heo con ghi nhận rằng Vitom3 có tác dụng kích thích tăng trọng, phòng bệnh
heo con phân trắng, tỉ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh 100% và không có heo
bị tái phát.
+ Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải và Võ Thị Hạnh (2004) đã nghiên cứu sản
xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ
sung vào khẩu phần ăn của bò vắt sữa và bê sau cai sữa đã kết luận rằng bê được bổ
sung 50gr BIO-C tăng trọng cao hơn từ 48 – 49g/con/ngày so với bê không bổ sung.
- Ngoài nước:
+ Nhóm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả chế
phẩm Bioplus 2B (chứa B.subtilis và B.licheniformis) lên tình trạng sức khỏe, tính
năng sinh sản của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt. Kết quả ghi nhận được
khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chế sự giảm trọng
lượng của heo mẹ trong thời kì tiết sữa (15,3 ± 3,6 đối với chế phẩm Bioplus so với
đối chứng là 18,8 ± 3,1), làm cải thiện các thông số của máu và sữa ngoại trừ
lactose và chất rắn.
+ Nhóm nghiên cứu của Siriat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của
probiotic trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dòng S11
không hạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu
trùng tôm (trọng lượng là 43,8mg so với 26mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là
1,83 ± 0,31 so với đối chứng là 1,71 ± 0,2). Tôm có tỉ lệ sống sót cao (13% so với
4% đối chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng).
Ngoài ra nhóm còn kết luận Bacillus dòng S11 không có ảnh hưởng đến chất lượng
nước ao nuôi và Arterma là vật mang probiotic có hiệu quả.
1.5. Quy trình tạo chế phẩm và các vấn đề liên quan
8
Kiểm soát
chất lượng
Ống
giống Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2
Kiểm soát chất lượng
Lên men thu sinh khối
Kiểm soát chất lượng Làm khô
Phối trộn
Sản (bã mía, cám
Đóng gói Nghiền
phẩm gạo…)
Hình 1.1. Quy trình tạo chế phẩm
*Kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất

Việc kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt trong suốt quá trình sản xuất là rất
quan trọng. Bất kỳ sự tạp nhiễm hoặc thay đổi điều kiện tăng sinh sẽ ảnh hưởng đến
hoạt động và sinh lý phát triển của vi sinh vật và qua đó dẫn đến sự tạp nhiễm các
chủng vi sinh vật không mong muốn cũng như ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng về
độ tinh khiết sản phẩm, mức độ hoạt động và hiệu quả của vi sinh bên trong sản
phẩm.
Việc duy trì một môi trường vô trùng trong suốt quá trình và kiểm soát chất
lượng sau mỗi bước của quá trình này là cần thiết để đảm bảo không có tạp nhiễm,
duy trì sự tinh khiết (thuần chủng) của vi sinh vật, đảm bảo chúng vẫn sống trong
điều kiện tối ưu. Ở mỗi bước trong quy trình sản xuất, vi khuẩn được kiểm tra theo
tiêu chuẩn nghiêm ngặt bao gồm kiểm tra điều kiện tối ưu và các thử nghiệm DNA.
Một yếu tố quan trọng để đảm bảo chủng vi khuẩn đang được sản xuất đúng
với chủng đã được lựa chọn trong một năm trước là đảm bảo độ tinh khiết và tính
thống nhất của quá trình nuôi cấy. Các chủng tinh khiết, khi được chọn sẽ được gửi
đến các trung tâm phân tích để xác nhận đúng dòng cần sản xuất.
*Lên men ở quy mô lớn hơn
Một khi chất lượng và độ tinh khiết vủa chủng nuôi cấy được kiểm tra, nó
được chuyển đi trong điều kiện vô trùng đến thiết bị tiền lên men nơi mà các điều
9
kiện nuôi cấy được kiểm soát và theo dõi liên tục. Mỗi chủng vi khuẩn được nuôi
cấy tăng trưởng trong môi trường riêng biệt, tuy nhiên quá trình phát triển của vi
khuẩn được biểu thị bằng một đường cong bao gồm phase tăng trưởng của vi sinh
vật theo cấp số nhân, sau đó đạt đến trạng thái ổn định và cuối cùng thì bắt đầu
giảm dần. Mục tiêu chính của quá trình là dừng quá trình lên men khi vi sinh vật đạt
đến mức hoạt động cực đại mà không nhất thiết phải đạt năng suất tối đa vì khi đạt
năng suất tối đa thì chúng cũng bắt đầu suy giảm mà không đạt được mức độ hoạt
động trao đổi chất tối ưu. Để theo dõi sự phát triển vi khuẩn, nhà sản xuất sẽ kiểm
tra mật độ quang học của môi trường nuôi cấy.
Việc nuôi cấy vi khuẩn sau đó được chuyển hệ thống lên men công nghiệp,
với dung lượng 2 – 20m3, tùy thuộc vào nhu cầu thị trường. Một lần nữa, quá trình
lên men được dừng lại ở giai đoạn tối ưu về mặt hoạt động sinh học hơn là năng
suất.
*Nguyên tắc chọn chủng vi sinh vật làm chế phẩm sinh học [11]
- Không sinh độc tố, không gây bệnh cho vật chủ và không ảnh hưởng xấu
tới hệ sinh thái và môi trường.
- Có khả năng bám dính niêm mạc đường tiêu hóa và các mô khác của vật
chủ, cạnh tranh vị trí bám với vi sinh vật gây bệnh, không cho chúng tiếp xúc trực
tiếp với các cơ quan trong cơ thể.
- Có khả năng sinh ra các chất ức chế, ngăn cản sự sinh trưởng mạnh mẽ của
các vi sinh vật gây bệnh.
- Có khả năng sinh trưởng nhanh, cạnh tranh thức ăn, hóa chất, năng lượng
với các vi sinh vật có hại.
- Tăng cường khả năng miễn dịch, tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên và
khả năng tạo thành kháng thể.
- Có khả năng sống sót trong đường ruột vật chủ, chịu pH thấp dạ dày và
muối mật trong đường ruột…
- Phù hợp với yêu cầu sản xuất công nghiệp, quy trình nuôi cấy và sản xuất
đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản.
Có một số phương pháp giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic
như: nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động
học của probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ.
Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic cho người đều bắt
buộc phải đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi có thể giảm bớt một số yêu
cầu, chủ yếu tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng nó.
10
11
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: Trung tâm Thí nghiệm thực hành (Cơ sở Tân Kỳ Tân Quý) –
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM
Thời gian thực hiện: 24/4/2017 đến 16/6/2017
2.2. Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy
Giống vi sinh vật:
- Men vi sinh Bacillus subtilis dạng nước Entero Lactyl.
- E.coli, Salmonella được phân lập từ các đề tài trước.
Môi trường nuôi cấy:
- Môi trường giữ giống vi sinh vật: môi trường NA
- Môi trường đếm khuẩn lạc: môi trường NA
- Môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn: môi trường NA
- Môi trường khảo sát pH dạ dày và muối mật: môi trường MRS
- Môi trường cấp 1:
Rỉ đường 3%
Peptone 15g/L
Muối khoáng 10g/L
- Môi trường cấp 2:
Bột bắp xay mịn 70g
Cám gạo 30g
Khô dầu lạc 50g
DAP 0.75g
Nước 80%
- Môi trường thử hoạt tính amylase:
Tinh bột 10g/L
12
NaCl 30g/L
Agar 20g/L
- Môi trường thử hoạt tính protease:
Sữa gầy 5g/L
NaCl 30g/L
Agar 20g/L
- Môi trường thử hoạt tính cellulase:
CMC 10g/L
NaCl 30g/L
Agar 20g/L
2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

2.3.1. Dụng cụ, thiết bị
Sử dụng một số dụng cụ, thiết bị cơ bản của phòng thí nghiệm
2.3.2. Hóa chất
STT Tên hóa chất SL/ĐVT Ghi chú
1 Nước cất ml
2 Cồn 96o ml
3 NaCl g
4 HCl 2M ml
5 Peptone g
6 NaCl g
7 Cao nấm men g
8 Agar g
13
9 CMC g
10 Sữa gầy g
11 Tinh bột g
12 Muối khoáng g
2.4. Phương pháp

2.4.1. Quy trình sản xuất
14
Cám gạo, bột

Giống bắp, khô dầu lạc, 80% nước
B.subtilis DAP
Hoạt hóa giống

Hấp khử trùng
121oC/15 phút
Nhân giống
Làm nguội
- Kiểm tra khả năng kháng khuẩn Đổ lên khay

- Kiểm tra hoạt tính enzyme.
- Kiểm tra khả năng chịu pH thấp
Nuôi ở nhiệt độ thường
và khả năng chịu muối mật.
trong thời gian tối ưu
Đánh tơi
Sấy khô ở nhiệt độ 45oC

trong 2 ngày
Kiểm tra mật độ VSV sống
Nghiền mịn
Phối trộn với cám gạo,

bã mía
Kiểm tra mật độ VSV sống và
khả năng kháng khuẩn
Sản phẩm
Hình 2.1. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi
15
2.4.2. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis
2.4.2.1. Khả năng đối kháng với E.coli
E.coli Giống B.subtilis

tăng sinh trên
môi trường cấp 1
Cấy trang bề mặt

thạch NA
Pha loãng
Thấm dịch vào

đĩa giấy
Đặt lên môi trường
Ủ 37oC trong
24h
Đo đường kính
vòng kháng khuẩn
Hình 2.2. Quy trình thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis với E.coli
*Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị các đĩa thạch Nutrien Agar
Thạch Nutrien Agar được chuẩn bị theo các bước sau đây:
- Cân các thành phần hòa tan vào nước cất.
- Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
- Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7,2 – 7,4 nếu cần.
- Hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50oC.
16
- Đổ môi trường vào đĩa petri dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml
thạch).
Chuẩn bị các ống dịch huyền phù vi khuẩn E.coli
Từ các ống nghiệm chứa giống gốc, vi khuẩn được cấy chuyền qua ống
nghiệm khác có chứa môi trường dinh dưỡng Nutrien Agar (thạch nghiêng). Ủ các
ống nghiệm chứa vi khuẩn ở nhiệt độ 37oC qua đêm.
Sau khi ủ, cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất để tạo dịch huyền phù vi
khuẩn, lắc nhẹ.
Cấy vi khuẩn E.coli
Dùng micropipet, hút 0,1ml dịch huyền phù vi khuẩn cho vào đĩa môi trường
NA. Sau đó dùng que cấy gạt thủy tinh, trải đều trên mặt thạch sau cho vi khuẩn
khuếch tán đầy và đều lên mặt thạch. Để khô mặt thạch.
Chuẩn bị đĩa giấy
Lấy giấy lọc cắt thành từ đĩa giấy có đường kính là 9mm. Đem hấp khử trùng
ở 121oC/15 phút, để nguội, dùng tâm bông tẩm dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa
giấy vô khuẩn (đã chuẩn bị) thu được các đĩa giấy có nồng độ thay đổi từ 10 010-5.
Để khô ở nhiệt độ phòng và dùng ngay.
Đặt khoanh giấy tẩm dịch nuôi cấy B.subtilis
Dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy tẩm dịch nuôi cấy B.subtilis ở các nồng độ
khác nhau lên bề mặt thạch đã trải đều vi khuẩn. Các đĩa giấy không được đặt sát
nhau quá, cách thành đĩa khoảng 1cm. Lật ngược đĩa thạch và ủ ở 37oC.
Đo vòng kháng khuẩn
Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng
kháng khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng
khuẩn.
Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) = đường kính vòng kháng khuẩn – đường
kính đĩa giấy
Nồng độ pha loãng

canh khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
B.subtilis
100
10-1
17
10-2
10-3
10-4
10-5
2.4.2.2. Khả năng đối kháng với Salmonella
Giống B.subtilis
Salmonella
tăng sinh trên
môi trường cấp 1
Cấy trang bề mặt

thạch NA
Pha loãng
Thấm dịch vào

đĩa giấy
Đặt lên môi trường
Ủ 37oC trong
24h
Đo đường kính
vòng kháng khuẩn
Hình 2.3. Quy trình thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis với Salmonella
*Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị các đĩa thạch Nutrien Agar
Thạch Nutrien Agar được chuẩn bị theo các bước sau đây:
18
- Cân các thành phần hòa tan vào nước cất.

- Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
- Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7,2-7,4 nếu cần.
- Hấp tiệt trùng ở 121oC/15 phút, để nguội môi trường tới 50oC.
- Đổ môi trường vào đĩa petri dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml
thạch).
Chuẩn bị các ống dịch huyền phù vi khuẩn Salmonella
Từ các ống nghiệm chứa giống gốc, vi khuẩn được cấy chuyền qua ống
nghiệm khác có chứa môi trường dinh dưỡng Nutrien Agar (thạch nghiêng). Ủ các
ống nghiệm chứa vi khuẩn ở nhiệt độ 37oC qua đêm.
Sau khi ủ, cho vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất để tạo dịch huyền phù vi
khuẩn, lắc nhẹ.
Cấy vi khuẩn Salmonella
Dùng micropipet, hút 0,1ml dịch huyền phù vi khuẩn cho vào đĩa môi trường
NA. Sau đó dùng que cấy gạt thủy tinh, trải đều trên mặt thạch sau cho vi khuẩn
khuếch tán đầy và đều lên mặt thạch. Để khô mặt thạch.
Chuẩn bị đĩa giấy
Lấy giấy lọc cắt thành từ đĩa giấy có đường kính là 9mm. Đem hấp khử trùng
ở 121oC/15 phút, để nguội, dùng tâm bông tẩm dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa
giấy vô khuẩn (đã chuẩn bị) thu được các đĩa giấy có nồng độ thay đổi từ 10 010-5.
Để khô ở nhiệt độ phòng và dùng ngay.
Đặt khoanh giấy tẩm dịch nuôi cấy B.subtilis
Dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy tẩm dịch nuôi cấy B.subtilis ở các nồng độ
khác nhau lên bề mặt thạch đã trải đều vi khuẩn. Các đĩa giấy không được đặt sát
nhau quá, cách thành đĩa khoảng 1cm. Lật ngược đĩa thạch và ủ ở 37oC.
Đo vòng kháng khuẩn
Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng
kháng khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng
khuẩn.
Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) = đường kính vòng kháng khuẩn – đường
kính đĩa giấy
Nồng độ pha loãng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

canh khuẩn
19
B.subtilis
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
2.4.2.3. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày

Mục đích: kiểm tra khả năng chịu pH dạ dày (pH từ 2 – 3) của B.subtilis để
tiến hành thử nghiệm sản xuất chế phẩm.
Cách tiến hành: Nuôi tăng sinh vi khuẩn B.subtilis trong môi trường mật rỉ -
pepton, sau đó chuyển vào nuôi trong môi trường MRS dịch thể có pH thấp (điều
chỉnh pH bằng HCl 1M). Sau 0h, 2h, 4h khảo sát cấy trên NA, ủ 24h và đếm số
khuẩn lạc trên môi trường.
Đếm khuẩn lạc ở pH 2, 2.5, 3 theo mẫu
Thời gian (giờ) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0h
2h
4h
2.4.2.4. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật

Mục đích: kiểm tra đặc tính chịu đựng muối mật của B.subtilis để tiến hành
thử nghiệm sản xuất chế phẩm.
Cách thực hiện: Nuôi tăng sinh vi khuẩn B.subtilis trong môi trường mật rỉ -
peptone, sau đó chuyển vào môi trường MRS dịch thể có hàm lượng muối mật
0.5%, 1%, 1,5%, 2%. Sau 0h, 2h, 4h đếm số khuẩn lạc còn lại trên môi trường NA.
Đếm số khuẩn lạc ở nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5%, 2% theo mẫu
Thời gian (giờ) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0h
20
2h
4h
2.4.3. Kiểm tra hoạt lực enzyme

2.4.3.1. Khả năng sinh amylase
Cách thực hiện:
- Đổ môi trường thử hoạt tính đã thanh trùng vào đĩa petri đã hấp khử trùng
- Sau khi thạch đông lại dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy tẩm dịch nuôi cấy
B.subtilis
- Ủ ở 37oC trong 24h.
- Cho 5ml dung dịch I2 0,1N vào toàn bộ môi trường xác định vòng phân giải
Đo vòng phân giải:
- Kích thước vòng phân giải (mm) = đường kính vòng phân giải – đường
kính đĩa giấy
Kích thước vòng phân giải (mm)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Vòng phân giải

Đĩa giấy
2.4.3.2. Khả năng sinh cellulase

- Đổ môi trường thử hoạt tính đã thanh trùng vào đĩa petri đã hấp khử trùng.
21
B.subtilis.
- Cho 5ml dung dịch lugol 0,1N vào toàn bộ môi trường xác định vòng phân
giải.
kính đĩa giấy
2.4.3.3. Khả năng sinh protease

- Đổ môi trường thử hoạt tính đã thanh trùng vào đĩa petri đã hấp khử trùng
B.subtilis
- Cho 5ml dung dịch HgCl2 vào toàn bộ môi trường xác định vòng phân giải
kính đĩa giấy
2.4.4. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men
Mục đích: xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men
Cách tiến hành:
- Cân môi trường cấp 2
- Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút
22
- Bổ sung 10% giống B.subtilis từ môi trường nhân giống cấp 1 vào môi
trường lên men.
- Lên men ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ
- Sau các thời gian lên men, mỗi nghiệm thức lấy 0.1g pha loãng với 9.9ml
nước cất đã hấp khử trùng và pha loãng ra các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3,… đến 10-14
- Lấy 10-14 của mỗi nghiệm thức cấy vào môi trường NA, mỗi nghiệm thức 3
đĩa. Nuôi cấy ở nhiệt độ thường trong 24 giờ để xác định mật độ tế bào sống.
Bảng. Số khuẩn lạc ở nồng độ 10-14 với các thời gian lên men
Thời gian lên men

(giờ)
24 giờ
36 giờ
48 giờ
60 giờ
72 giờ
2.4.5. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang
Mục đích: Xác định tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang để duy trì
được nhiều vi sinh vật sống
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị bã mía và cám gạo, hấp khử trùng 121oC/15 phút
- Sấy khô ở nhiệt độ 70°C. Làm nguội
- Phối trộn tỷ lệ sản phẩm lên men : bã mía : cám gạo lần lượt là 10:45:45,
10:55:35, 10:65:25, 10:75:15, 10:85:5.
- Kiểm tra mật độ tế bào sống ở 5 tỷ lệ phối trộn theo phương pháp đếm
khuẩn lạc sau 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày
Bảng. Số khuẩn lạc ở các tỷ lệ phối trộn sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày
Tỷ lệ Lặp lại Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Trung bình
10:45:45 1
23
2
10:55:35 2
10:65:25 2
10:75:15 2
10:85:5 2
2.4.6. Kiểm tra đặc tính sản phẩm

2.4.6.1. Khả năng đối kháng với E.coli, Salmonella (tương tự phần 2.4.2.1)
2.4.7. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Statgraphics và vẽ sơ đồ bằng phần mềm Excel
2007.
24
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kiểm tra các đặc tính probiotic của B.subtilis
3.1.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella
Để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, ngoài việc cạnh tranh vị trí
bám dính thì khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh là một đặc tính rất quan
trọng của các chủng vi sinh vật được chọn làm probiotic.
Do đó, thí nghiệm được tiến hành khảo sát hoạt tính đối kháng mạnh với 2
chủng vi khuẩn kiểm định gồm E. coli và Salomonella
Thí nghiệm thu được kết quả và thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1, 3.2
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên
E.coli và Salmonella
Nồng độ
pha loãng 100 10-1 10-2 10-3
B.subtilis
Đường kính vòng

27 ± 1.53 14.67 ± 1.76 8.33 ± 0.33 8.67 ± 0.67
kháng E.coli (mm)

kháng Salmonella 33.33 ± 0.67 24.67 ± 1.20 14 ± 1.15 7 ± 0.58
(mm)
Nhận xét:
Từ bảng 3.1 trên cho thấy rằng B.subtilis có khả năng kháng E.coli mạnh ở các
nồng độ 10-3, 10-2, 10-1 và 100 lần lượt là 8.67, 8.33, 14.67 và 27 (mm). B.subtilis có
khả năng kháng Salmonella mạnh ở các nồng độ 10-3, 10-2, 10-1 và 100 lần lượt là 7,
14, 24.67, 33.33 (mm). Kết quả cho thấy chủng B.subtilis được khảo sát có khả
năng kháng Salmonella tốt hơn so với E.coli. Tuy nhiên, chủng B.subtilis này đều
có khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella, đây cũng là đặc tính nổi bật của
chủng Bacillus dùng để sử dụng làm chủng probiotic.
Theo nghiên cứu của tác giả Trần Thị Bích Quyên (2012) về khả năng đối
kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Salmonella lần lượt ở khoảng
từ 8 đến 21 mm đối với E.coli và khoảng từ 9 đến 24 mm đối với Salmonella ở
nhiều chủng Bacillus khác nhau. Kết quả thí nghiệm của tác giả Trần Quốc Việt
(2009) về khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng probiotic như sau:
25
đường kính vòng kháng E.coli khoảng từ 3 đến 12 mm, đường kính vòng kháng
Salmonella khoảng từ 6 đến 21 mm. Ngoài ra, nghiên cứu khảo sát chủng Bacillus
subtilis về khả năng kháng bệnh tiêu chảy do E.coli của tác giả Đặng Ngọc Phương
Uyên (2007) cho kết quả khoảng 4.15 mm trong vòng 24 giờ nuôi cấy.
Từ việc so sánh kết quả kháng khuẩn của chủng Bacillus subtilis trong thí
nghiệm có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Salmonella…cho kết
quả tương tự với các nghiên cứu của các tác giả đã thực hiện trước đó. Điều đó
chứng minh rằng Bacillus subtilis có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh tốt và có
thể sử dụng làm probiotic.
26
100 10-1
10-2 10-3
10-4 10-5
Hình 3.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên E.coli
27
100 10-1
10-2 10-3
10-4
10-5
Hình 3.2. Thử nghiệm khả năng đối kháng của B.subtilis trên Salmonella
3.1.2. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày
Khả năng sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của pH thấp ở dạ
dày là một trong những đặc tính quan trọng của chủng vi sinh vật được chọn làm
probiotic.
28
Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu pH thấp của chúng ở
những độ pH 2; 2.5; 3 tại các thời điểm 0; 2; 4 giờ (tương ứng với thời gian thức ăn
lưu lại tại dạ dày). Đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, từ đó tính tỉ lệ tế bào sống
sót (%) của các chủng vi khuẩn khảo sát qua các thời gian khảo sát khác nhau.
Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis ở pH 2, pH 2.5, pH 3
Thời gian (giờ) Đối chứng pH 2 pH 2.5 pH 3
0 100 100 100 100
2 101.74 81.25 82.41 93.36
4 104.78 53.98 65.83 81.99
120
100
Tỷ lệ sống sót (%)
80 ĐC
pH 2
60 pH 2.5
pH 3
40
20
0
0 2 4 Thời gian (giờ)
Hình 3.3. Tỷ lệ sống sót của Bacillus subtilis ở các pH khác nhau
Nhận xét:
Từ bảng số liệu trên cho thấy, tỷ lệ sống sót của B.subtilis giảm dần theo thời
gian và chịu ảnh hưởng bởi pH của môi trường. Thí nghiệm được khảo sát trong 4
giờ do thời gian lưu của thức ăn trong dạ dày của gia súc trong khoảng 4 – 5 giờ. Ở
pH trung tính (đối chứng), tỷ lệ sống sót của B.subtilis tăng nhưng với tỷ lệ thấp là
do vi sinh vật chưa thích ứng được với môi trường mới nên vi sinh vật cần thời gian
để thích nghi dẫn đến việc tăng sinh chậm. Tại pH 3, tỷ lệ sống sót đến 4h giảm
18.01%; tại pH 2.5, tỷ lệ sống sót đến 4h giảm 34.17% và tại pH 2, tỷ lệ sống sót
đến 4h giảm 46.02%. Số liệu cho thấy ở pH càng thấp thì khả năng sống sót của
B.subtilis càng yếu. Vậy chủng B.subtilis có khả năng chịu pH thấp dạ dày trong
vòng 4 giờ khoảng từ 53.98% đến 81.99%.
29
Ngoài ra, so sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Trần Thị Bích Quyên
(2012) về khả năng sống sót của B.subtilis trong pH dạ dày như sau: tỷ lệ sống sót
của các chủng B.subtilis ở pH dạ dày khoảng từ 38.94% đến 76.23%. Các kết quả
nghiên cứu của nhóm tác giả Hồ Trung Thông và Hồ Lê Huỳnh Châu (2009) về khả
năng chịu pH thấp của các chủng probiotic ở pH 2 là khoảng từ 27,81% đến
53,56%.
Từ kết quả so sánh trên cho thấy chủng B.subtilis trong thí nghiệm này cũng
có khả năng sống cao trong môi trường pH thấp ở dạ dày có tỷ lệ cao hơn so với các
thí nghiệm trước đó. Kết quả đạt được có thể do giống B.subtilis trong thí nghiệm
này có nguồn gốc từ men vi sinh nên đã được chọn lọc về khả năng sống sót cao
trong môi trường pH thấp của dạ dày. Từ các kết quả và lập luận trên chứng minh
được B.subtilis có khả năng chịu pH thấp của dạ dày trong 4 giờ và có thể sử dụng
làm thức ăn chăn nuôi bổ sung probiotic.
3.1.3. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật
Trong hệ tiêu hóa, sau khi trải qua điều kiện khắc nghiệt với pH thấp ở dạ
dày, các vi sinh vật probiotic lại phải tiếp xúc với muối mật trong đường ruột. Muối
mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm
nhập của các vi sinh vật gây bệnh.
Havenaar và cộng sự (1992) đã chỉ ra rằng, probiotic chỉ phát huy tác dụng
có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non để từ đó hình thành
khuẩn lạc, tăng khả năng kết dính trong đường ruột. Như vậy, dựa trên khả năng
sống sót của các chủng Bacillus sau tác dụng của muối mật trong đường ruột làm
tiêu chí quan trọng để sàng lọc các chủng vi sinh vật probiotic. Ở ruột non, nơi dịch
mật toàn phần tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2%. Vì vậy, Bacillus
subtilis được tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật ở các nồng độ muối mật
0,5; 1,0; 1.5, 2,0% tại các thời điểm 0, 2 và 4 giờ (tương ứng với thời gian thức ăn
lưu lại tại ruột non của người và động vật (Charteris và cộng sự, 1998). Kết quả
được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis
ở nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5%, 2%
Thời gian (giờ) Đối chứng (ĐC) 0.5% 1% 1.5% 2%
0 100 100 100 100 100
2 101.74 95.20 88.63 77.88 70.44
4 104.78 79.48 75.83 62.21 52.71
30
120
100
Tỷ lệ sống sót (%) ĐC
80
0.50%
1%
60 1.50%
2%
40
20
0 Thời gian (giờ)

0 2 4
Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót (%) của B.subtilis

ở các nồng độ muối mật khác nhau
Nhận xét:
Từ bảng số liệu trên cho thấy, tỷ lệ sống sót của B.subtilis giảm dần theo thời
gian và chịu ảnh hưởng bởi nồng độ muối mật trong môi trường. Thí nghiệm được
khảo sát ở các nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5%, 2% trong 4 giờ do dịch mật toàn
phần ở ruột non tiết ra có thể có nồng độ cao nhất khoảng 2% và thời gian lưu của
thức ăn trong dạ dày của người và động vật trong khoảng 4 – 5 giờ. Ở nồng độ
muối mật 0% (đối chứng), tỷ lệ sống sót của B.subtilis tăng nhưng với tỷ lệ thấp là
do vi sinh vật chưa thích ứng được với môi trường mới nên vi sinh vật cần thời gian
để thích nghi dẫn đến việc tăng sinh chậm. Tại nồng độ muối mật 0.5%, tỷ lệ sống
sót đến 4h giảm 20.52%; tại nồng độ muối mật 1%, tỷ lệ sống sót đến 4h giảm
24.17%; Tại nồng độ muối mật 1.5%, tỷ lệ sống sót đến 4h giảm 37.79% và tại
nồng độ muối mật 2%, tỷ lệ sống sót đến 4h giảm 47.29%. Vậy chủng B.subtilis có
khả năng chịu nồng độ muối mật từ 0.5 – 2% trong vòng 4 giờ khoảng 52.71% đến
79.48%.
So sánh kết quả nghiên cứu của tác giả Văn Thị Thủy (2011) khi nghiên cứu
khả năng sống sót của các chủng Bacillus có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra và
Nguyễn Đức Quỳnh Như (2008) khi sàng lọc một số chủng Bacillus có hoạt tính
probiotic trong nuôi trồng thủy sản với tỉ lệ tế bào sống sót cao (>100%). Kết quả
nghiên cứu của tác giả Trần Thị Bích Quyên (2012) về khả năng sống sót của
Bacillus sau 4 giờ khảo sát từ 76.19% đến 116.83%. Nghiên cứu của Kim và cộng
sự (2007), Trần Quốc Việt và cộng sự (2009) cũng cho thấy, các chủng vi sinh vật
thử nghiệm đều có khả năng tồn tại trong môi trường với nồng độ muối mật từ 0,3 –
0,5%. Ở nồng độ muối mật 1,0%, sau 4 giờ khảo sát, B.subtilis có tỉ lệ tế bào sống
sót cao từ 84,89% - 108,95%. Ở nồng độ muối mật 2,0%, đây là nồng độ muối mật
31
cao nhất đổ vào ruột non. Sau 4 giờ xử lý, các chủng khảo sát đều có tỉ lệ sống sót
cao từ 75,51% - 105,85%.
Từ kết quả so sánh cho thấy chủng B.subtilis trong thí nghiệm này có sức sống
yếu hơn so với các nghiên cứu đã được thực hiện trước đây nhưng tỷ lệ sống sót vẫn
cao (>50%). Kết quả có sự chênh lệch có thể do số thí nghiệm lặp lại ít, điều kiện ủ
không đảm bảo và kỹ thuật cấy vi khuẩn chưa đạt. Tuy nhiên, khả năng sống sót
của chủng B.subtilis trong thí nghiệm cũng đạt được tỷ lệ sống sót ở nồng độ muối
mật cao (2%) khoảng 52.75%. Điều đó chứng minh vi khuẩn B.subtilis có khả năng
chịu được nồng độ muối mật cao trong ruột non và có thể sử dụng làm thức ăn chăn
nuôi bổ sung probiotic.
Thành phần chủ yếu trong thức ăn chăn nuôi là protein, tinh bột và một số
chất xơ. Vì vậy, khả năng sinh các enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase)
của các chủng probiotic có vai trò rất quan trọng, nhằm hỗ trợ tiêu hóa thức ăn,
chuyển hóa các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp gia súc tăng trọng.
Chủng B.subtilis được tiến hành khảo sát khả năng sinh các enzyme ngoại
bào. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5 và hình 3.5, 3.6 và 3.7.
Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis
Enzyme Amylase Protease Celluase

4.67 ± 0.33 4.33 ±0.67 7 ± 0.58
phân giải (mm)
Nhận xét:
Kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.10, 3.11 cho thấy chủng Bacillus khảo sát có
khả năng sinh cả 3 loại enzyme ngoại bào là amylase, protease và cellulase. Có thể
đây là một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus để chúng thích nghi và tồn tại với
điều kiện môi trường sống phức tạp. Thí nghiệm khảo sát hoạt lực enzyme của
B.subtilis cho kết quả vòng phân giải enzyme amylase, protease và cellulose lần
lượt là 4.67, 10.33 và 7mm .
So sánh kết quả với kết quả thí nghiệm của Trần Thị Bích Quyên (2012) về
khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus cho kết quả đường kính
vòng phân giải enzyme amylase khoảng từ 10 đến 17.5 (mm), protease khoảng từ
8.5 đến 25 (mm) và cellulose là từ 8 đến 26 (mm). Nghiên cứu khảo sát về khả năng
sinh enzyme ngoại bào của tác giả Nguyễn Văn Phúc và Phan Thị Phượng Trang
(2014) cho kết quả đường kính vòng phân giải amylase, protease và cellulase lần
lượt là 6, 6.25 đến 7 và 6.5 đến 7 (mm).
32
Khảo sát cho thấy chủng Bacillus subtilis thí nghiệm có khả năng sinh
enzyme ngoại bào phân giải yếu hơn so với các chủng Bacillus đã được các tác giả
khảo sát trước đó. Khả năng sinh enzyme ngoại bào thấp có thể do điều kiện thí
nghiệm chưa tối ưu. Tuy nhiên, chủng B.subtilis thí nghiệm có khả năng sinh 3 loại
enzyme ngoại bào và hoạt lực sinh enzyme có thể tối ưu bằng các điều kiện nuôi
cấy thích hợp.
Hình 3.5. Vòng phân giải amylase trước và sau khi nhỏ thuốc thử
Hình 3.6. Vòng phân giải cellulase trước và sau khi nhỏ thuốc thử
Hình 3.7. Vòng phân giải protease trước và sau khi nhỏ thuốc thử
3.2. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men
Việc thu nhận sinh khối để sản xuất chế phẩm vi sinh đòi hỏi quá trình lên
men vi sinh vật phải đạt số lượng tế bào cao nhất, có sức sống tốt và hoạt tính cao
nhất. Khảo sát thời gian lên men của B.subtilis giúp ghi nhận được thời gian lên
men tối ưu để có thể thu nhận được nguồn sinh khối nhiều nhất để làm ra chế phẩm
đạt chất lượng cao với thời gian và giá thành tốt nhất.
Thí nghiệm khảo sát thời gian sinh trưởng tạo sinh khối được thực hiện theo
7 khoảng thời gian lần lượt là 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ.
Kết quả số lượng tế bào vi khuẩn B.subtilis được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.8.
33
Bảng 3.5. Số lượng tế bào sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ lên men
(x1015 CFU/g)
Thời gian
lên men 0 12 24 36 48 60 72
(giờ)
Số lượng
tế bào
74 ± 6d 93 ± 6d 145 ± 5c 196 ± 9b 234 ± 5a 213 ± 8ab 192 ± 13b
(x10 15
CFU/g)
250
Số lượng tế bào (x1015 CFU/g)
200
150
Số tế bào
100
50
0
0 12 24 36 48 60 72 thời gian (giờ)
Hình 3.8. Số lượng tế bào B.subtilis ở các khoảng thời gian lên men khác nhau
(x1015 CFU/g)
Nhận xét:
Từ kết quả được thể hiện ở bảng 3.6 và biểu đồ về số khuẩn lạc sau 12 giờ,
24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ đã xử lý số liệu cho thấy lượng sinh khối
tạo ra từ 0 giờ đến 24 giờ tăng chậm là do vi sinh vật thích ứng với môi trường mới.
Từ 24 giờ đến 48 giờ tăng nhanh và cao nhất ở 48 giờ với số khuẩn lạc 234 ở nồng
độ pha loãng 10-14 do theo biểu đồ sinh trưởng của B.subtilis thì thời gian từ 24 giờ
đến 48 giờ là ở pha ổn định (pha log) của quá trình sinh trưởng. Bắt đầu từ sau 48
giờ đến 72 giờ, số lượng khuẩn lạc giảm dần theo thời gian, khi tế bào ở trạng thái
cân bằng động nên mật độ tế bào có khi tăng, giảm tuy nhiên luôn ổn định. Hoạt
tính đối kháng của chủng nghiên cứu đạt cực đại ở thời điểm 48 giờ, ổn định đến 60
giờ, sau đó giảm nhẹ và giảm mạnh sau 72 giờ nuôi cấy
34
Kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Duy Khánh (2006) về việc khảo sát
thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis thể hiện rằng ở khoảng
thời gian 48 giờ nuôi cấy ghi nhận được số lượng tế bào vi sinh vật đạt cao nhất.
Tương tự, kết quả nghiên cứu về thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis của tác giả Lê
Thị Bích Phượng (2012) cũng đưa ra thời gian nuôi cấy tối ưu của B.subtilis là
khoảng từ 40 đến 48 giờ lên men. Và kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Thị Phi
(2007) trong thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy Bacillus subtilis cũng đưa ra kết
luận rằng thời gian nuôi cấy 48 giờ là tối ưu cho việc thu nhận sinh khối vi khuẩn
B.subtilis.
Như vậy cho thấy, sinh khối vi khuẩn B.subtilis của đạt cực đại ở 48 giờ.
Thời gian lên men tạo ra sản phẩm phải có lượng vi sinh vật cao nhất và việc thu
sinh khối phải diễn ra ở cuối pha log để sinh khối vi sinh vật đạt chất lượng tốt, khả
năng sống sót cao cho quá trình bổ sung vào sản phẩm probiotic. Xét số liệu cho
thấy thời gian lên men 48 giờ là phù hợp với yêu cầu sản phẩm.
3.3. Kiểm tra số lượng tế bào B.subtilis sau sấy
Chế phẩm sau khi được lên men thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 45°C
trong 2 ngày để làm khô chế phẩm. Thời gian và nhiệt độ sấy có thể ảnh hưởng đến
số lượng tế bào sống trong chế phẩm. Việc kiểm tra lại số lượng tế bào với mục
đích khảo sát khả năng sống sót của vi khuẩn B.subtilis trong chế phẩm để điều
chỉnh điều kiện sấy cho phù hợp giúp số lượng sinh khối sống còn nhiều nhất có
thể. Và kết quả như sau:
Số lượng tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis = 228.1011 CFU/g
Theo kết quả thí nghiệm về thời gian lên men thu sinh khối cao nhất khoảng
48 giờ lên men thu được số lượng tế bào của Bacillus subtilis là 234.1015 CFU/g. So
sánh số lượng tế bào trước và sau khi sấy có sự chênh lệch lớn từ 234.10 15 CFU/g
còn lại 228.1011 CFU/g. Sự chệnh lệch lớn như vậy có thể là do nhiệt độ sấy và thời
gian sấy làm ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật. Với thời gian sấy 2
ngày, vi sinh vật trong chế phẩm có thể chuyển từ pha log đến pha suy thoái gây ra
việc giảm số lượng tế bào xuống đáng kể. Như vậy, việc rút ngắn thời gian sấy có
thể sẽ giảm được tỷ lệ vi sinh vật chết trong chế phẩm giúp chế phẩm duy trì được
số lượng tế bào tốt hơn.
3.4. Kiểm tra các chỉ tiêu của chế phẩm tạo ra
3.4.1. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang
Nguồn chế phẩm thô sau khi lên men để thu sinh khối tối ưu được sử dụng
làm thức ăn phối trộn trong chăn nuôi. Tuy nhiên, do thời gian lên men đã làm
nguồn dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, cùng với việc sấy khô làm cho vi sinh
35
vật thiếu hụt chất dinh dưỡng. Điều đó khiến cho số lượng tế bào vi sinh vật trong
chế phẩm không còn chất lượng. Vì thế, việc phối trộn thêm cho chế phẩm góp
phần bổ sung một lượng nguồn dinh dưỡng khô cho vi sinh vật có thể duy trì lượng
sinh khối tốt nhất trong thời gian dài bảo quản.
Việc phối trộn chủ yếu dựa trên các nguồn dinh dưỡng cơ bản cho vi sinh vật
phát triển như nguồn Carbon, Nitơ… Tỷ lệ phối trộn chế phẩm cùng với chất mang
cũng góp phần quan trọng trong việc duy trì số lượng tế bào vi sinh vật trong sản
phẩm. Vì thế, thí nghiệm đưa ra 5 tỷ lệ phối trộn theo tỷ lệ chế phẩm : bã mía : cám
gạo và kết quả được thể hiện ở bảng 3.7 sau đây.
Bảng 3.6. Số lượng tế bào theo các tỷ lệ phối trộn sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày
(x1011 CFU/g)
Tỷ lệ phối trộn 5 ngày 10 ngày 15 ngày Trung bình
10:45:45 191 ± 8 148 ± 13 128 ± 16 155.67c
10:55:35 192 ± 9 160 ± 9 145 ± 12 165.89bc
10:65:25 200 ± 6 175 ± 17 142 ± 11 172.56abc
10:75:15 206 ± 8 178 ± 11 147 ± 18 177.0ab
10:85:5 209 ± 11 183 ± 8 162 ± 11 184.56a
Nhận xét:
Với kết quả được thể hiện trên bảng 3.7 và số liệu sau khi xử lý cho thấy, ở
tỷ lệ phối trộn có sự phân hạng về số lượng vi khuẩn B.subtilis sống trong sản phẩm
thức ăn chăn nuôi. Sự phân hạng cho ta biết được ở môi trường khô, vi sinh vật vẫn
có thể tồn tại nhưng với điều kiện nhất định. Sự phân hạng cũng cho thấy được sự
tối ưu hóa về nguyên liệu phối trộn để giúp cho sản phẩm sản xuất ra có giá thành
hợp lý, có sức cạnh tranh trên thị trường. Theo kết quả sau xử lý số liệu cho thấy, ở
tỷ lệ phối trộn 10:85:5 có mức phân hạng cao nhất trong 5 tỷ lệ phối trộn được khảo
sát. Từ kết quả trên bảng có thể thấy việc giảm hàm lượng cám gạo trong sản phẩm
phối trộn giúp cho vi sinh vật có thể sống ở thời gian lâu hơn. Điều đó có thể giải
thích rằng, việc bổ sung cám gạo trong tỷ lệ phối trộn góp phần bổ sung nguồn Nitơ
cho vi sinh vật sống trong môi trường bảo quản lâu dài. Tuy nhiên, nhiều nghiên
cứu cho thấy việc bổ sung lượng Nitơ quá nhiều có thể gây ảnh hưởng đến quá trình
sống của vi sinh vật. Như kết quả khảo sát của tác giả Trần Thị Bích Quyên (2012)
về sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến quá trình sống của chủng Bacillus nói rằng
nồng độ Nitơ cho sự tăng sinh khối tế bào của chủng Bacillus là 1 – 5%. Tương tự
36
kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quỳnh Trang (2013) trong việc khảo sát ảnh
hưởng của nguồn dinh dưỡng đến B.subtilis cũng đưa ra tỷ lệ nguồn Nitơ 1 – 5%.
Từ những kết quả trên, tỷ lệ phối trộn giữa sản phẩm lên men: bã mía : cám gạo
10:85:5 là tốt nhất cho vi khuẩn Bacillus subtilis tồn tại trong thời gian lâu nhất.
3.4.2. Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của sản phẩm
Bảng 3.7. Đường kính vòng kháng E.coli và Salmonella
ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau
Đường kính
Tỷ lệ
vòng kháng 100 10-1 10-2 10-3
phối trộn
khuẩn (mm)
Salmonella 18 ± 1.73 - - -
10 : 45 : 45
E.coli - - - -
Salmonella 26.67 ± 2.03 - - -

10 : 55 : 35
E.coli 13.33 ± 0.88 - - -
Salmonella 23.33 ± 0.88 16.67 ± 0.67 - -

10 : 65 : 25
E.coli 21.67 ± 0.88 14.33 ± 0.88 - -
Salmonella 30.67 ± 0.88 24.33 ± 0.88 20.33 ± 0.88 14.33 ± 0.88

10 : 75 : 15
E.coli 28.33 ± 0.88 19.67 ± 0.88 - -
Salmonella 33.67 ± 1.33 28.33 ± 0.67 20.67 ± 0.88 17.67 ± 0.67

10 : 85 : 5
E.coli 30.33 ± 0.67 21.67 ± 0.88 - -
Nhận xét:
Dựa vào kết quả được thể hiện trên bảng 3.8 cho thấy, ở tỷ lệ phối trộn
10:75:15 và 10:85:5 có khả năng kháng khuẩn khá mạnh ( kháng E.coli đến nồng độ
pha loãng 10-1 và kháng Salmonella đến nồng độ pha loãng 10-3). Tuy số liệu có
chênh lệch nhưng hầu hết không đáng kể.
Cùng với kết quả của việc khảo sát tỷ lệ phối trộn giữa chế phẩm:bã mía:cám
gạo, cho thấy ở tỷ lệ phối trộn 10:75:15 và 10:85:5 mang lại kết quả về số lượng tế
bào và khả năng kháng khuẩn cao hơn các tỷ lệ còn lại. Tuy nhiên, tính theo mặt giá
thành sản phẩm, tỷ lệ 10:85:5 có giá trị kinh tế hơn do giá của cám gạo trên thị
37
100 10-1
trường đắt hơn nhiều so với bã mía nên việc lựa chọn sản xuất cần chọn tỷ lệ phối
trộn có giá trị kinh tế hơn. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ phối trộn giữa chế
phẩm:bã mía:cám gạo là 10:85:5 để sử dụng cho việc thử nghiệm sản xuất.
100 10-1 10-2
10-3
trên Salmonella
100 10-1
100 10-1 10-2
38
10-3
trên Salmonella
100 10-1
39
100 10-1
trên Salmonella
100
trên E.coli
100
trên Salmonella
40
100
100
trên Salmonella
41
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ những thực nghiệm trên, chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
 Kiểm tra được các đặc tính của Bacillus subtilis sử dụng làm chế phẩm
probiotic:
- Có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như E.coli, Salmonella
- Có khả năng sinh 3 loại enzyme ngoại bào (trong đó khả năng sinh enzyme
cellulase cao, còn lại amylase và protease còn yếu)
- Có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày với phần trăm sống sót lần lượt là
53.98%, 65.83% và 81.99% ở pH 2, 2.5 và 3 sau 4 giờ khảo sát.
- Có khả năng chịu được nồng độ muối mật với phần trăm sống sót lần lượt là
79.48%, 75.83%, 62.21% và 52.71% ở nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5% và 2%
sau 4 giờ khảo sát.
 Xác định được khoảng thời gian 48 giờ là thời gian nuôi cấy tạo sinh khối
cao nhất thích hợp cho việc thu nhận sinh khối để sử dụng làm chế phẩm vi sinh với
số lượng tế bào là 234.1015 CFU/g.
 Kiểm tra số lượng tế bào sống của vi khuẩn Bacillus subtilis trong chế phẩm
sau khi sấy khô là 228.1011 CFU/g.
 Khảo sát tỷ lệ phối trộn giữa chế phẩm vi sinh : bã mía : cám gạo là 10: 85: 5
là tối ưu cho việc bảo quản Bacillus subtilis. Đồng thời cũng kiểm tra được số
lượng tế bào vi sinh vật sau 15 ngày đóng gói là 162.1011 CFU/g.
 Lựa chọn tỷ lệ phối trộn giữa chế phẩm vi sinh : bã mía : cám gạo là 10:85:5
dựa vào số lượng tế bào sống trong sản phẩm, khả năng kháng khuẩn và giá trị kinh
tế của sản phẩm.
4.2. Kiến nghị
- Khảo sát khả năng bám dính dạ dày.
- Khảo sát thêm nhiều loại chất mang.
- Kiểm tra độ ẩm sản phẩm.
- Khảo sát tỉ lệ phối trộn với thức ăn chăn nuôi.
- Thử nghiệm trực tiếp cho heo ăn.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt
[1]- Vũ Quý Ba (2013). Tối ưu hóa một số điều kiện thu sinh khối của các
chủng Bacillus tạo chế phẩm nuôi tôm, Luận văn tốt nghiệp.
[2]- Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạm Văn
Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến (1976). Một số phương pháp nghiên
cứu vi sinh vật học tập I, II, III, NXB Khoa học kỹ thuật.
[3]- Nguyễn Thị Huyền và cộng sự (2014). Khảo sát thành phần vi sinh và
các đặc tính probiotic của các sản phẩm men tiêu hóa trên thị trường, Tạp chí Khoa
học và Phát triển 2014, tập 12, số 1: 65 – 72.
[4]- Lý Kim Hữu (2005). Khảo sát đặc điểm của B.subtilis và tìm hiểu điều
kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic, Luận văn tốt
nghiệp.
[5]- Đặng Đình Kim và cộng sự (2003). Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật
xử lý nền đáy ao nuôi tôm cao sản, NXB Nông nghiệp.
[6]- Nguyễn Quỳnh Nam (2006). Phân lập vi khuẩn B.subtilis trong phân
heo và thử đối kháng với E.coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, Luận văn tốt nghiệp.
[7]- Trần Trường Nhân (2009). Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ phân
heo đối kháng với E.coli và ứng dụng trong sản xuất probiotic, Luận văn tốt nghiệp.
[8]- Lê Minh Cẩm Ngọc (2005). Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế
phẩm probiotic. Tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm,
Luận văn tốt nghiệp.
[9]- Bùi Thị Phi (2007). Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu
khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế
phẩm sinh học, Khóa luận tốt nghiệp.
[10]- Trần Thị Bích Quyên (2012). Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng
Bacillus làm probiotic trong chăn nuôi, Luận văn tốt nghiệp.
Tài liệu Tiếng Anh
[11]- Maloy Kumar Sahu và cộng sự (2008). Probiotic in acquaculture:
importance and future perspectives.
43
PHỤ LỤC I
SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
3.1.1. Thử nghiệm khả năng đối kháng với E.coli và Salmonella
 Kết quả đối kháng với E.coli

B.subtilis
100 25 30 26 27 ± 1.53
10-1 14 12 18 14.67 ± 1.76
10-2 9 8 8 8.33 ± 0.33
10-3 10 8 8 8.67 ± 0.67
10-4 0 0 0 0
10-5 0 0 0 0
Nồng độ Count Average Standard error
100 3 27.0 1.52753
10-1 3 14.6667 1.76383
10-2 3 8.33333 0.333333
10-3 3 8.66667 0.666667
Total 12 14.6667 2.33658
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
Between groups 684.667 3 228.222 50.72 0.0000
Within groups 36.0 8 4.5
Total (Corr.) 720.667 11
44
 Kết quả đối kháng với Salmonella

B.subtilis
100 32 34 34 33.33 ± 0.67
10-1 23 24 27 24.67 ± 1.20
10-2 16 12 14 14 ± 1.15
10-3 8 7 6 7 ± 0.58
10-4 0 0 0 0
10-5 0 0 0 0
Nồng độ Count Average Standard error
100 3 33.3333 0.666667
10-1 3 24.6667 1.20185
10-2 3 14.0 1.1547
10-3 3 7.0 0.57735
Total 12 19.75 3.05784
Between groups 1212.92 3 404.306 151.61 0.0000
Within groups 21.3333 8 2.66667
Total (Corr.) 1234.25 11
3.1.2. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày

pH trung tính: (Đối chứng)
Thời gian Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Tỷ lệ sống sót
45
(%)
0h 233 232 226 230 ± 2 100
2h 234 238 230 234 ± 2 101.74
4h 241 244 238 241 ± 2 104.78
Thời gian Count Average Standard error
0 3 230.333 2.18581
2 3 234.0 2.3094
4 3 241.0 1.73205
Total 9 235.111 1.88152
Between groups 176.222 2 88.1111 6.72 0.0294
Within groups 78.6667 6 13.1111
Total (Corr.) 254.889 8
pH 2
Tỷ lệ sống sót
Thời gian Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
(%)
0h 141 204 182 176 ± 18 100
2h 114 186 129 143 ± 22 81.25
4h 80 105 101 95 ± 8 53.98
0 3 175.667 18.4602
2 3 143.0 21.9317
4 3 95.3333 7.75314
46
Total 9 138.0 14.4741
Between groups 9792.67 2 4896.33 5.55 0.0432
Within groups 5291.33 6 881.889
Total (Corr.) 15084.0 8
pH 2.5
(%)
0h 173 209 215 199 ± 13 100
2h 161 133 199 164 ± 19 82.41
4h 146 116 132 131 ± 9 65.83
0 3 199.0 13.1149
2 3 164.333 19.1253
4 3 131.333 8.66667
Total 9 164.889 12.1031
Between groups 6869.56 2 3434.78 5.60 0.0424
Within groups 3677.33 6 612.889
Total (Corr.) 10546.9 8
pH 3
Thời gian Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Tỷ lệ sống sót
47
(%)
0h 225 215 194 211 ± 9 100
2h 201 212 179 197 ± 10 93.36
4h 159 178 181 173 ± 7 81.99
Thờigian Count Average Standard error
0 3 211.333 9.13479
2 3 197.333 9.70109
4 3 172.667 6.88799
Total 9 193.778 7.11957
Between groups 2299.56 2 1149.78 5.11 0.0506
Total (Corr.) 3649.56 8
3.1.3. Khảo sát khả năng chịu muối mật:

Nồng độ muối mật 0% (Đối chứng):
(%)
0h 233 232 226 230 ± 2 100
2h 234 238 230 234 ± 2 101.74
4h 241 244 238 241 ± 2 104.78
0 3 230.333 2.18581
2 3 234.0 2.3094
48
4 3 241.0 1.73205
Total 9 235.111 1.88152
Between groups 176.222 2 88.1111 6.72 0.0294
Within groups 78.6667 6 13.1111
Total (Corr.) 254.889 8
Nồng độ muối mật 0.5%:
(%)
0h 230 223 235 229 ± 3 100
2h 209 225 221 218 ± 5 95.20
4h 173 183 191 182 ± 5 79.48
0 3 229.333 3.4801
2 3 218.333 4.8074
4 3 182.333 5.20683
Total 9 210.0 7.45356
Between groups 3626.0 2 1813.0 29.09 0.0008
Total (Corr.) 4000.0 8
Nồng độ muối mật 1%:

49
(%)
0h 198 226 210 211 ± 8 100
2h 158 197 206 187 ± 15 88.63
4h 150 158 171 160 ± 6 75.83
0 3 211.333 8.11035
2 3 187.0 14.7309
4 3 159.667 6.11919
Total 9 186.0 9.0753
Between groups 4008.67 2 2004.33 6.26 0.0340
Within groups 1921.33 6 320.222
Nồng độ muối mật 1.5%:

(%)
0h 228 234 188 217 ± 14 100
2h 184 133 189 169 ± 18 77.88
4h 102 163 140 135 ± 18 62.21
0 3 216.667 14.4376
2 3 168.667 17.8916
4 3 135.0 17.7858
50
Total 9 173.444 14.5183
Between groups 10106.9 2 5053.44 5.98 0.0373
Within groups 5069.33 6 844.889
Total (Corr.) 15176.2 8
Nồng độ muối mật 2%:

(%)
0h 210 178 221 203 ± 13 100
2h 158 172 98 143 ± 23 70.44
4h 67 134 119 107 ± 20 52.71
0 3 203.0 12.897
2 3 142.667 22.6961
4 3 106.667 20.3005
Total 9 150.778 16.9876
Between groups 14216.2 2 7108.11 6.50 0.0315
Within groups 6561.33 6 1093.56
Total (Corr.) 20777.6 8
Enzyme Kích thước vòng phân giải (mm)

51
Amylase 4 5 5 4.67 ± 0.33
Protease 3 5 5 4.33 ± 0.67
Cellulase 7 6 8 7 ± 0.58
Enzyme Count Average Standard error
Amylase 3 4.66667 0.333333
Protease 3 4.33333 0.666667
Cellulase 3 7.0 0.57735
Total 9 5.33333 0.5
Between groups 12.6667 2 6.33333 7.12 0.0260
Within groups 5.33333 6 0.888889
3.2. Khảo sát thời gian cho quá trình lên men
Thời gian lên men Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
0 giờ 75 62 84 74 ± 6d
12 giờ 95 82 102 93 ± 6d
24 giờ 137 154 144 145 ± 5c
36 giờ 181 213 195 196 ± 9b
48 giờ 231 244 229 235 ± 5a
60 giờ 225 214 199 213 ± 8ab
72 giờ 217 172 186 192 ± 13b
52
0 3 73.6667 6.38575
12 3 93.0 5.85947
24 3 145.0 4.93288
36 3 196.333 9.26163
48 3 234.667 4.70225
60 3 212.667 7.5351
72 3 191.667 13.2958
Total 15 196.067 8.55596
Between groups 68205.2 6 11367.5 60.16 0.0000
Within groups 2645.33 14 188.952
Total (Corr.) 70850.6 20
Thời gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
24 3 145.0 9.05293 X
72 3 191.667 9.05293 X
36 3 196.333 9.05293 X
60 3 212.667 9.05293 XX
48 3 234.667 9.05293 X
3.3. Kiểm tra chế phẩm
Lặp lại Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Số khuẩn lạc 215 224 245 228 ± 9
Col_9 Count Average Standard error
53
0 3 228.0 8.88819
1 3 1.0 0.0
Total 6 114.5 50.9141
3.4. Khảo sát tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang
Tỷ lệ Ngày Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
5 188 206 179 191 ± 8
10:45:45 10 133 175 137 148 ± 13
15 134 151 98 128 ± 16
5 209 178 189 192 ± 9
10:55:35 10 173 142 166 160 ± 9
15 122 153 161 145 ± 12
5 209 203 189 200 ± 6
10:65:25 10 191 141 194 175 ± 17
15 156 149 121 142 ± 11
5 213 214 190 206 ± 8
10:75:15 10 158 194 182 178 ± 11
15 122 138 182 147 ± 18
5 189 213 226 209 ± 11
10:85:5 10 199 178 171 183 ± 8
15 160 182 143 162 ± 11
Tỷ lệ phối trộn Ngày Count Average Standard error F-Ratio P-Value
45:45 5 3 191.0 7.93725 6.44 0.0321
54
10 3 148.333 13.3832
15 3 127.667 15.6241
5 3 192.0 9.07377
55:35 10 3 160.333 9.38675 5.46 0.0446
15 3 145.333 11.893
5 3 200.333 5.92546
65:25 10 3 175.333 17.1885 5.78 0.0400
15 3 142.0 10.6927
5 3 205.667 7.83865
75:15 10 3 178.0 10.583 5.16 0.0497
15 3 147.333 17.9382
5 3 209.333 10.8372
85:5 10 3 182.667 8.41295 5.42 0.0452
15 3 161.667 11.2891
MAIN EFFECTS
Ngày 22686.5 2 11343.3 33.23 0.0000
Tỷ lệ phối trộn 4349.87 4 1087.47 3.19 0.0237
RESIDUAL 12972.8 38 341.389
TOTAL (CORRECTED) 40009.2 44
Tỷ lệ Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups
phối trộn
45:45 9 155.667 6.15891 X
55:35 9 165.889 6.15891 XX
65:25 9 172.556 6.15891 XXX
75:15 9 177.0 6.15891 XX
85:5 9 184.556 6.15891 X
55
3.5. Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của sản phẩm
Tỷ lệ phối trộn 10:45:45
Salmonella
100 16 21 17 18 ± 1.73

E.coli
100 15 12 13 13.33 ± 0.88
Salmonella
100 22 26 29 26.67 ± 2.03

E.coli
100 23 20 22 21.67 ± 0.88
10-1 13 14 16 14.33 ± 0.88
Col_ Count Average Standard error

1
0 3 21.6667 0.881917
1 3 14.3333 0.881917
Total 6 18.0 1.73205
Between groups 80.6667 1 80.6667 34.57 0.0042
56
Within groups 9.33333 4 2.33333
Salmonella
100 23 22 25 23.33 ± 0.88
10-1 16 18 16 16.67 ± 0.67
0 3 23.3333 0.881917
1 3 16.6667 0.666667
Total 6 20.0 1.57056
Between groups 66.6667 1 66.6667 36.36 0.0038
Within groups 7.33333 4 1.83333

E.coli
100 28 30 27 28.33 ± 0.88
10-1 20 18 21 19.67 ± 0.88
0 3 28.3333 0.881917
1 3 19.6667 0.881917
57
Total 6 24.0 2.0166
Between groups 112.667 1 112.667 48.29 0.0023
Within groups 9.33333 4 2.33333
Salmonella
100 31 29 32 30.67 ± 0.88
10-1 24 26 23 24.33 ± 0.88
10-2 22 20 19 20.33 ± 0.88
10-3 16 14 13 14.33 ± 0.88
0 3 30.6667 0.881917
1 3 24.3333 0.881917
2 3 20.3333 0.881917
3 3 14.3333 0.881917
Total 12 22.4167 1.83178
Between groups 424.25 3 141.417 60.61 0.0000
Within groups 18.6667 8 2.33333
Total (Corr.) 442.917 11
58
E.coli
100 31 29 31 30.33 ± 0.67
10-1 23 20 22 21.67 ± 0.88
0 3 30.3333 0.666667
1 3 21.6667 0.881917
Total 6 26.0 2.0
Between groups 112.667 1 112.667 61.45 0.0014
Within groups 7.33333 4 1.83333
Salmonella
100 35 35 31 33.67 ± 1.33
10-1 29 27 29 28.33 ± 0.67
10-2 21 19 22 20.67 ± 0.88
10-3 19 17 17 17.67 ± 0.67
0 3 33.6667 1.33333
1 3 28.3333 0.666667
2 3 20.6667 0.881917
3 3 17.6667 0.666667
59
Total 12 25.0833 1.94024
Between groups 476.25 3 158.75 61.45 0.0000
Within groups 20.6667 8 2.58333
Total (Corr.) 496.917 11
60
PHỤ LỤC II
HÌNH ĐẾM KHUẨN LẠC
pH 2 pH 2
pH 2
Hình 1. Số khuẩn lạc của pH 2 tại thời điểm 0h, 2h, 4h
pH 2.5 pH 2.5
pH 2.5
Hình 2. Số khuẩn lạc của pH 2.5 tại thời điểm 0h, 2h, 4h
pH 3 pH 3
pH 3
Hình 3. Số khuẩn lạc của pH 3 tại thời điểm 0h, 2h, 4h
61
Hình 4. Số khuẩn lạc của nồng độ muối mật 0.5% tại 0h, 2h, 4h
M=0,5% M=0,5% M=0,5%
Hình 5. Số khuẩn lạc của nồng độ muối mật 1% tại 0h, 2h, 4h
M=1% M=1% M=1%
M=1,5% M=1,5% M=1,5%
Hình 6. Số khuẩn lạc của nồng độ muối mật 1.5% tại 0h, 2h, 4h
62
M=2% M=2% M=2%
Hình 7. Số khuẩn lạc của nồng độ muối mật 2% tại 0h, 2h, 4h
24h 36h 48h
60h 72h
Hình 8. Số khuẩn lạc tại các thời gian lên men
63
10:45:45 10:45:45 10:45:45
Hình 9. Số khuẩn lạc của tỉ lệ phối trộn 10:45:45

sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày
10:55:35 10:55:35 10:55:35

10:65:25 10:65:25 10:65:25

64
10:75:15 10:75:15 10:75:15

10:85:5 10:85:5 10:85:5

65

DO-AN-B.SUBTILIC Full

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

DO-AN-B.SUBTILIC Full

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

LỜI CẢM ƠN..........................................................................................................iii

DANH MỤC BẢNG

Các phản ứng sinh hóa Kết quả

Hoạt tính catalase +

(The Holt, 1992) [4]

1.2. Giới thiệu chung về probiotic

Kiểm soát chất lượng

Lên men thu sinh khối

Kiểm soát chất lượng Làm khô

Hình 1.1. Quy trình tạo chế phẩm

*Kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất

Muối khoáng 10g/L

- Môi trường cấp 2:

Bột bắp xay mịn 70g

Cám gạo 30g

Khô dầu lạc 50g

- Môi trường thử hoạt tính amylase:

Tinh bột 10g/L

- Môi trường thử hoạt tính protease:

Sữa gầy 5g/L

- Môi trường thử hoạt tính cellulase:

2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

STT Tên hóa chất SL/ĐVT Ghi chú

7 Cao nấm men g

2.4. Phương pháp

Cám gạo, bột

Hoạt hóa giống

- Kiểm tra khả năng kháng khuẩn Đổ lên khay

Sấy khô ở nhiệt độ 45oC

Kiểm tra mật độ VSV sống

Phối trộn với cám gạo,

Hình 2.1. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi

E.coli Giống B.subtilis

Cấy trang bề mặt

Thấm dịch vào

Đặt lên môi trường

Nồng độ pha loãng

2.4.2.2. Khả năng đối kháng với Salmonella

Cấy trang bề mặt

Thấm dịch vào

Đặt lên môi trường

- Cân các thành phần hòa tan vào nước cất.

Nồng độ pha loãng Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

2.4.2.3. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp của dạ dày

Thời gian (giờ) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

2.4.2.4. Thử nghiệm khả năng chịu đựng muối mật

Thời gian (giờ) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

2.4.3. Kiểm tra hoạt lực enzyme

Kích thước vòng phân giải (mm)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

Vòng phân giải

2.4.3.2. Khả năng sinh cellulase

Kích thước vòng phân giải (mm)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình