chế phẩm protease từ natto

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Thị Nhung
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ

BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
Bùi Thị Nhung
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ

BACILLUS SUBTILIS CÓ TRONG NATTO NHẬT BẢN
HƯỚNG TỚI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 60 42 01 07
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN HỮU PHÚC
Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu được trình bầy trong phần kết quả của luận văn này là do
chính tôi thực hiện và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nào.
Tác giả luận văn
Bùi Thị Nhung
1
LỜI CẢM ƠN
Sau hai năm học tập và nghiên cứu, nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
Sinh học. Để đạt được thành quả như ngày hôm nay
Tôi xin chân thành cảm ơn:
 Toàn thể quý Thầy, Cô khoa sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp. HCM đã truyền
đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong thời gian tôi theo học tại trường.
 TS. Nguyễn Hữu Phúc – giáo viên hướng dẫn của tôi, một người thầy nhưng cũng
rất gần gũi và luôn tận tâm đối với học trò của mình. Người đã hết lòng hướng dẫn, quan
tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong những lúc khó khăn. Thầy đã truyền đạt kiến thức và
kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này .
 Sở Giáo Dục - Đào Tạo tỉnh Bình Dương, Trường THPT An Mỹ đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian đi học.
 Ths. Dương Nhật Linh và Ths. Nguyễn Văn Minh (Đại Học Mở) đã nhiệt tình
giúp đỡ và hỗ trợ tôi làm thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
 Em Trang, Quỳnh, Phi (sinh viên Đại Học Mở) và toàn thể các bạn học viên cao
học khóa 22 đã luôn giúp đỡ, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
 Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân yêu trong gia đình đã
luôn bên cạnh, ủng hộ tôi, là nguồn động viên lớn lao nhất và hy sinh nhiều nhất để tôi có
được ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn
Bùi Thị Nhung
2
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 1
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 2
MỤC LỤC .................................................................................................................... 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ 6
MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................................. 7
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................................... 8
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................... 8
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10
1.1. Khái quát chung về protease .................................................................................... 10
1.1.1. Khái niệm và phân loại ......................................................................................... 10
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease ......................................................... 13
1.1.3. Enzyme protease kiềm .......................................................................................... 19
1.1.4. Enzyme Nattokinase ............................................................................................. 26
1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn ....... 30
1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn ........................................................ 30
1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme.................................................. 30
1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn ......................................................... 31
1.3. Đại cương về Bacillus subtilis ................................................................................... 31
1.3.1. Lịch sử phát triển .................................................................................................. 31
1.3.2. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 32
1.3.3. Đặc điểm phân bố ................................................................................................. 32
1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa ............................................................................. 32
1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.1. Khái niệm về huyết khối ....................................................................................... 34
1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối ..................................................................... 34
1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối ........................................................................... 35
1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam ....................................... 36
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 37
2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 37
2.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................... 37
3
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................... 37
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 37
2.2. Môi trường nghiên cứu ............................................................................................. 37
2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát) ................ 39
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto .................................................. 40
2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV .............................................................................. 41
2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng ...................................................... 41
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc ........................................................... 42
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................... 42
2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop .................................................... 43
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase ..................................................... 43
2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM .......... 44
2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét ....................................... 44
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử .......................................... 44
2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ............................... 45
2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân ............. 46
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến .......................... 47
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry...................................... 49
2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase ........................................................ 50
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng hợp
protease của chủng B. subtilis N18 ................................................................................. 51
2.3.17. Phương pháp làm natto ....................................................................................... 54
2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men................................... 55
2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme ......................................................................... 56
2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme ........................................................................... 56
2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol58
2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 58
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 60
3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao ........................... 60
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản............................................... 60
3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao.............................................. 61
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi.... 66
3.2.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 66
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái .......................................................................... 68
4
3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử ....................... 68
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease
của chủng B. subtilis N18 ................................................................................................. 69
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành ....................................................... 69
3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường ...................................................................... 71
3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men ........................................................................ 72
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu .................................................................................. 73
3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống .................................................................................... 75
3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ ................................................................................... 76
3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease ...... 77
3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm................................................................................... 78
3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase ............................................ 82
3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của
Nhật Bản ......................................................................................................................... 82
3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn ..................... 86
3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis ............... 91
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 96
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 103
5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ACE Angiotensin
BT Bào tử
CPE Chế phẩm enzyme
ĐN & GL Đậu nành và gạo lức
ĐN Đậu nành
G(-) Gram âm
G(+) Gram dương
GL Gạo lức
KHV Kính hiển vi
KL Khuẩn lạc
MT Môi trường
NXB Nhà xuất bản
OD Mật độ quang
PP Phương pháp
STT Số thứ tự
TB Tế bào
TCA Axit tricloacetic
TN Thí nghiệm
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
6
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết
peptid (-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy
phân này có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn, nhiều enzyme protease còn
có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc
acid amin. Protease là các enzyme công nghiệp quan trọng hàng đầu, chiếm ít nhất một
phần hai tổng sản lượng thị trường enzyme trên toàn thế giới (Rao et al.,1998). Các
enzyme protease chiếm vị trí quan trọng do được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp khác nhau: Chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc, gia cầm, trong ngành công
nghiệp dược phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp dệt và
thu hồi bạc từ phim ảnh…
Vi sinh vật là nguồn quan trọng nhất trong sản xuất enzyme. Trừ một số ít protease
được sản xuất từ động vật, thực vật như trypsin, chymotrypsin, papain, bromelain, ficin, còn
lại hầu hết đựợc sản xuất từ vi sinh vật [2], trong đó vi khuẩn là nguồn đóng góp chủ yếu,
thứ đến là nấm mốc.
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết do các
bệnh tim mạch (nhồi máu cơ tim và đột quy), mà nguyên nhân là hậu quả của chứng huyết
khối. Theo ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỷ USD
(Cong et al., 2009) [26]. Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán
đột quỵ có liên quan đến huyết khối. Huyết khối xuất hiện khi sợi protein có tên là Fibrin
tích lũy trong lòng mạch. Huyết khối là nguyên nhân gây tắc nghẽn các dòng mạch máu
tới nuôi mô và cơ tim. Nếu dòng mạch máu bị chẹn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm
hoặc không còn. Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối trong
các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não gây tắc nghẽn các mạch máu não và gây ra
các biến chứng như tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ.
Các chất làm tiêu sợi fibrin đường tĩnh mạch như streptokinase, urokinase và hoạt hóa
plasminogen mô ( t-PA ) đã được sử dụng điều trị làm tan huyết khối từ những năm 1960,
1970, 1980. Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học của các chất này tồn tại không lâu nên
có trường hợp huyết khối lại xuất hiện trở lại và nguy cơ biến chứng gây xuất huyết (Kumar
A.,(2010) [40]. Năm 1980 đã có một phát minh vô cùng lý thú đó là enzyme Nattokinase
7
(NK). NK là một enzyme hoạt huyết mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật
Bản có tên là Natto. Nó là một loại gia vị dân gian và là một phương thuốc cổ truyền chữa
bệnh tim mạch. Natto được sản xuất bằng lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis –
một loại vi khuẩn có ích, khi ủ ấm với hạt đậu nành sản sinh ra enzyme NK. Bác sỹ
Hyroyuki Sumi là tác giả đầu tiên phát hiện Natto làm tan huyết khối năm 1980.
Dựa trên nguồn gốc thực phẩm và hoạt tính làm tan huyết khối tương đối mạnh,
NK có lợi thế về y tế và thương mại hóa nhờ tác dụng phòng ngừa và hiệu quả kéo dài,
uống thuận tiện và sự ổn định trong đường tiêu hóa (Sumi et al., 1990). NK tăng cường
hoạt hóa plasminogen và bất hoạt plasminogen activator inhibitor (Sumi et al, 1987,
Urano et al. 2001)[52]. Các sản phẩm NK ngày nay đang được bán rộng rãi trên thế giới
và sử dụng như một thực phẩm chức năng, hầu như không có phản ứng phụ.
Nguyên liệu để sản xuất NK chủ yếu là đậu nành, ngoài ra có thể sử dụng các sản
phẩm phụ của công nghiệp chế biến thực phẩm như cám mì, cám gạo, trấu, các loại vỏ đậu
(đậu xanh, đậu đỏ..), vỏ tôm. Công đoạn lên men có thể thực hiện bằng lên men bán rắn
hoặc lên men chìm, nhiệt độ lên men từ 30-40oC...Ngoài các chủng Bacillus subtilis phân
lập từ Natto, chúng ta có thể tìm kiếm ở Việt nam nhiều chủng Bacillus sp khác từ các sản
phẩm lên men truyền thống hoặc trong đất, nước của Việt nam. Tất cả những điều kiện
như vậy đều có thể đáp ứng ở Việt nam.
Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài :
“Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng
tới thực phẩm chức năng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ Natto Nhật Bản và xác định một số điều kiện tạo
chế phẩm protease giàu nattokinase
3. Nội dung nghiên cứu
1) Phân lập các mẫu B.subtilis từ Natto của Nhật Bản
2) Chọn lọc khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập
3) Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc
4) Phân loại đến loài hai mẫuh Bacillus đã chọn
5) Xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc
6) Nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ
8
7) Đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô
4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 09/2013
- Địa điểm: Viện Sinh Học Nhiệt Đới
Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Đại Học Mở Tp. HCM
9
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát chung về protease

1.1.1. Khái niệm và phân loại
1.1.1.1. Khái niệm protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid
(-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của quá trình thủy phân này
có thể là các acid amin, các polypeptide chuỗi ngắn. Nhiều enzyme protease còn có thể xúc
tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid và phản ứng chuyển vị gốc acid amin.
Phản ứng theo sơ đồ sau:
1.1.1.2. Phân loại protease

1.1.1.2.1. Dựa vào cơ chế xúc tác
Theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm [11]:
Nhóm 1: Exo-peptidase còn gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch. Thủy phân
đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Nếu xúc tác ở đầu gốc carboxyl tự do thì gọi là enzyme
carboxypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase
Dựa trên cơ chất enzyme sử dụng thì protease được chia thành hai nhóm: protease và
peptidase.
Nhóm 2: Endo-peptidase còn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch. Xúc tác phản
ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase.
Cả hai enzyme endo-peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách hiệu quả
trong việc thủy phân phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endo-peptidase là
tạo một lượng lớn những peptid có đầu tận cùng là nhóm carboxyl tự do và nhóm amin tự
do để tạo điều kiện cho exo-peptidase hoạt động.
10
Hình 1.1. Cơ chế xúc tác của enzyme protease
1.1.1.2.2. Dựa vào hoạt động của pH
Dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH khác nhau mà enzyme protease
được chia thành 3 loại.
- Loại 1: Protease acid: pHopt trong khoảng 2 – 5. Nhóm enzyme này xúc tác cho sự thủy
phân các peptid và protein ở vùng pH acid. Ngoài ra chúng còn có khả năng thủy phân một
số đi – tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase.
Loại protease này thường được thu nhận từ các loại nấm sợi như: A. niger, A.
awmori, A.saitoi.
- Loại 2: Protease trung tính: pHopt trong khoảng hẹp, từ 6 – 7,5, không bền với nhiệt độ và
mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm, có trung tâm hoạt động là kim loại, chứa nhiều
Zn2+.
Được thu nhận chủ yếu từ các loại nấm sợi như: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A.
tericola.
- Loại 3: Protease kiềm: pHopt trong khoảng 8 – 11, thường được tổng hợp nhiều bởi vi
khuẩn và nấm men.
Những protease kiềm tính là nhóm được quan tâm khá nhiều trong những năm gần
đây vì có thể sử dụng chúng như chất phụ gia trong việc giặt tẩy, trong quá trình thuộc da,
xử lý chất thải môi trường. Đa số chúng được thu nhận từ chủng Bac.subtilis hay những vi
khuẩn khác.
1.1.1.2.3. Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động
Đây là cách phân loại chi tiết nhất, cách phân loại này dựa trên đặc điểm cấu tạo
trung tâm hoạt động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó.
Theo cách phân loại này protease được chia thành 4 nhóm.
Nhóm I: Cystein - protease ( EC.3.4.22)
11
- Còn được gọi là thinol protease hoặc sulfhydryl protease.
- Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số protease từ vi sinh vật.
- Trung tâm hoạt động bao gồm 2 acid amin là cysteine và histidine
- Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4,5 – 10, tuy nhiên vùng pHopt là 6 –
7,5, phụ thuộc vào cơ chất
- Có khả năng bền với nhiệt độ từ 60 – 800C ở pH tự nhiên
- Nhóm enzyme này rất nhạy với các phản ứng oxy hóa, vì vậy người ta thường dùng
chúng kèm theo tác nhân khử (ví dụ cystein), hoặc dùng các chất có cấu trúc không gian
phức tạp như EDTA.
- Bị ức chế hoạt động bởi chất sulfhydryl.
- Nhóm II: Aspartic protease (EC 3.4.23)
- Còn được gọi là acid protease
- Đại diện cho nhóm các enzyme như rennin, pepsin.
- Aspartic protease có nguồn gốc từ VSV, được chia làm hai nhóm là pepsin-like và
rennin-like. Nhóm pepsin-like thu nhận từ Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Asp.
awamon, Penicilium spp và Trametes sanguinea…Nhóm rennin-like thu nhận từ Asp.usami,
Mucor pusillus…
- Phân tử aspartic protease có hai nhóm carbocyl, 1 ở miền tiếp xúc và một ở tâm hoạt
động. Tâm hoạt động gồm: 2 aspartic acid và 1 tyrosine
- pH hoạt động trong khoảng 2 – 4 và còn gọi là protease-acid, riêng cathepsin D có
pHopt trong khoảng 6 – 7, cắt liên kết k – casein làm đông tụ sữa với tính đặc hiệu rất cao.
- Hoạt tính enzyme bi ức chế bởi peptatin
- Nhóm III: Metallo - protease (EC 3.4.24)
- Các enzyme nhóm này gồm exopeptidase, dipeptidase, amino peptidase,
carboxylpeptidase A & B, prolidase và một số protease thu nhận từ VSV như Bac. cereus,
Bac. megaterium, Bac. subtilis, Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae
- Hầu hết protease đều chứa các ion kim loại trong phân tử enzyme. Phần lớn chúng
chứa 1 mol Zn2+ trên 1 mol protein, nhưng với prolidase và prolinase thì thay bằng 1 mol
Mn2+. Trong đó kim loại đóng vai trò chất nhận điện tử trong enzyme carboxylpeptidase A,
nó thiết lập liên kết với carboxyl trong liên kết peptid và sẽ phân tách liên kết này.
- Hoạt động trong vùng pH 6 – 9
- Các tác nhân vô hoạt là các chất có cấu trúc không gian phức tạp như EDTA hay natri
dodecylsulfate.
12
- Nhóm IV: Serine protease ( EC.3.4.21)
- Đại diện cho nhóm này là các enyme có nguồn gốc từ động vật như trypsin,
chymotrypsin, plasmin và thrombin. Một số khác được tổng hợp từ VSV mà đặc biệt là từ
VK và nấm mốc như B.cereus, B.firmus, B.subtilis, Asp.flavus, Asp. oryzae.
- Hai acid amin hình thành trung tâm hoạt động là serine và histidine.
- Khoảng pHopt là 7 – 11
- Các tác nhân làm mất hoạt tính của enzyme thuộc nhóm này là đi – isopropyl
phosphoroflouridate (DFP) hay phenylmethenesulphosphate ( PMSF), coumarin và một số
chất ức chế thuận nghịch như antitrypsin ở đậu nành, aprotinin, chymostatin.
- Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là
nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ trung
tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với các nhóm
protease khác.
1.1.2. Cơ chế phản ứng và ứng dụng của protease
1.1.2.1. Cơ chế phản ứng của protease
Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động của chúng
được chia ra làm 2 loại như sau:
- Thủy phân giới hạn: Enzyme thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên
kết peptide có trong phân tử protein và tạo thành các peptid phân tử nhỏ.
- Thủy phân không giới hạn: Protein bị thủy phân thành những acid amin
Dưới tác dụng của protease, liên kết peptide -CO-NH- sẽ bị thủy phân tạo thành sản
phẩm là aminoacid và một ít peptide có phân tử nhỏ.
Với 4 nhóm protease được chia theo đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động sẽ có 4
cơ chế xúc tác khác nhau như sau:
13
Hình 1.2. Cơ chế xúc tác của Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của
Serine - protease [62] Cystein – protease[63]
14
Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của
Aspartic – protease[64] Metallo – protease[65]
* Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease

Serine protease có chung nhóm phân loại (EC 3.4.21), là một trong số các
enzyme được nghiên cứu khá rộng rãi. Ngoài khả năng thủy phân protein trong quá trình
tiêu hóa của động vật, serine protease còn tham gia vào nhiều hiện tượng sinh lý trong cơ
thể như làm tan huyết khối và hoạt hóa các bổ thể. Trung tâm hoạt động của nhóm này có
chứa amino acid aspartic, histidin và serine, trong đó serine giữ vai trò trực tiếp gắn với cơ
chất theo cơ chế được trình bày trong hình 1.7
15
Hình 1.6. Các bước xúc tác cơ bản của nhóm serine protease
Cơ chế theo hình 1.7 gồm 3 phản ứng:
- Phản ứng 1: Nhóm -OH của serine trong trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với
nhóm C=O của liên kết peptide trong chuỗi polypeptide tạo phức hợp chuyển tiếp tứ diện
(tetrahedral complex).
- Phản ứng 2: Ở trạng thái chuyển tiếp tứ diện thường kém bền nên chuyển điện tích
lên O tạo nhóm C=O mới làm đứt liên kết peptide giải phóng mạch polypeptide đầu N và
hình thành hợp chất trung gian acyl-enzyme mới.
- Phản ứng 3: Với sự có mặt của nước sẽ giải phóng mạch polypeptide đầu C còn lại
và khôi phục trung tâm hoạt động của serine protease.
1.1.2.2. Ứng dụng của enzyme protease[1][11][16]
Ngày nay việc khai thác và sử dụng enzyme đã phát triển thành một nghành công
nghiệp với kỹ thuật hoàn chỉnh đã đem lại nguồn lợi không nhỏ.
Người ta đã tìm ra trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ có 140 enzyme có thể
thương mại được. Năm 1997, thị trường về enzyme đã đạt 150 triệu USD.
16
Trong đó các enzyme thuộc nhóm protease hiện đang được ứng dụng nhiều nhất,
chiếm 59% lượng enzyme được ứng dụng. Đặc biệt là enzyme protease kiềm được ứng
dụng trong chất tẩy rửa với số lượng lớn so với các loại enzyme khác.
Ngoài ra protease còn được ứng dụng trong các lĩnh vực:
* Trong công nghiệp thịt
Có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt. Ngoài papain có thể dùng
chế phẩm protease của VSV thủy phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành
phần của thịt. Kết quả là chất lượng của các loại thịt được tăng cao.
Để làm mềm thịt có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau:
- Ngâm thịt vào dung dịch có chứa hỗn hợp protease, giữ ở pH và nhiệt độ thích hợp.
Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến và thuận lợi hơn cả.
- Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease, muối, mì chính) trên bề mặt thịt.
- Tiêm dung dịch enzyme vào mô thịt
- Tiêm enzyme vào máu động vật trước khi giết mổ.
Thịt sau khi làm mềm có thể biến thành các thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.
* Trong công nghiệp sữa
Protease không những có khả năng phân giải protein mà còn có khả năng làm đông
tụ sữa. Protease của nấm mốc và vi khuẩn cũng thể hiện khả năng đó. Tuy nhiên, tất cả các
protease của VSV đều khác với rennin động vật ở chỗ chúng không những làm đông tụ
được sữa mà còn có thể thủy phân sâu casein, do đó ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat.
Trong sản xuất phomat người ta cố gắng tìm những chủng VSV tạo ra được protease
có tính chất giống rennin hoặc thay thế một phần rennin (25 – 50%) bằng protease của VSV.
Ở Nhật, từ canh trường bề mặt Mucor, người ta có thể thu được chế phẩm protease dùng
trong sản xuất phomat. Ở một số nước khác, người ta cũng thu được chế phẩm tương tự nấm
mốc Asp.candidus 11 hoặc từ Bacillus mesentericus
* Trong công nghiệp thuộc da

Trong công nghiệp thuộc da, protease của VSV cũng góp phần quan trọng trong hai
quá trình: Làm mềm da và tách lông [60]. Về mặt này, chế phẩm protease như là một
phương tiện có hiệu quả để hoàn thiện kỹ thuật chế biến da.
17
Protein là một phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy
phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin,
globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela et al., 1997)
* Trong hương phẩm và mỹ phẩm
Protease sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt,
kem đánh răng… Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết, làm cho da mịn. Thuốc
đánh răng có chứa protease có tác dụng chữa viêm lợi và diệt khuẩn. Các loại xà phòng
chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở áo quần, drap ở
bênh viện… khá tốt.
* Trong công nghiệp y dược
Trong công nghiệp y dược, các chế phẩm protease được sử dụng để sản xuất các MT
dinh dưỡng hỗn hợp có proten dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các VSV khác.
Ngoài ra người ta còn thường dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các
huyết thanh kháng độc tố để chữa bệnh (huyết thanh miễn dịch)
Chế phẩm protease thuần khiết được sử dụng trong y học để loại bỏ các tổ chức hoại
tử, hỗ trợ tiêu hóa, loại trừ cholesterol bám trên thành mạch máu và để chữa bệnh viêm tắc
động mạch.
Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với bệnh viện quân y 108 nghiên cứu
sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozumabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy dả mạc
rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi [11].
* Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu ảnh quang khác nhau như
điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen…Các protease sẽ phân giải và hòa tan lớp nhũ tương
gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy
ảnh quý.
* Ứng dụng protease để sản xuất các sản phẩm lên men giàu đạm
- Tương: Nguyên liệu trong sản xuất tương là gạo nếp, đậu tương. Nấm mốc từ ngoài
không khí rơi vào xôi (được nấu lên từ gạo nếp) và phát triển thành phức hệ enzyme
amylase – protease tham gia vào hai quá trình sinh hóa quan trọng là thủy phân protein của
đậu nành thành các acid amin và thủy phân tinh bột thành đường. Do vậy tương có vị ngọt
của đường, vị đậm đà của chất đạm, vị mặn của muối ăn.
18
- Nước mắm: Nước mắm là dịch thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease của
hệ vi khuẩn có trong ruột cá, mang cá, trong đó chủ yếu là B.subtilis, B.mesentericus. Nếu
để cá tự thủy phân trong quá trình ướp chượp, thời gian sản xuất sẽ kéo dài từ 6 tháng đến 1
năm. Khi thêm nguồn protease từ động vật, thực vật hoặc VSV thì quy trình sẽ rút ngắn về
thời gian. Nếu dùng chế phẩm protease nấm mốc ở độ tinh khiết cao có thể giảm thời gian
ướp chượp xuống chỉ còn 17 – 60 giờ với tỉ lệ enzyme : Cơ chất khoảng 10%. Đây cũng là
cơ sở của việc sản xuất nước mắm ngắn ngày.
- Chao: Là một sản phẩm làm từ đậu nành bằng phương pháp lên men VSV, hệ VSV
chủ yếu trong chao là nấm mốc Mucor: Actinomucor elegans, Mucor hiemalis, Mucor
silvaticus, mucor sultiliscimus, trong đó Actinomucor elegans là tốt nhất.
- Nước chấm lên men: Nước chấm là tên chung chỉ các loại gia vị dạng lỏng chứa
chủ yếu là acid amin, muối ăn và hương vị đặc trưng. Nước chấm được sản xuất từ các
nguyên liệu giàu protein theo hai phương pháp hóa học và lên men vi sinh vật
Phương pháp lên men trong sản xuất nước chấm sử dụng phản ứng thủy phân protein
nhờ xúc tác là enzyme protease từ vi sinh vật.
* Trong chăn nuôi: Nhiều loại protease của vi nấm cũng có thể bổ sung vào khẩu phần ăn
trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nhằm tăng nhanh quá trình tiêu hóa thức ăn, tăng tốc độ
tăng trọng của động vật, nhất là động vật non.
1.1.3. Enzyme protease kiềm
Thế giới ngày nay người ta tập trung quan tâm vào các sản phẩm thân thiện môi
trường và đầu ra của sản phẩm. Nhiều quá trình hóa học đang được thay thế bằng quá trình
thực hiện bằng enzyme. Protease kiềm là một trong những nhóm quan trọng nhất của
enzyme vi sinh do được sử dụng có hiệu quả trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp thực phẩm, thức ăn gia
súc, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa học. Các protease kiềm quan trọng cho
công nghiệp từ nguồn vi khuẩn đã được nghiên cứu rộng rãi, trong đó Bacillus sp được công
bố nhiều. Hầu hết các protease kiềm quan trọng trong công nghiệp chịu được nhiệt độ cao
50-70oC (Bảng 1.1 và Hình 1.8).
Bảng 1.1. Thị trường enzyme toàn cầu dựa trên cơ sở các lĩnh vực ứng dụng (triệu USD)
Lĩnh vực Tăng trưởng %
2005 2006 2007 2012
ứng dụng 2007-2012
Kỹ thuật 1075 1105 1140 1355 3
19
Thực phẩm 775 800 830 1010 4
Chăn nuôi 240 260 280 375 6
Tổng cộng 2090 2165 2250 2740 4
ezyme phân
tích và y học,
10%
Protease kiềm,
Lipase, 3% 25%
Carbohydratase
khác, 10%
Amylase, 18% Các protease

khác, 21%
rennins, 10%
Trypsin, 3%
Hình 1.7. Thị trường của các enzyme trên thế giới (Rao el al., 1998)[47]
1.1.3.1. Nguồn thu nhận protease kiềm
Protease kiềm được thu nhận từ các nguồn VSV khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi và
một số ít nấm men.
Trong tất cả các nguồn vi sinh thu nhận protease kiềm thì vi khuẩn là nguồn đặc biệt
quan trọng do được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp dệt,
công nghiệp da, thực phẩm và thức ăn gia súc…
Nguồn lớn nhất protease kiềm vi khuẩn là từ các loài Bacillus. Một số loài nấm được
biết có sản xuất protease kiềm và được sử dụng trong công nghiệp thuộc các loài thuộc chi
Aspergillus. Chỉ có một vài nghiên cứu về nấm men sản xuất protease kiềm. Protease kiềm
được sản xuất từ nấm men như Aureobasidium pullutans, Yarrowia lipolytica, Issatchenkia
orientalis và Criptococcus aureus có pH tối ưu 9-10 và nhiệt độ tối ưu 45-50oC, đã có công
bố về sản xuất một số peptid có hoạt tính sinh học mạnh.
Hiện tại các protease kiềm từ nấm ăn đã được nghiên cứu và công bố. Bảng 1.2 liệt
kê các vi sinh vật sản xuất protease kiềm.
Bảng 1.2. Các protease kiềm từ vi sinh vật (V.K.Nigam et al., 2012)[51]
Vi sinh vật Ứng dụng Tài liệu

Pseudomonas aerugenosa Dùng trong điều trị thay Najafi et al., 2005
20
PD 100 collagen, xử lí chất thải, tẩy
vết máu và tẩy lông
Thermoactinomyces sp
Tẩy lông Verma et al., 2011
RM 4
Công nghiệp chất tẩy rửa,
Bacillus sp.Tk1 và TK2 công nghiệp thực phẩm và Kuberan et al.,2010
công nghiệp dược phẩm
Bacillus pumilus Cbs Thuốc tẩy, tẩy lông Jaouadi et al.,2011
Streptomyces sp. Ab1 Tẩy lông, thủy phân lông vũ Jaouadi et al.,2011
Adinarayana et
Bacillus subtilis PE-11 Thuốc tẩy
al.,2003
Bacillus sp.SSBi Công nghiệp chất tẩy rửa Singh et al.,2005
Trích ly chitin, thủy phân Hadda et al., 2011
Bacillus licheniformis RP1
lông vũ, tẩy lông et al.,
Vi sinh vật Ứng dụng Tài liệu
Bacillus coagulans Asokan et al
Lĩnh vực công nghiệp
Bacillus licheniformis al.,2010
Vadlamani et
Bacillus clausii Lĩnh vực công nghiệp
al.,2011
Abou- elela et al.,
Bacillus cereus Chất tẩy rửa , tẩy vết máu
2011
Loại bỏ protein trong cám
Bacillus sp.K-30 Naidu et al.,2005
gạo, chất tẩy rửa
Ravindran et
Bacillus cereus 1173900 Tẩy lông
al.,2011
Bacillus circulans Prakasham eal.,2005
Loại bỏ lông trong công Mukhtar and Haq et
Bacillus subtilis
nghiệp thuộc da al., 2008
Kalaiarasi and
Pseudomonas fluorescens Chất tẩy rửa, công nghiệp dệt
Sunitha et al.,2009
Chất tẩy rửa, công nghiệp
Microbacterium AR-68 Gessesse et al.,1997
thuộc da
Streptomyces pulveresceus Jayasree et al., 2009
Chất tẩy rửa cho vào khi giặt
Stenotrophomonas Kuddus et al.,2011
với nước lạnh, bảo vệ môi
maltophila MTCC 7528
trường vùng lạnh
Shewanella oneidensis
Lĩnh vực công nghiệp Anbu et al.,2009
MR-1
Streptomyces
Công nghiệp nhiệt độ cao Ahmad, 2011
orantiograceus EGS-5
Aspergillus niger Chất tẩy rửa Devi et al.,2008
Aspergillus oryzae (kỹ Công nghiệp thực phẩm và Samarntar et
thuật di truyền) U 1521 thức ăn động vật al.,1999
Aspergillus
Công nghiệp da và thực phẩm Chellapandi, 2011
Aspergillus terreus
Aspergillus aidulans Ha- Công nghiệp thực phẩm, công
Charles et al.,2008
10 nghiệp y dược và công
21
nghiệp da
Engyodontium album Chất tẩy rửa, thu nhận bạc
Jasmin et al.,2010
BTMFS10 trong trong xử lí phim
Công nghiệp chất tẩy rửa,
Aspergillus flavus Yadav et al., 2011
tổng hợp peptid
1.1.3.3. Sản xuất protease kiềm

Để có thể sử dụng enzyme protease kiềm trong công nghiệp, đòi hỏi phải sản xuất
công nghiệp. Hiện tại phương pháp lên men bán rắn và phương pháp lên men chìm đều
được sử dụng.
Các thành phần môi trường đặc biệt là nguồn carbon và nitơ cũng như các thông số
lên men như nhiệt độ, pH, chế độ oxy hòa tan, chế độ đảo trộn trong lên men bán rắn và chế
độ khuấy trộn trong lên men chìm là những yếu tố có ảnh hưởng rất quan trọng đến năng
suất lên men (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Thông số hóa lí sản xuất protease kiềm (V.K.Nigam et al., 2012)[51]
Tốc
Nhiệt độc
Nguồn
Vi sinh Nguồn nitơ pH độ lắc, Tài liệu
carbon
(0C) khuấy
(rpm)
Bột đậu
B.licheniformi Nadeem et
Glucose nành tách 10 37 140
s N2 al., 2008
dầu
Bacillus Tinh
Akhavan et
subtilis CR bột, Cao ngô 8 45 150
al., 2011
179 maltose
Ammonium Devi et al.,
A. niger Glucose 8,5 45 150
sulphate 2008
Halobacterium Bột đậu nành Vijayanand
Cám gạo 7 40 200
sp. IS tách dầu et al., 2010
Bacillus subtilis Bột đậu nành Reddy et al.,
Glucose 9,0 55 150
SVR-07 tách dầu 2011
Bột đậu nành Banerjee et
Bacillus brevis Lactose 10,5 37 200
tách dầu al., 1999
Bacillus
Bột đậu nành Bhunia et
licheniformis Tinh bột 7 37 180
tách dầu al.,2010
NCIM 2042
Bacillus
Arabino Akcan et al.,
subtilis RSkk- Cao thịt bò 9 37 150
se 2011
96
22
Pseudomonas Kalaiarasi et
Cám mì Peptone 9 37 -
fluorescens al.,2009
Microbacteriu
Glucose, Gessesse et
m Pepton 10,3 32 -
sucrose al.,1997
AR-68
Streptomyces Casein Jayasree et
Tinh bột 9 33 -
pulverescens al.,2009
Mỗi chủng VSV sản xuất protease kiềm đều đòi hỏi những điều kiện khác nhau, một
số chủng vi sinh đòi hỏi phải có các ion kim loại dưới dạng các muối cho vào môi trường.
Vì chi phí giá cả của môi trường lên men liên quan đến giá thành sản phẩm, đồng
thời theo xu hướng sản xuất sạch hơn, một số chất thải trong nông nghiệp có thể được sử
dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất protease kiềm như cám gạo, cám lúa mì, trấu
lúa, vỏ đậu các loại.v.v.. Hầu hết các vi sinh vật sản xuất protease kiềm ở pH 8-9 và nhiệt độ
32 - 45oC.
Để đạt được năng suất tối đa và sử dụng tiết kiệm các nguồn nguyên liệu, vật tư,
năng lượng, các nhà nghiên cứu đã liên tục nghiên cứu tối ưu các điều kiện sản xuất. Theo
truyền thống các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu từng biến số theo thời gian, mỗi biến số cho
một tối ưu độc lập. Điều này tốn rất nhiều thời gian, chi phí tốn kém và không phản ảnh
đúng giá trị tối ưu khi có một số lượng lớn các biến số tham gia và can thiệp bởi sự tương
tác giữa chúng.
Gần đây một số phương pháp thống kê như phương pháp Taguchi, thiết kế Placket-
Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) cho kết quả tối ưu hóa nhanh hơn, giúp ta
hiểu biết tốt hơn sự tương tác giữa các biến số (bảng 1.4).
Bảng 1.4. Các phương pháp thống kê tối ưu hóa sản xuất protease kiềm
(V.K.Nigam et al., 2012) [51]
Phương pháp Vi sinh Các thông số Cải thiện Tài liệu
tối ưu hóa được tối ưu năng suất
Plackett- Bacillus. Lượng giống,
Bhuniaa et al.,
Burman, và licheniformis nhiệt độ, pH, tốc 1,72 lần
2012
RSM NCIM 2042 độ khuấy
Phương pháp Bacillus
Nguồn carbon,
Plackett- subtilis 4,4 lần Kezia et al., 2011
nitơ
Burman DKMNR
Plackett- Bacillus Thành phần môi Romsomsa et al.,
2,2 lần
Burman và subtilis C4 trường, và tốc độ 2010
23
RSM khuấy
Thành phần môi
Bacillus
RSM trường nhiệt độ 8 lần Venil et al., 2009
subtilis HB04
và tốc độ khuấy
Plackett- Thành phần môi
Aspergilus
Burman và trường, pH và 14 lần Hajji et al., 2008
clavatus ES1
RSM nhiệt độ
Plackett- Mật độ giống và
Bacillus Reddy et al.,
Burman và thành phần môi 2 lần
.RKY2 2008
RSM trường
Phương pháp
Plackett- Halobacterium Thành phần môi Akolkar et al.,
3,9 lần
Burman . SP 1 trường 2009
Thành phần môi

Phương pháp Bacillus Oskouie et al.,
trường, và tốc độ 4 lần
Taguchi clausii 2007
khuấy
Phương pháp Aspergillus Nguồn carbon,
3 lần Babu et al., 2007
Box –Beehnken oryzae nitơ, nhiệt độ,pH
1.1.3.4. Đặc tính protease kiềm
Protease kiềm từ các nguồn vi sinh khác nhau được xác định các đặc tính để sử dụng
trong các mục đích cụ thể, thí dụ protease kiềm với pH hoạt động rộng, ổn định ở nhiệt độ
cao được ứng dụng trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp da. Các protease
kiềm phân lập từ Pseudomonas aerugenosa hoạt động ở pH 6 - 11, nhiệt độ 25 – 650C, các
nghiên cứu thấy rằng enzyme tinh khiết giữ được hoạt tính của nó trong các chất hoạt động
bề mặt và các chất tẩy rửa trắng. Với các đặc tính này có thể sử dụng trong công nghiệp tẩy
rửa.
1.1.3.5. Cố định enzyme protease kiềm
Mặc dù việc sử dụng phương pháp enzyme có nhiều lợi điểm, nhưng bên cạnh đó
vẫn còn có giới hạn, do giá chi phí cho enzyme cao và thiếu ổn định.
Để khắc phục khó khăn đó, kỹ thuật cố định enzyme đã phát triển mạnh mẽ trong
những năm gần đây. Nhiều chất mang như agar, gelatin, calcium alginate, polyacrylamide,
carageenan, mùn cưa, perlit.. đã được sử dụng như những chất mang để cố định các enzyme
24
protease, nhờ vậy chi phí cho việc sử dụng enzyme đã được giảm do có thể sử dụng được
nhiều lần, ngoài ra nhiều đặc tính enzyme được cải thiện tốt hơn (bảng 1.5).
Bảng 1.5. Các protease kiềm cố định bằng các vật liệu khác nhau
(V.K.Nigam et al., 2012)[51]
Vi sinh Vật liệu sử dụng Kết quả Tài liệu
Agar, gelatin,
Bacillus
sodium alginate, Tăng hoạt tính Kumar et al., 2010
subtilis
polyacrylamide
Bacillus Calcium alginate,
Tăng hoạt tính, sử dụng Adinarayana et
subtilis PE- k-carageenan,
kéo dài, tái sử dụng al.,2005
11 polyacylamide
Bacillus Agar, calcium Kocher et al.,2009
Tăng hoạt tính
circulans alginate,
Calcium alginate
Bacillus Tăng hoạt tính, sử dụng Naidu et al.,2011
polyacylamide,
subtilis K30 kéo dài, tái sử dụng
agar, gelatin
Bacillus Calcium alginate, Admed et al.,2010
Tăng hoạt tính
licheniformis k-carageenan, agar
Calcium alginate
B. pumlus polyacylamide, Tăng hoạt tính Kumari et al., 2009
aga
Surendran et
B. sphaericus Mùn cưa, perlit… Tăng hoạt tính
al.,2011
Tăng nhiệt độ tối ưu, Zanpholin et
Myceliophtho Hạt calcium
nhiệt độ ổn định, tái sử al.,2010
ra sp. alginate
dụng trên 7 lần.
Tăng nhiệt độ ổn định, thời
Streptomyces Admed et al.,2008
Bọt biển gian sử dụng, tái sử dụng 5
avermectinus
lần
Tăng giá trị Km, pH tối ưu,
Aspergillus Hạt calcium Sharma et al.,2006
tăng tính ổn định trong môi
oryzae alginate
trường acid, kiềm.
Bacillus Xơ mướp Tăng hoạt tính, thời gian sử Admed et al.,2007
25
licheniformhs dụng, ổn định với EDTA
B.polymyxa Perlit Tăng hoạt tính Emtiazi et al.,2005
1.1.4. Enzyme Nattokinase

1.1.4.1. Công dụng của nattokinase
NK làm tan huyết khối bằng cách phân cắt các liên kết chéo của sợi fibrin (chất sợi
buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành huyết khối). Nattokinase rất hữu dụng
trong việc tiêu hủy huyết khối nội sinh ở người vì hoạt tính cao được duy trì ở nội mạc
trong thời gian dài bằng liều uống. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin
càng làm tăng nguy cơ hình thành huyết khối. NK cũng giúp tăng cường plasmin của cơ thể
bằng cách chuyển plasminogen thành plasmin (Kim et al.2008)[39].
Nattokinase làm giảm huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin
(ACE). ACE khiến mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. Nattokinase có khả năng ức
chế ACE, ngăn cản dày nội mạc mạch [38][41].
Tăng cường lưu thông máu: Nattokinase trợ giúp máu lưu thông bằng cách hỗ trợ bù
trừ trong tuần hoàn. Nó cũng được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch.
(Sumi H. Healthy Mirobe “Bacillius Natto” – Japan Bio Science Laboratory).
tự như enzyme này. Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết khối
thông thường khác như Urokinase, Streptokinase và tissue Plasminogen Activator (t-PA).
Nó là một hoạt chất thiên nhiên làm tan huyết khối hữu hiệu, không gây dị ứng và có độ an
toàn cao. Một số nghiên cứu chứng minh rằng Nattokinase là một serine protease thuộc họ
subtilisin, có trọng lượng phân tử 28kDa [35].
Huyết khối làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất
huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và bệnh trĩ. NK hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích
tuyệt vời cho những người bệnh này.
1.1.4.2. Cơ chế tác dụng của Nattokinase trên huyết khối
Huyết khối được hình thành khi các sợi fibrin tích lũy trong mạch máu. Huyết khối
trong các mạch máu có thể di chuyển lên não làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não
gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: Tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ.
Theo hình 1.9 thì Nattokinase tiêu hủy fibrin theo 3 cách[54][56][57][60]:
- Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những
khu vực mà dòng máu lưu thông bị cản trở.
26
- Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin từ Urokinase, Nattokinase
không những giúp làm tan huyết khối đã hình thành mà còn hoạt động như một thành phần
chống hình thành huyết khối.
- Nattokinase giúp tăng cường t-PA để sản sinh plasmin. Đây là enzyme nội sinh tiêu
hủy fibrin tự nhiên trong cơ thể.
Hình 1.8. Hiệu ứng của Nattokinase lên fibrin

1.1.4.3. Các công trình nghiên cứu Nattokinase ở Việt Nam và trên thế giới
Natto với nghĩa là “Đậu nành lên men” ngày nay, đã xuất hiện ở Nhật vào năm
1068.
Năm 1894, nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến sĩ
K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông về sự lên
men của Natto, ghi lại rằng “Natto - một loại phomat thực vật”.
Vào năm 1905, TS Shin Sawamura (Đại học Tokyo) đã thành công trong việc tách 2
loại vi khuẩn Natto từ đậu nành nấu chín, trong đó vi khuẩn gây ra mùi hương đặc biệt làm
hạt đậu lên men (Bacillus subtilis Natto) cũng như vi khuẩn tạo chất nhờn rất dẻo dai
(Bacillus mesentericus) tạo vị ngọt.
Trong những năm 1920, các nhà nghiên cứu đã tìm ra cách sản xuất Natto từ môi
trường có chứa B. subtilis Natto thay vì lên men đậu nành.
27
Sumi et al.,(1987)[52] TS. Hiroyuki Sumi đã nghiên cứu các enzyme thủy phân
huyết khối, tìm kiếm các loại thực phẩm tự nhiên có khả nằng hòa tan huyết khối - nguyên
nhân gây bệnh đột quỵ và bệnh nhồi máu cơ tim. Năm 1980, Sumi phát hiện Nattokinase
khi ông làm việc như nhà nghiên cứu chuyên về hóa lí ở Đại học Y khoa Chicago. Sau khi
thử trên 173 loại thực phẩm tự nhiên về khả năng thủy phân huyết khối. Sumi phát hiện thấy
khi nhỏ Natto vào huyết khối nhân tạo (fibrin) trong đĩa petri và để ở 37oC (nhiệt độ cơ thể)
thì Natto hòa tan dần dần và hòa tan hoàn toàn huyết khối trong vòng 18 giờ. Sumi đặt tên
cho enzyme mới này là “Nattokinase” có nghĩa enzyme trong Natto.
Sumi et al.,(1990)[53] đã tiến hành thử nghiệm trên chó bằng cách cho ăn chế phẩm
Nattokinase, kết quả thử nghiệm thấy rằng Nattokinase dùng như loại thuốc để xử lí bệnh
tắc nghẽn mạch máu, đồng thời cũng sử dụng để phòng ngừa vì Nattokinase rất an toàn nên
có thể sản xuất lớn.
Sumi et al.,.(1995) [54] tiếp tục thử nghiệm ảnh hưởng Nattokinase trên chó, tác giả
đã gây ra huyết khối ở các con chó đực, sau đó cho mỗi con 4 viên thuốc con nhộng chứa
Nattokinase (250mg/viên) hoặc 4 viên giả dược cho mỗi con chó. Kết quả đo tia X mạch
máu thấy rằng những con chó uống Nattokinase tuần hoàn máu trở lại bình thường (không
có huyết khối) sau 5 giờ uống thuốc. Các huyết khối ở các con chó uống giả dược vẫn
không có dấu hiệu thay đổi sau 18 giờ thử nghiệm. Các nhà nghiên cứu phòng thí nghiệm
công nghệ sinh học và của JCR Pharmaceutical Co ở Kobe, Nhật Bản đã thử khả năng tan
huyết khối ở động mạch cảnh của chuột. Kết quả cho thấy các con chuột sử dụng
Nattokinase đạt 72% lưu lượng máu, trong khi ở chuột uống plasmin chỉ đạt 15,8% lưu
lượng máu.
Một thí nghiệm khác giữa JCR Pharmaceutical, Đại học bang Oklahoma, (Mỹ) và
Trường Đại học y Miyazaki phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo). Thí nghiệm
tiến hành trên 12 người Nhật tình nguyện (6 nam và 6 nữ) tuổi từ 21- 55. Họ cho các tình
nguyên viên mỗi người 200g Natto (không phải loại thực phẩm) trước bữa ăn, sau đó kiểm
tra khả năng thủy phân fibrin trong huyết thanh. Các kiểm tra thấy Natto có hoạt tính cao
làm tan huyết khối. Kết quả đã giảm 48% trong vòng 2 giờ thử nghiệm và giữ khả năng làm
tan huyết khối 2-8 giờ. Ở đối chứng, các nhà nghiên cứu sau đó cho các tình nguyện viên ăn
một lượng tương đương đậu nành luộc chín và kiểm tra hoạt tính hòa tan fibrin. Kết quả cho
thấy không có thay đổi có ý nghĩa.
28
Okamoto Akiko et al., (1995) [45] đã xác định khả năng ức chế enzyme biến đổi
Angiotensin I thành Angiotensin II của 11 loại lên men khác nhau như nước mắm, cơm
rượu, rượu Sake, nước tương, dấm ăn, phomat, Miso, Temphe, và Natto… .Các sản phẩm
có hoạt tính ức chế Angiotensin (ACE) mạnh là nước tương, nước mắm, Natto và phomat.
Các sản phẩm không ức chế ACE là cơm rượu, rượu sake và dấm ăn. . .
Xie et al., (1999) [58] đã trích ly Nattokinase từ Natto - loại thực phẩm lên men
truyền thống của Nhật Bản và thấy có hoạt tính thủy phân mạnh fibrin. Họ cũng đã phân lập
chủng vi khuẩn từ Natto và xác định điều kiện sinh Nattokinase trong môi trường dịch thể
có pH 7, nguồn carbon là xylose 2%, nguồn nitơ là protein đậu nành 3%, giống 2% trong 24
giờ, lên men trong bình tam giác 100ml chứa 10 ml môi trường. Với điều kiện như vậy hoạt
tính Nattokinase đạt được 78.71 đơn vị/ml.
Ruei - Lin Hsu et al., (2009) [48] đã nghiên cứu protein có dạng amyloid in vivo có
liên quan đến nhiều bệnh như bệnh Alzhemer, bệnh bò điên (prion).. Tác giả thấy rằng
Nattokinase có khả năng phân giải amyloid. Các serine protease như Subtilisin có khả năng
phân giải amyloid, khả năng này cũng thấy có ở Protease K, Subtilisin Carlsberg nhưng
không thấy có ở Trypsin và Plasmin.
Yeon Kyoung Kim et al.,(2011)[61] đã tiến hành thử nghiệm trên chuột được ăn
khẩu phần cao cholesterol (0,5% cholesterol + 0,5% acid cholic) để tạo huyết áp cao tự phát,
sau 11 tuần thí nghiệm, các dấu hiệu sinh học đã được theo dõi như huyết áp tâm thu, hoạt
tính rennin, angiotensin II trong thận, trong huyết tương, hoạt tính thủy phân fibrin. Kết quả
cho thấy huyết áp tâm thu giảm đáng kể ở lô thử nghiệm so với đối chứng. Hoạt tính rennin
trong huyết tương, trong thận giảm mạnh khi có dịch chiết Natto. Hoạt tính angiotensin II
trong thận giảm rõ rệt trong khi trong huyết tương bằng nhau ở đối chứng và thử nghiệm.
Từ các kết quả trên các tác giả cho rằng cơ chế giảm huyết áp liên quan đến hệ rennin
angiotensin và hoạt tính thủy phân fibrin.
Jiun –Min Wang et al.,(2012) [37] đã đánh giá ảnh hưởng bảo vệ thần kinh trung
ương của Nattokinase gây ra do thiếu máu cục bộ ở chuột. Nattokinase đã làm giảm mức độ
nhồi máu so với đối chứng. Tuy nhiên vai trò bảo vệ hệ thần kinh trung ương của
Nattokinase thì còn chưa rõ, vì vậy cần nghiên cứu tiếp cơ chế bảo vệ hệ thần kinh của
Nattokinase.
Lê thị Bích Phượng vctv., (2012) đã chọn lọc được hai chủng Bacillus 7.2 và Bacillus
NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enyme (nattokinase) làm tan huyết khối [12]
29
Qua các công trình nghiên cứu có thể chứng minh rằng, NK có tiềm năng làm tan
huyết khối mạnh mẽ.
1.2. Phương pháp nuôi cấy và thu nhận enzyme từ canh trường lên men bán rắn
1.2.1. Những vấn đề cơ bản trong lên men bán rắn
Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn là một quá trình
trong đó sự sinh trưởng của VSV và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt của
nguyên liệu gần như không có mặt của nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ
trong mạng chất rắn. Hoạt động sống của VSV diễn ra chủ yếu trên bề mặt rắn. Sự trao đổi
nhiệt và khí hầu như là trực tiếp giữa pha rắn hay pha khí không qua chất lỏng trung gian.
Các phản ứng sinh học và sự chuyển hóa thực hiện trực tiếp giữa tế bào VSV và cơ chất tại
nơi tiếp xúc.
Lên men trên môi trường bán rắn đã được sử dụng từ nhiều năm qua. Ngày
nay, lên men bán rắn đang được quan tâm trở lại một cách mạnh mẽ và được sử dụng rộng
rãi nhằm gia tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế
liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp [21].
1.2.2 Những ưu điểm của lên men bán rắn tạo enzyme
Lên men bán rắn có những ưu điểm vượt trội so với lên men trong môi trường lỏng.
Đó là việc không cần khuấy đảo hay thông khí, đặc biệt là thành phần môi trường nuôi cấy
đơn giản, rẻ tiền. Chẳng hạn, các cơ chất dùng trong lên men bán rắn thường là các phế
liệu của ngành nông nghiệp hay công nghiệp thực phẩm, tất cả đều là cơ chất rẻ tiền và ổn
định nên có tiềm năng sử dụng để sản xuất enzyme ở quy mô lớn.
Những ưu điểm khác so với lên men trong môi trường lỏng là nồng độ cơ chất cao
hơn, ít bị nhiễm tạp, giảm năng lượng và lượng nước sản xuất đầu vào, lên men bán rắn
không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi, chỉ cần
giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp. Do đó, việc vận hành cũng như việc đầu tư vừa đơn giản
vừa ít tốn kém. Sau quá trình nuôi cấy, canh trường nuôi cấy bề mặt dễ dàng sấy khô và ít
bị tổn hao hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp
nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Lượng enzyme được tạo ra từ lên men bán
rắn thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy lỏng. Đây là đặc điểm rất quan trọng để giải
thích tại sao phương pháp lên men bán rắn đang phát triển trở lại một cách mạnh mẽ
[21][15].
Mặc dù lên men bán rắn đang hấp dẫn nhưng việc ứng dụng vẫn còn mặt hạn chế.
30
Thực tế, không thể kiểm soát hay điều chỉnh môi trường một cách chính xác theo ý muốn
và cũng vì vậy không thể áp dụng có hiệu quả các phương pháp tối ưu hóa như đối với lên
men lỏng. Ngoài ra, lượng cơ chất thừa gây khó khăn cho việc thu nhận sản phẩm tinh sạch,
do đó khả năng ứng dụng còn bị hạn chế. Tuy nhiên, nếu xét toàn diện thì lên men bán rắn
có lẽ là công cụ khá hữu hiệu để tạo ra các sản phẩm, cụ thể là trong tổng hợp enzyme
công nghiệp. Ngoài ra, lên men bán rắn còn được dùng trong xử lý môi trường và nhiều
lĩnh vực khác.
1.2.3 Các giai đoạn của quá trình lên men bán rắn
Quá trình lên men có thể chia thành 2 pha:
* Pha thứ 1- pha sinh trưởng:
Các tế bào VSV còn non, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối - là quá trình sinh
tổng hợp protein và xây dựng tế bào. Môi trường nuôi cấy trong pha này giàu nguồn
carbon, nitơ, phosphor. Sản phẩm trao đổi chất của VSV ở thời kì này không có hoặc bắt
đầu tích tụ với một lượng rất nhỏ và dần dần tăng lên đồng thời với sự phát triển của giống
đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ 2.
* Pha thứ 2 – pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất:
Ở giai đoạn này, các tế bào VSV đã trưởng thành, sự phát triển sinh khối chậm lại
hoặc ngừng hẳn, các sản phẩm trao đổi chất tích tụ chủ yếu trong pha này. Trong môi
trường nuôi cấy, các nguồn carbon, nitơ, phosphor còn rất ít hoặc cạn gần hết. Thời kì đầu
của pha này, tế bào VSV có khả năng tổng hợp cao, tích tụ nhiều sản phẩm trong môi
trường. Ở cuối pha, lượng sinh khối bắt đầu giảm đi do tế bào bắt đầu tự phân và quá trình
tích tụ bị chậm lại, đồng thời một số sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng cho VSV.
Trong thực tế sản xuất, quá trình lên men thường được kết thúc trước điểm cuối pha thứ 2
để tránh tình trạng tự phân sẽ làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc [21].
1.3. Đại cương về Bacillus subtilis
1.3.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chứa y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Việc sử dụng để phòng trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 – 1957
khi Henry, Albot và cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó,
“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng,
chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa.
31
Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong
chăn nuôi, y học, thực phẩm…[11]
1.3.2. Vị trí phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacilliales
Họ: Bacilliaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
Hình 1.9. Trực khuẩn Bacillus subtilis
1.3.3. Đặc điểm phân bố
B.subtilis có thể được phân lập từ nhiều loại môi trường khác nhau, đặc biệt chúng có
nhiều trong rơm, cỏ. Mức độ thích nghi cao của chúng là do khả năng hình thành nội bào tử
và tái tổ hợp DNA bộ gen với DNA lạ. B.subtilis có khả năng kháng lại các điều kiện khắc
nghiệt của môi trường về pH, áp suất thẩm thấu, oxy và nhiệt độ.
B.subtilis cũng được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật ăn thực vật,
nó đóng vai trò là một probiotic giúp duy trì hoặc khôi phục lại hệ vi khuẩn có lợi trong cơ
thể.
Vi khuẩn Bacillus subtilis thường có trong những môi trường thiếu hụt dinh dưỡng,
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: Cỏ khô, bụi, đất, nước…Phần lớn chúng tồn tại ở
trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh
dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sông cũng như
nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis [11].
1.3.4. Đặc điểm hình thái và sinh hóa
1.3.4. 1. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ 3 – 5 x 0,6
µm, tế bào thường nối với nhau thành chuỗi hoặc đứng riêng rẽ, có khả năng di động, gồm 8
– 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,8 – 1,8 µm. Vị trí
của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể
32
lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Bacillus subtilis là loài sinh vật tự dưỡng,
hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện.
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Bacillus
subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn
gặp điều kiện bất lợi. Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa
học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành
phần và có thêm một số thành phần mới. Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do
sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng
xạ….
1.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa
Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường
thiếu oxi, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 370C, pH 7 – 7,4, tối ưu ở pH 7,2. Vi khuẩn lên men
không sinh khí các loại đường: Glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose và
một số hoạt tính khác được liệt kê trong Bảng 1.6.
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động
của hemolysine. Hệ enzyme Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,
amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase. Bacillus subtilis đã
được ứng dụng khá nhiều trong các nghành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp sản xuất
enzyme như protease, amylase…
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L của
acid glutamic. Sản xuất kháng sinh subtilin va bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Tuy nhiên, đa số các chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.
Bảng 1.6. Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh Indol -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử nitrate +
Tan chảy Gelatin +
33
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
maltose +
1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối

1.4.1. Khái niệm về huyết khối
Bình thường, trong cơ thể, máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái thể dịch nhờ
sự cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu. Khi xảy ra tổn thương mạch máu,
các yếu tố đông máu sẽ cùng với nội mạc mạch máu và tiểu cầu phối hợp xảy ra một loạt
các phản ứng để tạo nút cầm máu tại vị trí tổn thương. Tình trạng tăng đông máu xảy ra khi
mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu do tăng hoạt hoá đông máu hoặc
do giảm ức chế đông máu, tiêu sợi huyết dẫn đến huyết khối lan rộng quá giới hạn cần thiết,
gây tắc nghẽn. Huyết khối có thể được định nghĩa là một quá trình bệnh lý do một sự phát
động và lan rộng bất hợp lý của phản ứng cầm máu của cơ thể dẫn đến hình thành huyết
khối trong lòng mạch máu. Tuỳ theo kích thước của huyết khối, đường kính mạch máu mà
huyết khối có thể gây tắc mạch hoàn toàn hay bán tắc, nghẽn mạch….[20]
1.4.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối
Huyết khối được tạo thành do 3 nguyên nhân:
- Tổn thương mạch máu: Khi mạch máu bị tổn thương do áp lực máu cao, những thứ
có trong mạch máu như cholesterol, tiểu cầu đến tích tụ ở những nơi bị tổn thương khiến
mạch máu trở nên cứng và dày lên, lòng mạch máu dần dần hẹp lại.
- Xơ vữa động mạch (XVĐM): Chất béo tích tụ trong thành của các động mạch tạo
thành các mảng XVĐM. Mảng XVĐM có thể ngày càng to dần gây hẹp lòng của động
mạch. Đôi khi mảng XVĐM bị vỡ ra làm cho máu tiếp xúc với lõi chất béo bên trong
mảng. Khi đó các tế bào tiểu cầu và hệ thống đông máu bị hoạt hóa dẫn đến hình thành
huyết khối gây tắc động mạch.
34
- Giảm sản sinh, giảm hoạt tính Plasmin: Plasmin là enzym duy nhất trong cơ thể có
khả năng làm tan huyết khối. Khi giảm sản sinh và giảm hoạt tính plasmin, huyết khối sẽ dễ
dàng hình thành và không bị loại bỏ [20]
1.4.3. Biến chứng của bệnh huyết khối
Huyết khối xuất hiện khi dải protein có tên là fibrin tích lũy trong lòng mạch. Ở tim,
huyết khối là nguyên nhân gây tắc các dòng mạch máu tới nuôi mô và cơ tim. Nếu dòng
máu bị chặn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc không còn. Điều này dẫn đến chứng
đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên
não. Trong não, huyết khối có thể gây tắc nghẽn các mạch máu lên não và gây ra các biến
chứng: Tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ. Một số biến chứng
thường gặp do ảnh hưởng của huyết khối:
Bệnh động mạch vành: Bệnh này ảnh hưởng đến các mạch máu cung cấp máu cho
cơ tim. Nếu động mạch bị nghẽn và dòng máu đưa vào tim bị hạn chế, có thể gây ra cơn đau
tim đột qụy, bệnh động mạch vành cũng có thể gây ra cơn đau ngực. Đột quỵ: Đột quỵ khi
động mạch mang máu và oxy đến tim bị chặn lại, không có oxy, phần cơ này của tim
không hoạt động và sẽ có cảm giác đau ở ngực. Trong giai đoạn cấp, bệnh nhân yếu đột
ngột hoặc liệt hẳn một nửa bên người kèm với yếu hoặc liệt nửa mặt cùng bên. Người bệnh
có thể có những triệu chứng khác như: Nói khó, nuốt khó, rối loạn thị giác, mất thăng bằng.
Nặng hơn là rối loạn tri giác, lơ mơ hoặc hôn mê, thậm chí có thể ngưng thở và tử vong rất
nhanh.
Suy tim: Tim khoẻ mạnh sẽ bơm máu đến khắp cơ thể. Một quả tim yếu sẽ không đủ
khả năng làm việc bơm máu này một cách hiệu quả. Khi tim không bơm đủ máu, sẽ bị suy
tim.
Xơ vữa động mạch: Khi các mạch máu bị tắc bởi sự tích tụ cholesterol, chất béo và
canxi (còn được biết đến như là những mảng bám), đây chính là điều kiện dẫn đến bệnh
XVĐM. Những mảng bám tạo thành trên thành của mạch máu, mạch máu trở nên kém mềm
dẻo và sự lưu thông trong mạch máu cũng kém hơn, làm dòng máu khó chảy qua. Đột quỵ
hay cơn đau tim có thể xuất hiện nếu sự tích tụ mảng bám trở nên dày và mạch máu bị tắc
nghẽn nên dòng máu không thể chảy qua được.
Huyết áp cao: Huyết áp cao xuất hiện khi máu được đẩy đi trong mạch máu với áp
suất cao. Khi huyết áp lên cao, thành mạch trở nên yếu và có thể gây ra các biến chứng như
đột quỵ hay cơn đau tim.
35
Những enzyme làm tan huyết khối được sinh ra ở thành tế bào trong lòng mạch
máu có ở khắp cơ thể như: Trong động mạch, hệ thống mao mạch và mạch bạch huyết. Ở
người già việc sản sinh các enzym này bị suy giảm dẫn đến tình trạng hình thành các huyết
khối ở bất kỳ vị trí nào trong cơ thể. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự tắc nghẽn dòng
máu lên não có thể gây suy giảm và mất trí nhớ ở người cao tuổi [20].
Hình 1.10. Biến chứng của bệnh huyết khối
1.4.4. Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam
Hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu người tử vong vì nhồi máu cơ tim và 5
triệu người tử vong vì đột quỵ. Đây là hai trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện
nay và đều xuất phát từ một nguyên nhân, đó là hậu quả của chứng huyết khối do XVĐM.
Theo dự báo của WHO thì huyết khối sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào năm
2020. Nhồi máu cơ tim thường xảy ra đột ngột, nhanh và rất nguy hiểm. Khoảng 30% bệnh
nhân chết trước khi kịp đến bệnh viện [57].
Trong số những người nhập viện, có 5 đến 10% chết do các biến chứng như suy tim,
choáng tim, rối loạn nhịp tim. Theo thống kê cứ 6 người bị nhồi máu cơ tim thì có 1 người
sẽ bị tái phát cơn nhồi máu cơ tim, đột quỵ, tử vong do tim mạch sau 1 năm.
Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ. Trong
những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối ngày càng tăng cao và ngày càng có nhiều
người trẻ tuổi bị huyết khối [57].
36
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu

2.1.1. Nguyên vật liệu
- Chế phẩm natto của Nhật Bản bán tại Việt Nam.
- Nguyên liệu làm cơ chất: Bột đậu nành, cám gạo, cám lúa mì.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ
2.1.2.1. Dụng cụ
Que cấy vòng, que cấy nhọn, bình tam giác, ống nghiệm, bình định mức, pipetman, ống
đong, ống ly tâm, eppendorf , đèn cồn, diêm quẹt, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc,
khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel…
2.1.2.2. Thiết bị
Các loại máy móc: Tủ ấm (Sanyo, Nhật), nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật), tủ cấy vô trùng
(Việt Nam), tủ sấy (Memmert, Đức), máy lắc (Gerhardt, Đức), máy li tâm (Hettich, Đức),
tủ lạnh (National, Nhật), cân phân tích điện tử (Sartorius, Đức), máy đo quang phổ
UV(Amersham Biosciences, Thụy Điển), kính hiển vi (Olympus, Nhật), máy chụp ảnh kỹ
thuật số (Olympus, Nhật), máy đo pH (Windaus, Mỹ), tủ ấm (Sanyo, Nhật), máy trưng cất
đạm (Gerhardt, Đức), tủ giữ giống (Sanyo, Nhật)
2.1.3. Hóa chất
- Glucose, cao thịt, cao nấm men, peptone, bột đậu nành, KH2PO4, K2HPO4,
MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, Na2CO3, Na2HPO4, CuSO4.5H2O, MnSO4,
MnCl2, CaCl2, ZnSO4.7H2O, Casein, Albumin, Tyrosin, Fibrin, NaOH, HCl, Agar...
- Thuốc nhuộm: Tím gelatin, lugol, xanh metylen, đỏ trung tính, fuchsin,
phenolphtalein....
2.2. Môi trường nghiên cứu
MT1: MT phân lập, giữ giống, nhân giống VK
Nước chiết đậu nành 200ml, Glucose 15g, Pepton 10g, Yeast extract 5g, K2HPO4 2g,
KH2PO4 3g, dung dịch A 5ml, dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, agar 20g, Nước 1000ml,
pH 7,5 trước thanh trùng.
Nước chiết đậu nành: 100g đậu nành ngâm 12 – 14 giờ, rửa sạch, cho 150ml nước
luộc chín, thanh trùng 1 atm trong 30 phút, nghiền mịn, lọc lấy nước, bổ sung nước cho đủ
200ml.
37
Dung dịch A Thành phần Nồng độ
MgSO4.7H2O 12,3 g/l
MnSO4.4H2O 0,223g/l
ZnSO4.7H20 1,4g/l
Nước cất 1 lít
Dung dịch B
Thành phần Nồng độ
FeSO4.7H2O 2g/l
H2SO4 đđ 3ml/l
Hòa tan 2g FeSO4.7H2O vào 100ml nước cất. Sau đó cho 3ml dung dịch H2SO4 đđ
vào. Sau khi tan hết thì bổ sung nước cất cho đủ 1 lít.
Dung dịch C: Hòa 20g CaCl2 vào 1 lít nước cất.
MT2: Môi trường thử hoạt tính catalase
Pepton 5g/l
Cao thịt 5g/l
Yeast extract 5g/l
Glucose 10g/l
MnSO4. 4H2O 0,1g/l
Tween 80 0,5g/l
Agar 18g/l
MT3: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme protease

Cám lúa mì 50g, Bột đậu nành 50g, dung dịch A 5ml,dung dịch B 5ml, dung dịch C
5ml, pH ban đầu 7,5, độ ẩm 60%.
MT4: Môi trường thử hoạt tính enzyme protease
38
Casein 5g/l
NaHCO3 2g/l
Agar 15g/l
pH 7,5
H2 O 1 lít
2.3. Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí thí ngiệm tổng quát)
39
SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM TỔNG QUÁT
Chế phẩm natto của Nhật Bản
Nhuộm Gram
Phân lập chọn chủng Bacillus
Thử nghiệm catalase
Định danh bằng sinh học phân tử

Chủng Bacillus được chọn
Khảo sát ảnh hưởng của các điều
kiện nuôi cấy( độ ẩm, thời gian,
pH, tỉ lệ giống…) đến hoạt tính
protease.
Giữ giống
Thành phần MT( bột đậu nành,

Nhân giống cám mì, muối khoáng…)
Lên men Thanh trùng
Sấy khô
Nghiền
Hoạt tính enzyme

Tiêu chuẩn hóa chất lượng
VSV lạ (E.coli, Salmonella)
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto

* Nguyên tắc [14]
- Tách rời các tế bào vi khuẩn
40
- Nuôi cấy các tế bào trong MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, tách biệt
nhau.
* Cách tiến hành
- Lấy 10g natto của Nhật Bản giã nhỏ trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác có
90ml nước muối sinh lý, lắc đều tạo huyền phù, được dung dịch pha loãng 10-1.
- Lắc đều, hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý,
ta được dịch pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục pha loãng như thế được dịch pha loãng 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7 , 10-8
- Từ dịch pha loãng 10-7, 10-8, nhỏ 0,1 ml (ở mỗi nồng độ) vào đĩa petri có sẵn MT1.
Dùng que trang trải đều dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que trang đó trải tiếp
2 đĩa tiếp theo (mỗi nồng độ 3 đĩa).
- Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h – 48h. Chọn
những KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng [10].
* Phương pháp làm thuần [13]
- Lấy 1 KL riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào nước cất vô trùng, trải lên đĩa lần
2. Nếu các dạng KL đồng đều, có màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều có 1 dạng tế bào,
chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết.
- Sau đó chọn các KL riêng rẽ cấy chuyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa.
* Yêu cầu: Chủng phân lập được phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết
[4].
2.3.2. Phương pháp cấy truyền VSV
- Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT1 đã vô trùng. Dùng que cấy vô trùng, cấy
zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Để ống nghiệm ở 370C, sau 24h – 48h thấy xuất hiện
KL thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống.
- Giống được cấy chuyền hàng tháng và hoạt hóa trước khi nhân giống [10].
2.3.3. Phương pháp giữ giống dưới lớp dầu khoáng
- Yêu cầu của PP này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin phải trung
tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với VSV và vô trùng.
* Nguyên tắc:
Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống bằng cách tạo MT
yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của VSV
41
* Cách tiến hành: [10][14][17]
- Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút. Sau sấy khô ở tủ sấy
(1700C) trong 1 – 2 giờ.
- Để nguội.
- Đổ lên bề mặt MT có VSV phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm
1 cm.
- Dùng keo parafin đặc quấn quanh miệng và giữ ở điều kiện lạnh 4 – 60C
2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc
* Nguyên tắc
Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước và màu sắc KL của các chủng phân lập được
để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua phương pháp
nhuộm Gram.
* Tiến Hành [13].
- Lấy một vòng que cấy KL trên ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần trên mặt thạch (MT1)
ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3 - 4 đường khác
sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn
nữa phần VK dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của
vòng que cấy.
- Đặt mẫu ở nhiệt độ 370C trong 1-2 ngày để chọn ra các KL mọc riêng rẽ.
- Tiến hành quan sát các KL này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
hình dạng KL, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc ( trên,
dưới, có khuếch tán ra MT không).
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram
- Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết
tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa
trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí
bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.
* Cách tiến hành [13]
- Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24h trên ống thạch nghiêng
42
- Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.
- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút.
- Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết
màu.
- Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100
* Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím. Chọn
các chủng VK Gram dương để tiếp tục nghiên cứu.
2.3.6. Phương pháp nhuộm bào tử theo M.A. Peskop
- Dựa vào cấu trúc đặc biệt của bào tử: Dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước
hết xử lí để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.
- Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và TB bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh.
- Tẩy màu tế bào chất TB đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm bổ sung. Nhờ đó tế bào
chất của bào tử và tế bào chất TB bắt màu phân biệt.
- Làm vết bôi với VK nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng và để vết bôi khô tự
nhiên.
- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm xanh metylen, hơ nóng phía dưới và giữ trong 1 phút (nếu thuốc cạn phải bổ
sung ngay).
- Rửa kĩ vết bôi cho đến khi hết màu.
- Nhuộm đỏ trung tính 0,5% trong 1 phút.
- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.
* Đọc kết quả: Bào tử màu xanh, tế bào chất màu đỏ.
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh catalase
43
- VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có
enzyme catalase (trừ các chủng Streptococcus spp). Enzyme này thủy phân hydrogen
perioxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này
trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen perioxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện
tượng sủi bọt khí.
- Thử nghiệm này thường được dùng để phân biệt các VSV hiếu khí với kỵ khí như
phân biệt Bacillus (+) với Clostridium (-).
- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ KL thuần đặt lên một phiến kính sạch.
- Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên sinh khối VSV trên phiến kính. Ghi nhận sự
sủi bọt (nếu có).
* Đọc kết quả
Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra, ngược lại là (-)
khi không có sự sủi bọt khí.
2.3.8. Phương pháp xử lí tế bào và bào tử để chụp trên KHV điện tử quét SEM
Tiến trình gồm các bước sau:
- Ly tâm canh trường VK
- Rửa TB bằng dung dịch đệm phosphate pH7,2 ( 3 lần)
- Thêm 0,25% gluteraldehyde vào đệm phosphate pH 7,2
- Ủ qua đêm
- Rửa TB bằng đệm Na – phosphate (3 lần)
- Ly tâm thu TB
- Khử nước TB bằng ethanol 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, mỗi giai đoạn để 10 phút.
- Ủ trong ethanol 100% trong 1 giờ
- Làm tiêu bản đưa vào KHV điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope)
2.3.9. Chụp ảnh tế bào, bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron
Microscop-SEM)
Do Viện Hóa học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt nam thực hiện
2.3.10. Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử
* Thu nhận DNA
44
- Phá màng TB và màng nhân bằng protein đặc hiệu (protease K) để giải phóng các
DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
- Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: Sử dụng hỗn hợp phenol và
chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA.
- Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các
acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.
* Chạy PCR (polymerase chain reaction)
Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản
ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước.
- Bước 1: (Biến tính): Trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép,
DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC - 95oC
trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 2 (Lai): Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này
dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút.
- Bước 3 (Tổng hợp): Nhiệt độ được tăng lên đến 720C để DNA polymerase
hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA,
thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
* Giải trình tự DNA
- Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): Dựa vào các phản ứng thủy
giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước
chênh lệch nhau một nucleotide.
- Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): Dựa
vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử
dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng
hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một
nucleotide.
Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên
gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần
xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. Sau khi giải trình tự gen 16S
rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng VK nghiên cứu.
2.3.11. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
* Nguyên tắc
45
Đếm số KL mọc trên MT từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi KL hình
thành từ một tế bào duy nhất.
- Chuẩn bị dung dịch pha loãng: Cân 10g MT định mức lên 100ml bằng dung dịch
NaCl 0,9% ta được độ pha loãng 10-1, sau đó hút 1ml dung dịch có độ pha loãng 10-1 cho
vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl 0,9% được độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng để được
các độ pha loãng 10-3 , 10-4 , 10-5, 10-6 , 10-7 ,10-8.
- Chuẩn bị MT thạch đĩa: MT1 được vô trùng cẩn thận.
- Cấy và dàn đều dịch pha loãng.
+ Dùng pipetman lấy 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng 10-7, 10-8 cho vào
mỗi đĩa petri, mỗi độ pha loãng cấy 3 đĩa
+ Dùng que gạt vô trùng, gạt mẫu thật đều trên mặt thạch để tách riêng rẽ từng
TB. Ghi vào nắp hộp petri các thông tin: Nồng độ pha loãng, ngày cấy mẫu.
- Gói kín các đĩa petri vừa cấy, cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C.
- Sau 24 giờ, đếm số KL trong mỗi đĩa. Ghi nhận các độ pha loãng có số KL từ 25
đến 250 KL/đĩa
* Cách tính kết quả
Mi (CFU/g) = Ai x Di/V
Trong đó Ai: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa
Di: Độ pha loãng
V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình MI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi các nồng
độ pha loãng khác nhau.
2.3.12. Xác định hoạt tính protease bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
* Nguyên tắc [6]
Enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong
suốt xung quanh lỗ thạch. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt tính của enzyme.
• Phương pháp đặt thỏi thạch
- Chuẩn bị các chủng VK cần nghiên cứu và nuôi trên MT1
- Chuẩn bị MT thử hoat tính enzyme protease ( MT4)
- Dùng khoan nút chai (đường kính d = 0,9 cm) khoan thỏi thạch có VK ở MT1 và đặt
46
lên MT4
- Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó đo đường kính vòng phân giải.
Phương pháp này chỉ sơ bộ định tính enzyme.
• Phương pháp khoan lỗ thạch
- Chuẩn bị các đĩa petri có MT4
- Dùng khoan nút chai (đường kính d = 0,9 cm) khoan lỗ trên đĩa thạch.
- Lấy 5g môi trường rắn sau lên men, nghiền mịn trong cối sứ vô trùng, hòa trong 100ml
nước muối sinh lí, lắc đều, lấy 1ml cho vào eppendorf ly tâm, lấy dịch trong.
- Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch enzyme thô vào lỗ thạch, đặt trong tủ ấm 370C
trong 24 giờ
- Kiểm tra hoạt tính protease: Thuốc thử là TCA. Nếu VK có sinh protease sẽ tạo vòng
trong suốt quanh lỗ khoan, phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với TCA
- Đánh giá khả năng sinh protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải D-d (cm).
Trong đó D: Đường kính vòng phân giải (cm), d: Đường kính lỗ thạch (cm).
• D-d ≥ 2,5 cm: Rất mạnh.
• D-d ≥ 2,0 cm: Mạnh.
• D-d ≥ 1,5 cm: Trung bình.
• D-d < 1,0 cm: Yếu.
2.3.13. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
a. Nguyên tắc [10]
Cho protease tác dụng với casein, sau đó kết tủa protease dư thừa bằng TCA. Sản
phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay các acid amin, trong các acid amin thì tyrosine chiếm
đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ
enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính protease là lượng enzyme cần để thủy phân
casein trong thời gian 60 phút tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine
trong 1 ml dịch lọc ở 370C và pH 7
b. Hóa chất
- Đệm phosphate 0,2M: Cho từ từ dung dịch NaH2PO4 0,2M vào dung dịch Na2HPO4
0,2M và khuấy đều cho đến khi đạt pH 6.
- Casein 1,5%: 1,5g casein + 25 ml NaOH 0,1M, đun cách thủy ở 90 – 950C trong 10
phút. Làm mát, chỉnh về pH 7 bằng H3PO4 1/30M. Thêm 20 ml đệm phosphate 0,2M và
định mức dung dịch để đạt đến 100 ml bằng nước cất.
47
c. Dựng đường chuẩn Tyrosine
Hòa tan 10 mg tyrosine trong 80 ml, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung
dịch HCl 0,1M đến vạch
Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm như sau:
Ống nghiệm AS0 AS10 AS20 AS30 AS40 AS50
Dung Dịch Tyrosine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Lượng Tyrosine tương ứng 0 10 20 30 40 50
HCl 0,1M (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5
Na2CO3 0,4M 5 5 5 5 5 5
Folin(ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều các ống nghiệm này, đặt vào bể ổn nhiệt 370C trong 20 phút. Đo mật độ
quang ở bước sóng 660 nm
d. Tiến hành phản ứng
Cho 1 ml casein 1,5% vào ống nghiệm , ủ 370C trong 10 – 15 phút. Cho 1 ml dung
dịch enzyme vào, lắc đều, đem ủ 370C trong 60 phút. Sau đó cho vào 2 ml dung dịch TCA
0,4M, để ổn định trong 25 phút, lọc bỏ tủa. Cho 5 ml Na2CO3 0,4m vào 1ml dịch lọc , thêm
1ml Folin. Trộn đều, để yên ở 370C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh đem
đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm.
Với mẫu đối chứng, lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các bước
tương tự như trên.
e. tính toán kết quả
Hoạt tính protease được tính theo công thức:
(A – A0) x F x n
UI =
100
F = (10/(AS10 – AS0) + 20/(AS20 – AS0) + .......... + 50/(AS50 – AS0))/5
Trong đó:
A: Độ hấp thụ của mẫu
A0: Độ hấp thụ của mẫu đối chứng
F: Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine (µg) và độ hấp thụ ở bước sóng 660
nm
n : Hệ số pha loãng enzyme
48
1/100: Hệ số chuyển đổi.
2.3.14. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
Để xác định nồng độ protein trong dung dịch, có nhiều phương pháp khác nhau:
Lowry, Biuret, BAC, Bradford, Hartree, lowry cải tiến, hấp thu UV( UV absortin). Mỗi
phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Ỏ đây chúng tôi sử dụng phương pháp Lowry [8]
* Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan, hàm lượng của những acid amin
này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm
lượng acid amin này như nhau.
Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu,
màu này tỉ lệ với hàm lượng của tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein). Vì vậy ta có
thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích với
những mẫu chuẩn có nồng độ protein đã biết. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép
phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1µg/cm3.
* Hóa chất sử dụng
Dung dịch Albumin 0,1%: Cân chính xác 0,1g Albumin pha với nước cất thành
100ml
Dung dịch A: Cân 2g Na2CO3 hòa trong NaOH N/10 thành 100 ml
Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch Citrat Natri 1% thành
100ml
Dung dịch C: (chỉ pha dùng trong ngày) là hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ
lệ 49:1
Thuốc thử Folin
- Hút 0,4 ml dung dịch protein cho vào ống nghiệm sạch và sấy khô.
- Thêm vào 2ml dung dịch C, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Thêm vào 2ml thuốc thử Folin, lắc đều để trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ
5ml.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 750 nm.
• Dựng đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là Albumin của
bò đã đông khô. Từ dung dịch albumin chuẩn tiến hành pha loãng như sau:
49
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ
0 50 100 150 200 250
Albumin γ/ml
Dung dịch
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Albumin 0,1%
Nước cất 5 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5
Vẽ đường biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ protein
chuẩn (γ/ml)
* Cách tính
Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein, từ đó suy
ra hàm lượng protein của dung dịch enzyme là a (γ/ml)
Lượng protein (M) có trong 1 ml dung dịch enzyme hay chế phẩm enzyme được tính
theo công thức:
a x 10-3 x n
M=
m
Trong đó M: Lượng protein có trong 1ml dung dịch enzyme hay chế phẩm enzyme (mg
protein/g chế phẩm enzyme hay mg protein/ml chế phẩm enzyme)
a : Hàm lượng protein (γ/ml dung dịch)
n : Hệ số pha loãng
m : Khối lượng chế phẩm enzyme
2.3.15. Phương pháp xác định hoạt độ nattokinase
* Hóa chất
- Đệm borat 0,05M
- Fibrin 0,4%
- TCA 0,2M
Hoá chất Ống nghiệm
Mẫu thật Mẫu không
Đệm borat 0,05M (ml) 1,5 1,5
Fibrin 0,4% (ml) 0,4 0,4
Lắc đều, giữ ở 370C/ 5 phút
TCA 0,2M (ml) 0 2
Dung dịch enzyme (ml) 0,1 0
50
Lắc đều, giữ ở 370C/ 60 phút
TCA 0,2M (ml) 2 0
Dung dịch enzyme (ml) 0 0,1
Lắc đều, giữ ở 370C/ 30 phút, ly tâm 12000 vòng/ 5 phút, thu dịch nổi
Dịch nổi(ml) 1 1
Đo bước sóng 275nm
Ký hiệu A1 A2
Công thức xác định hoạt tính:

(A1 – A2).d
FU =
0,01.t.v
Trong đó A1: Chỉ số OD275 của mẫu thật

A2: Chỉ số OD275 của mẫu không
d: Độ pha loãng
t = 95: Thời gian phản ứng (phút)
v = 4: Thể tích enzym (mL)
2.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng tổng
hợp protease của chủng B. subtilis N18
2.3.16.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ Cám mì và Bột đậu nành
Tiến hành nuôi VK trên MT3 với 10g MT trong bình tam giác 250ml có bổ sung cám
mì và bột đậu nành với các tỉ lệ khác nhau theo Bảng 2.2
Bảng 2.2. Tỉ lệ cám mì và bột đậu nành trong MT nuôi cấy B.subtilis N18
TN Cám mì (%) Bột đậu nành (%)
1 0 100
2 30 70
3 40 60
4 50 50
5 60 40
6 70 30
7 100 0
Với thời gian lên men là 48h, nhiệt độ lên men 370C và độ ẩm MT ban đầu 60%
Sau thời gian nuôi cấy thu dịch enzyme, xác định hoạt độ protease theo phương pháp
Anson cải tiến mục 2.3.13. Chọn nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt độ protease cao.
51
2.3.16.2. Phương pháp xác định lượng nước cho vào ở các độ ẩm cần thiết và khảo
sát ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường
Cách tính lượng nước cho vào 1 kg nguyên liệu gồm bột đậu nành và cám mì thực
hiện theo công thức sau:
Nguyên liệu ban đầu có độ ẩm trung bình: 10%
mb - m
a=
m - ma
a: Lượng nước cần thiết cho vào với các độ ẩm cần thiết (lit)
ma = 1 ( 100% độ ẩm)
mb = 0,1 ( Độ ẩm của nguyên liệu)
m: Độ ẩm cần thiết
Vd: Để có độ ẩm MT là 60%  lượng nước cho vào 1 kg nguyên liệu là
(0,1 – 0,6)/ (0,6 – 1) = (- 0,5)/(- 0,4) = 1,25
Vậy cần 1,25 lít nước cho vào 1 kg nguyên liệu.
Tiến hành khảo sát với các độ ẩm 40, 50, 60, 70, 80% để xác định độ ẩm tối ưu cho
sự sinh tổng hợp protease cao.
2.3.16.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men
- Tiến hành nuôi VK trên MT theo kết quả của TN 2.3.16.2.
- Bổ sung Nấm men vào MT nuôi cấy với các nồng độ 0,1 ; 0,2 ; 0,3%, mẫu đối
chứng là VK nuôi trong MT không bổ sung Nấm men.
- Xác định hoạt độ protease theo phương pháp mục 2.3.13. Chọn nồng độ nấm men
thích hợp cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.16.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
- Nuôi VK trong MT theo mục 2.3.16.3
- Chỉnh pH ban đầu ở các mức: 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12
- Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm loại bỏ sinh khối ở 12000 vòng/phút trong 15 phút,
lấy dịch enzyme. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến.
- Dựa vào kết quả thu được xác định pH thích hợp cho quá trình lên men.
2.3.16.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống
* Mục đích: xác định tỉ lệ cấy giống tối ưu vào MT để thu được prptease có hoạt tính
cao nhất.
52
* Cách tiến hành:
- Nhân giống trong môi trường lỏng (MT1 không có agar), 20ml môi trường trong
bình tam giác 250ml, nuôi trên máy lắc ngang 120 vòng/ phút, nhiệt độ 37oC, thời gian nuôi
14 giờ
- Chuẩn bị các bình tam giác 250ml chứa 10g các MT có bổ sung NaCl 0,5% , NaCl
0,5% + 0,1% nấm men trích ly, đối chứng là MT không bổ sung NaCl và nấm men trích ly.
Hấp khử trùng ở 1atm/1 giờ.
- Giống cấy các nồng độ 107 và 108 ở từng nghiệm thức
- Lên men tiến hành ở nhiệt độ 37oC, thời gian nuôi 48 giờ
- Đánh giá kết quả theo hoạt tính protease
2.3.16.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K +
- Tiến hành nuôi VK trên MT theo kết quả TN 2.3.16.5
- Bổ sung thêm nguyên tố khoáng được thay đổi là Zn2+, K+.
- Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến.
- Dựa vào kết quả thu được, chọn vi khoáng phù hợp cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.16.7. Ảnh hưởng thời gian lên men
- Tiến hành lên men bán rắn trên MT đã tối ưu theo mục 2.3.16.6. Ở nhiệt độ 37oC,
từng khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ
- Lấy mẫu phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson cải tiến ( mục
2.3.13) và PP đếm khuẩn lạc (mục 2.3.11)
- Dựa vào kết quả thu được, chọn mốc thời gian phù hợp cho hoạt tính protease cao
nhất.
2.3.16.8. Tối ưu hóa nồng độ Tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch
thực nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm
Để xác định nồng độ Tween 80 và Glucose thích hợp cho lên men, chúng tôi tiến
hành quy hoach thực nghiệm với hai yếu tố là nồng độ Tween 80 và nồng độ Glucose.
Chúng tôi sử dụng phương pháp trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm để đưa ra phương trình
hồi quy.
Các mức tiến hành thí nghiệm được bố trí như Bảng 2.3
Bảng 2.3. Các mức tiến hành thí nghiệm
Các mức Các yếu tố
53
Glucose (%) Tween 80 (%)
Mức tâm 2,5 0,03
Khoảng biến thiên 1,5 0,01
Mức trên ( +) 4 0,02
Mức dưới ( -) 1 0,04
Tiến hành các TN theo bảng 2.4

Số TN tối ưu là 11 tí nghiệm, trong đó có 3 TN ở tâm phương án với các điều kiện ban đầu
được cố định như:
- Tỉ lệ Cám mì/ Bột đậu nành: 7/3
- Nhiệt độ nuôi cấy: 370C
- Thời gian nuôi cấy: 48 giờ
- pH ban đầu: 9
Bảng 2.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao bậc hai,
cấu trúc có tâm.
TN x1 x2 x1 (%) x2 (%)
1 -1 -1 1 0,02
2 1 -1 4 0,02
3 -1 1 1 0,04
4 1 1 4 0,04
5 -1 0 1 0,03
6 1 0 4 0,03
7 0 -1 2,5 0,02
8 0 1 2,5 0,04
9 0 0 2,5 0,03
10 0 0 2,5 0,03
11 0 0 2,5 0,03
Phương trình hồi quy có dạng:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b11x12 + b22x22 + b12 x1x2
Trong đó:
y: Hàm mục tiêu cần tối ưu
x1: Biến ngẫu nhiên, nồng độ glucose
x2: Biến ngẫu nhiên, nồng độ tween 80
b0, b1, b2, b11, b22, b12: Hệ số của phương tình hồi quy.
Thông số khảo sát: Hoạt tính protease
2.3.17. Phương pháp làm natto
54
* Nguyên tắc
VK Bacillus subtilis sinh trưởng trên cơ chất hạt đậu nành và gạo lức đã được hấp
chín sẽ sản sinh enzyme protease giàu nattokinase có khả năng điều trị các bệnh về huyết
khối cho con người.
• Phương pháp làm natto đậu nành
- Đậu nành ngâm qua đêm. Cho vào hấp vô trùng ở 1210C trong 1 giờ để đậu chín
nhừ, không xát vỏ, để nguyên hạt.
- Đậu đã chín để nguội
- Cấy giống B.subtilis vào đậu nành, sau đó bỏ vào hộp Polypropylen 20x10x5cm,
mỗi hộp khoảng 40 - 50 gram đậu nành. Bịt miệng hộp bằng vải màn.
- Ủ ở 400C.
- Sau 20 - 24h thu được sản phẩm natto, đánh giá kết quả.
• Phương pháp thử nghiệm natto đậu nành – gạo lức
- Gạo lức, ngâm qua đêm, cho vào nồi cơm điện nấu chín
- Trộn đều gạo lức và hạt đậu nành đã hấp chín với tỉ lệ 500g đậu nành/ 400g gạo lức
- Cấy giống và ủ tương tự như tiến trình đối với cách làm natto đậu nành.
- Đánh giá chất lượng cảm quan và hoạt tính protease của từng nghiệm thức.
2.3.18. Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm sau lên men
* Nguyên tắc
Dựa trên nguyên lý làm khô mẫu đến khối lượng không đổi. Khối lượng mẫu mất đi
khi sấy mẫu đến khối lượng không đổi là lượng nước có trong mẫu.
* Dụng cụ và thiết bị
Tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích, hộp đựng mẫu.
- Sấy khô và cân đĩa petri đến khối lượng không đổi, sử dụng cân phân tích với độ
chính xác 0,5mg.
- Cân khoảng 5g mẫu cho vào đĩa petri, đặt vào tủ sấy 105oC trong 4giờ. Lấy ra để
nguội trong bình hút ẩm 15-20 phút, rồi cân đĩa petri với độ chính xác đến 1mg.
55
- Đặt đĩa petri sấy tiếp 30 phút nữa ở 105oC. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 15-20
phút, rồi cân lại. Chênh lệch giữa hai lần cân không quá 5mg là được (nếu vẫn chưa khô thì
phải sấy và cân lại).
* Cách tính
Độ ẩm (A) của mẫu được tính theo công thức:
(m1 – m2) . 100

A=
M
Trong đó:
M: Khối lượng mẫu phân tích.
m1: Khối lượng hộp và mẫu trước khi sấy (g).
m2: Khối lượng hộp và mẫu sau khi sấy (g).
100: Hệ số qui đổi ra %.
2.3.19. Phương pháp tách chiết enzyme
* Nguyên tắc
Protease được nghiên cứu ở đây là những enzyme ngoại bào nên việc tách chiết khá
đơn giản, protease được VSV tiết ra ngoài và ngấm vào MT nuôi dưỡng, MT nuôi dưỡng ở
đây thuộc MT bán rắn. Để tách chiết protease, hòa MT vào nước muối 0,9% hoặc dung dịch
đệm có pH thích hợp và chiết lấy dịch lỏng sẽ được dịch protease thô.
* Hóa chất và dụng cụ
- Môi trường rắn sau lên men có protease
- Nước muối 0,9% hoặc dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp
- Máy ly tâm
- v.v...
- Cân 30g canh trừờng hòa trong 250 ml nước cất hoặc dung dịch đệm phosphat có
pH thích hợp.
- Khuấy đều và giữ ở nhiệt độ 3 – 50C trong 40 – 45 phút
- Lọc qua vải thưa.
- Ly tâm tốc độ 5000 vòng / phút với thời gian 15 phút.
- Chiết lấy dịch lỏng chứa protease.
2.3.20. Phương pháp thu nhận enzyme
56
Những tác nhân gây tủa protease bao gồm các dung môi hữu cơ như aceton, ethanol
98%. V.v... , các loại muối như MgCl2, (NH4)2SO4.v.v..,
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng tác nhân gây tủa là ethanol 98%
* Nguyên tắc:
Nguyên nhân gây kết tủa protein là lớp hydrate bao phủ protein bị tác nhân gây tủa
giành lấy, dẫn tới protein mất vỏ hydrate sẽ kết hợp với nhau và kết tủa xuống. Dựa vào
tính chất này, đưa tác nhân tủa dần dần vào dung dịch enzyme thô để có thể thu nhận
enzyme.
Anion protein Protein ở pI với vỏ hydrate Cation protein
Thêm kiềm Thêm axit

tăng pH giảm pH
Loại nước Loại nước Loại nước
Thêm cation Thêm ation
Protein kết tủa
Hình 2.2. Sự kết tủa protein

* Dụng cụ và hóa chất
- Etanol 98%
- Enzyme thô
- Bình tam giác, pipette
- Máy li tâm
- V.v...
Bước 1: Thu dịch chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy VK, giữ lạnh dịch enzyme và
Ethanol 98% sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C.
Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ Ethanol 98% vào dung dịch enzyme với tỉ lệ Ethanol
98% : ddE = 3: 1 (chú ý quá trình tủa phải được tiến hành ở 3 - 40C ) và khuấy đều.
57
Bước 3: Để yên ở 3 - 40C trong 30 – 40 phút, chú ý thời gian tủa không quá 1 giờ
Bước 4: Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút
Bước 5: Thu nhận tủa enzyme và sấy khô ở nhiệt độ < 400C. Bảo quản CPE thu được ở
40C.
2.3.21. Khảo sát một số đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng
ethanol
2.3.21.1. pH hoạt động tối ưu
- Tiến hành phản ứng enzyme trên cơ chất casein 1,5%, ở nhiệt độ 370C, tỉ lệ enzyme
ở các mẫu là như nhau.
- Chuẩn bị các dung dịch đệm có pH khác nhau.
- Thay đổi pH các mẫu ở các mức khác nhau: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0.
- Tiến hành xác định hoạt tính protease của CPE theo Anson cải tiến.
- Xác định pH tối ưu cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.21.2. Nhiệt độ hoạt động tối ưu
- Khảo sát hoạt tính protease của CPE trong MT có pH 8, cơ chất là casein 1,5%, các
mẫu được bố trí thí nghiệm ở các mức nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 600C.
- Sau thời gian phản ứng, tiến hành xác định hoạt tính của CPE protease.
- Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease.
2.3.21.3. Nồng độ cơ chất tối ưu
- Tiến hành phản ứng enzyme ở nhiệt độ 400C, pH 8,
- Thay đổi nồng độ cơ chất casein ở các mức khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%;
2,5%; 3,0%.
- Tiến hành xác định hoạt tính protease của CPE theo Anson cải tiến.
- Xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt tính protease cao nhất.
2.3.22. Phương pháp xử lí số liệu
Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Kết quả được trình bày bằng giá trị
trung bình ± sai số được tính bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Sử dụng phần mềm
Statgraphics Plus 3.0 để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm và đánh giá sự khác biệt giữa
các mẫu.
Có hai thí nghiệm tối ưu hóa MT được thực hiện theo mô hình tối ưu hóa các yếu tố
trực giao bậc 2, cấu trúc có tâm, sử dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế và xử lý số liệu
thực nghiệm, đó là:
58
- Tối ưu hóa ảnh hưởng của nồng độ glucose và tween 80 đến hoạt tính protease.
- Tối ưu hóa ảnh hưởng của cám mì, cám gạo và bột đậu nành đến hoạt tính protease.
59
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Phân lập và tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus từ Natto của Nhật Bản
Natto là thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản được cho là có lịch sử trên
1000 năm. Natto được sản xuất trên nguyên liệu đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis
natto. Hiện nay hàng năm Nhật Bản sản xuất trên 300.000
tấn. Natto làm giảm đông máu nhờ phân giải fibrin của
huyết khối và ức chế hoạt hóa plasminogen giúp phòng tránh
chứng huyết khối. Nhiều tác giả trên thế giới và trong nước
đã phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm
Natto của Nhật để nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất
Nattokinase như Xie et al.,(1999)[58], Chen tien Chang et
al.,(2000)[25], Cong Wang et al.,(2009)[26],
Lê Thị Bích Phượng vctv (2012)[12].
Hình 3.1: Chế phẩm natto
của Nhật Bản
Chúng tôi đã mua các mẫu Natto của Nhật Bản ở cửa tiệm bán hàng hóa thực phẩm
của Nhật Bản tại 15A8 Lê Thánh Tôn, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh để sử dụng trong
phân lập vi khuẩn Bacillus. Qua bốn đợt phân lập cho thấy: Vi khuẩn Bacillus trong Natto
của Nhật Bản có mật độ cao, từ 1-2 x 109 cfu trong một gam sản phẩm tươi, hình thái khuẩn
lạc khá đồng đều, là những khuẩn lạc Bacillus điển hình. Sau khi phân lập, làm thuần, chúng
tôi đã chọn lựa được 20 mẫu. Các mẫu phân lập được đều phát triển tốt hơn trên môi trường
có nước chiết đậu nành hoặc sữa đậu nành so với môi trường peptone-glucose. Hình thái
khuẩn lạc của một số mẫu trình bày ở hình 3.2.
60
Hình 3.2. Hình thái KL của một số mẫu VK phân lập được
trên MT peptone-glucose và MT có nước chiết đậu nành
Hình 3.3. Hình thái KL của VK trong Natto Nhật Bản

3.1.2. Tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease cao
Để đánh giá sơ bộ khả năng sinh protease của các mẫu phân lập được, chúng tôi tiến
hành tuyển chọn các mẫu VK có hoạt tính protease theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.12,
từng mẫu tách được chúng tôi cấy trang trên MT1, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ, đục thỏi
môi trường có VK phát triển tốt và đặt lên MT4, ủ tiếp 24h ở 370C. Nhỏ dung dịch TCA
0,4M lên trên mặt thạch MT4. Nếu thấy xung quanh thỏi thạch xuất hiện vòng trong suốt thì
chứng tỏ VK đó có khả năng sinh protease, vì chính protease đã phân giải cơ chất casein
trong MT4 làm cho môi trường trở nên trong suốt. Kết quả trình bày ở hình 3.4
61
N18 N24
8.1
N17
N23 N441
BC
N32
N32
N46
N36 N21
N43
N420
N13 N26
N30
Hình 3.4. Vòng phân giải casein của một số VK phân lập được
bằng phương pháp đặt thỏi thạch
Từ kết quả hình 3.4 cho thấy tất cả các mẫu phân lập được đều có khả năng sinh
protease, tuy nhiên có một số mẫu có hoạt tính yếu (12/20 mẫu). Trong số các mẫu có hoạt
tính protease, chúng tôi chọn được 8 mẫu có hoạt tính cao (có đường kính lớn hơn 2 để tiếp
tục nghiên cứu). Các mẫu sau đây đã được chọn lọc gồm: N17, N18, N21 N23 N24, N32,
N441, N36 và hai chủng BC và 8.1 (trong bộ sưu tập của phòng thí nghiêm). Tiếp theo tiến
hành kiểm tra khả năng sinh protease của các mẫu bằng cách đo đường kính vòng thủy phân
casein của các mẫu theo phương pháp 2.3.12. Qua độ lớn của đường kính vòng thủy phân có
thể đánh giá khả năng sinh protease của các mẫu. Kết quả được trình bầy ở bảng 3.1 và hình
3.5.
62
N18 8.1 BC
N21 N17 N32
N24 N23 N441
N36
Hình 3.5. Vòng phân giải casein của 10 mẫu VK có hoạt tính protease cao nhất
Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của 10 mẫu VK
có hoạt tính protease cao nhất
Hoạt tính protease

STT Ký hiệu mẫu
(D - d) (cm)
63
1 8.1 2,6 ± 0,1
2 BC 2,5 ± 0,03
3 N18 2,6 ± 0,04
4 N17 2,4 ± 0,15
5 N441 2,4 ± 0,06
6 N36 2,1 ± 0,02
7 N21 2,1 ± 0,15
8 N23 2,3 ± 0,09
9 N24 2,2 ± 0,11
10 N32 2,1 ± 0,04
Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của các mẫu VK đã tuyển chọn, chúng
tôi tiến hành nuôi các mẫu phân lập được gồm: N18, N17, N441, N36, N21, N23, N24,
N32, 8.1, BC trong MT3 tại 4 mốc thời gian là 24 giờ, 40 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Sau thời
gian nuôi cấy, thu dịch enzyme thô và xác định hoạt tính protease của các mẫu theo phương
pháp Anson cải tiến (mục 2.3.13). Kết quả được trình bầy tại bảng 3.2 và hình 3.6.
Bảng 3.2. Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn
Hoạt tính protease (U/g)

STT Kí hiệu
24 giờ 40 giờ 48 giờ 72 giờ
1 N24 26,67 ± 0,43 42,58±0,37 44,73±0,22 40,86±0,78
2 N17 41,93 ± 0,37 44,94±0,57 63,87±0,00 42,79±0,57
3 BC 71,61 ± 0,37 79,35±0,65 97,42±0,37 73,55±0,99
4 N21 16,77 ± 1,34 18,71±0,37 39,35±0,37 23,23±0,00
5 N32 17,85 ± 0,94 21,29±0,65 35,70±0,94 23,87±0,37
6 8.1 67,31 ± 0,22 75,91±0,22 97,85±0,57 53,76±1,14
7 N23 18,92 ± 0,94 33,12±0,57 42,36±0,57 17,63±0,57
8 N18 54,62 ± 0,86 94,62±0,57 110,53±1,20 58,92±0,22
64
9 N441 50,32 ± 1,34 80,97±0,37 92,14±0,57 53,12±0,78
10 N36 27,10 ± 0,00 36,99±0,78 48,82±0,94 28,60±0,22
24 giờ 40 giờ 48 giờ 72 giờ

120
100
80
60
40
20
0
N24 N17 BC N21 N32 8.1 N23 N18 N441 N36
Hình 3.6. Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn

Nhận xét: Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy đa số các mẫu nghiên cứu
sinh tổng hợp protease cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy với hoạt tính cực đại là 110,53 U/g (ở
mẫu N18). Vào thời điểm này VSV đang ở kỳ đầu của pha tích tụ sản phẩm trao đổi chất,
lượng enzyme sinh ra là cao nhất. Trước thời điểm trên thì VSV ở thời kì sinh trưởng, chủ
yếu tổng hợp protein và xây dựng tế bào nên tích tụ sản phẩm trao đổi chất rất ít. Sau 48 giờ
trở đi thì lượng enzyme giảm đáng kể do tế bào bắt đầu tự phân và một số sản phẩm trao đổi
chất trở thành nguồn dinh dưỡng cho VSV.
Tùy theo hình thức lên men dịch thể hay lên men bán rắn mà thời điểm đạt đựợc hoạt
tính enzyme cao nhất sẽ khác nhau. Dong Ming sheng et al., (2001)[29] cho rằng chủng
Bacillus subtilis khi lên men dịch thể cho hoạt tính cao nhất sau 24 giờ. Chang Jin Liu et
al., (2004)[24] đã nghiên cứu sinh tổng hợp Nattokinase của chủng Bacillus subtilis SBS (J)
đạt tối ưu tại 44 giờ. Saurabh S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng
hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29. Hoạt tính tối đa protease đạt được 3028
U/ml trên môi trường dịch thể có 1,5% bột đậu nành là sau 18 giờ lên men. Nadeem et
al.,(2008) [43] đã nghiên cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis thấy hoạt
tính protease đạt cao nhất trong 12 giờ. Nurullah et al.,(2011)[44] đã nghiên cứu sản xuất
65
protease kiềm từ chủng Bacillus subtilis RSKK96, hoạt tính enzyme đạt được cao nhất tại
thời gian nuôi 120 giờ. Essam et al., (2012)[32] đã cho rằng khi lên men bán rắn, việc sinh
tổng hợp nattokinase đạt tối ưu sau thời gian lên men 2 ngày.
Như vậy khi lên men các chủng Bacillus sp để sản xuất protease hoặc Nattokiane thì
thời gian cho enzyme cao nhất trong lên men dịch thể sớm hơn so với lên men bán rắn.
Dựa trên kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.6 cho thấy các mẫu vi
khuẩn cho hoạt tính cao nhất là N18, tiếp đến là BC, 8.1 và N441. Tuy nhiên hai chủng 8.1
và BC do không phân lập từ các chế phẩm thực phẩm lên men truyền thống như natto Nhật
Bản, vì vậy để an toàn hơn trong việc tạo ra chế phẩm cho con người có thể sử dụng, chúng
tôi chọn mẫu N18 và N441 có hoạt tính cao để tiếp tục nghiên cứu.
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai mẫu N18 và N441, định danh đến chi
3.2.1. Đặc điểm hình thái
Để nghiên cứu đặc điểm sinh học và định danh 2 mẫu N18 và N441, chúng tôi tiến
hành cấy trên môi trường thạch đĩa (MT1) ở 37oC. Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc,
bề mặt khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm Gram theo phương pháp 2.3.5 và nhuộm bào tử theo
phương pháp 2.3.6. Kết quả được nêu trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của hai mẫu N18 và N441
Đặc điểm hình thái
Đặc điểm Đặc điểm hình thái mẫu N18
mẫu N441
Bề mặt hơi nhăn, khô, màu hơi Bề mặt nhăn, nhầy và có các
vàng, ở giữa có một núm nhỏ gợn sóng, màu trắng đục, mép
Hình thái KL hình tròn có màu vàng nhạt hơi nhăn và bám chặt vào bề
hơn, mép hình răng cưa, lan mặt thạch
trên bờ mặt thạch
Hình que, ngắn, nhỏ, xếp đơn Hình que, mảnh, xếp đơn hoặc
Hình thái TB hoặc đôi, bắt màu tím chứng tỏ đôi, bắt màu tím chứng tỏ chủng
chủng này là VKG(+) này là VKG(+)
Hình thành nội bào tử, phân bố Hình thành nội bào tử, phân bố
Hình thành nội BT
chính tâm chính tâm
Hình dạng tế bào và bào tử đã được xử lý bằng cách cố định tế bào bằng 0,25%
glutaraldehyde trong dung dịch đệm phosphate pH=7,2 và khử nước bằng ethanol ở các
nồng độ đậm đặc tăng dần từ 30% đến 100%. Mẫu vi khuẩn chụp bằng kính hiển vi điện tử
66
quét SEM do Viện công nghệ Hóa học, Viện hàn lâm khoa học Việt nam thực hiện. Tế bào
hình que, ngắn, điển hình của B.subtilis, bào tử thấy rõ phần trung tâm, còn các phần vỏ bị
biến đổi nhiều (các hình 3.8; 3.9).
Mẫu N18 Mẫu N441
Hình 3.7. Hình thái KL của hai Mẫu N18 và N441

Hình 3.8. Hình thái TB của hai Mẫu N18 và N441 chụp SEM
Hình 3.9. Bào tử của hai Mẫu N18 và N441 chụp SEM
67
3.2.2. Định danh đến chi theo hình thái
Các kết quả thu nhận được khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 mẫu N18 và
N441 được trình bày tóm tắt ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của mẫu N18 và mẫu N441
Đặc điểm sinh học Mẫu N18 Mẫu N441
Gram (+) + +
Hình thành nội bào tử + +
Nhu cầu về oxy + +
Catalase + +
Ghi chú: +: Kết quả dương tính

- : Kết quả âm tính
Theo khóa phân loại của Bergey (2004) và các kết quả khảo sát đặc tính sinh học của
2 mẫu khảo sát được trình bày ở bảng 3.3 và bảng 3.4, cho phép chúng tôi kết luận như sau:
Mẫu N18 và mẫu N441 đều thuộc chi Bacillus.
3.3. Định danh hai mẫu N18 và N441 đến loài bằng sinh học phân tử
Chúng tôi gửi hai mẫu N18 và N441 đến công ty xét nghiệm Nam Khoa (793/58
Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, Tp. HCM) để định danh bằng cách giải trình tự gen
16S-rARN và so sánh với ngân hàng gen. Kết quả trình tự gen 16S rRNA của hai chủng như
sau:
- Chủng N441
ATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG
GACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT
GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCG
GATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT
TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAG
GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC
ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA
AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGC
TCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTA
CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC
- Chủng N18
68
TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACA
GATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT
AACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG
GTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA
GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA
CGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG
CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT
CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGT
TGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTAC
CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTG
So sánh với trình tự 16S-rARN của loài VK đã được định danh trong ngân hàng gen
BLAST SEARCH. Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của hai mẫu N18 và N441 với loài
B. subtilis là 100%. Kết quả này cho phép kết luận mẫu N18 và N441 đã phân lập được là B.
subtilis và chúng tôi gọi hai chủng này là B.subtilis N18 và B. subtilis N441.
B. subtilis là một loài rất phổ biến trong tự nhiên như đất, rơm, cỏ, được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều nghành khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất enzyme do có
thể tạo ra được nhiều loại enyme như amylase, protease, lypase, cellulase, xylanase... Trong
đó protease kiềm giàu nattokinase là nguồn enzyme quan trọng, có thể sử dụng làm thực
phẩm chức năng chữa bệnh huyết khối cho con người.
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện MT nuôi cấy lên sự tổng hợp protease
của chủng B. subtilis N18
3.4.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành
Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp cho B.subtilis N18. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy
chủng B.subtilis N18 trên MT3 đồng thời thay đổi tỉ lệ cám mì và bột đậu nành. Kết quả
được trình bầy trong bảng 3.5 và hình 3.10
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng
tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18.
Cám mì Bột đậu nành Hoạt tính Protease
TN
(%) (%) (U/g)
1 0 100 33,54h ± 0,37
2 30 70 52,47e ± 0,43
3 40 60 62,69d ± 0,76
4 50 50 78,06c ± 0,99
69
5 60 40 94,61b ± 0,57
6 70 30 149,67a ± 0,75
7 100 0 46,01g ± 0,22
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác
nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
160,000
140,000
120,000
100,000
80,000
60,000
40,000
20,000
0
0/10 3/7 4/6 5/5 6/4 7/3 10/0
Tỷ lệ cám mì/ bột đậu nành
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng tổng hợp protease
của chủng B.subtilis N18
Nhận xét: Dựa vào kết quả TN bảng 3.5 và hình 3.10 cho thấy: Môi trường chỉ
mình bột đậu nành và các muối cho hoạt tính enzyme thấp nhất (33,54 U/g). Điều đó có thể
giải thích vì bột đậu nành mặc dù có nhiều chất dinh dưỡng như Protein (40%), lipid (12-
25%), glucid (10-15%), các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2,
D, E, F, cellulose và có đủ các acid amin cơ bản như isoleucin, leucin, lysin, methionin,
phenylalanin, tryptophan, valin. Các acid amin và các vitamin có tác dụng kích thích quá
trình sinh tổng hợp enzyme protease. Nhưng môi trường không đảm bảo độ xốp, thiếu oxy
để vi khuẩn phát triển. Tỷ lệ nồng độ cám mì/ bột đậu nành là 7/3 cho hoạt tính enzyme cao
nhất (149,67 U/g). Cám mì cũng chứa rất nhiều dinh dưỡng như chất xơ, khoáng chất và các
loại acid amin. Thành phần dinh dưỡng biến động xung quanh 87% vật chất khô, 16,5%
protein thô, 4% béo thô, 10% xơ thô, 42% NDF, 16% ADF, 0,6% lysin, 0,27% methionin,
5,3% tro, 0,15% canxi, 1,8% phosphor tổng số. Trong quá trình phát triển, B.subtilis sử
dụng các chất dinh dưỡng có trong cám mì và bột đậu nành, hơn nữa B.subtilis là loài hiếu
khí tùy ý, nhưng trong điều kiện thoáng khí hoạt động mạnh hơn. Vì vậy bột đậu nành
được xay nhỏ kết hợp với cám mì tạo độ thoáng khí vừa phải, giúp B.subtilis sinh trưởng
tốt, sử dụng chất dinh dưỡng được tối đa, kích thích sản sinh nhiều enzyme. Số lượng cám
70
mì/ bột đậu nành ở các tỉ lệ 5/5; 6/4 cũng cho hoạt tính enzyme cao tương ứng là 78,06 và
94,61 U/g, tuy nhiên theo phân tích thống kê cho thấy nó vẫn thấp hơn so với tỉ lệ cám mì/
bột đậu nành 7/3(149,67 U/g), nên chúng tôi chọn tỉ lệ cám mì/ bột đậu nành là 7/3 cho các
khảo sát nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả.
Chen Tiên Chang et al., (2000)[25], tác giả cũng đã sử dụng B.subtilis IMR-NK1 để
sản xuất enzyme thủy phân fibrin bằng phương pháp lên men bán rắn với cám lúa mì.
Dong Ming Jiang et al., (2001)[28] sử dụng bột đậu nành 2%, cám mì 0,5% làm cơ
chất sinh tổng hợp protease ở chủng B.subtilis NK5
Saurabh S. et al., (2007)[46] cho rằng nguồn carbon tốt nhất là cám mì và nguồn
nitrogen tốt nhất là bột đậu nành.
Nadeem et al.,(2008)[43] và Ting wei Ku et al., (2009)[55] sử dụng môi trường có
bột đậu nành để nghiên cứu sản xuất protease từ chủng Bacillus licheniformis và B.subtilis
natto.
Cong Wang et al., (2009)[26], nghiên cứu thấy rằng nguồn nitơ tốt nhất để nuôi cấy
chủng B.subtilis B12 là cám lúa mì, tiếp đến là bột đậu nành.
3.4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường
Khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường bán rắn, độ ẩm môi trường có vai trò hết
sức quan trọng, nếu độ ẩm thấp quá sẽ không đủ nước để vi sinh vật phát triển, còn khi độ
ẩm quá lớn sẽ giảm độ xốp, ảnh hưởng tới quá trình trao đổi vật chất giữa thể rắn và thể khí.
Trong môi trường nuôi B.subtilis trên hai cơ chất cám mì và bột đậu nành, kích thước các
hạt đều nhỏ, chủng B.subtilis lại sinh nhiều chất keo (γ- polyglutamic acid), làm môi trường
khó thoát nước làm khô, vì vậy không thể đưa độ ẩm lên 70% được, kết quả thí nghiệm của
chúng tôi cho thấy độ ẩm từ 50 đến 60% đều cho hoạt tính cao (hình 3.11 và bảng 3.6).
Bảng 3.6. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp
protease của chủng B.subtilis N18
Độ ẩm Hoạt tính Protease

TN
(%) (U/g)
1 40 149.24c ± 0,94
2 50 176.34b ± 1,55
3 60 178.06a ± 0,37
71
4 70 112.90d ± 0,00
5 80 56.56e ± 0,57
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
40 50 60 70 80
Độ ẩm môi trường (%)
Hình 3.11. Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp protease
3.4.3. Ảnh hưởng cuả nồng độ nấm men
Nấm men là nguồn cung cấp vitamin nhóm B cho vi sinh vật phát triển. Sử dụng nấm
men với một nồng độ thích hợp sẽ kích thích tăng trưởng cũng như khả năng tổng hợp
protease của VSV. Vì vậy chúng tôi nuôi B. subtilis N18 trên môi trường có tỷ lệ cám mì/
bột đậu nành là 7/3, độ ẩm 60%, đồng thời bổ sung nấm men với các nồng độ 0,1%; 0,2%
và 0,3%. Kết quả được trình bầy trong bảng 3.7 và hình 3.12.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến khả năng tổng hợp protease
Nồng độ nấm men Hoạt tính protease
STT
(%) (U/g)
1 Đối chứng 189,02b ± 0,37
72
2 0,1 194,18a ± 0,00
3 0,2 195,26a ± 0,57
4 0,3 122,36c ± 0,57
* Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau
không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
250
200
150
100
50
0
Đối chứng 0,1 0,2 0,3
Nồng độ nấm men trích ly (%)
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ nấm men trích ly đến khả năng tổng hợp protease
Nhận xét: Qua kết quả được trình bầy ở bảng 3.7 và hình 3.12 cho thấy khi bổ sung nấm
men vào MT nuôi cấy với nồng độ 0,2% cho hoạt tính protease cao nhất (195,26 U/g). Tuy
nhiên khi tăng lên nồng độ 0,3% thì hoạt tính protease giảm còn 122,36 U/g. Điều đó có thể
giải thích do chất dinh dưỡng được bổ sung quá nhiều làm thay đổi MT nuôi cấy dẫn đến ức
chế khả năng sinh tổng hợp enzyme protease.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ nấm men tối ưu là 0,2%. Hơn nữa theo phân tích thống
kê thì sự chênh lệch hoạt tính protease tại nồng độ 0,1% (194,18 U/g) và 0,2% (195,26 U/g )
không có ý nghĩa. Nên chúng tôi quyết định chọn nồng độ nấm men bổ sung vào MT nuôi
cấy là 0,1% cho các khảo sát tiếp theo.
3.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
pH môi trường tác động trực tiếp lên VSV, ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng
sinh tổng hợp enzyme của VSV. Do đó pH là một trong những yếu tố quan trọng cần được
nghiên cứu. TN nhằm xác định pH tối ưu giúp VSV tổng hợp enzyme protease có hoạt tính
73
cao nhất. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B.subtilis N18 trên MT tối ưu theo mục 3.3.3
với các pH khác nhau. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8 và hình 3.13.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18
STT pH Hoạt tính protease (U/g)
1 6 137,62d ± 0,22
2 7 190,31c ± 0,37
3 8 220,85b ± 0,94
4 9 230,31a ± 0,75
5 10 192,03c ± 0,86
6 11 72,68e ± 0,22
7 12 33,76g ± 0,22
250
200
Hoạt tính ptotease (U/g)
150
100
50
0
5 6 7 8 9 10 11 12
pH môi trường
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease
Nhận xét: Kết qủa trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.13 cho thấy trị số pH đầu tiên của
MT có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease của chủng B.subtilis N18. Với pH ban đầu là
74
6,0 thì hoạt tính protease thấp 137,62 U/g. Tại pH 11 và 12 thì hoạt tính protease cũng giảm
mạnh, tương ứng là 72,68 U/g và 33,76 U/g. Hoạt tính enzyme có sự thay đổi như vậy có
thể giải thích là khi pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ức chế quá trình trao đổi chất do ion
H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của VSV, chúng có khả năng làm
thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh
dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men, dẫn đến ảnh hưởng đến khả năng sinh
trưởng và hoạt hóa enzyme. pH ban đầu thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như tổng hợp
protease của chủng B.subtilis N18 từ 8,0 – 10,0 và tối ưu ở pH 9 (đạt 230,31 U/g). Kết quả
này cũng phù hợp với nghiên cứu của các tác giả khác. Saurabh S. et al., (2007)[50] đã
kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29. Hoạt
tính tối đa protease đạt được trên MT có pH tối ưu là 9,5. Chang Jin Liu et al., (2004) [24]
đã tối ưu hóa quá trình lên men sản xuất nattokinase ở chủng B.subtilis SBS (J). Điều kiện
lên men tối ưu ở pH ban đầu 8,3. Nadeem et al.,(2008)[43] đã nghiên cứu sản xuất protease
bằng chủng Bacillus licheniformis ưa kiềm trong môi trường tối ưu có pH 10. Nurullah et
al.,(2011) [44] đã nghiên cứu sản xuất protease kiềm từ chủng B.subtilis RSKK96 bằng
phương pháp lên men bán rắn. Hoạt tính enzyme đạt được cao nhất trên môi trường pH ban
đầu 9.
3.4.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống
Tỷ lệ giống cấy có ảnh hưởng quan trọng đển chất lượng và thời gian lên men. Trong thí
nghiệm này chúng tôi thực hiện trên môi trường có tỷ lệ cám mì/bột đậu nành theo tỷ lệ 7/3,
pH trước khi thanh trùng bằng 9, nhiệt độ nuôi 37oC, chủng VK B.subtilis N18. Kết quả
trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.14
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease
Nghiệm thức
107 108
ĐC 203,00 ± 0,22 206,44 ±0,75
NaC l0,5% 123,00 ± 0,22 194,18 ± 0,00
NaCl 0,5% +0,1% (YE) 239,77 ± 0,43 245,58 ± 1,14
75
1.00E+07 1.00E+08
Hoạt tính protease (U/g) 300
250
200
150
100
50
0
Đc NaCl, 0,5% NaCl, 0,5%+ YE
0,1%
Thành phần môi trường
Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease
Nhận xét: Qua kết quả bảng 3.9 và hình 3.14, chúng tôi nhận thấy trong MT có bổ sung
thêm 0,5% NaCl thì hoạt tính enzyme giảm ở cả hai trường hợp với lượng giống 107 cfu/g
cũng như lượng giống 108 cfu/g môi trường, Nhưng khi có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1%
nấm men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108 cfu/g thì hoạt tính enzyme tăng so với đối chứng
ở cả hai mật độ giống. Vì vậy chúng tôi chọn MT có bổ sung thêm NaCl 0,5% + 0,1% nấm
men trích ly và tỉ lệ cấy giống là 108 cfu/g cho các khảo sát tiếp theo.
3.4.6. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+
Ngoài các yếu tố như Magnesium, calcium, thì kẽm và kali cũng là những nguyên tố
cần thiết cho sư tổng hợp Nattokinase. Xue Jian et al., (2005)[59] đã chỉ ra rằng MgSO4
0,2%, CaCl2 0,2% cho hoạt tính protease cao nhất. Trên môi trường cơ sở có magnesium và
calcium chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của kẽm và kali. Kết quả được trình bầy ở bảng 3.10
và hình 3.15.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của Zn2+ và K+ đến khả năng tổng hợp protease
STT Nguyên tố khoáng Hoạt độ Protease ( U/g)
1 Đối chứng 227,30c ± 0,78
76
2 ZnCl2 250,20a ± 0,47
3 KCl 231,60b ± 0,75
*Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác
250.20
255.0
250.0
245.0
240.0 231.60
235.0 227.30
230.0
225.0
220.0
215.0
Đối chứng ZnCl2 KCl
Muối khoáng
Hình 3.15. Ảnh hưởng của Zn2+ và k+ đến khả năng tổng hợp protease
Nhận xét: Qua kết quả thể hiện ở bảng 3.10 và hình 3.15 cho thấy Zn2+ là nguồn khoáng cần
thiết cho B.subtilis tổng hợp protease. Điều này có thể giải thích là do ion Zn2+ đóng vai trò
quan trọng đối với hoạt tính của serine protease. Đối với nguyên tố K+ được bổ sung dưới
dạng KCl đã cho kết quả cao trong nghiên cứu này (231,60 U/g). Tuy nhiên hoạt tính
protease không cao bằng trường hợp bổ sung ion Zn2+ (250,20 U/g). Kết quả này cũng phù
hợp với nghiên cứu của Cong Wang et al.,(2009) [26] cho rằng hoạt tính enzyme được hoạt
hóa bởi Zn2+ .Từ kết quả này chúng tôi chọn ZnCl2 0,01% để tiến hành cho các khảo sát tiếp
theo.
3.4.7. Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính protease
Trên môi trường cơ sở gồm cám mì và bột đậu nành theo tỷ lệ 7/3 và các yếu tố khác
đã tối ưu, chúng tôi tiến hành lên men bán rắn, nhiệt độ 37oC, từng khoảng thời gian 24 giờ,
48 giờ và 72 giờ, lấy mẫu phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson cải tiến và
phương pháp đếm KL. Kết quả trình bày ở bảng 3.11
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến phát triển sinh khối và hoạt tính
77
Chỉ tiêu theo dõi Thời gian lên men
24 giờ 48 giờ 72 giờ

Hoat tính
U/g 220,23 258,34 257,56
protease
Số lượng tế bào 109 CFU/g 1,7 3,5 3,5
Nhận xét: Qua kết quả bảng 3.11 cho thấy hoạt tính enzyme và mật độ tế bào tăng dần từ
24 giờ lên 48 giờ, còn từ 48 giờ đến 72 giờ cả hoạt tính enzyme và mật độ tế bào hầu như
thay đổi không đáng kể, vì vậy để tiết kiệm năng lượng và thời gian, chúng tôi dừng thời
gian lên men ở 48 giờ.
3.4.8. Tối ưu hóa nồng độ tween 80 và glucose bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm trực giao, cấu trúc có tâm
Các chất hoạt động bề mặt (surfactant inclusions) có vai trò quan trọng trong môi
trường nuôi cấy vi sinh vật, glucose cung cấp nguyên liệu ban đầu để vi sinh vật phát triển
trước khi tổng hợp được các enzyme để phân giải glucose từ nguồn tinh bột có trong môi
trường. Egwin et al.,(2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt
như tween 80, acetonitrile cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis đến lượng protease sinh
ra. Kết quả thấy rằng cho tween 80 vào môi trường thì lượng protease tăng lên 5 lần và
enzyme có tính ổn định hơn ở nhiệt độ 50-60oC.
Sự phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố và chúng ta cần phải xem sự
tác động của những yếu tố đó như thế nào. Hoạt tính của enzyme thu được không chỉ bị ảnh
hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu tố với
nhau. Vì thế, nếu chỉ dựa trên những nghiên cứu rời rạc để đưa ra giá trị tối ưu thì kết quả sẽ
không đạt được độ chính xác cao.
Để quá trình nuôi cấy vi khuẩn B.subtilis N18 đạt hiệu quả và đánh giá chính xác,
toàn diện hơn về ảnh hưởng của từng yếu tố Tween 80 và Glucose cũng như ảnh hưởng
đồng thời của hai yếu tố này đến hoạt tính enzyme protease, chúng tôi nuôi chủng VK
B.subtilis N18 trên môi trường theo mục 3.4.7, đồng thời tiến hành thí nghiệm theo phương
pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là hoạt
tính enzyme protease [27][36][37].
78
Chúng tôi thay đổi đồng thời hai yếu tố khảo sát là nồng độ Tween 80 và Glucose, từ
đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu. Trên cơ sở đó chúng
tôi sẽ chọn ra các thông số tối ưu. Số thí nghiệm tối ưu là 11 thí nghiệm, trong đó 3 thí
nghiệm ở tâm phương án. Hàm mục tiêu là hoạt tính enzyme protease y .
Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:
- x1 là nồng độ Glucose với khoảng khảo sát là 1 – 4%, mức tâm là 2,5%, khoảng
biến thiên là 1,5%
- x2 là nồng độ Tween 80 với khoảng khảo sát là 0,02 – 0,04%, mức tâm là 0,03%,
khoảng biến thiên là 0,01%.
Kết quả của thí nghiệm tối ưu nồng độ Tween 80 và glucose với hàm mục tiêu là hoạt
tính enzyme protease được trình bầy trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao bậc hai, cấu
trúc có tâm và kết quả
TN X1 x2 x1 (%) x2 (%) y (U/g)
1 -1 -1 1 0,02 258,72
2 1 -1 4 0,02 222,87
3 -1 1 1 0,04 47,16
4 1 1 4 0,04 291,67
5 -1 0 1 0,03 195,42
6 1 0 4 0,03 300,71
7 0 -1 2,5 0,02 234,50
8 0 1 2,5 0,04 156,01
9 0 0 2,5 0,03 281,01
10 0 0 2,5 0,03 287,15
11 0 0 2,5 0,03 282,30
Sử dụng chương trình Modde 5.0 để giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và kiểm
định sự tương thích của các hệ số hồi quy và phương trình. Các kết quả được thể hiện ở
bảng 3.15.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ tween 80 và glucose đến hoạt tính
Y Coeff. SC Std. Err P
Constant 273,954 8,37476 5,01693e-007
x1 52,3257 6,66482 0,000538267
79
x2 -36,8755 6,66483 0,00264498
x1 x1 -11,5939 10,2569 0,309617
x2 x2 -64,4044 10,2569 0,00150484
x1 x2 70,0907 8,16271 0,000353221
N = 11 Q2 = 0,847 RSD = 16,3254

DF = 5 R2 = 0,977 Conf. lev. = 0,95
Hệ số in nghiêng là hệ số không có ý nghĩa

(Coefficients: Các giá trị của hệ số; Std.Err: Sai số chuẩn; P (P – value): Giá trị của
hệ số; R2: Độ biến thiên thực; Q2: Độ biến thiên ảo; Conf. lev.: Mức ý nghĩa; DF: Bậc tự do;
RSD: Độ lệch chuẩn). Mức độ phù hợp của mô hình được kiểm định thông qua các giá trị
Q2, R2. Độ biến thiên thực R2 và độ biến thiên ảo Q2 cho ta biết một cách tổng quát sự thích
hợp của mô hình thí nghiệm. R2 là tiêu chuẩn đánh giá cao nhất và Q2 là tiêu chuẩn đánh giá
thấp nhất. Cả hai giá trị này là các số dao động trong khoảng từ 0 đến 1 và Q2 đạt giá trị âm
nếu mô hình không phù hợp, kết quả không đáng tin cậy.
Q2 và R2 đạt giá trị 1 chỉ ra mô hình rất tốt. Eriksson et al.,(2000) cho biết R2 dao
động trong khoảng 0,8 – 0,9 và Q2 lớn hơn 0,5 là những giá trị chấp nhận được [39]. Điều
này cũng tương đồng với các nghiên cứu của nhiều tác giả khác [40][38][42][44]
Giá trị R2 và Q2 trong thí nghiệm này lần lượt là 0,977 và 0,847 đều thõa mãn với
điều kiện đã nêu trên. Kết quả này chứng tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm.
Sau khi loại trừ hệ số không có ý nghĩa, chúng tôi xác định được phương trình hồi
quy như sau:
Y = 273,954 + 52,3257 x1 - 36,8755 x2 - 64,4044 x22 + 70,0907 x1 x2 (1)
Ảnh hưởng của mỗi biến số trong hàm hồi quy được thể hiện trong bảng 3.13 ở mức
ý nghĩa 95%. Theo phương trình hồi quy (1) với hàm đáp ứng là hoạt tính protease thì nồng
độ tween 80 và glucose đều ảnh hưởng đến hoạt tính protease. Nồng độ glucose ảnh hưởng
đến hoạt tính protease theo hàm bậc một. Nồng độ tween 80 ảnh hưởng đến hoạt tính
protease theo hàm bậc hai.
Mặt khác sự hiện diện của hệ số tương hỗ x1 x2 trong phương trình chứng tỏ nồng độ
glucose và tween 80 không tác động độc lập mà tương tác giữa hai yếu tố này cũng ảnh
hưỡng rõ rệt đến hoạt tính protease. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác
giả trước đó. Theo Rowe (1987), Keshavarzi và cộng sự (2005), môi trường gồm nhiều
80
thành phần dinh dưỡng thường được sử dụng trong nuôi cấy Bacillus, các thành phần trong
môi trường tác động tương hỗ, ảnh hưởng đến hoạt tính protease [48][49].
Trong thí nghiệm này, phương trình hồi quy (1) tương thích với kết quả đó. Do vậy
nếu ta chỉ xét ảnh hưởng của nồng độ glucose và tween 80 một cách rời rạc rồi kết luận
nồng độ thích hợp nhất thì kết quả này sẽ không đáng tin cậy.
Phương trình hồi quy (1) được biểu diễn dưới dạng đồ thị đáp ứng bề mặt ở hình 3.16
trên ba trục tọa độ không gian và biểu diễn dưới dạng đồ thị các đường cong ở hình 3.17.
Hình 3.16. Đồ thị đường cong biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose),
x2 (nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease)
Hình 3.17. Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ của x1(nồng độ Glucose), x2
(nồng độ Tween 80) và y (hoạt tính protease)
Nhận xét: Đồ thị hình 3.16 và 3.17 cho thấy ảnh hưởng rõ của nồng độ glucose và
tween 80 đến hoạt tính protease. Chúng tôi nhận thấy không phải nồng độ glucose và tween
80 càng cao thì hoạt tính protease càng cao. Amin và Doelle (1990), Arcas et al.,(1987) cho
rằng nồng độ chất dinh dưỡng quá cao sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn [50][51].
81
Kết quả tối ưu đạt được theo phương trình hồi quy như sau:
- Nồng độ glucose: 3,9%
- Nồng độ tween 80: 0,03%
- Hoạt tính protease dự đoán theo phương trình hồi quy là 318.96 U/g
Tiến hành kiểm tra thực nghiệm hoạt tính protease với nồng độ glucose và tween 80
thu được từ phương trình hồi quy. Kết quả đạt được như sau: Hoạt tính protease thu được là
315,26 U/g ứng với nồng độ glucose là 3,9% và nồng độ tween 80 là 0,03%
Sự khác biệt về hoạt tính protease giữa giá trị dự đoán theo phương trình hồi quy và
giá trị thực nghiệm là 1,16%.
Như vậy giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình
hồi quy. Vậy mô hình dự đoán có tính chính xác cao
Kết quả thu được bằng thực nghiệm cho thấy sự thay đổi nồng độ glucose và tween
80 đã làm thay đổi có ý nghĩa hoạt tính protease. Nồng độ glucose 3,9% và tween 80 là
0,03% được xem là các thông số tối ưu để thu được giá trị hoạt tính protease cực đại.
Kết quả thí nghiệm cũng phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả.
Egwin et al., (2012)[31] đã nghiên cứu ảnh hưởng của Tween 80 (chất hoạt động bề
mặt) đến lượng protease sinh ra khi cho vào môi trường nuôi cấy B.subtilis. Kết quả thấy
rằng khi cho tween 80 đã tăng lượng protease lên 5 lần. Theo các tác giả thì việc lựa chọn
chất hoạt động bề mặt thích hợp trong nuôi cấy B.subtilis là yêu cầu cần thiết để sản xuất tối
ưu protease. Ting wei Ku et al., (2009) [55] và Cong Wang et al., (2009)[26] đã chỉ ra rằng
nguồn carbon tốt nhất trong nuôi cấy B.subtilis là glucose. Nadeem et al.,(2008)[43] nghiên
cứu sản xuất protease bằng chủng Bacillus licheniformis đã khẳng định nguồn carbon tốt
nhất là glucose. Saurabi S. et al., (2007)[50] đã kiểm tra sự phát triển và sinh tổng hợp
protease của chủng Bacillus subtilis SBP 29 cũng chỉ ra rằng glucose là nguồn carbon tốt
nhất.
3.5. Nghiên cứu tạo chế phẩm protease giàu nattokinase
3.5.1. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase theo phương pháp sản xuất natto của
Nhật Bản
Từ hai chủng B.subtilis N18 và B. subtilis N441 đã phân lập được, chúng tôi tiến
hành làm Natto theo phương pháp được trình bầy ở mục 2.3.17. Sáu nghiệm thức đã được
thực hiện gồm đậu nành hấp chín với chủng B.subtilis N18, đậu nành hấp chín và cơm gạo
lức với chủng B.subtilis N18, đậu nành hấp chín với chủng B.subtilis N441, đậu nành hấp
82
chín và cơm gạo lức với chủng B.subtilis N441, đậu nành hấp chín với hai chủng B.subtilis
N18 và B.subtilis N441, đậu nành hấp chín và cơm gạo lức với hai chủng B.subtilis N18 và
B.subtilis N441, tỷ lệ đậu nành/ cơm gạo lức là 5/4. Thí nghiệm thực hiện trong hộp
Polypropylen 20x10x5cm, lên men thực hiện ở 40oC. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.13 và
hình 3.14.
Bảng 3.14. Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto từ hai chủng
B.subtilis N18 và B.subtilis N441
Hoạt tính protease
Các nghiệm thức
(U/g tươi)
ĐN, B.subtilis N18 57,95 ± 0,01
ĐN + GL, B.subtilis N18 50,97 ± 0,04
ĐN, B.subtilis N441 49,53 ± 0,06
ĐN + GL, B.subtilis N441 42,56 ± 0,16
ĐN, B.subtilis N18+ B.subtilis N441 55,60 ± 0,06
ĐN + GL, B.subtilis N18+ B.subtilis N441 49,31 ± 0,00
Natto Nhật Bản 58,16 ± 0,16
Hình 3.18. Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto
83
từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441
84
Natto chủng B.subtilis N18 & B.subtilis N441 (đậu nành)
Natto chủng B.subtilis N18 & B.subtilis N441 (đậu nành & gạo lức)
Độ nhớt cuả Natto chủng B.subtilis N18
Độ nhớt cuả Natto chủng B.subtilis N441

Hình 3.19. Một số sản phẩm Natto từ hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441
Nhận xét: Kết quả thử nghiệm lên men đậu nành hạt hấp chín làm Natto cho thấy cả
hai chủng B.subtilis N18 và B. subtilis N441 đều có khả năng sử dụng làm Natto. Hoạt lực
protease trong các sản phẩm Natto làm ra đều tương đương với hoạt lực protease trong
Natto Nhật. Đánh giá cảm quan chấp nhận tốt. Do Natto sản xuất bằng chủng B.subtilis N18
85
có hoạt lực protease cao hơn, nhưng độ nhớt thấp so với Natto sản xuất với chủng B. subtilis
N441, vì vậy chủng B. subtilis N18 thích hợp để sản xuất protease (Nattokinase) còn chủng
B. subtilis N441 thích hợp để sản xuất Natto. Kết quả thí nghiệm cũng thấy rằng khi kết hợp
thêm gạo lức, hoạt tính enzyme giảm so với nghiệm thức chỉ một mình đậu nành hấp chín.
Ở nghiệm thức đậu nành hấp chín cùng với cơm gạo lức hoạt lực enzyme thấp hơn so với
nghiệm thức chỉ mình đậu nành hấp chín, nhưng khi ăn ở nghiệm thức có gạo lức dễ ăn hơn,
thích hợp cho một số đối tượng. Mùi vị của Natto không hấp dẫn nhiều người ( 20% người
Nhật không thích mùi natto), cũng như nước mắm, mắm tôm, chao đối với nhiều người
trong chúng ta, tất cả do thói quen, natto là một món ăn rất tốt cho sức khỏe do enzyme
Nattokinase trong Natto có hoạt tính mạnh gấp bốn lần plasmin nội sinh, có khả năng làm
tan huyết khối và giảm huyết áp. Natto sẽ là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và phòng
chống các bệnh tim mạch tốt đối với người Việt nam, nếu được sản xuất trong nước với giá
bán phải chăng, cũng như cung cấp giống và cách làm dễ dàng thì nhiều người Việt Nam
chúng ta cũng có thể tự làm ở nhà để vừa nâng cao chất lượng dinh dưỡng trong bữa ăn
hàng ngày vừa phòng ngừa được các bệnh tim mạch, nguy hiểm và rất tốn kém khi bị bệnh.
3.5.2. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase trên MT lên men bán rắn
3.5.2.1. Thu nhận chế phẩm enzyme protease sau lên men bằng ethanol
Nhiều tác giả đã nghiên cứu tinh sạch enzyme Nattokinase từ canh trường nuôi cấy
B.subtilis (Dubey R. et al., 2011)[30]. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng B. subtilis N18
trên môi trường bán rắn có bổ sung tỉ lệ cám mì / bột đậu nành là 7/3, nuôi ở 370C. Sau 48
giờ tiến hành tách chiết enzyme theo phương pháp trình bầy ở mục 2.3.19 và tủa enzyme
theo mục 2.3.20. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến mục 2.3.13.
Kết quả được trình bầy ở bảng 3.18
Bảng 3.15. Kết quả thu nhận chế phẩm enzyme protease bằng ethanol
Hoạt tính Tổng
Sản Hoạt Khối
Tổng hoạt protease hoạt tính Hiệu suất
phẩm tính lượng
tính sau lên trong protease thu hồi
sau lên protease CPE
men (U/g) CPE trong (%)
men (g) (U/g) (g)
(U/g) CPE (U/g)
100 300 30000 3,79 3399,34 12883,50 42,9
86
Hiệu suất thu nhận enzyme protease sau lên men bằng ethanol đạt 42,9%. Có thể giải
thích nguyên nhân làm cho hiệu suất thu hồi không cao là:
- Các enzyme sau khi tủa hoặc tinh sạch có xu hướng kết tụ lại. Điều này ảnh hưởng
rất nhiều đến hoạt tính của enzyme do các trung tâm phản ứng bị vùi lấp bên trong và không
phục hồi được sau khi hòa tan trở lại.
- Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện tủa enzyme bằng tác nhân tủa là
etanol với tỉ lệ 3 Etanol : 1ddE. Đây là tỉ lệ tham khảo từ các đề tài nghiên cứu thu nhận và
tinh sạch enzyme protease khác. Vì vậy kết quả này chưa phải là kết quả tối ưu để tủa
protase từ canh trường nuôi cấy chủng B. subtilis N18.
Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein và nhiều tạp chất khác nhau. Hoạt
tính riêng đặc trưng cho mức độ tinh sạch, vì vậy việc xác định hoạt tính riêng của các CPE
sau khi tủa là cần thiết. Chúng tôi tiến hành hòa CPE vào dung dịch đệm phosphate có pH 8
và xác định hoạt tính chung của CPE theo phương pháp Anson cải tiến trình bày ở mục
2.3.13, xác định hàm lượng protein có trong CPE theo phương pháp Lowry mục 2.3.14, qua
đó xác định được hoạt tính riêng của các CPE. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19
Bảng 3.16. Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme protease thu nhận
bằng kết tủa với Ethanol
Hoạt tính chung Hàm lượng protein Hoạt tính riêng
protease (U/g) (mg protein/g CPE) (U/mg protein)
3399,34 16187,33 0,21
Qua quá trình tham khảo từ các công trình nghiên cứu về thu nhận và tinh sạch
enzyme, chúng tôi nhận thấy khi dùng tác nhân tủa là Ethanol thì hiệu suất thu nhận và hoạt
tính chung, hoạt tính riêng của CPE cao hơn so với các tác nhân tủa khác như aceton,
sulphate amon v.v.. Do vậy, chúng tôi chọn Ethanol làm tác nhân tủa để thu CPE. Hoạt tính
này có thể cao hơn nếu CPE được tinh sạch bằng các phương pháp hiện đại như sắc ký, điện
di, lọc gel.
3.5.2.2. Khảo sát đặc tính của chế phẩm enzyme protease thu nhận bằng ethanol
Khảo sát pH tối ưu cho hoạt động của enzyme
pH là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme vì khi pH thay đổi mức
ion hóa cơ chất – enzyme sẽ ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng và độ bền của enzyme.
Enzyme có bản chất là protein nên mỗi enzyme có khả năng hoạt động tại một giá trị pH tối
87
ưu khác nhau. Vì vậy việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme là cần
thiết ( Hu Sheng et al.,(2003)[36].
Để khảo sát ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính của CPE, chúng tôi tiến hành trên cơ
chất casein 1,5%, ở nhiệt độ 370C, tỉ lệ enzyme ở các mẫu là như nhau, thay đổi pH các mẫu
ở các mức khác nhau: 6, 7, 8, 9, 10, 11. Xác định hoạt tính protease của CPE . Kết quả được
trình bầy trong bảng 3.17 và hình 3.20.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE
Hoạt tính protease Hoạt tính tương đối
STT pH
(U/g) so với cực đại (%)
1 6 1221,18f ± 3,61 29,99
2 7 2778,37d ± 3,61 68,23
3 8 4071,81a ± 3,63 100,00
4 9 3497,35b ± 7,22 85,89
5 10 3197,47c ± 6,25 78,53
6 11 1878,74e ± 3,61 46,14
*Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không
có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05)
Hoạt tính Hoạt tính tương đới (%)
4500 120
4000
100
3500
Hoạt tính tương đối (%)
3000 80
2500
60
2000
1500 40
1000
20
500
0 0
6 7 8 9 10 11
pH
Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của CPE
Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.17 và hình 3.20 cho thấy hoạt tính của CPE thay đổi
theo pH, pH tối ưu cho hoạt động của CPE protease là 8 (100%), ở pH 6 là 29,99% và tăng
88
68,23% ở pH 7,0. Tại các giá trị pH 9, 10, 11 hoạt tính CPE lần lượt là 85,89%, 78,53%,
46,14% so với hoạt tính cực đại. Như vậy ta có thể kết luận CPE có khoảng pH hoạt động
rộng từ 8,0 – 10,0. Trong khoảng này pH dao động từ 78,53% đến 100% so với hoạt tính tối
ưu tại pH 8,0.
Vậy có thể kết luận pH tối ưu cho hoạt động của CPE là 8
Khảo sát nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính xúc tác và vận tốc phản ứng của
enzyme. Về nguyên tắc, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc xúc tác sẽ tăng, khi nhiệt độ quá thấp,
vận tốc xúc tác của enzyme không đáng kể, nhưng nhiệt độ quá cao enzyme sẽ bị biến tính.
Để tìm ra giá trị thích hợp cho hoạt động của CPE, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính
protease của CPE trong môi trường đệm phosphat pH = 8, cơ chất là casein 1,5%, các mẫu
được bố trí thí nghiệm ở các mức nhiệt độ 350C, 400C, 450C, 500C, 550C, 600C. Sau thời
gian phản ứng, tiến hành xác định hoạt tính protease của CPE theo Anson cải tiến. Kết quả
được trình bày ở bảng 3.18 và hình 3.21
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của CPE
Nhiệt
Hoạt tính CPE Hoạt tính tương đối
STT độ
(U/g) so với cực đại ( %)
(0C)
1 25 3197,47g ± 6,25 78,39
2 30 3295,02e ± 6,25 80,78
3 35 3656,32d ± 3,61 89,64
4 40 4079,03a ± 7,22 100,00
5 45 3988,71b ± 10,83 97,79
6 50 3844,19c ± 7,22 94,24
7 55 3226,37f ± 9,56 79,09
8 60 2998,76h ± 3,61 73,51
89
Hoạt tính protease (U/g) Hoạt tính tương đối ( %)
4500 120
4000
100
3500
Hoạt tính tương đối (%)

Hoạt tính protease (U/g
3000 80
2500
60
2000
1500 40
1000
20
500
0 0
25 30 35 40 45 50 55 60
Nhiệ độ 0C
Hình 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của CPE
Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.18 và hình 3.21 cho thấy khi nhiệt độ phản ứng tăng
dần thì hoạt tính của CPE cũng tăng và đạt cực đại là 400C (4079,03 U/g). Nhiệt độ tiếp tục
tăng cao hơn thì hoạt tính CPE giảm dần. Đến 600C thì hoạt tính chỉ còn 2998,76 (đạt
73,51% so với hoạt tính cực đại). Như vậy CPE có thể chịu được nhiệt độ từ 400C đến 500C.
Do bản chất của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa học, vận tốc phản ứng do
enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định. Ở nhiệt độ cao,
enzme bị tê liệt và bị phá hủy do rối loạn về cấu trúc phân tử bậc 2,3 làm hỏng trung tâm
hoạt động được tạo nên từ các acid quan trọng và các nhóm ghép.
Vậy có thể kết luận nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của CPE là 400C.
Khảo sát nồng độ cơ chất tối ưu cho hoạt động của enzyme
Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của CPE. Tiến
hành phản ứng enzyme ở nhiệt độ 400C, pH 8, thay đổi nồng độ cơ chất casein ở các mức
khác nhau: 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3,0%. Xác định hoạt tính protease của CPE. Kết
quả được trình bầy trong bảng 3.19 và hình 3.22
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của CPE
Nồng độ cơ chất Hoạt tính tương đối so

STT Hoạt tính CPE (U/g)
(%) với cực đại
90
( %)
1 0,5 1434,34e ± 9,55 33,08

2 1,0 3482,90d ± 9,55 80,33
3 1,5 4335,56a ± 6,25 100,00
4 2,0 4248,84b ± 6,25 98,00
5 2,5 4212,71c ± 3,61 97,17
c
6 3,0 4205,49 ± 6,25 97,00
*Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Nồng độ cơ chất (%)
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của CPE
Nhận xét: Kết quả bảng 3.19 và hình 3.22 cho thấy hoạt tính của CPE tăng dần khi
nồng độ cơ chất tăng, nồng độ cơ chất tại 0,5% và 1,0% hoạt tính tương ứng là 1434,34 U/g
và 3482,90 U/g và đạt cực đại (4335,56 U/g) ở nồng độ 1,5%.
Tại các gía trị nồng độ 2,0%; 2,5%; 3,0% hoạt tính CPE lần lượt là 4248,84 U/g;
4212,71 U/g và 4205,49 U/g, đã giảm so với hoạt tính cực đại. Khi tăng nồng độ cơ chất thì
vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là hoạt tính của enyme tăng. Tuy nhiên vận tốc phản ứng
đạt cực đại ở một giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì
vận tốc phản ứng cũng không tăng nữa do các trung tâm hoạt động của enzyme bị bão hòa
bởi cơ chất.
3.5.3. Tạo chế phẩm protease giàu nattokinase và sinh khối Bacillus subtilis
91
Tế bào B. subtiliis đóng vai trò probiotic, gamma polyglutamic acid là chất làm ổn
định hoạt tính enzyme rất tốt nên sử dụng toàn thể môi trường sau lên men dưới dạng bột
khô hoặc dạng patte đều có thể sản xuất thành thực phẩm chức năng.
Sơ đồ quy trình:
Chuẩn bị giống → Chuẩn bị môi trường lên men → Thanh trùng, làm nguội → Cấy
giống → Lên men→ Thu sản phẩm → Sản phẩm sau lên men→Sấy khô dưới 45oC→
Nghiền mịn → Rây thu hạt mịn → Kiểm tra chất lượng → Đóng bao → sản phẩm (nguyên
liệu để làm thực phẩm chức năng)
Giải thích quy trình:
- Chủng VSV: Bacillus subtilis N18 → Chuẩn bị giống (từ ống đông khô→Thạch
nghiêng → Nhân giống)
- Chuẩn bị môi trường:
Cám mì 66,40%, bột đậu nành 28,46%, glucose 3,9%, Tween 80 0,03%, Zn 0,01%, dung
dịch A 5ml, dung dịch B 5ml, dung dịch C 5ml, NaCl 0,5%, nấm men trích ly 0,1%, pH MT
ban đầu 9, độ ẩm 60%.
- Thanh trùng môi trường 1 kg/cm2 trong 1 giờ
- Cấy giống: Giống đã được chuẩn bị trước đó 14h, lượng giống cấy 108 cfu/g môi
trường.
- Lên men: Nuôi trên khay, chiều cao môi trường 3-5cm, nhiệt độ nuôi 370 C, thời gian
nuôi 48 giờ.
- Tạo sản phẩm: Phơi khô, nghiền mịn, xác định chất lượng
- Sản phẩm: Nguyên liện cho sản xuất thực phẩm chức năng.
- Chất lượng sản phẩm : 252,48 U/g
Kết quả bảo quản sản phẩm
Thí nghiệm bảo quản ở 4oC sau 1 tháng hoạt tính còn 238,16 U/g (đạt 94,33%), còn
nếu bảo quản ở nhiệt độ phòng, sau một tháng hoạt tính còn 223,32 U/g (đạt 88,45%).
Mẫu sản phẩm gửi Viện Pasteur Tp. Hồ chí Minh kiểm tra độ an toàn vi sinh. Kết
quả kiểm nghiệm cho thấy sản phẩm không có E.coli, Salmonella.
92
Hình 3.23. Chế phẩm protease dạng bột khô giàu Nattokinase
Tỷ lệ Nattokinase trong chế phẩm enzyme protease
Từ chế phẩm enzyme thu được, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính Nattokinase
trên cơ chất fibrin theo phương pháp trình bầy ở mục 2.3.15. Kết quả thu được ở bảng 3.23.
Bảng 3.20. Tỷ lệ hoạt tính nattokinase trong chế phẩm enzyme protease
Hoạt tính Hoạt tính Nattokinase Tỷ lệ Nattokinase/

protease (U/g) (FU/g) Protease (%)
4334,38 2915,09 67,23
Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.23 cho thấy hoạt tính Nattokinase trong chế phẩm enzyme
protease là 2915,09 FU/g, chiếm 67,23% hoạt tính protease tổng số, qua đó chứng tỏ khi
CPE có protease tổng cao thì hoạt tính Nattokinase cũng cao.
93
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1) Chúng tôi đã phân lập, chọn lọc được một số chủng vi khuẩn Bacillus có khả
năng sinh protease cao từ bốn mẫu Natto của Nhật Bản, hai chủng tốt nhất là B.subtilis N18
và B.subtilis N441 đã được sử dụng để định danh và xác định các điều kiện lên men tối ưu
sản xuất chế phẩm enzyme protease.
2) Kết quả định danh bằng phương pháp cổ điển và phương pháp sinh học phân tử
cho thấy hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis N441 thuộc loài Bacillus subtilis (so sánh
với trình tự 16S-rARN của loài VK đã được định danh trong ngân hàng gen BLAST
SEARCH. Kết quả cho thấy mức độ giống nhau của hai chủng B.subtilis N18 và B.subtilis
N441 với loài B. subtilis là 100%.).
3) Đã xác định thành phần môi trường và điều kiện lên men tối ưu cho sản xuất
protease ở chủng B.subtilis N18 bằng phương pháp cổ điển và phương pháp quy hoạch thực
nghiệm với phần mềm Modde 5, như tỷ lệ cám mì/bột đậu nành, tỷ lệ cám mì, cám gạo, bột
đậu nành, nồng độ glucose, ZnCl2, KCl, Tween 80 và các điều kiện lên men như độ ẩm, pH
môi trường, tỷ lệ giống ban đầu và thời gian lên men.
5) Đã xây dựng ba phương pháp sản xuất chế phẩm enzyme protease giàu
Nattokinase.
- Phương pháp thứ nhất: Sản xuất theo phương pháp làm natto của Nhật Bản: Natto
được sản xuất bằng đậu nành và đậu nành kết hợp với cơm gạo lức bằng hai chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis N18 và Bacillus subtilis N441 cho thấy sản phẩm làm ra cho hoạt tính
protease tương đương với Natto Nhật Bản, hoạt tính đạt 57,95 U/g tươi, mùi vị màu sắc cảm
quan tốt, Bacillus subtilis N441 tạo sản phẩm có độ nhớt cao, thích hợp để sản xuất Natto
còn chủng Bacillus subtilis N18 hoạt tính protease cao, ít nhớt thích hợp để sản xuất chế
phẩm protease giàu Nattokinase.
- Phương pháp thứ hai: Trích ly enzyme từ sản phẩm sau khi lên men bằng nước
muối sinh lý, sau đó kết tủa bằng Ethanol, thu sản phẩm, sấy khô, nghiền mịn, sản phẩm.
Với phương pháp này hoạt tính đạt 3399,34 U/g, hiệu xuất thu hồi đạt 42,9%. Enzyme thu
nhận có pH tối ưu 8, nhiệt độ tối ưu 40oC. Tỷ lệ Nattokinase chiếm 67,23%.
- Phương pháp thứ ba: Sử dụng toàn bộ sản phẩm sau lên men bán rắn, sấy khô,
nghiền mịn, kiểm tra chất lượng, đóng bao, hiệu suất thu nhận 80%. chất lượng sản phẩm:
252,48 U/g, Sau 4 tuần bảo quản ở 40C, hoạt tính của chế phẩm còn 238,16 U/g (94,33%),
94
khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (khu vực Thành phố Hồ Chí Minh và Thủ Dầu Một, Bình
Dương), hoạt tính còn 223,32 U/g (88,45%).
Kiến nghị
- cách nâng cao năng suất lên men, tinh sạch và tạo chế phẩm phù hợp yêu cầu của sản
phẩm chức năng.
- Phân lập các chủng Bacillus từ các loại thực phẩm cổ truyền ở Việt nam nhằm tìm
được các chủng có hoạt tính cao...
95
TÀI LIỆU THAM KHẢO
 Tiếng Việt
1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2011), Công nghệ sinh học - tập 3, enzyme và
ứng dụng, Nxb Giáo Dục Việt Nam, Tr. 111 – 136
2. Dương Thị Thanh Diễm (2010). Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Bacillus và bước đầu
ứng dụng trong xử lí nước nuôi cá tra. Luận văn Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa
học Tự nhiên Tp. HCM, tr. 4 – 6.
3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật học, Nxb
Giáo dục, tr. 25 – 38.
4. Nguyễn Thùy Dương (2012). Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số
chủng Bacillus phân lập từ đất vườn, Luận văn Thạc sĩ sinh học. Trường Đại học Sư
phạm Tp. HCM, tr. 33 – 38.
5. Trần Thị Minh Định (2012). Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm
Aspergillus sp. Phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học,
Trường Đại Học Sư Phạm Tp. HCM, tr. 36 – 37
6. Trần Ngọc Hùng (2010), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử
dụng trong chế biến thức ăn gia cầm, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa
học Tự nhiên, tr. 36 – 42.
7. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme
protease từ ruột cá Ba Sa. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, tập 9, số 11,
2006, tr. 59 – 67.
8. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ Thuật Sinh Hóa, Nxb Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí
Minh, tr. 81 – 93.
9. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), (2003), Thí nghiệm Vi sinh vật học, Tập 2, Nxb ĐH
Quốc gia Tp.HCM, tr. 112 – 115.
10. Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng
Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Tp. HCM, tr. 30-36.
11. Đỗ Trần Ngoan (2007). Nghiên cứu tổng hợp protease kiềm tính bằng phương pháp lên
men bởi tế bào vi khuẩn Bac.subtilis cố định. Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học.
Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 4 – 16.
96
12. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị hạnh, Trần Thạnh phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng
Vân, Lê Thị Hương (2012). “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng
hợp nattokinase”. Tạp chí Sinh Học, 34, (3se). Tr 99 - 104
13. Trần Thị Bích Quyên (2012), Nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng Bacillus làm
probiotic trong chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm
Thành Phố Hồ Chí Minh, tr. 33 – 43.
14. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành sinh hóa vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr.
45 – 56, 97 – 102.
15. Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí
Minh, tr. 8 –13.
16. Đồng Thị Thanh Thu, Giáo trình sinh hóa cơ bản, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 45 – 70.
17. Hoàng Thị Kim Thoa (2013). Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong
kiểm nghiệm thực phẩm. Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học. Trường Đại học Bách
khoa Tp. Hồ Chí Minh, Tr. 3 – 15.
18. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007). Tương lai ứng dụng enzyme trong xử lý phế
thải. Tạp chí khoa học Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Khoa học tự nhiên và công nghệ
23 (2007), Tr. 75 – 85
19. Nguyễn Minh Tuyển (2005). Quy hoạch thực nghiệm. Nxb Khoa học và Kỹ thuật
20. Nam Việt – Khánh Linh, Bệnh tai biến mạch máu não, phương pháp chẩn đoán và điều
trị, Tr. 5 – 28.
21. Võ Thị Xuyến (2006), Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ một số chủng vi
sinh vật và khả năng thủy phân cellulose, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường
Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. HCM.
 Tiếng Anh
22. Chu Y. H., Han I . S. and Han C., (2002). “Improved Evolutionary Operation Based on
D – Design and Response Surface Method”. Korean Journal of Chemical
Engineering, vol 19(4), pp: 535 – 544
23. Chen et al. (2007), “Strategy To Approach Stable Production of Recombinant.
Nattokinase in Bacillus subtilis”, Biotechnol.Prog, 23, pp: 808 -813.
24. Chang Jin Liu, Yan Li Z, Wei Zhong Cao (2004). “Optimization of fermentation
process on a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis SBS(J)”. Biotechnology 6.
97
25. Chen Tiên Chang, Ming Hui Fan, Fei Chi Kun Hsien Yi Sung (2000). “Potent
fibrinolytic enzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1”. J. Agrc. Fodd.
Chem. 48, pp: 3210-3216
26. Cong Wang, Ming Du, Dongmei Zheng, Fandong Kong, Guoren Zu, Yibing Feng
(2009). “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto
B12”. J.Agric.Food Chem 57, pp: 9722-9729.
27. Deepak V. Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Venkatesh Babu S., Senthilkumar
S.R.,Sangiliyandi G., (2008). “Optimization of media composition for nattokinase
production by Bacillus subtilis using response surface methodology”. Bioresource
Terchnology 99, pp: 8170-8174
28. Dong Mingsheng Jiang, Xiao Liu Cheng, Jiang Hanhu (2001). “Screening of
extracellular fibrinolytic strain NK5 and its enzyme production condiction’. J. Food
Fermentation Industries 1.
29. Dong Mingsheng Jiang, Xiao Liu Chen, Jiang Hanhu (2001). “Study on the stability of
Nattokinase from Bacillus subtilis NK 5”. J. Food Fermentation Industries 1
30. Dubey R., Kumar J., Agrawala D., Char T., and Pusp P. (2011). “Isolation, production,
purification, assay and characterization of fibriolytic enzymes (nattokinase,
streptokinase, and Urokinase) from bacterial sources”. American journal of
Biotechnology 10(8), pp: 1408-1420
31. Egwin C. Evans and Abdullahi A. (2012). “Effect of surfactant inclusions on the yield
and characteristics of protease from Bacillus subtilis. Proc”.Rom.Acad. Scies B, pp:
108-112.
32. Essam F. Al-juamily and Bushara H. Al-Zaidy (2012). “Optimization condiction of
production fibrinolytic enzyme from Bacillus lichniformis B4 local isolate”. British
Journal of Pharmacology and Technology 3(6), pp: 289-295.
33. Fujita, M., Ito Y., Homh K., and Nishimura S. (1995). “Characterization of
Nattokinase –degraded products from humam fibrinogen or cross linked fi”.
Fibriolysis, pp: 157.
34. Han Xin-mian, GUO Run-fang, YU Hong -wei and JIA Ying-min (2009),
“Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2”,
Agricultural Sciences in China, 8(5), pp: 591-596.
98
35. Han Xin-mian, GUO Run-fang, YU Hong -wei and JIA Ying-min (2009),
“Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2”,
Agricultural Sciences in China, 8(5), pp: 591-596
36. Hu Sheng Mei Leha Yao Shajing (2003). “Optimization of submerged fermentation of
nattokinase production by Bacillus subtilis with Response Surface Methodology”. J.
Food and Fermentation Industries .1.
37. Jiunn –Min Wang, Hsuan Ying Chen, shiu- Min Cheng, Su Hua Chen, Lin-Lan Yang,
and Fu-Chou Cheng. (2012). “Nattokinase reduces brain infarction, fibrinogen and
activated partial thromboplastin time against cerebral ischemia-reperfusion injury”.
Journal of Food and Drug Analysis 30(3), pp: 686-691.
38. Junguo Liu, Jianmin Xing, Tianshi Chang, Zhiya Ma, Huizhou Liu. (2005),
“Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto
NLSSE using statistical experimental methods”, Process Biochemistry, 40, pp:
2757-2762.
39. Kim.JY, Gum SN, Lim HH, Kim KC, Ogasawara K, Inoue K, Park S, Jang Y, and Lee
JH (2008). “Effect of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial”.
Hypertens Resource (8), pp: 1583-1588
40. Kumar A.,KK Pulicherla, K. Seetha Ram, KRS Sambasiva Rao (2010).
“Evolutionarytrend Thrombolytic. International Journal of Bio-Science and Bio-
Technolohy”. vol. 2 No. 4. pp: 51- 67.
41. Liang X, Jia S, Sun Y, et al. (2007), “Secretory expression of nattokinase from Bacillus
subtilis YF38 in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, 37, pp: 187-194.
42. Mishra V., Nag V. L., Tandon R. and Awasthi S., (2009). “Response Surface
Methodology-Based Optimisetion of Agarose Gel Electrophoresis for Screening and
Electropherotyping of Rotavirus”. Appl Biochem Biotechnol, vol 160(8), pp: 2322 –
2331
43. Nadeem M, Qazi JI, Baig S, Syed QA (2008) “Effect of medium composition on
commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis N-2”.
Food Technol Biotechnol 46 (4), pp: 388–394
44. Nurullah Akcan and Fkeret Uyar (2011). “Production of extracellular alkaline
protease from Bacillis subtilis RSKK96 with solid state fermentation”. Euraria J.
BioSci 5, pp: 64-72
99
45. Okamoto Akiko, Hanagata Hiroshi, Matsumoto Eiko, Kawamura Yukio, Koizumi
Yokimichi (1995). “Angiotensin I converting enzyme inhihitory activities of various
fermented foods”. Bioesci Biotech Biochem 59(6), pp: 1147-1149
46. Prabhavathy G., rajasekara Pandian M., Senthilkumsr B. (2012). “Optimization and
production of extracellular alkaline protease by solid state fermentation using
Bacillus subtilis”. J. Acad. Indus Res 1(7), pp: 427- 430
47. Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV (1998) “Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases”. Microbiol Mol Biol Rev 62(3),
pp: 597-635
48. Ruei- Lin Hsu , Kung-Ta lee, jung –Hao Wang, Lily Y-.L. Lee, and Ria P.-y. Chen
(2009). “Amyloid degradating ability of nattokinase from Bacillus subtilis Natto”. J.
Agric Food Chem 57, pp: 503- 508
49. Sharma A. K., Sarkar B. C. and Sharma H. K., 2005. “Optimization of enzymeatic
process parameters for increased juice yield from carrot (Daucus carota L.) using
response surface methodology”. Eur Food Res Technol, vol 221, pp: 106 – 112.
50. Saurabh, S., Jasmine, I., Pritesh, G., G., and Rajendra Kumar, S., (2007). “Enhanced
productivity of serine alkaline protease by Bacillus sp. using soybean as substrate”.
Malaysian journal of microbiology. (1), pp: 1-6.
51. Singhal P., V.K.Nigam, A.S.Vidyarthi (2012). “Studies on production, characterization
and applications of microbial alkaline proteases”. International . Journal of advanced
and research ISSN 0976-2612 Vol.3, issue 3, pp: 653-669.
52. Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., & Muriki H. (1987). “A novel
fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto: a typical and
popular soybean food in the Japanese diet”. Expientia 43 (10), pp: 1110-1111.
53. Sumi H., Hamada H., Nakanishi K.,& Hiratani H. (1990). “Enhancement of the
fibrinolytic activity in plasma by oral administration of Nattokinase”. Acta
Haematologia. 84 (3), pp: 139-143.
54. Sumi H.,Nakajima N.,yatagai C. (1995). “ unique strong fibrinolytic enzyme
(katsuwokinase) in skipjack”. Competitive biochemistry and physiology part B:
Biochemistry and Molecular Biology 112(3), pp: 543-547.
100
55. Ting wei Ku, Ruei –Lan Tsai and Tzu-Ming Pan (2009). “A simple and Cost – Saving
Approach ro optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of
Bacillus subtilis Natto”. J. Agric Food Chem. 57, pp: 292-296.
56. Xiaoyan zu, Zhenya Zhang, et al. (2010), “Thrombolytic Activities of Nattokinase
Extracted from Bacillus subtilis Fermented Soybean Curd Residues”,
International Journal of Biology, 2(2), pp: 120-125.
57. Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, Yingnan Yang, Haittao Che, Guihua zhang Ji Li (2010).
“Thrombolytic activities of nattokinase extracyed from Bacillus subtilis fermented
soybean curd residues”. International Journal of Biology 2(2), pp: 120-125.
58. Xie Quiling Gao Yong (1999). “The optimization of fermentation condiction of
nattokinase”. Journal of south China University of Technology (National Science).5.
59. Xue Jian, Xue- Li Z, Quuang C. Guang W. Jun Peng Gao (2005). “Optimization of
liquid fermentation condiction of nattokinase” . Journal of Jilin Agricultural
University 5.
60. Xu X., Skands A.R.H., Hoy C.-E., Mub H., Balchena S. and Adler- Nissenna J., 1998.
“Prodution of Specific – structured Lipids by Enymatic Interesterification:
Elucidation of Acyl Migration by Response Surface Design”. Journal of the
American Oil Chemists’ Society, vol 75 (9), pp: 1179 – 1186
61. Yeon Kyoung Kim, Sang Mi Kim, Ji Yeon Kim, and Oran Kwon (2011). “The culture
filtrates from Bacillus subtilis natto lowers blood pressure via rennin –angiotensin
system in spontaneously hypertensive rats fed with a high cholesterol diet”. J.Korean
Soc appl Biol. Chem 54(6), pp: 959-965.
 Internet
62. http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaser.gif
63. http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecacys.gif
64. http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecaasp.gif
65. http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/mecamet.gif
101
102
103
104
105
106
107
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Đường chuẩn Tyrosin
Tyrosine
0 10 20 30 40 50 60 70 80
(µg)
∆OD
0,000 0,086 0,181 0,281 0,371 0,465 0,560 0,645 0,780
(660nm)
0.90
y = 0.0094x
0.80
R² = 0.9980
0.70
0.60
0.50
∆OD
Tyrosine
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
0 20 40 60 80 100
Đường chuẩn Tyrosine (µg)
Đồ thị đường chuẩn Tyrosin
108
Phụ lục 2: Đường chuẩn Albumin
Albumin
0 50 100 150 200 250
(µg/ml)
∆OD
0,000 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15
(750nm)
0.18
y = 0.0006x
0.16
R² = 0.999
0.14
0.12
0.10
ΔOD
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0 50 100 150 200 250 300
Nồng độ Albumin (μg/ml)
Đồ thị đường chuẩn Albumin
109
Phụ lục 3: Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn
Thời Kí
ΔOD Hoạt độ protease (U/g)
gian hiệu
chủn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 T,B Sai số
g
N 24 0,04 0,04 0,04 27,10 25,81 27,10 26,67 0,43
N 17 0,07 0,07 0,06 41,93 42,58 41,29 41,93 0,37
BC 0,11 0,11 0,11 70,96 71,61 72,26 71,61 0,37
24 N 21 0,03 0,02 0,03 17,42 14,19 18,71 16,77 1,34
N 32 0,03 0,03 0,03 18,06 16,13 19,35 17,85 0,94
8.1 0,10 0,10 0,11 67,09 67,09 67,74 67,31 0,22
N 23 0,03 0,03 0,03 18,71 20,64 17,42 18,92 0,94
N 18 0,08 0,09 0,09 52,90 55,48 55,48 54,62 0,86
N441 0,08 0,07 0,08 50,97 47,74 52,26 50,32 1,34
N36 0,04 0,04 0,04 27,10 27,10 27,10 27,10 0,00
N 24 0,07 0,07 0,07 42,58 41,93 43,22 42,58 0,37
N 17 0,07 0,07 0,07 45,16 43,87 45,80 44,94 0,57
BC 0,12 0,13 0,12 78,71 80,64 78,71 79,35 0,65
N 21 0,03 0,03 0,03 18,71 19,35 18,06 18,71 0,37
N 32 0,03 0,03 0,03 21,93 20,00 21,93 21,29 0,65
40
8.1 0,12 0,12 0,12 76,13 76,13 75,48 75,91 0,22
N 23 0,05 0,05 0,05 32,90 34,19 32,26 33,12 0,57
N 18 0,15 0,15 0,15 94,83 93,54 95,48 94,62 0,57
N441 0,08 0,08 0,08 50,97 50,32 51,61 50,97 0,37
N36 0,06 0,06 0,06 37,42 38,06 35,48 36,99 0,78
N 24 0,07 0,07 0,07 44,51 44,51 45,16 44,73 0,22
N 17 0,10 0,10 0,10 63,87 63,87 63,87 63,87 0,00
BC 0,15 0,15 0,15 97,42 98,06 96,77 97,42 0,37
N 21 0,06 0,06 0,06 39,35 38,71 40,00 39,35 0,37
N 32 0,06 0,06 0,05 35,48 37,42 34,19 35,70 0,94
48
8.1 0,15 0,15 0,15 98,06 98,71 96,77 97,85 0,57
N 23 0,07 0,06 0,07 42,58 41,29 43,22 42,36 0,57
N 18 0,17 0,17 0,18 109,67 109,03 112,90 110,53 1,20
N441 0,09 0,09 0,09 59,35 60,00 58,06 59,14 0,57
N36 0,08 0,08 0,07 49,03 50,32 47,10 48,82 0,94
N 24 0,06 0,07 0,06 41,29 41,93 39,35 40,86 0,78
N 17 0,07 0,07 0,07 42,58 43,87 41,93 42,79 0,57
BC 0,12 0,11 0,12 74,19 71,61 74,84 73,55 0,99
N 21 0,04 0,04 0,04 23,23 23,23 23,23 23,23 0,00
N 32 0,04 0,04 0,04 24,52 23,87 23,23 23,87 0,37
72
8,1 0,08 0,08 0,09 54,19 51,61 55,48 53,76 1,14
N 23 0,03 0,03 0,03 17,42 16,77 18,71 17,63 0,57
N 18 0,09 0,09 0,09 58,71 58,71 59,35 58,92 0,22
N441 0,08 0,08 0,08 53,55 51,61 54,19 53,12 0,78
N36 0,04 0,04 0,05 28,39 28,39 29,03 28,60 0,22
Phụ lục 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ cám mì và bột đậu nành đến khả năng tổng hợp protease của
chủng B.subtilis N18
110
Tỉ lệ Δ OD Hoạt độ protease (U/g)
cám
mì/đậu Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số
nành 1 2 3 1 2 3
0/10 0,05 0,05 0,05 33,55 32,90 34,19 33,55 0,37

3/7 0,08 0,08 0,08 52,90 52,90 51,61 52,47 0,43
4/6 0,10 0,01 0,10 63,87 63,45 61,93 62,69 0,76
5/5 0,12 0,12 0,12 77,42 76,77 80,00 78,06 0,99
6/4 0,15 0,15 0,15 94,83 95,48 93,54 94,62 0,57
7/3 0,23 0,23 0,23 149,67 148,38 150,96 149,67 0,75
10/0 0,07 0,07 0,07 46,45 45,80 45,80 46,02 0,22
Phụ lục 5: Ảnh hưởng tỷ lệ độ ẩm môi trường đến khả năng tổng hợp protease của chủng
B.subtilis N18
Δ OD Hoạt độ protease (U/g)

Độ
ẩm
Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số
(%)
1 2 3 1 2 3
40 0,23 0,23 0,23 149,03 150,96 147,74 149,24 0,94
50 0,27 0,28 0,27 175,48 179,35 174,19 176,34 1,55

60 0,28 0,28 0,28 178,06 177,41 178,70 178,06 0,37
70 0,18 0,18 0,18 112,90 112,90 112,90 112,90 0,00
80 0,09 0,09 0,09 56,77 55,48 57,42 56,56 0,57
Phụ lục 6: Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.
subtilis N18
Nồng Δ OD Hoạt độ protease (U/g)

độ
111
Nấm Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số
Men 1 2 3 1 2 3
Đối
0,29 0,29 0,29 189,67 189,02 188,38 189,02 0,37
chứng
0,1 0,30 0,30 0,30 194,19 194,19 194,19 194,19 0,00
0,2 0,30 0,30 0,30 195,48 194,19 196,12 195,26 0,57
0,3 0,19 0,19 0,19 122,58 123,22 121,29 122,36 0,57
Phụ lục 7: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp protease

pH
Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số
1 2 3 1 2 3
6 0,21 0,21 0,21 137,41 138,06 137,41 137,63 0,22
7 0,30 0,29 0,30 190,31 189,67 190,96 190,31 0,37
8 0,34 0,35 0,34 220,64 222,57 219,35 220,85 0,94
9 0,36 0,36 0,36 230,31 229,02 231,60 230,31 0,75
10 0,30 0,30 0,30 190,31 192,89 192,89 192,03 0,86
11 0,11 0,11 0,11 72,90 72,26 72,90 72,69 0,22
12 0,05 0,05 0,05 33,55 33,55 34,19 33,76 0,22
Phụ lục 8: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis
N18
Tỉ lệ Δ OD Hoạt độ protease (U/g)

cấy
MT
giống Lần Lần Lần Lần Lần Lần Sai
TB
(ml) 1 2 3 1 2 3 số
112
Đối 107 0,32 0,31 0,32 203,22 202,57 203,22 203,00 0,22
chứng
108 0,32 0,32 0,32 206,44 207,73 205,15 206,44 0,75
NaCl, 107 0,19 0,19 0,19 122,58 123,22 123,22 123,01 0,22
0,5% 108 0,30 0,30 0,30 194,19 194,19 194,19 194,19 0,00
NaCl 107 0,37 0,37 0,37 239,34 239,34 240,63 239,77 0,43
0,5%,
0,2% 108 0,38 0,38 0,38 245,15 247,73 243,86 245,58 1,14
(YE)
Phụ lục 9: Ảnh hưởng của Zn2+ và k+ đến khả năng tổng hợp protease của chủng B.subtilis
N18

Vi
khoáng
Lần Lần Lần Lần Lần Lần
TB Sai số
1 2 3 1 2 3
Đối
0,35 0,35 0,35 227,73 225,80 228,38 227,30 0,78
chứng
ZnCl2 0,39 0,34 0,39 250,96 249,35 250,31 250,20 0,47
KCl 0,36 0,36 0,36 231,60 232,89 230,31 231,60 0,75
Phụ lục 10 : Hoạt tính protease trong các sản phẩm natto từ hai chủng B.subtilis N18 và
B.subtilis N441
Natto
TB Sai số
1 2 3 1 2 3
N18 ĐN 0,54 0,53 0,54 57,99 57,77 58,10 57,95 0,10
N18 ĐN - GL 0,47 0,47 0,47 50,94 51,05 50,94 50,98 0,04
N441 ĐN 0,46 0,46 0,46 49,53 49,64 49,43 49,53 0,06
N441 ĐN - 0,39 0,39 0,40 42,60 42,27 42,81 42,56 0,16
113
GL
N18 & N441
0,51 0,51 0,51 55,60 55,50 55,71 55,60 0,06
ĐN
N18 & N441
0,46 0,46 0,46 49,32 49,32 49,32 49,32 0,00
ĐN -GL
Natto Nhật
0,54 0,54 0,53 58,21 58,42 57,88 58,17 0,16
Bản
Phụ lục 11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease của CPE
Δ OD Hoạt độ CPE (U/g)

pH
Lần Lần Lần Lần Lần Lần Sai
TB
1 2 3 1 2 3 số
6 0,11 0,11 0,11 1224,80 1224,80 1213,96 1221,18 3,61
7 0,26 0,26 0,26 2774,76 2785,60 2774,76 2778,37 3,61
8 0,38 0,38 0,38 4064,59 4075,43 4075,43 4071,81 3,61
9 0,32 0,32 0,32 3511,80 3490,13 3490,13 3497,35 7,23
10 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 3186,64 3197,48 6,26
11 0,18 0,17 0,18 1875,13 1885,97 1875,13 1878,74 3,61
Phụ lục 12, Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease của CPE
Nhiệt
độ
(0C) TB Sai số
1 2 3 1 2 3
25 0,30 0,30 0,29 3208,31 3197,48 3186,64 3197,48 6,26
30 0,30 0,30 0,31 3284,19 3295,03 3305,87 3295,03 6,26
35 0,34 0,34 0,34 3652,71 3652,71 3663,55 3656,32 3,61
40 0,38 0,38 0,38 4064,59 4086,27 4086,27 4079,04 7,23
45 0,37 0,37 0,37 3999,55 3999,55 3967,04 3988,72 10,84
50 0,35 0,35 0,36 3836,97 3836,97 3858,65 3844,20 7,23
55 0,30 0,30 0,30 3208,31 3229,99 3240,83 3226,38 9,56
60 0,28 0,28 0,28 2991,54 3002,38 3002,38 2998,76 3,61
114
Phụ lục 13: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính protease của CPE
Nồng Δ OD Hoạt độ protease (U/g)

độ cơ
chất Lần Lần Lần Lần Lần Lần Sai
TB
(%) 1 2 3 1 2 3 số
0,5 0,13 0,13 0,13 1430,74 1419,90 1452,41 1434,35 9,56
1,0 0,32 0,32 0,32 3468,45 3479,29 3500,97 3482,90 9,56
1,5 0,40 0,40 0,40 4346,40 4335,56 4324,72 4335,56 6,26
2,0 0,39 0,39 0,39 4238,01 4248,85 4259,69 4248,85 6,26
2,5 0,39 0,39 0,39 4205,49 4216,33 4216,33 4212,72 3,61
3,0 0,39 0,39 0,39 4194,65 4205,49 4216,33 4205,49 6,26
115

chế phẩm protease từ natto

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

chế phẩm protease từ natto

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

Bùi Thị Nhung

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Thành Phố Hồ Chí Minh – 2013

Tác giả luận văn

Bùi Thị Nhung

Bùi Thị Nhung

Với những lý do như trên chúng tôi thực hiện đề tài :

1.1. Khái quát chung về protease

1.1.1.2. Phân loại protease

* Cơ chế phản ứng của nhóm serine protease

* Trong công nghiệp thuộc da

Amylase, 18% Các protease

Vi sinh vật Ứng dụng Tài liệu

1.1.3.3. Sản xuất protease kiềm

Thành phần môi

1.1.4. Enzyme Nattokinase

Hình 1.8. Hiệu ứng của Nattokinase lên fibrin

1.3.2. Vị trí phân loại

1.4. Giới thiệu bệnh huyết khối

Hình 1.10. Biến chứng của bệnh huyết khối

2.1. Vật liệu

MT3: Môi trường bán rắn sản xuất enzyme protease

Thành phần Nồng độ

Chế phẩm natto của Nhật Bản

Định danh bằng sinh học phân tử

Thành phần MT( bột đậu nành,

Lên men Thanh trùng

Hoạt tính enzyme

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.3.1. Phương pháp phân lập VK Bacillus trong Natto

Công thức xác định hoạt tính:

Trong đó A1: Chỉ số OD275 của mẫu thật

Các mức Các yếu tố

Tiến hành các TN theo bảng 2.4

(m1 – m2) . 100

Anion protein Protein ở pI với vỏ hydrate Cation protein

Thêm kiềm Thêm axit

Thêm cation Thêm ation

Protein kết tủa

Hình 2.2. Sự kết tủa protein

Hình 3.3. Hình thái KL của VK trong Natto Nhật Bản

N21 N17 N32

N24 N23 N441

Hoạt tính protease

3 N18 2,6 ± 0,04

4 N17 2,4 ± 0,15

5 N441 2,4 ± 0,06

6 N36 2,1 ± 0,02

7 N21 2,1 ± 0,15

8 N23 2,3 ± 0,09

9 N24 2,2 ± 0,11

10 N32 2,1 ± 0,04

Hoạt tính protease (U/g)

24 giờ 40 giờ 48 giờ 72 giờ

Hình 3.6. Hoạt tính protease của 10 mẫu VK đã tuyển chọn