Nghiên Cứu Ứng Dụng Enzyme Vào Sản Xuất Rượu Vang Nếp Trắng: Huỳnh Phước Nghĩa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
HUỲNH PHƯỚC NGHĨA
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME VÀO SẢN

XUẤT RƯỢU VANG NẾP TRẮNG
Luận văn tốt nghiệp

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME VÀO SẢN

XUẤT RƯỢU VANG NẾP TRẮNG
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Ts. LÝ NGUYỄN BÌNH HUỲNH PHƯỚC NGHĨA
MSSV: 2051654
Lớp: CNTP K31
Cần Thơ, 2009

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 31 - 2009 Trường Đại học Cần Thơ
Luận văn kèm theo đây, với đề tài "Nghiên cứu ứng dụng enzyme vào sản xuất rượu
vang nếp than", do sinh viên Huỳnh Phước Nghĩa thực hiện và báo cáo đã được hội
đồng luận văn thông qua
Cán bộ hướng dẫn
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009

Chủ tịch hội đồng
Ngành Công nghệ thực phẩm i

LỜI CẢM ƠN
…  …
Xin gửi lời cám ơn chân thành nhất đến quý thầy cô Trường Đại học Cần thơ, đặc
biệt là quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giảng dạy và
truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tại trường.
Xin chân thành cám ơn thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian làm luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực
phẩm đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận văn.
Cám ơn tập thể lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 31 đã gắn bó với tôi trong suốt
khoảng thời gian học tập tại trường.
Xin chân thành cám ơn!
Cần thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2009
Sinh viên thực hiện
Ngành Công nghệ thực phẩm ii

TÓM TẮT
…  …
Đề tài nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme protease và glucoamylase vào quá
trình sản xuất rượu vang nếp trắng. Nội dung nghiên cứu bao gồm khảo sát ảnh
hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ và thời gian thủy phân đến hoạt tính enzyme protease;
ảnh hưởng nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến hoạt tính enzyme
glucoamylase; tỷ lệ bổ sung nguyên liệu bột mì.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở mức nhiệt độ 500C, pH 6,5, nồng độ enzyme 0,08%
và thời gian thủy phân 40 phút hoạt tính của chế phẩm enzyme protease cao nhất.
Nồng độ enzyme 0,4% và thời gian thủy phân 30 phút hoạt tính của chế phẩm
enzyme glucoamylase là cao nhất. Tỷ lệ bổ sung bột mì ở mức 0%, 5%, 10%, 15%,
20%, 25% có màu đậm dần, tỉ lệ bổ sung bột mì ở mức 25 và 30% có màu gần
giống nhau.
Ngành Công nghệ thực phẩm iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... ii
TÓM TẮT ................................................................................................................ iii
MỤC LỤC.................................................................................................................iv
DANH SÁCH BẢNG ...............................................................................................vi
DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. vii
Chương 1 GIỚI THIỆU ...........................................................................................1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................................1
Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................................2
2.1 NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................2
2.1.1 Nếp trắng.........................................................................................................2
2.1.2 Bột mì .............................................................................................................2
2.1.3 Nấm men.........................................................................................................3
2.1.4 Enzyme ...........................................................................................................5
2.1.5 Các chế phẩm enzyme sử dụng.....................................................................10
2.1.6 Nước .............................................................................................................12
2.2 CƠ CHẤT CỦA ENZYME...............................................................................13
2.2.1 Tinh bột.........................................................................................................13
2.2.2 Glycogen .......................................................................................................15
2.2.3 Protein...........................................................................................................15
2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME 16
2.4 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN .....................................20
2.4.1 Khái quát về quá trình lên men rượu ............................................................20
2.4.2 Cơ chế của quá trình lên men .......................................................................21
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...............................................21
2.4.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men ...............23
2.5 PHẢN ỨNG MAILLARD.................................................................................25
2.5.1 Các điều kiện phản ứng.................................................................................26
2.5.2 Cơ chế phản ứng ...........................................................................................27
Ngành Công nghệ thực phẩm iv

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................29

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM........................................................................29
3.1.1 Địa điểm, thời gian .......................................................................................29
3.1.2 Nguyên liệu...................................................................................................29
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị............................................................................................29
3.1.4 Hóa chất ........................................................................................................29
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.......................................................................29
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ...................................................................................29
3.2.2 Phương pháp thực hiện .................................................................................29
3.2.3 Quy trình sản xuất thử nghiệm rượu vang nếp trắng ....................................30
3.2.4 Thuyết minh một số công đoạn trong quy trình............................................31
3.2.5 Bố trí thí nghiệm ...........................................................................................31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................39
4.1 THÍ NGHIẸM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH
PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN..........................................39
4.2 THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME PROTEASE VÀ
THỜI GIAN LÊN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN ..............................41
4.3 THÍ NGHIỆM 3: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME
GLUCOAMYLASE VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN HIỆU SUẤT
ĐƯỜNG HÓA ...................................................................................................43
4.4 THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ GẠO NẾP VÀ BỘT MÌ ĐẾN
MÀU SẮC SẢN PHẨM....................................................................................45
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................47
5.1 KẾT LUẬN........................................................................................................47
5.2 ĐỀ NGHỊ ...........................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................48
PHỤ LỤC............................................................................................................... xiii
Ngành Công nghệ thực phẩm v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hoá học của nếp ----------------------------------------------------- 2
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của bột mì tính bằng % chất khô------------------------ 3
Bảng 2.3 Thành phần hóa học của nấm men----------------------------------------------- 4
Bảng 2.4 Độ bền với nhiệt độ của α-amylase từ các nguồn khác nhau----------------- 7
Bảng 2.5 Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia----------------12
Bảng 4.1 Hàm lượng nitơ amin thu được sau quá trình thủy phân tinh bột bằng
enzyme protease ở mức nhiệt độ và pH khác nhau ----------------------------36
Bảng 4.2 Hàm lượng nitơ amin thu được sau quá trình thủy phân tinh bột bằng
enzyme protease ở các nồng độ và thời gian khác nhau ----------------------38
Bảng 4.3 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân tinh bột bằng
enzyme glucoamylase ở các nồng độ và thời gian khác nhau----------------40
Ngành Công nghệ thực phẩm vi

DANH SÁCH HÌNH

------------
Hình 2.1 Nếp trắng ------------------------------------------------------------------------------------- 2
Hình 2.2 Bột mì----------------------------------------------------------------------------------------- 2
Hình 2.3 Saccharomyces cerevisiae ----------------------------------------------------------------- 3
Hình 2.4 Cơ chế tác động của amylase lên tinh bột ----------------------------------------------- 6
Hình 2.5 Cấu trúc enzyme α-amylase --------------------------------------------------------------- 6
Hình 2.6 Cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột--------------------------------------------- 7
Hình 2.7 Cấu trúc enzyme β-amylase --------------------------------------------------------------- 7
Hình 2.8 Cấu trúc enzyme γ-amylase---------------------------------------------------------------- 8
Hình 2.9 Cấu trúc của enzyme protease------------------------------------------------------------- 8
Hình 2.10 Cấu trúc Amylose------------------------------------------------------------------------- 14
Hình 2.11 Cấu trúc của amylopectin---------------------------------------------------------------- 14
Hình 2.12 Cấu trúc bậc 1 của protein--------------------------------------------------------------- 15
Hình 2.13 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng------------------------------ 16
Hình 2.14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính --------------------------------------- 17
Hình 2.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme-------------------- 17
Hình 2.16 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme -------------------------------------- 18
Hình 2.17 Ảnh hưởng của môi trường lên phản ứng Maillard của D-glucose và các acid
amin ở 1210C trong 10 phút ------------------------------------------------------------ 26
Hình 2.18 Ảnh hưởng của hoạt độ nước lên phản ứng hóa nâu không do enzyme ---------- 27
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của
protease trong quá trình thủy phân protein --------------------------------------------- 33
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian
thủy phân protein--------------------------------------------------------------------------- 35
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian
thủy phân đến hiệu suất đường hóa------------------------------------------------------ 36
Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ gạo nếp trắng và bột mì đến
màu sắc sản phẩm -------------------------------------------------------------------------- 38
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme---- 40
Hình 4.2 Đồ thị không gian 3 chiều và contour biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ và pH lên
hoạt tính của protease đến khả năng thủy phân protein ------------------------------------------ 40
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian lên hoạt tính
enzyme--------------------------------------------------------------------------------------- 42
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ và thời gian lên hoạt tính của enzme --
------------------------------------------------------------------------------------------------ 44
Hình 4.5 Màu của các sản phẩm rượu được bổ sung bột mì ở những tỉ lệ khác nhau ------- 45
Ngành Công nghệ thực phẩm vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc nghiên cứu ứng dụng rộng rãi những thành tựu về công nghệ enzyme vào
trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm đã mang lại nhiều triển vọng mới, đặc biệt là
trong sản xuất rượu. Sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, công nghệ
enzyme càng ngày càng được ứng dụng rộng rãi vào nhiều lĩnh vực khác như:
công nghiệp dệt, công nghệ sinh học, y học… và nó đã đem lại giá trị kinh tế cao.
Ở nước ta, rượu chủ yếu được sản xuất theo cách truyền thống, chưa chú trọng
việc áp dụng khoa học kỹ thuật vào trong sản xuất. Các sản phẩm rượu chủ yếu để
tiêu thụ trọng nước, chưa thể cạnh tranh với các loại rượu ngoài nhập. Quy trình
sản xuất thủ công và thiết bị còn thô sơ dẫn đến rượu chưa ổn định về mặt chất
lượng và số lượng, thời gian sản xuất kéo dài và hao phí nhiều nguyên liệu trong
sản xuất.
Ứng dụng enzyme α-amylase, glucoamylase vào quá trình dịch hóa và hồ hóa tinh
bột nếp sẽ cải thiện được thời gian sản xuất, hiệu suất thu hồi sản phẩm và làm
giảm giá thành sản xuất. Ngoài ra, enzyme protease sẽ tạo cho sản phẩm có màu và
hương vị đặc trưng. Quy mô sản xuất phòng thí nghiệm sẽ là tiền đề cho việc ứng
dụng vào quy mô công nghiệp, nhằm nâng cao sức cạnh tranh cho sản phẩm rượu
Việt.
Chính vì những lí do trên, tôi tiến hành: “Nghiên cứu ứng dụng enzyme vào
trong sản xuất rượu vang nếp trắng”.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nhằm tìm ra những thông số tối ưu cho quá trình thủy phân nguyên liệu gạo nếp
trắng và bột mì. Đề tài sẽ nghiên cứu:
 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính protease trong quá trình thủy phân
protein
 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease và thời gian đến khả năng thủy phân
protein
 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian lên khả năng đường
hóa dịch tinh bột
 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ gạo nếp và bột mì đến màu sắc sản phẩm.
Ngành Công nghệ thực phẩm 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Nếp trắng

Hàm lượng tinh bột trong ngũ cốc rất cao, nó phù
hợp với ngành công nghiệp sản xuất rượu. Trong
đó, nếp trắng (hình 2.1) là một loại gạo với hàm
lượng tinh bột trên 70%, được sử dụng rộng rãi
trong sản xuất rượu.
Thành phần của tinh bột nếp trắng gồm amylose
và amylopectin. Trong đó, amylopectin chiếm tới
99,7%. Vì vậy, nếp có độ kết dính cao hơn gạo.
Bảng 2.1 thể hiện thành phần hóa học của
gạo nếp
Hình 2.1 Nếp trắng
Nguồn:(www.fdlserver.files.wordpres.co
m)
Bảng 2.1 Thành phần hoá học của nếp
Thành phần Hàm lượng (%)

Nước 14
Protein 8,2
Lipid 1,5
Glucid 74,9
Tro 0,8
(Từ Giấy và ctv., 1994)
2.1.2 Bột mì
 Định nghĩa bột mì
 Bột mì (Hình 2.2) là sản phẩm được chế biến từ hạt
lúa mì bằng quá trình nghiền. Trong quá trình này vỏ
cám và phôi được tách ra và phần còn lại của hạt lúa
mì (nội nhũ) được nghiền nhỏ tới độ mịn thích hợp
(ra thành phẩm là bột mì)
 Ngoài ra, bột mì có thể được bổ sung một số thành Hình 2.2 Bột mì

phần khác vì các mục đích công nghệ như:

 Các sản phẩm malt có hoạt tính enzyme vốn được sản xuất từ hạt lúa mì, hạt
mạch đen hay từ hạt đại mạch, gluten tươi, bột đậu tương hay bột đậu khác có
chất lượng thực phẩm thích hợp
 Các chất dinh dưỡng: Việc thêm các vitamin, các chất khoáng hoặc các axidd
amin đặc hiệu nhưng phải phù hợp với pháp luật của nước tiêu thụ sản phẩm.
 Một số yêu cầu tối thiểu để được coi là bột mì thương phẩm
 Độ acid của các acid béo không quá 50mg KOH cần để trung hòa acid béo tự
do trong 100g bột tính theo chất khô
 Protein: hàm lượng protein không thấp hơn 7,0%, tính theo chất khô.
 Độ ẩm: độ ẩm của sản phẩm không vượt quá 15,5%
 Cỡ hạt: Bột mì không nhỏ hơn 98% lượng bột lọt qua rây có kích thước lỗ 212
milimicron (N-70)
 Kim loại nặng: Trong bột mì không được phép có kim loại nặng với số lượng
gây nguy hiểm cho con người
 Dư lượng chất trừ sinh vật hại phải tuân thủ giới hạn tối đa cho phép theo quy
định.
Thành phần hóa học của bột mì được thể hiện trong bảng 2.2:
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của bột mì tính bằng % chất khô

Tinh bột 79
Protid 12
Pantose 1,95
Chất béo 0,8
Đường chung 1,8
Cellulose 0,1
Tro 0,5
(Nguồn: Công ty bột mì Hồng Hà )
2.1.3 Nấm men

Nấm men (hình 2.3) có cấu tạo đơn bào, sinh sản
bằng cách nẩy chồi và phân cắt. Chúng là các vi
sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong cả điều
kiện hiếu khí và yếm khí.
Hình 2.3 Saccharomyces

Ngành Công nghệ thực phẩm cerevisiae 3
a) Hình dạng và kích thước

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, hình elip hoặc hình
ovan, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài thành sợi.
Kích thước của tế bào nấm men rất khác nhau, điều này phụ thuộc vào chủng nấm
men và điều kiện nuôi cấy, thường khoảng 8 - 15μm.
b) Hình thức sinh sản
Nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Tế bào mẹ nảy sinh ra thành
một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra. Quá trình này xảy ra khoảng 2 giờ. Ở
một số giống nấm men, các nấm men tạo màng tế bào con không tách rời mà kết
thành chuỗi.
c) Thành phần hóa học của nấm men
Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản của nấm men chủ yếu là nước,
chiếm 75% khối lượng chung. Thành phần sinh khối của nấm men được thể hiện ở
bảng 2.3
Bảng 2.3 Thành phần hóa học của nấm men

Chất vô cơ 5 - 10
Cacbon 25 - 50
Nitro 4,8 - 12
Protein (N x 6,25) 30 – 75
Lipit 2-5
(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 2005)
d) Nấm men trong sản xuất rượu từ tinh bột

Saccharomyces cerevisiae Rasse II:
Chủng này sinh sản trong môi trường nước đường, thường tụ lại thành đám, sau
thời gian ngắn lắng xuống. Đặc điểm của loài này trong tế bào có nhiều hạt
glycogen, không bào lớn hình thành bào tử nội sinh ít và chậm, sinh bọt nhiều và
thích nghi với độ acid thấp, có sức kháng cồn cao, không lên men được lactose,
kích thước tế bào từ 5-7μ m.
Saccharomyces cerevisiae Rasse XII:
Phân lập được ở Đức năm 1902. Tốc độ phát triển nhanh, sau 24 giờ từ một tế bào
có thể phát triển thành 55 tế bào mới. Ở loài này không bào nhỏ, ít sinh bọt, tế bào
hình trứng hoặc hình tròn, kích thước vào khoảng 5-8μm, lên men ở nhiệt độ cao

và lên men được đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và 1/3
đường rafinose, không lên men đường lactose, có thể lên men đến 13% rượu. Nấm
men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII thuộc loại men nổi, phân bố rất đều
trong dịch lên men không tạo thành đám trắng.
R211:
Loại nấm men này được phân lập từ men thuốc bắc ở nhà máy rượu Hà Nội. Tế
bào hình ovan có kích thước (3-5) x (5-8) μm, nó có thể lên men được ở đường
glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose. Được dùng trong sản xuất rượu từ
nguyên liệu chứa tinh bột như: gạo, ngô, khoai, sắn. Sinh sản nhanh sau khi cấy từ
12 đến 16 giờ, lên men tốt trong dịch đường 120-140g/l và ở 160-180g/l vẫn có thể
lên men được nhưng hiệu suất chuyển hóa thấp. Nồng độ rượu tạo thành trong môi
trường lên men là 10- 12 %. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 đến 300C, nhưng
đến 380C thì vẫn có thể lên men được. Chúng có khả năng chịu được chất sát
trùng Na2SiF6, nồng độ 0,02% (nồng độ này vi khuẩn bị ức chế) (Bùi Thị Quỳnh
Hoa, 2002).
2.1.4 Enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein (Đặng Thị Thu và ctv, 2004)
và tham gia vào các phản ứng sinh học. Enzyme thường là những protein hình cầu
có kích thước khoảng từ 62 đơn vị acid amin (Dunaway-Mariano, 2008). Enzyme
xúc tác chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng mà không làm thay đổi bản thân chúng.
Chúng có tính chọn lọc cao và hoạt tính có thể điều khiển được.
Enzyme là những chất không thể điều chế được bằng phương pháp tổng hợp hóa
học, mà người ta thường thu nhận chúng từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc
vi sinh vật (Đặng Thị Thu và ctv, 2004).
a) Enzme amylase Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải
các liên kết glucoside nội phân tử trong các polyssacharide với sự tham gia của
nước. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose
và dextrin giới hạn (hình 2.4). Hệ này tồn tại trong nước bọt, trong dịch tiêu
hoá, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men… Có nhiều loại enzyme amylase:
α-amylase, β-amylase, γ-amylase, pullutanase, isoamylase…
Payen và Persoz (1833) là người đầu tiên nhận biết được sự thủy phân tinh bột của
enzyme, họ thấy rằng dịch chiết malt đã chuyển đổi tinh bột thành đường. Rất lâu
sau đó, amylase từ nấm mốc đã được ứng dụng trong sản xuất sirô thương mại vào
năm 1938 (Dale and Langlois, 1940). Ngoài ra, có thể điều chế hỗn hợp enzyme
gồm glucoamylase và α – amylase để thủy phân acid hydrolycate (Schenck, 1992).

Hình 2.4 Cơ chế tác động của amylase lên tinh bột
(Nguồn: Lý Nguyễn Bình, 2007)
 α-amylase(1,4 - α-glucan 4-glucanhyrolase)
(EC 3.2.1.1):
α-amylase (hình 2.5) có khả năng phân cắt các
liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách
ngẫu nhiên được thể hiện ở hình 2.6 nên được
gọi là enzyme nội phân (endoenzyme).
Amylose bị phân cắt tạo thành oligosaccharide
gồm 6-7 gốc glucose, sau đó các mạch này bị
phân cắt và bị phân giải chậm thành maltose. Sản
phẩm thủy phân amylose bao gồm: 87% maltose, Hình 2.5 Cấu trúc enzyme α-
13% glucose. Amylopectin bị phân giải giống amylase
như amylose nhưng α-amylase không phân cắt (Nguồn: www.goldbamboo.com )
liên kết α-1,6 glucozide nên sản phẩm thủy phân có khoảng 72% maltose, 19%
glucose, dextrin phân tử thấp và 8% izomaltose.
α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt bị kìm hãm bởi các
ion kim loại nặng như Cu2+, Ag2+, Hg2+…. Tùy thuộc vào nguồn enzyme thu được
từ thực vật hay vi sinh mà pH và nhiệt độ hoạt động của enzyme khác nhau.

Hình 2.6 Cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột
(Nguồn: www.molecularexpressions.com)
Do α-amylase có bản chất là protein nên chịu ảnh hưởng của nhiệt độ. Bảng 2.4
thể hiện độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau:
Bảng 2.4 Độ bền với nhiệt độ của α-amylase từ các nguồn khác nhau
Hoạt độ của α-amylase (%) so với ban đầu

Nhiệt độ
Malt Nấm mốc Vi khuẩn
65 100 100 100
70 100 52 100
75 58 3 100
80 25 0 92
85 1 0 58
90 0 0 52
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004)
 β-amylase (1,4-α-glucan-
maltohydrolase) (EC 3.2.1.2):
β-amylase (hình 2.7) là enzyme ngoại phân
(exo-enzyme), phân cắt các liên kết α-1,4-
glucoside thành từng gốc maltose ở đầu không
khử của nhánh ngoài cùng của cơ chất.
β-amylase phân giải 100% amylose thành Hình 2.7 Cấu trúc enzyme β-
maltose. Do β-amylase không phân cắt các amylase
(Nguồn: www.goldbamboo.com )
liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucosid nên chỉ phân giải 54-
58% amylopectin thành maltose, phần còn lại là dextrin phân tử lớn (β-limit
dextrin).
β-amylase không bền khi có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+,
Hg2+, urê, iodoacetamide, iod, ozon... Nhiệt độ tối thích trong dung dịch nấu là
550C ở pH 5,1-5,5 và bị vô hoạt ở 700C. β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên
kết α-1,4 glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. (Nguyễn
Đức Lượng và ctv., 2004)
 γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) (EC 3.2.1.3):
γ-amylase (hình 2.8) là enzyme ngoại phân (exo-
enzyme) , có khả năng xúc tác thủy phân cả liên
kết α -1,4; 1,6 glucoside trong tinh bột, glycogen,
polysaccharide. Nó thủy phân polysaccharide từ
đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một,
không thủy phân các dextrin vòng. Sản phẩm tạo
thành là glucose và dextrin vòng. γ-amylase
Hình 2.8 Cấu trúc enzyme
(glucoamylase) từ các nguồn nấm mốc khác nhau γ-amylase
thì khác nhau về tính chất vật lý và hóa học của (Nguồn: www.goldbamboo.com )
nó (Manjunath et al., 1983; Shenoy, 1984). Hoạt
động tốt ở 500C và pH 3,5-5,5. Bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn
trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+ (Nguyễn Đức Lượng và ctv.,
2004).
b) Enzyme protease
Hệ enzyme thủy phân protein thành acid amin là enzyme protease (hình 2.9).
Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-
NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid
amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
Hình 2.9 Cấu trúc của enzyme protease

(Nguồn: www.scripps.edu)
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử
nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều
enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho
sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành
hai loại:
 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một tripeptide.
 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
 Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác
của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
 Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH 2-4

 Protease trung tính: pH 7-8

 Protease kiềm: pH 9-11
2.1.5 Các chế phẩm enzyme sử dụng

a) Termamyl 120L
Mô tả:
Termamyl 120L được sản xuất từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis, là
enzyme nội phân, thủy phân liên kết α-1,4-glucoside trong chuỗi amylose và
amylopectin. Tinh bột được phân cắt thành những dextrin và oligosaccharides hòa
tan.
Đặc điểm của enzyme:
Hoạt độ: 120 KNU-T/g
Màu sắc: Nâu
Màu sắc có thể thay đổi từ lô này sang lô khác.
Cường độ không phải là thước đo của enzyme.
Trạng thái vật lí: Lỏng
Tỉ trọng (g/ml): 1,26
Chất ổn định: Methionine
Sodium chloride
Sucrose
Sinh vật sản xuất: Bacillus licheniformis
Được sản xuất từ quá trình lên men chìm của vi
sinh vật.
Đặc điểm kĩ thuật:
Đơn vị phân giải protein: AU-NH
Coliform bacteria: <= 30/g
Enteropathogenic E.coli: 0/25g
Samonella: 0/25g
Nhiệt độ bảo quản: 0-250C
Sản phẩm sử dụng tốt nhất trong 3 tháng kể từ ngày
sản xuất.

Sản phẩm tuân theo các tiêu chuẩn về độ tinh khiết đối với các enzyme trong
ngành thực phẩm, được quy định bởi Ủy ban Chuyên môn chung của FAO/WHO
về Phụ gia Thực phẩm (JECFA) và Bộ luật về Hóa chất Thực phẩm (FCC).
b) Enzyme AMG 300L
Mô tả:
Enzyme AMG 300L là enzyme ngoại phân được sản xuất từ chủng vi sinh vật
Aspergillus niger bằng phương pháp lên men chìm. Tên hệ thống là 1,4-α-D-
glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.3). Enzyme thủy phân được cầu nối α-1,4-
glucoside và α-1,6-glucoside, sản phẩm tạo thành là đường glucose.
Màu sắc: Nâu
Màu sắc có thể thay đổi từ lô này sang lô khác.
Cường độ không phải là thước đo của enzyme.
Hoạt tính của enzyme có thể bị vô hoạt khi đun nóng dung dịch đến 800C trong 5
phút hoặc 750C trong 40 phút. Enzyme sử dụng tốt nhất trong 6 tháng kể từ ngày
sản xuất.
c) Enzyme Neutrase 0.8L
Mô tả:
Neutrase là loại enzyme trung tính được sản xuất từ chủng Bacillus
amiloliquefaciens. Nó thủy phân protein thành amin nitrogen tự do (FAN) và các
peptid hòa tan.
Khoảng hoạt động tối ưu:
Nhiệt độ: 40-500C
pH: 5,5-6,5
Hoạt độ: 0,8 AU-NH/g
Màu sắc: Nâu

Màu sắc có thể thay đổi từ lô này sang lô khác

Cường độ không phải là thước đo của enzyme
Chất ổn định: Natri chloride
Sorbitol
Sinh vật sản xuất: Bacillus amiloliquefaciens
Được sản xuất từ quá trình lên men chìm của vi
sinh vật.
Đặc điểm kĩ thuật:
Đơn vị phân giải protein: AU-NH
Coliform bacteria: <= 30/g
Enteropathogenic E.coli: 0/25g
Samonella: 0/25g
Nhiệt độ bảo quản: Tốt nhất là ở 0-100C, ở nhiệt độ này sản phẩm có thể duy trì
trong một năm. Nếu bảo quản ở 250C thì sản phẩm dùy trì được trong vài tháng,
mỗi tháng hoạt lực sẽ giảm vài phần trăm.
Enzyme này bị vô hoạt ở nhiệt độ 850C trong 2 phút. Tuy nhiên còn phụ thuộc vào
nồng độ cơ chất, pH…
(Novo nordisk, 2005)
2.1.6 Nước
Độ cứng không quá 7 mg đương lượng/lít phải trong suốt không màu không mùi,
hàm lượng muối không được quá giới hạn. Hàm lượng muối của nước sử dụng
trong sản xuất rượu bia được thể hiện trong bảng 2.5
Bảng 2.5 Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia
Ion Hàm lượng (mg/l)

Cl- 0,5

SO42- 80
As 0,05
Pb 0,1
NO3 40
F 3
Zn 3
Cu 5
Fe 0,3
(Nguồn: Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002)
Khả năng oxy hóa một lít nước không quá 2ml dung dịch KMnO4 (0,01N). Chất
cặn không vượt quá 1000ml/l. Hàm lượng các chất hữu cơ không vượt quá 4mg/l.
Vi sinh vật hầu như không có. pH kiềm không thích hợp cho quá trình nấu nguyên
liệu, có khả năng tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển và thúc đẩy quá
trình tạo thành glyceryl trong quá trình lên men.
Ecoli < 20 tế bào/lít
2.2 CƠ CHẤT CỦA ENZYME
2.2.1 Tinh bột

Tinh bột là chất dinh dưỡng dự trữ ở thực vật, là nguồn thức ăn, nguồn cung cấp
năng lượng cho người và động vật. Cấu tạo hạt tinh bột là một chuỗi gồm các đơn
vị glucose liên kết chủ yếu bởi các nối α-1,4-glucoside, với một vài α-1,6-
glucoside. Nó bao gồm hỗn hợp hai loại chuỗi: amylose và amylopectin. Hai thành
phần hình thành một cơ cấu bán kết dính trong hạt tinh bột, trong đó có các lá
mỏng dạng tinh thể và lá mỏng vô định hình (Oates, 1997). Tinh bột từ các nguồn
khác nhau có độ kết dính khác nhau (khoảng 15-45%) (Zobel, 1988). Tỉ lệ khối
lượng của amylose thường nằm trong khoảng 20-30%. Có những loại tinh bột chứa
chủ yếu thành phần amylopectin (tinh bột khoai tây và ngô chứa gần như 100%
amylopectin). Amylopectin là chuỗi phân nhánh. Mạch thẳng chứa 20 – 24 đơn vị
liên kết α-1,4-D-glucose được kết nối với những liên kết α-1,6-glucoside, từ đó
hình thành nên cấu trúc nhánh. Amylose là chuỗi mạch thẳng nhiều hơn (Hizukuri,
1996) và tỉ lệ liên kết α-1,6-glucoside (0,2-0,7%) thấp hơn rất nhiều so với
amylopectin (4-5%).
Amylose:

Hình 2.10 Cấu trúc Amylose

(Nguồn: www.biology.iastate.edu)
Cấu tạo dạng mạch thẳng, không phân nhánh, chứa từ 300-1000 gốc glucose, trọng
lượng phân tử từ 32400-162000 đơn vị (hình 2.10). Thành phần cấu tạo gồm các
gốc α-D-glucopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside.
Amylose có những đặc tính: tạo màu xanh với iod, dễ hoà tan trong nước ấm và
tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, tủa trong butanol và pentanol.
Amylopectin:
Hình 2.11 Cấu trúc của amylopectin

(Nguồn: www.biology.iastate.edu)
Amylopectin có cấu tạo mạch phân nhánh (hình 2.11). Thành phần gồm các đơn
vị α-D-glucopyranose liên kết với nhau. Trên mạch thẳng các gốc glucose liên kết
bằng liên kết α-1,4-glucoside, tại các vị trí phân nhánh liên kết với nhau bằng liên
kết α-1,6-glucozide.

Amylopectin tạo thành từ 600-6000 gốc đường glucose, trọng lượng phân tử từ
96120-961000 đơn vị. Tính chất của amylopectin: hoà tan trong nước ấm và tạo
nên dung dịch có độ nhớt cao, không tạo màu với iod, không bị tủa với butanol và
pentanol.
(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2006)
2.2.2 Glycogen
Glycogen là nguồn năng lượng và nguồn glucid được dự trữ trong cơ thể người và
động vật, chúng có lượng lớn trong gan và cơ. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy
trong một vài thực vật bậc cao, trong nấm và trong các vi sinh vật. Cấu tạo của
glycogen tương tự như amylopectin nhưng số điểm phân nhánh nhiều hơn.
Tính chất của glycogen: dễ tan trong nước nóng, cho màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với
iod, khi thủy phân băng acid hoặc enzyme thu được chủ yếu là glucose, maltose,
isomatose.
2.2.3 Protein
 Khái niệm:
Protein là hợp chất cao phân tử (hình
2.12), phổ biến rộng rãi trong các tế bào và
chiếm 50% trọng lượng khô của tế bào.
Khi thủy phân protein ta thu được các acid
amin.
Protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp “protos” Hình 2.12 Cấu trúc bậc 1 của
có nghĩa là đầu tiên, quan trọng. protein
Protein được tìm thấy trong mọi thành phần của tế bào, tham gia vào thành phần
cấu trúc và chức năng của tế bào. Chúng động vai trò quan trọng trong quá trình
sinh sản, sinh trưởng của vi sinh vật.
 Thành phần hóa học:
Tất cả các phân tử protein đều chứa các nguyên tố cơ bản: C (50-55%), O (21,5-
23,5%), N (15-18%), H (5,5-7,3%). Ngoài ra, trong thành phần của chúng còn
chứa các nguyên tố khác với hàm lượng không đáng kể: P, S, Fe, Zn, Cu, Ca, Mg.

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TỐC ĐỘ PHẢN ỨNG CỦA
ENZYME
 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Khi có đầy đủ cơ chất thì vận tốc của phản ứng enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ
enzyme (hình 2.13). Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng
độ enzyme bằng biểu thức sau:
V = k[E]
Trong đó: V : Tốc độ phản ứng
k: hằng số tốc độ phản ứng
[E] : Nồng độ enzyme
Nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều. Tuy
nhiên, khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm
)
ản ứng (V
ph
ốc
T
đ
ộ
0 Nồng độ enzyme [E]

Hình 2.13 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
 Nồng độ cơ chất
Vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất được thể hiện ở hình 2.14.
Phản ứng khi có enzyme xảy ra ba giai đoạn:
 Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai
đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng V phụ thuộc tuyến tính
với nồng độ cơ chất.
E+S ES
 Giai đoạn 2: phức hợp ES sẽ được tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn
toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

 Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng này
được xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất.
Tốc độ phản ứng

(V)
1
Vmax
2
0 Km Nồng độ cơ chất
Hình 2.14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính
enzyme
 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme (hình 2.15). Cũng như các
phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng của enzyme tăng khi nhiệt độ
tăng. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất là protein, nó kém bền với nhiệt độ nên
tốc độ phản ứng enzyme không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.
Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá nhiệt độ
đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Đa số enzyme
bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C.
Vận tốc của enzyme (V)
0 Nhiệt độ
Hình 2.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q enzyme
10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến
tốc độ phản ứng, ở khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme khi nhiệt độ tăng lên
100C thì tốc độ phản ứng tăng 1,4-2 lần. Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme
cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích của enzyme. Phần lớn enzyme hoạt động

mạnh nhất ở nhiệt độ 40-500C. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì
hoàn toàn khác nhau, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao
hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có
khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C thì hoạt động của
enzyme bị hạn chế mạnh và khi nâng nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng
dần đến mức tối ưu. Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt
của cơ chất, kim loại, pH và chất bảo vệ.
 pH:
Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường (hình 2.16), mỗi
enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH
môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme, phức hợp
enzyme – cơ chất và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế
pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme.Các enzyme từ các nguồn
gốc khác nhau thì có pH tối thích khác nhau. Đa số enzyme hoat động mạnh ở môi
trường acid yếu, kiềm yếu và trung tính. Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt
động mạnh ở môi trường kiềm và acid.
Vận tốc của enzyme (v)
pH tối thích
pH
Hình 2.16 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme
 Chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản
ứng của enzyme, làm giảm hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm
thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Chất kìm
hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của
enzyme. Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu
cơ có phân tử nhỏ hoặc protein. Chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển
các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm
thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Tùy thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản
chất của chất kìm hãm, người ta chia ra những chất kìm hãm sau :

Các chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu
trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm
thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme.
Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động làm cho cơ
chất không có cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất
kìm hãm và cơ chất làm giảm số lượng của các enzyme kết hợp với cơ chất. Do đó,
cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng.
E+S ES E+P
E+I EI
Các chất kìm hãm không cạnh tranh: Chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp
với enzyme ở vị trí khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi cấu trúc không gian
của phân tử enzyme, làm giảm hoạt động xúc tác của enzyme dẫn đến giảm vận
tốc phản ứng. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, enzyme
vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng
sau:
E+S ES E+P
E+I EI
ES + I EIS
EI + S EIS
Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: Các sản phẩm phản ứng có thể đóng vai
trò như chất kìm hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và
chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có
ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và chất B. Khi đó, sản phẩm P1 và P2 được xem
như chất kìm hãm của enzyme.
Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành
chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng
E+S ES E+P
Nếu có cơ chất thứ hai tham gia và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó trên
phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho enzyme không hoạt động, khi đó cơ chất
thứ hai này coi như chất kìm hãm.
ES + S ESS
 Chất hoạt hóa

Những chất hoạt hóa có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động
trở thành hoạt động, từ hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Các chất hoạt
hóa thường có bản chất hóa học rất khác nhau, chúng có thể là:
 Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển gốc hóa học
 Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm hoạt động của trung tâm hoạt
động enzyme
 Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm
loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho các nhóm chức xích lại gần
nhau để hình thành trung tâm hoạt động
 Ngoài ra, một số cation kim loại có bán kính từ 0,34 - 1,65 A0 (Na+, K+, Ca2+,
Mg2+) và các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá
trình hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt
động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu
trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme.
2.4 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN
2.4.1 Khái quát về quá trình lên men rượu

Lên men rượu là một quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương
ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống
của nấm men). Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm
nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men
yếm khí và lên men hiếu khí.
 Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của oxy như
quá trình lên men lactic, lên men rượu butylic…
 Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện diện của O2 như quá trình
lên men acid acetic, acid citric…
Lên men rượu, bia đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men
(Yeast). Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Nguời ta
còn có thể gọi là quá trình cồn hóa, rượu hóa.
Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kì chính:
 Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm
men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)
 Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này, nấm men hấp
thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện
xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu
và CO2.

2.4.2 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định.
Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông
thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong
1 ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả
năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đuờng lên men và các chất dinh
dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm
men sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và
CO2 sẽ được tạo thành. Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài
qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất
nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa
tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C lượng CO2 hòa tan vào
nước là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình
lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái
bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những
bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và
lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng
riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do
có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị
phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại
nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ
trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế
bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh
hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên
men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm
men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện
tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự
thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men.
(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002)
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu:
 Nồng độ đường:
Nồng độ đường thích hợp nhất của nấm men trong sản xuất rượu vang là 20 –
28%, nếu cao hơn thì năng lực lên men giảm và ngược lại nếu thấp sẽ không tạo
được điều kiện cho quá trình lên men. Trên thực tế, ở nồng độ đường 30 – 35% thì
sự lên men bị đình chỉ.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm
men Saccharomyces cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men
chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu
là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 – 220C có
năng lực lên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới
hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 – 450C. Nếu nhịêt độ quá 500C nấm men sẽ chết.
 Ảnh hưởng của acid (pH):
Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2 – 8 nhưng thích hợp
nhất là 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ
có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm
khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH 3,8 – 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có
những loài vi khuẩn do quen dần (thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng
dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH
8,0 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH
3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển.
Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta
có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid
không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.
 Ảnh hưởng của nồng độ rượu:
Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm
men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phù
thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi
cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, điều
kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc
độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% đã có ảnh hưởng xấu.
 Ảnh hưởng của oxy:
Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy
nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy
nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu
ứng Pasteur” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2.
Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Tùy
nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại.
Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển
sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều
aldehyde, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu

gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi
khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do
rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển.
Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng
O2 cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng
đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm
men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không
khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ
oxy.
(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002).
2.4.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men
 Sự tạo thành acid:
Quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic,
acid citric, acid pyruvic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid
lactic.
Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde
acetic, một phân tử bị oxy hoá và phân tử thứ hai sẽ bị khử:
CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH
Acid lactic được tạo bởi pyruvate dehydronase theo phản ứng:
CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH2CHOHCOOH + NAD
Hoặc
CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4
Acid citric theo Laphon được tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng được biểu diễn tổng
quát như sau:
9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH
Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai
phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic:
2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH
Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric
tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic
cùng với glycerin từ acid glutamic được biểu diễn như sau:
C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH +
2C3H8O3 +NH3 + CO2.

Glycerin và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong điều
kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu etanol, người ta khống chế pH dịch lên men
trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 –
0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường 2 – 3% so với lượng đưa vào.
Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và
đường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%.
Lên men đường xảy ra theo phương trình:
2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH
(Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007)
 Sự tạo thành rượu bậc cao:
Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men
rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng
nếu lẫn vào etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đó là các alcol
propylic, izobutylic, izoamylic, amylic...Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 –
0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có
tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin.
Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo
phản ứng:
R-CH(NH2)-COOH + H2O  RCH2OH + NH3 + CO2.
Như vậy, việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin
xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu, sự tạo thành
alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau đó mất CO2 và cuối
cùng aldehyt bị khử để tạo ra alcol.
Bằng con đường tương tự, nhiều acid amin cũng được tạo thành như valine và
isoleucine… chúng là tiền đề để tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình
amin hoá acid pyrovic xảy ra rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ
với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho các quá trình khác
tiếp theo.
 Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác:
Sự tạo thành ester
Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men,
các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng. Phương
trình tổng quát:
R1CH2OH + R2COOH  R2COO-CH2R1 + H2O

Ester etylic có thể được tạo thành do alcol etylic kết hợp với acid acetic. Sự tạo
thành sẽ dễ hơn khi các cấu tử tham gia phản ứng là các aldehyde:
R1CHO + R2CHO  R1COO-CH2R2
Sự tạo thành metanol
Trong quá trình nấu nguyên liệu, các chất pectin ester của acid polygalacturonic bị
thủy phân tạo thành acid pectic và alcol metylic.
Sự tạo thành fufurol
Đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccharose, glucose, fructose và một ít
maltose được tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt độ cao các đường sẽ bị phân
hủy và mất nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin.
Đường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol.
Sự tạo thành aldehyde
Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể được tạo thành
qua con đường oxy hóa các loại rượu. Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde.
Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men
phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí
cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu.
Decarboxyl hóa
Acid pyruvic acetaldehyde
2.5 PHẢN ỨNG MAILLARD

Phản ứng Maillard được biết đến như sự hóa nâu không do enzyme, được báo cáo
lần đầu tiên bởi Louis-Camille Maillard, là trong một bài báo cáo ngắn của Viện
hàn lâm Pháp vào năm 1912 (Maillard, 1912). Phản ứng Maillard là phản ứng giữa
đường khử và hợp chất amin chứa nhóm amin chưa bị ion hóa (Nguyễn Thị Thu
Thủy, 2008). Phản ứng có thể dẫn tới một số hệ quả sau:
 Sự tạo hợp chất màu nâu gọi là melanoidin. Các hợp chất này có chứa hàm
lượng nitơ khác nhau và có phân tử lượng cũng như khả năng hòa tan trong
nước khác nhau
 Tạo hợp chất dễ bay hơi
 Tạo vị đắng
 Tạo reductone, đó là những chất có tính khử mạnh giúp thực phẩm ổn định
trước các tác nhân oxy hóa
 Mất các acid amin không thay thế (Cysteine, Methionine)

 Tạo các hợp chất có khả năng gây ung thư

 Sự sinh khí CO2 thường thấy khi tồn trữ ở nhiệt độ cao do sự giảm cấp strecker
2.5.1 Các điều kiện phản ứng

 Nhiệt độ
Sự gia tăng tốc độ phản ứng hóa nâu đồng thời với việc gia tăng nhiệt độ. Tồn trữ
ở nhiệt độ thấp sẽ có lợi hơn trong việc tránh các tiến trình hóa nâu (Nguyễn Thị
Thu Thủy, 2008).
 pH và chất đệm
Chất đệm là chất có khả năng chống lại sự thay đổi pH của môi trường khi tăng
[H+] hoặc [OH-]. Vì vậy, vai trò của chất đệm trong sự hóa nâu không do enzyme
là làm tăng tốc độ hóa nâu của hệ thống acid amin – đường khử. Trong quá trình
phản ứng các sản phẩm có tính acid sinh ra, các chất đệm sẽ kết hợp với các acid
đó, giữ môi trường hơi kiềm thích hợp cho các tiến trình hóa nâu.Phản ứng
Carbonyl – amin có thể xảy ra trong môi trường acid hay môi trường kiềm mặc dù
nó xảy ra trong môi trường kiềm ưu thế hơn. Môi trường acid thường được dùng
để ngăn cản phản ứng Maillard (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). Phản ứng hóa nâu
của glucose và một số acid amin phụ thuộc vào pH môi trường được thể hiện ở
hình 2.17.
Hình 2.17 Ảnh hưởng của môi trường lên phản ứng Maillard của D-glucose
và các acid amin ở 1210C trong 10 phút
(Nguồn:
Thànhwww.landfood.ubc.ca)
phần ẩm
Phản ứng xảy ra trong môi trường có nước. Sự làm khô hoàn toàn sẽ làm dừng tiến
trình hóa nâu. Tuy nhiên, phản ứng xảy ra cực đại ở trạng thái khá khô và thấp hơn
ở trạng thái độ ẩm cao (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008). Sự phụ thuộc của phản ứng
Maillard vào hoạt độ nước được thể hiện ở hình 2.18 .

Hình 2.18 Ảnh hưởng hoạt độ nước lên phản ứng hóa nâu không do enzyme
(Nguồn: www.landfood.ubc.ca)
Hình 2.18 cho thấy phản ứng xảy ra nhanh ở giá trị aw trung bình (0,5 – 0,8). Tuy
nhiên, hoạt độ nước thích hợp nhất cho hệ thống phản ứng còn tùy thuộc vào các
thành phần có trong thực phẩm.
 Đường
Trong phản ứng Maillard, đường là thành phần cơ bản, nó cung cấp nhóm
carbonyl cần thiết để phản ứng với nhóm α – amin tự do. Phản ứng này tự nó
không chỉ giới hạn trong các monosaccharide nhưng cũng có thể tiến hành trên các
disaccharide khử như: maltose, lactose,...Tuy nhiên các loại đường không khử
không thể tham gia cho đến khi nối glycoside bị cắt rời phóng thích thành phần
đường khử có khả năng tham gia phản ứng. Trong đó, đường aldopentose hoạt
động hơn đường aldohexose. Disaccharide có tính khử ít hơn monosaccharide
(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008).
2.5.2 Cơ chế phản ứng

Phản ứng Maillard là sự kết hợp các chất đường như: aldose, cetose với các amin
theo các con đường phức tạp và khác nhau. Sản phẩm ngưng tụ đầu tiên là một
base Schiff, sau đó tạo vòng thành chất thế nitơ N- subtituted glycosylamine tham
gia vào một chuỗi phản ứng, sắp xếp lại cấu tạo amodori thành một tác chất bị thế
nitơ N – subtituted 1 – amino – 1 – deoxy – 2 – ketose và fructóamine acid. Các
chất này chưa có màu và tiếp tục biến đổi bằng một chuỗi phản ứng polymer hóa
dẫn đến sự tạo thành các sản phẩm polymer có màu. Bên cạnh đó, một con đường
khác là sự giảm cấp Strecker không liên quan đến sắc tố, nó chỉ cung cấp những
chất khử cơ bản để tham gia các phản ứng tạo màu. Mặc dù sự giảm cấp Strecker

không liên quan đến sự thành lập sắc tố nhưng nó rất quan trọng trong thực phẩm
vì nó cung cấp các hợp chất khử và có trách nhiệm khởi đầu việc sinh ra các hương
vị. Các hợp chất mùi được tạo thành là những dẫn xuất aldehyde qua sự giảm bậc
oxi hóa của acid amin.
 Khởi đầu của phản ứng Maillard
Phản ứng giữa đường khử và hợp chất amin tạo thành glycosylamin và sau đó xảy
ra sự chuyển vị Amadori, các phản ứng này xảy ra khi khử nước hoặc gia nhiệt hay
tồn trữ thực phẩm. Phản ứng oxy hóa cắt mạch carbon của sản phẩm chuyển vị
Amadori tạo thành N – carboxymethyl amino acid có thể được sử dụng cho chất
chỉ thị cho phản ứng Maillard.
 Biến đổi của 3 – deoxyosone
3 – deoxyosone của hexose bị chuyển hóa thành hydroxymethyl furfural và 2 –
hydroxy – 6 – hydroxymethyl – 3 – pyranone, các hợp chất này ngưng tụ tạo ra
hợp chất có màu vàng.
 Biến đổi của 1 – deoxyosone
1 – deoxyosone của pentose, methylpentose và hexose biến đổi thành furanone là
những chất tạo hương vị.
 Giai đoạn cuối của phản ứng Maillard
Giai đoạn cuối bao gồm nhiều phản ứng phức tạp, có thể chia thành hai kiểu phản
ứng sau:
 Phản ứng ngưng tụ aldol với sự tạo thành polymer màu nâu không chứa nitơ
 Phản ứng trùng hợp các aldehydamin với sự tạo thành các hợp chất nitơ dị
vòng.
Giai đoạn này có sự tạo thành các polymer. Chúng có màu đậm và gọi tên là
melanoidin.

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Địa điểm, thời gian

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp
và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ 02/02/2009 đến 05/05/2009.
3.1.2 Nguyên liệu

- Gạo nếp trắng CK 2003 được mua ở chợ Xuân khánh - Thành phố Cần thơ.
- Bột mì Hoha Flour của công ty Hồng Hà - Thành phố Cần Thơ.
- Nấm men Saccharomyces cerevisiae của S.I.Lesaffre - Pháp
- Chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L, Termamyl 120L, AMG 300L của hãng
Novo nordisk.
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị

 Máy nghiền búa, waterbath, bếp điện, nồi nấu, cân, chiết quang kế, nhiệt kế, pH
kế
 Một số dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm: ống nghiệm, ống đong,
phễu, pipet, micropipet, buret…
3.1.4 Hóa chất

 Acid citric và Na2CO3 dùng để chỉnh pH
 NaOH chuẩn 0,01N, formol và các hóa chất khác…
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

 Gạo nếp phải được lựa chọn thật kĩ, không lẫn gạo, màu trắng đục và có hương
thơm tự nhiên
 Bột mì phải có màu trắng đẹp, không bị mốc hoặc vón cục, phải còn hạn sử
dụng
 Mẫu phải được mua một lần cho tất cả các thí nghiệm để hạn chế sai số. Trong
quá trình thí nghiệm mẫu phải được bảo quản thật tốt
 Mẫu các enzyme và nấm men được mua tại cửa hàng hóa chất TP-Cần Thơ.
3.2.2 Phương pháp thực hiện

Thí nghiệm được bố trí với 1 hoặc 2 nhân tố với 2 lần lặp lại. Kết quả thí nghiệm
được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Plus 4.0.

3.2.3 Quy trình sản xuất thử nghiệm rượu vang nếp trắng
Phối trộn nếp trắng nghiền mịn và bột mì
Pha nước tỉ lệ 1 nếp : 4 nước
Thủy phân protein
Dịch hóa
Đường hóa
Lọc bỏ bã nếp
(Chỉnh pH: 4,5-5,0, độ Bx = 22)
Thanh trùng (NaHSO3, 122mg/lít)
Làm nguội (30-330C)
Bổ sung nấm men (0,1%)
Lên men (5 ngày)
Chiết rút
Sản phẩm

3.2.4 Thuyết minh một số công đoạn trong quy trình

Nghiền
Gạo nếp trắng sau khi được làm sạch sẽ đem đi nghiền mịn. Mục đích quá trình
nghiền, giúp cho tinh bột và một số chất khô khác dễ hòa tan vào nước trong quá
trình dịch hóa.
Sử dụng chế phẩm enzyme Neutrase 0.8L để thủy phân các protein trong nguyên
liệu thành các acid amin.
Dịch hóa
Sử dụng chế phẩm enzyme Termamyl 120L để hóa hồ tinh bột. Mục đích của quá
trình dịch hóa là thủy phân tinh bột thành đường và các dextrin phân tử thấp, làm
giảm độ nhớt của dịch đường.
Đường hóa
Sau quá trình dịch hóa, tinh bột chưa được thủy phân hoàn toàn thành đường đơn.
Mục đích của quá trình đường hóa là thủy phân tinh bột hoàn toàn thành đường
đơn, giúp tăng hiệu suất quá trình lên men.
Thanh trùng
Tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm để chúng không thể cạnh tranh với sự phát triển
của nấm men.
Làm nguội
Hỗn hợp sau khi thủy phân tinh bột có nhiệt độ khá cao. Nấm men phát triển tốt ở
nhiệt độ khoảng 30 – 300C. Vì vậy ta phải làm nguội hỗn hợp xuống để tạo môi
trường thuận lợi cho nấm men phát triển.
Lên men
Tiến hành lên men ở nhiệt độ thường, thời gian này có hai quá trình xảy ra song
song với các mức độ khác nhau, đó là quá trình tăng sinh khối của nấm men và quá
trình sinh rượu.
Chiết rút
Mục đích loại bỏ bã nấm men, giúp rượu trong và ổn định hơn.
3.2.5 Bố trí thí nghiệm

a) Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính protease
trong quá trình thủy phân protein

Mục đích thí nghiệm: Tìm ra pH và nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
protein.
Chuẩn bị mẫu:
Bột mì, gạo nếp trắng, nước để pha loãng.
Chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L.
Dung dịch chỉnh pH.
Sơ đồ tiến hành thí nghiệm:
Mẫu nếp trắng xay nhỏ
Trộn nếp xay nhỏ và bột mì (theo tỉ lệ 7:3),

pha loãng hỗn hợp với nước (theo tỉ lệ 1:4)
Chỉnh pH theo các mức khảo sát,

nâng nhiệt độ lên mức cần khảo sát
Bổ sung 0,05% Neutrase 0.8L,

giữ mẫu trong 20 phút
Bổ sung 0,05% Termamyl 120L,

(Nguyễn Thị Giang Thanh, 2008)
nâng nhiệt lên 850C trong 5 phút
Làm nguội và xác định lượng acid amin sinh ra
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid amin sinh ra trong dịch thủy phân.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 2 nhân tố và 2 lần lặp lại.
Nhân tố cố định: thời gian thủy phân và nồng độ enzyme.
Nhân tố A: pH môi trường thủy phân.
A1: 5,5 A2: 6,0 A3: 6,5 A4: 7,0 A5: 7,5 A6: 8

Nhân tố B: Nhiệt độ thủy phân (0C)

B1: 30 (0C) B2: 40 (0C) B3: 50 (0C) B4: 60 (0C) B5: 70 (0C)
Tổng nghiệm thức: 6 x 5 = 30
Số đơn vị thí nghiệm: 30 x 2 = 60
A1 A2 A3 A4 A5 A6
B1 B2 B3 B4 B5 B1 B2 B3 B4 B5 B1 B2 B3 B4 B5
B1 B2 B3 B4 B5 B1 B2 B3 B4 B5 B1 B2 B3 B4 B5
Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ
lên hoạt tính của protease trong quá trình thủy phân protein
b) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease và thời gian
lên khả năng thủy phân protein
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme protease và thời gian thích hợp cho
quá trình thủy phân protein.
Chuẩn bị mẫu:
Chế phẩm enzyme Neutrase 0,8L.
Dung dịch đệm chỉnh pH.



Pha loãng hỗn hợp với nước (theo tỉ lệ 1:4)
Chỉnh pH về mức tìm được ở thí nghiệm trên,

nâng nhiệt độ lên mức tìm được ở thí nghiệm trên
Bổ sung Neutrase 0,8L ở những nồng độ cần khảo sát,

giữ mẫu ở những khoảng thời gian cần khảo sát
Bổ sung 0,05% Termamyl 120L,

nâng nhiệt lên 850C trong 5 phút.
Làm nguội và xác định lượng acid amin sinh ra
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng acid amin sinh ra trong dịch thủy phân.
Nhân tố cố định: Nhiệt độ, pH của dịch thủy phân.
Nhân tố C: Nồng độ protease.
C1: 0,04 (%) C2: 0,06 (%) C3: 0,08 (%) C4: 0,1 (%)
Nhân tố D: Thời gian thủy phân.
D1: 20 phút D2: 30 phút D3: 40 phút D4: 50 phút

C1 C2 C3 C4
D1 D2 D3 D4 D1 D2 D3 D4 D1 D2 D3 D4 D1 D2 D3 D4
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ
c) enzyme và thời gian thủy phân protein
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời
gian lên khả năng đường hóa dịch tinh bột
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích
hợp cho quá trình đường hóa.
Chuẩn bị mẫu:
Chế phẩm enzyme AMG 300L.

Dịch hóa
(0,05% Termamyl 120L, 70ppm Ca2+, thời gian 30 phút,
pH 6,6, nhiệt độ 860C)
Làm nguội,
chỉnh pH 4,0 và nhiệt độ 690C

Bổ sung AMG 300L ở những nồng độ cần khảo sát,

giữ mẫu ở những khoảng thời gian cần khảo sát
Nâng nhiệt lên 850C trong 5 phút.
Làm nguội và xác định lượng đường khử sinh ra
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân.
Nhân tố cố định: Nhiệt độ, pH.
Nhân tố E: Nồng độ enzyme glucoamylase (%).
E1: 0,1 (%) E2: 0,2 (%) E3: 0,3 (%) E4: 0,4 (%) E5: 0,5 (%)
Nhân tố F: Thời gian thủy phân.
F1: 20 phút F2: 30 phút F3: 40 phút
E1 E2 E3 E4 E5
F1 F2 F3 F1 F2 F3 F1 F2 F3 F1 F2 F3 F1 F2 F3
Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ
enzyme và thời gian thủy phân đến hiệu suất đường hóa
d) Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ gạo nếp và bột mì đến màu sắc sản
phẩm .
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra tỉ lệ bột mì và gạo nếp trắng thích hợp cho sản
phẩm có màu sắc được ưa thích.
Chuẩn bị mẫu:


Enzyme
Nấm men

Phối trộn nếp trắng nghiền mịn và
bột mì theo tỉ lệ cần khảo sát
Dịch hóa
Đường hóa
Lọc bỏ bã nếp
(Chỉnh pH: 4,5-5,0, độ Bx = 22)
Thanh trùng(NaHSO3, 122mg/lít)
Làm nguội (30-330C)

Bổ sung nấm men (0,1%)
Lên men (5 ngày)

Chiết rút
So màu

Chỉ tiêu theo dõi: So màu các mẫu với tỉ lệ phối trộn khác nhau.
Nhân tố H: Tỉ lệ giữa bột mì và gạo nếp trắng (%).
H1: 0 : 100 H2: 5 : 95 H3: 10 : 90 H4: 15 : 85 H5: 20 :80
H6: 25:75 H7: 30 : 70
Tổng nghiệm thức: 1 x 7 = 7 nghiệm thức.
Số đơn vị thí nghiệm: 7 x 2 = 14 đơn vị.
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7
Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ gạo nếp
trắng và bột mì đến màu sắc sản phẩm

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT
TÍNH PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN
Nhiệt độ và pH là hai yếu tố tác động mạnh đến hoạt tính của enzyme:
Nhiệt độ tác động đến hoạt tính của enzyme qua hai hiện tượng: làm hoạt hóa các
phản ứng hóa học và làm biến tính protein dẫn đến vô hoạt enzyme. Khi nhiệt độ
tăng lên thì vận tốc của một phản ứng hóa học tăng lên đồng thời enzyme cũng
chịu tác động của nhiệt. Khi năng lượng mà chúng thu được đủ để thắng các tương
tác yếu vốn quyết định cấu trúc protein hình cầu sẽ dẫn đến protein bị thay đổi
hình thể và làm giảm hoạt tính của enzyme.
Tất cả các enzyme đều nhạy cảm với pH của môi trường. Hoạt tính của enzyme đạt
cực đại ở vùng enzyme pH nhất định. Thật vậy, enzyme là protein do các acid
amin kết hợp tạo nên. Khi pH thay đổi sẽ tác động đến các acid amin này và làm
thay đổi hoạt tính của enzyme.
(Đặng Thị Thu và ctv., 2004)
Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại cơ chất mà enzyme sẽ có khoảng nhiệt độ và pH tối
ưu khác nhau. Vì vậy thí nghiệm tiến hành thủy phân protein trong hỗn hợp nếp và
bột mì bằng enzyme protese ở những nhiệt độ và pH khác nhau, nồng độ và thời
gian thủy phân được cố định. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.1,
Hình 4.1 và Hình 4.2.
Bảng 4.1 Hàm lượng nitơ amin thu được sau quá trình thủy phân hỗn hợp bột
bằng enzyme protease ở mức nhiệt độ và pH khác nhau
pH Trung bình
Nhiệt độ 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 (Nhiệt độ)
30 (0C) 0,0406 0,0420 0,0420 0,0602 0,0462 0,0364 0,0481C
40 (0C) 0,0574 0,0616 0,0644 0,0672 0,0602 0,0504 0,0602B
50 (0C) 0,0700 0,0854 0,0994 0,0910 0,0700 0,0630 0,0798A
60 (0C) 0,0574 0,0882 0,0980 0,0602 0,0504 0,0420 0,0660B
70 (0C) 0,0238 0,0420 0,0504 0,0392 0,0378 0,0238 0,0362D
Trung bình 0,0498cd 0,0638b 0,0750a 0,0636b 0,0529c 0,043d
(pH)
Ghi chú: Các số mang chữ số mũ khác nhau cùng một cột (hoặc hàng) sai khác có ý
nghĩa thống kê(P < 0,05) theo phép thử LSD

Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại.
0,12
Lượng nito amin tạo thành (g/l)
0,10
5,5
0,08
6,0
0,06 6,5
7,0
0,04 7,5
8,0
0,02
0,00
30 40 50 60 70
Nhiệt độ (0C)
(0C)
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt
tính của protease đến khả năng thủy phân protein
Hình 4.2 Đồ thị không gian 3 chiều và contour biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ
và pH lên hoạt tính của protease đến khả năng thủy phân protein.
Kết quả ở hình 4.1 và hình 4.2 cho thấy lượng nitơ amin sinh ra tăng dần ở các
mức nhiệt độ 30, 40 và 500C sau đó giảm dần đến các mức nhiệt độ 60 và 700C.
Trong đó lượng nitơ amin tạo ra ở mức 500C là cao nhất và mức 700C là thấp nhất.

Xét về mặt thống kê, lượng nitơ amin tạo ra ở mức nhiệt độ 40 và 600C khác biệt
không có ý nghĩa (bảng 4.1).
Các mức nhiệt độ 30, 40 và 500C chưa tác động nhiều đến khả năng hoạt độ của
enzyme, lượng nitơ amin sinh ra tăng lên là do tốc độ của phản ứng hóa học tăng
lên. Ở mức nhiệt độ 60 và 700C tốc độ phản ứng hóa học cũng tăng lên nhưng
protein bắt đầu bị biến tính làm cho hoạt độ của enzyme giảm, dẫn đến lượng nitơ
amin sinh ra giảm.
Ngoài ra, hình 4.1 và hình 4.2 cho thấy ở mức pH 6,5 lượng nitơ amin sinh ra cao
nhất. Lượng nitơ amin giảm dần theo thứ tự pH 6,0, 7,0, 7,5, 5,5 và 8,0. Về mặt
thống kê chỉ có ở mức pH 6,0 so với 7,0 pH 5,5 so với pH 7,5 và 8,0 thì khác biệt
không có ý nghĩa.
Mỗi enzyme có một vùng pH mà hoạt độ của enzyme đạt cực đại, hoạt độ của
enzyme sẽ giảm dần khi pH môi trường vượt ra xa vùng pH đó. Qua kết quả ở trên
pH 6,5 là giá trị pH tối thích của enzyme protease, ngoài giá trị pH trên thì enzyme
bị tác động và làm giảm hoạt tính.
Tóm lại, từ kết quả của thí nghiệm 1 enzyme hoạt động mạnh ở giá trị pH 6,5 và
nhiệt độ 500C. Kết quả của thí nghiệm này sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp
theo.
PROTEASE VÀ THỜI GIAN LÊN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN
Thí nghiệm tiến hành thủy phân protein ở những thời gian và nồng độ khác nhau,
giá trị pH và nhiệt độ được lấy theo thí nghiệm 1. Kết quả thí nghiệm được thể
hiện trong bảng 4.2, hình 4.3.

Bảng 4.2 Hàm lượng nitơ amin thu được sau quá trình thủy phân tinh bột
bằng enzyme protease ở các nồng độ và thời gian khác nhau
Nồng độ protease (%) Trung bình
Thời gian 0,04 0,06 0,08 0,10 (Thời gian)
thủy phân (phút)
20 0,0672 0,0784 0,0924 0,0952 0,0833C
30 0,0938 0,1092 0,1162 0,1176 0,1092B
40 0,1120 0,1176 0,1204 0,1218 0,1180A
50 0,1176 0,1204 0,1232 0,1232 0,1211A
Trung bình 0,0977c 0,1064b 0,1131a 0,1145a
(Nồng độ)
0,14
Lượng niito amin tạo thành (g/l)
0,12
0,10 0,04
0,06
0,08
0,08
0,06
0,10
0,04
0,02
0,00
20 30 40 50
Thời gian (phút)
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease
và thời gian lên khả năng thủy phân protein

Kết quả ở hình 4.3 cho thấy lượng nitơ amin sinh ra tăng dần ở các giá trị nồng độ
0,04, 0,06, 0,08 và 0,1%. Đồng thời lượng nitơ amin cũng tăng dần ở những thời
gian 20, 30, 40 và 50 phút. Xét về mặt thống kê lượng nitơ amin sinh ra ở nồng độ
0,08 và 0,1%, thời gian 40 và 50 phút khác biệt không có ý nghĩa.
Nồng độ enzyme tăng lên làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Khi
đó lượng cơ chất sẽ giảm nhanh hơn, lượng sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Nếu
tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên nữa thì lượng sản phẩm tạo ra không tăng, lúc đó
lượng cơ chất đã được thủy phân hết. Qua kết quả thí nghiệm ở mức nồng độ
enzyme 0,08% protein đã gần như chuyển thành các acid amin nên khi tăng nồng
độ enzyme lên 0,1% thì lượng nitơ amin sinh ra tăng không đáng kể.
Ngoài ra, thời gian thủy phân cũng ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm sinh ra.
Thời gian kéo dài sẽ làm cho lượng cơ chất bị phản ứng nhiều hơn, khi lượng cơ
chất hết thì lượng sản phẩm tạo ra không tăng nữa. Kết quả thí nghiệm trên cho
thấy ở thời gian 40 phút thì protein đã gần như chuyển hết thành các acid amin nên
khi thời gian có kéo dài đến 50 phút thì lượng nitơ amin tạo ra không đáng kể.
Tóm lại, chọn nồng độ 0,08% và thời gian 40 phút là giá trị tối ưu của thí nghiệm
vì lượng nitơ amin tăng không đáng kể ở nồng độ 0,1% và thời gian 50 phút.
GLUCOAMYLASE VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN HIỆU SUẤT
ĐƯỜNG HÓA
Quá trình đường hóa rất quan trọng trong quá trình sản xuất rượu. Nếu quá trình
đường hóa xảy ra không hoàn toàn nghĩa là lượng đường đa chưa chuyển hóa hết
thành đường đơn thì sẽ ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men rượu. Lượng đường
khử tạo ra càng nhiều thì quá trình lên men càng diễn ra mạnh mẽ hơn. Ngoài ra
quá trình thủy phân diễn ra không hoàn toàn thì nó không có lợi về mặt kinh tế.
Nhằm tìm ra những thông số để quá trình đường hóa diễn ra một cách triệt để, thí
nghiệm tiến hành khảo sát các nồng độ enzyme và thời gian thủy phân tinh bột
khác nhau. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong bảng 4.3, hình 4.4.

Bảng 4.3 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân tinh bột
bằng enzyme glucoamylase ở các nồng độ và thời gian khác nhau
Nồng độ( %) Trung bình
Thời gian 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 (Thời gian)
20 (phút) 10,06 11,26 11,49 12,01 12,28 11,42B
30 (phút) 13,01 14,21 14,81 15,41 15,86 14,66A
40 (phút) 13,48 14,36 15,22 15,67 15,61 14,87A
Trung bình 12,18d 13,27c 13,84b 14,36a 14,58a
(Nồng độ)
18
Lượng đường khử tạo thành(%)
16
14
0,1
12
0,2
10
8 0,3
6 0,4
4
0,5
2
0
20 30 40
Thời gian (phút)
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme
glucoamylase và thời gian thủy phân lên khả năng đường hóa tinh bột
Qua kết quả ở bảng 4.4, lượng đường khử tạo ra tăng dần từ các mức nồng độ 0,1,
0,2, 0,3, 0,4 và 0,5% và các mức thời gian 20, 30, 40 phút. Xét về mặt thống kê ở
nồng độ 0,4 và 0,5%, ở thời gian 30 và 40 phút thì khác biệt không có ý nghĩa.
Nồng độ enzyme tăng lên làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Khi
đó lượng cơ chất sẽ giảm do kết hợp với enzyme để tạo ra sản phẩm. Khi lượng
enzyme đủ lớn thì sản phẩm tạo ra không tăng nữa do lượng cơ chất đã được thủy

phân hết. Kết quả cho thấy ở nồng độ enzyme 0,4% tinh bột đã gần như chuyển
thành đường khử hết nên khi tăng nồng độ enzyme lên 0,5% lượng đường khử sinh
ra tăng không đáng kể.
Bên cạnh đó, thời gian thủy phân cũng ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm sinh ra.
Khi thời gian thủy phân kéo dài sản phẩm sinh ra tăng lên, nếu tiếp tục kéo dài thời
gian thủy phân thì sản phẩm sẽ không tăng nữa do lượng cơ chất bị phản ứng hết.
Kết quả thí nghiệm trên cho thấy ở mức thời gian thủy phân là 30 phút thì tinh bột
đã gần như chuyển thành đường khử nên khi kéo dài thời gian thủy phân đến 40
phút lượng đường khử tạo ra không đáng kể.
Tóm lại, ở nồng độ 0,4% và thời gian 30 phút được chọn là giá trị tối ưu của thí
nghiệm vì nồng độ 0,5% và thời gian 40 phút lượng đường khử tăng không đáng
kể.
4.4 THÍ NGHIỆM 4: ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ GẠO NẾP VÀ BỘT MÌ
ĐẾN MÀU SẮC SẢN PHẨM
Quá trình thủy phân tinh bột và protein trong nguyên liệu sẽ tạo thành đường khử
và các acid amin. Lượng đường khử sẽ tác dụng với các acid amin tạo thành hợp
chất melanoidin có màu nâu.
Phản ứng xảy ra trong quá trình lên men và cả trong quá trình bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm tồn trữ càng lâu sẽ có màu càng đậm.
Màu của sản phẩm rượu được bổ sung bột mì ở những tỉ lệ khác nhau và tồn trữ ở
nhiệt độ phòng 30 ngày kể từ ngày lên men được thể hiện ở hình 4.5.
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30%
Hình 4.5 Màu của các sản phẩm rượu được bổ sung bột mì ở những tỉ lệ
khác nhau
Hình 4.5 cho thấy mẫu không bổ sung bột mì (0%) có màu nhạt nhất, màu rượu
đậm dần khi tăng lượng bột mì bổ sung nhưng mẫu bổ sung bột mì 25 và 30% có
màu gần giống nhau.

Mẫu không bổ sung bột mì (0%) có màu nhạt nhất vì hàm lượng protein trong nếp
thấp hơn trong bột mì, lượng acid amin sinh ra ít. Khi tăng lượng bột mì bổ sung,
lượng acid amin sinh ra tăng lên, hợp chất melanoidin được tạo ra nhiều hơn.
Qua quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng rượu bổ sung bột mì càng nhiều
thì màu của rượu càng đậm nhưng khi bổ sung đến 30% bột mì thì màu gần giống
mẫu bổ sung 25% bột mì.

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 KẾT LUẬN
Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme vào sản xuất rượu đã được thực hiện.
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein và tinh bột đã được khảo
sát. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân protein của enzyme protease được đánh
giá dựa vào lượng acid amin sinh ra. Kết quả khảo sát khả năng đường hóa của
enzyme glucoamylase được đánh giá dựa vào lượng đường khử sinh ra. Ngoài ra,
đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nếp trắng và bột mì đến màu của sản phẩm.
Đề tài thu được các kết quả sau:
Quá trình thủy phân protein sử dụng chế phẩm enzyme protease: enzyme hoạt
động tốt nhất ở nhiệt độ 500C, pH 6,5, nồng enzyme là 0,08% và thời gian thủy
phân là 40 phút.
Quá trình đường hóa sử dụng kết hợp chế phẩm enzyme α-amylase và
glucoamylase: nồng độ enzyme và thời gian tối thích của glucoamylase là 0,4% và
30 phút.
5.2 ĐỀ NGHỊ
- Khảo sát động học phản ứng của enzyme protease trên cơ chất chuẩn
- Khảo sát sự biển đổi màu của rượu theo thời gian
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng dịch hóa của enzyme α-amylase
- Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và pH của enzyme glucoamylase đến hiệu suất
đường hóa.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

--------
Tiếng việt
Lý Nguyễn Bình (2007), Phụ gia trong chế biến thực phẩm, Đại học Cần Thơ.
Từ Giấy, Bùi Thị Thu Nhuận, Hà Huy Khôi, Bùi Minh Đức. (1994), Thành phần
dinh dưỡng thức ăn Việt Nam, NXB Y học.
Bùi Thị Quỳnh Hoa (2002), Bài giảng Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải
khát, Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Nguyệt, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu
Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công
nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Lương Đức Phẩm (2005), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Nguyệt, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu
Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công
nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thị Giang Thanh (2008), Ứng dụng các chế phẩm enzyme cải tiến quy
trình sản xuất rượu vang nếp than, Luận văn Thạc sĩ ngành Công nghệ Thực
phẩm, Đại học Cần Thơ.
Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phan Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm.
(2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật.
Nguyễn Thị Thu Thủy (2006), Bài giảng Sinh hóa, Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Thu Thủy (2008), Bài giảng Hóa sinh học Thực phẩm, Đại học Cần
Thơ.
Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2007), Công nghệ sản xuất và kiểm
tra cồn ethylic, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tiếng anh
Dale JK, Langlois DP. (1940). Sirup and method of making the same. United
States Patent. 2, 201-609.
Dunaway-Mariano. (2008). Enzyme function discovery.
Hizukuri S. (1996). Starch: Analytical Aspects. In: Carbohydrates in Food (A.C.
Eliasson, ed.), pp.347-429. Marcel Dekker inc. New York.

Munjunath P, Shenoy BC, and Raghavendra Rao MR. (1983) J. Appl. Biochem. 5,
235.
Novo nordisk (2005), AMG 300L.
Novo nordisk (2005), Neutrase for brewing.
Novo nordisk (2005), Termamyl 120L, Type L.
Oates CG (1997). Towards an understanding of starch granule structure and
hydrolysis. Trend Food Sci. Technol. 8, 375–382.
Payen A, Persoz JF. (1833). Mémoire sur la diastase, les principaux produits de ses
réactions, et leurs applications aux arts industriels. Ann. Chim. (Phys. ) 53, 73-
92.
Schenck FW. (1992). Starch hydrolysis products; an introduction and history. In:
Starch Hydrolysis Products; Worldwide Technology, Production, and
Applications (F.W. Schenck and R.E. Hebeda, eds.), pp.1-22. VCH Publishers,
New York.
Zobel HF (1988). Molecules to granules: A comprehensive starch review.
Starch/starke 40, 44 – 50.
Địa chỉ các trang web
www.biology.iastate.edu
www.fdlserver.files.wordpres.com
www.goldbamboo.com
www.landfood.ubc.ca
www.molecularexpressions.com
www.scripps.edu

PHỤ LỤC
***
A. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1. Xác định hàm lượng nitơ formol bằng phương pháp Sorense
 Nguyên tắc
Các acid amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tử do nhóm amino và
nhóm cacboxyl trung hòa lẫn nhau. Để xác định hàm lượng nitơ amin trong mẫu,
người ta tiến hành “khóa” nhóm amin bằng cách cho tác dụng với aldehyde formic,
khi đó nhóm cacboxyl trở nên tự do, có thể được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH
chuẩn với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.
R – CH – COOH + HCHO R – CH – COOH + H2O

NH2 N = CH2
R – CH – COOH + NaOH R – CH – COONa + H2 O

N = CH2 N = CH2
 Tiến hành
Cho 10ml aldehyde formic và 10ml nước cất vào bình tam giác 100ml, thêm vào 2
giọt phenolphtalein. Dùng dung dịch NaOH 0,1N trung hòa cho đến khi hỗn hợp
có màu hồng nhạt.
Thêm vào bình 10ml mẫu. Tiếp tục chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến
khi dung dịch có màu đỏ tươi. Đọc thể tích NaOH 0,1N dùng trung hòa mẫu.
 Tính toán kết quả
Số gam nitơ formol có trong một lít mẫu được tính theo công thức sau:
X g / l  
0,0014 * v *1000 * HSPL
 0,14 * v * HSPL
10
Trong đó:
0,0014: số gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1N
v: thể tích dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích (ml)
HSPL: hệ số pha loãng mẫu phân tích.
2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp BERTRAND
 Hoá chất sử dụng
Ngành Công nghệ thực phẩm xiii

NaOH 30%, 10%

Pb(CH3COO)2 30%
Na2SO4 bão hoà
Metyl xanh 1% trong nước
Fehling A (69.28g CuSO4 trong 1 lít nư ớc cất)
Fehling B ( 346g Kalinatritartraate và 100g NaOH trong 1 lít nư ớc cất)
Phenolphtalein 1% trong cồn
 Phương pháp xác định
- Vắt lấy dịch của cơm nếp (sau thời gian ủ mốc), đem cân khoảng 10-20g. Sau
đó đem trung hoà bằng NaOH với chất chỉ thị Phenolphtalein (đến màu hồng
nhạt bền trong 30giây).
- Khử tạp chất bằng 7ml Pb(CH3COO)2 30%. Để yên trong 5phút đến khi thấy
một lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn thì coi như đã khử xong. Loại
bỏ kết tủa chì dư bằng 20ml Na2SO4 bão hoà. Rồi đem lọc và pha loãng dịch
lọc.
- Cho vào bình tam giác (loại 300ml): 5ml fehling A + 5ml fehling B + 15ml
dịch
- lọc. Đem đốt trên bếp điện và chuẩn độ. Mỗi lần nhỏ 1ml dịch chuẩn rồi lắc
đến màu đỏ gạch không còn ánhh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ 1 giọt metyl
xanh vào dung dịch đang sôi, nếu thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch thì
kết thúc quá trình chuẩn độ.
- Đọc kết quả và tra bảng để tính hàm lượng đường theo công thức:
số tra bảng*HSPL*100
Hàm lượng đường khử (%) =
khối lượng mẫu*1000
(với HSPL là hệ số pha loãng dịch lọc)
Bảng 8. Bảng tra thể tích dung dịch chuẩn đường
Thể tích khối lượng thể tích khối lượng

15 336 33 156,06
16 316 34 152,2
17 298 35 147,09
18 282 36 143,9
19 267 37 140,2
Ngành Công nghệ thực phẩm xiv

20 54,5 38 136,6
21 242,9 39 133,3
22 231,8 40 130,1
23 222,2 41 127,1
24 213,3 42 124,2
25 204,8 43 121,4
26 197,4 44 118,7
27 190,4 45 116,1
28 183,7 46 113,7
29 177,6 47 111,4
30 171,7 48 109,2
31 166,3 49 107,1
32 161,2 50 105,1
B. KẾT QUẢ THỐNG KÊ THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm 1:
Analysis of Variance for nitơ formol - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:nhiet do 0.0134396 4 0.0033599 51.27 0.0000
B:pH 0.0066917 5 0.00133834 20.42 0.0000
RESIDUAL 0.00327686 50 0.0000655372

--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 0.0234081 59
--------------------------------------------------------------------------------
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for nitơ formol by nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent LSD
nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
70 12 0.0361667 X
30 12 0.0480667 X
40 12 0.0602 X
60 12 0.0660333 X
50 12 0.0798 X
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for nitơ formol by pH

--------------------------------------------------------------------------------
pH Count LS Mean Homogeneous Groups
Ngành Công nghệ thực phẩm xv

--------------------------------------------------------------------------------
8 10 0.04312 X
5.5 10 0.04984 XX
7.5 10 0.05292 X
7 10 0.06356 X
6 10 0.06384 X
6.5 10 0.07504 X
--------------------------------------------------------------------------------
Thí nghiệm 2:
Analysis of Variance for nitơ formol - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:nong do 0.0014139 3 0.000471298 21.61 0.0000
B:thoi gian 0.00705674 3 0.00235225 107.88 0.0000
RESIDUAL 0.000545125 25 0.000021805

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for nitơ formol by nong do
--------------------------------------------------------------------------------
nong do Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
0.04 8 0.09765 X
0.06 8 0.1064 X
0.08 8 0.11305 X
0.1 8 0.11445 X
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for nitơ formol by thoi gian
--------------------------------------------------------------------------------
thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
20 8 0.0833 X
30 8 0.1092 X
40 8 0.11795 X
50 8 0.1211 X
--------------------------------------------------------------------------------
Thí nghiệm 3
Analysis of Variance for ham luong duong khu - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:nong do 22.2616 4 5.56541 60.55 0.0000
B:thoi gian 74.9479 2 37.4739 407.71 0.0000
RESIDUAL 2.11399 23 0.0919126

--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for ham luong duong khu by nong do
Ngành Công nghệ thực phẩm xvi

--------------------------------------------------------------------------------
nong do Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
0.1 6 12.1833 X
0.2 6 13.275 X
0.3 6 13.8383 X
0.4 6 14.3633 X
0.5 6 14.585 X
--------------------------------------------------------------------------------
Multiple Range Tests for ham luong duong khu by thoi gian
--------------------------------------------------------------------------------
thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
20 10 11.417 X
30 10 14.66 X
40 10 14.87 X
--------------------------------------------------------------------------------
Ngành Công nghệ thực phẩm xvii

Nghiên Cứu Ứng Dụng Enzyme Vào Sản Xuất Rượu Vang Nếp Trắng: Huỳnh Phước Nghĩa

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Nghiên Cứu Ứng Dụng Enzyme Vào Sản Xuất Rượu Vang Nếp Trắng: Huỳnh Phước Nghĩa

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH PHƯỚC NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME VÀO SẢN

Luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, 2009

Luận văn tốt nghiệp

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME VÀO SẢN

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Cần Thơ, 2009

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009

Ngành Công nghệ thực phẩm i

Ngành Công nghệ thực phẩm ii

Ngành Công nghệ thực phẩm iii

Ngành Công nghệ thực phẩm iv

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................29

Ngành Công nghệ thực phẩm v

DANH SÁCH BẢNG

Ngành Công nghệ thực phẩm vi

DANH SÁCH HÌNH

Ngành Công nghệ thực phẩm vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Ngành Công nghệ thực phẩm 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1.1 Nếp trắng

Bảng 2.1 Thành phần hoá học của nếp

Thành phần Hàm lượng (%)

Ngành Công nghệ thực phẩm 2

phần khác vì các mục đích công nghệ như:

Thành phần Hàm lượng (%)

2.1.3 Nấm men

Hình 2.3 Saccharomyces

a) Hình dạng và kích thước

Thành phần Hàm lượng (%)

d) Nấm men trong sản xuất rượu từ tinh bột

Ngành Công nghệ thực phẩm 4

Ngành Công nghệ thực phẩm 5

Ngành Công nghệ thực phẩm 6

Hoạt độ của α-amylase (%) so với ban đầu

Hình 2.9 Cấu trúc của enzyme protease

Ngành Công nghệ thực phẩm 9

 Protease trung tính: pH 7-8

2.1.5 Các chế phẩm enzyme sử dụng

Ngành Công nghệ thực phẩm 10

Ngành Công nghệ thực phẩm 11

Màu sắc có thể thay đổi từ lô này sang lô khác

Ion Hàm lượng (mg/l)

Ngành Công nghệ thực phẩm 12

2.2.1 Tinh bột

Ngành Công nghệ thực phẩm 13

Hình 2.10 Cấu trúc Amylose

Hình 2.11 Cấu trúc của amylopectin

Ngành Công nghệ thực phẩm 14

Ngành Công nghệ thực phẩm 15

0 Nồng độ enzyme [E]

Ngành Công nghệ thực phẩm 16

Tốc độ phản ứng

Ngành Công nghệ thực phẩm 17

Ngành Công nghệ thực phẩm 18

Ngành Công nghệ thực phẩm 19

2.4.1 Khái quát về quá trình lên men rượu

Ngành Công nghệ thực phẩm 20

2.4.2 Cơ chế của quá trình lên men