Cá yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT

PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Mã số: NCST 2011-05
Chủ nhiệm đề tài
NCS. Trần Thanh Trúc
Cần Thơ, tháng 12/2011

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT

PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Mã số: NCST 2011-05
Xác nhận của trường Đại học Cần Thơ Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)
Cần Thơ, tháng 12/2011

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI
1. NCS Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp
& Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2. PGs. Ts Nguyễn Văn Mười, Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông
nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
3. Ts Nguyễn Văn Thành, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Cần Thơ
4. Nguyễn Tấn Đạt, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa
15, Trường Đại học Cần Thơ.
5. Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ
uống Khóa 17, Trường Đại học Cần Thơ.
6. Vương Tố Trinh, Học viên Cao học Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Khóa
17, Trường Đại học Cần Thơ.
Báo cáo đề tài NCKH Cấp Trường Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
MỤC LỤC
i
DANH SÁCH HÌNH...............................................................................................................iv
DANH SÁCH BẢNG...............................................................................................................v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................................................................vi
THUẬT NGỮ..........................................................................................................................vi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI..........................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU....................................................................................1
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU....................................................................................1
1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................................................................2
1.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI..................................2
PHẦN 2 ..............................................................................................................................3
Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..................................................................................3
2.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE..............................................3
2.1.1 Khái quát chung...................................................................................................3
2.1.2 Đặc tính sinh lý của enzyme PME........................................................................3
2.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên........................................................................4
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME........................................6
2.1.5 Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm.......................................8
2.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER.......10
2.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE...................11
2.3.1 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết tủa...............11
2.3.2 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme........................................13
2.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT ĐIỆN
DI ..................................................................................................................................13
2.5 ĐỘNG HỌC ENZYME.........................................................................................14
2.5.1 Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học...............................................................14
2.5.2 Động học phản ứng enzyme...............................................................................15
2.5.3 Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme..............................................17
Trang i
2.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN.......................................................................20

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................23
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU..........................................................................23
3.1.1 Địa điểm, thời gian.............................................................................................23
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................23
3.1.3 Thiết bị, hoá chất................................................................................................23
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM..........................................................................24
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu...............................................................................24
3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả.........................................................24
3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................................25
3.3.1 Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến
khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger......................................................................25
3.3.2 Thí nghiệm 2. Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme PME từ A. niger bằng
phương pháp lọc màng....................................................................................................26
3.3.3 Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt tính
enzyme PME từ A. niger..................................................................................................27
3.3.4 Thí nghiệm 4. Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger theo
nhiệt độ28
3.3.5 Thí nghiệm 5. Động học sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger...........28
3.3.6 Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính enzyme
PME từ A. niger...............................................................................................................29
3.3.7 Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính enzyme
PME từ A. niger...............................................................................................................30
3.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU.........................................31
Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................................32
4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT VÀ TỶ LỆ SỬ DỤNG ĐẾN KHẢ
NĂNG KẾT TỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER..................................32
4.1.1 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng (NH4)2SO4....
32
4.1.2 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng NaCl........34
4.1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng dung môi hữu cơ đến khả năng kết tủa enzyme
PME từ A. niger...............................................................................................................35
Trang ii
4.1.4 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lọc màng
............................................................................................................................37
4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ PECTIN ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PME
TỪ ASPERGILLUS NIGER..............................................................................................39
4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN
METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER......................................................41
4.4 ĐỘNG HỌC SỰ VÔ HOẠT NHIỆT CỦA PECTIN METHYLESTERASE
TỪ ASPERGILLUS NIGER..............................................................................................42
4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA Ph ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PECTIN
METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER......................................................44
4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACL VÀ CACL 2 ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER......................................45
4.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger.......45
4.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger......46
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................................48
KẾT LUẬN.........................................................................................................................48
ĐỀ NGHỊ............................................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................49
PHỤ LỤC ............................................................................................................................xii
Trang iii
CHƯƠNG 1 DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME....2
Hình 2: Phức hợp pectate calcium.............................................................................................7
Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả.................................8
Hình 4: Nấm mốc A. niger.........................................................................................................9
Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein............................................11
Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc một.......................................................16
Hình 7: Hình minh họa động học theo phản ứng chuyển đổi một phần..................................17
Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng của nhiệt đến hằng số tốc độ phản ứng............................18
Hình 9: Thiết bị lọc màng........................................................................................................26
Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu enzyme PME từ A. niger.................37
Hình 11: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger...................39
Hình 12: Phương trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger.......................42
Trang iv
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật.........................4
Bảng 2: Thông số động học Km của một số enzyme................................................................15
Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu............................................................23
Bảng 4: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4.............31
Bảng 5: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với NaCl.....................33
Bảng 6: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với ethanol..................34
Bảng 7: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với aceton...................34
Bảng 8: So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng các loại hóa chất khác nhau.............35
Bảng 9: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME từ A. niger sau quá trình lọc màng........................36
Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger..................39
Bảng 11: Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger do ảnh hưởng của nhiệt độ............40
Bảng 12: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt enzyme PME từ A. niger........42
Bảng 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger..............................43
Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger...................45
Bảng 15: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger..................45
Trang v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A. niger Aspergillus niger

A. awamori Aspergillus awamori
A. aculeatus Aspergillus aculeatus
Cfu Colony forming unit (số khuẩn lạc)
DE Degree of esterification (độ ester hóa)
PE Pectin esterase
PG Polygalacturonase
PL Pectat lyase
PME Pectin methylesterase
SSF Solid state fermentation (lên men rắn)
U Đơn vị hoạt tính enzyme
THUẬT NGỮ
Pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger: enzyme PME được thu nhận từ
quá trình trích ly sinh khối nấm mốc sau Aspergillus niger quá trình lên men rắn hay
lỏng, Aspergillus niger ở các điều kiện lên men thích hợp.
Trang vi

Đơn vị: Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung

Tên đề tài: Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin methylesterase từ
Aspergillus niger
Mã số: NCST 2011 - 05
Chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Thanh Trúc Tel.: 0710.3831530 (8309)
E-mail: tttruc@ctu.edu.vn
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Cần Thơ
Thời gian thực hiện: 8 tháng (từ tháng 01. 5. 2011 đến tháng 31. 12. 2011)
2. Mục tiêu
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian gia nhiệt, pH, nồng độ
NaCl, nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A.niger.
3. Tính mới và sáng tạo
Pectin methylesterase (PME) là enzyme có ứng dụng quan trọng trong lãnh vực chế
biến rau, củ, quả; đặc biệt trong cải thiện cấu trúc nguyên liệu. Tuy nhiên, nghiên cứu
ứng dụng của enzyme này tại Việt Nam vẫn còn là một khái niệm mới mẻ, đồng thời
giá nhập ngoại của enzyme này rất cao. Việc xác định tính chất cơ bản của enzyme
này sau tiến trình sinh tổng hợp PME từ A. niger có ý nghĩa ứng dụng cao.
4. Kết quả nghiên cứu
Kết quả thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme PME thô từ A. niger bằng ethanol với tỷ
lệ 3:1 (v/v) là tốt nhất, thể hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mgprotein, hiệu suất thu hồi
91,48% và độ tinh sạch tăng gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với
ethanol, tiến hành lọc màng ở khoảng phân đoạn 50 kDa thu được enzyme PME có
hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mgprotein, độ tinh sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với
mẫu enzyme thô. Enzyme PME từ A. niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa,
hằng số Michealis–Menten (Km) của enzyme PME đạt được là 0,6668 ± 0,0379 g/L.
Hoạt tính của enzyme PME từ A. niger thể hiện cao nhất ở 40 oC, pH môi trường 5,0.
CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của enzyme PME từ
Trang vii
A. niger. Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của enzyme PME tuân theo phương trình bậc 1
chuyển đổi một phần với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70 oC.
5. Sản phẩm
- Các thông số cơ bản về tính chất của PME thu nhận từ A. niger.
- Các kết quả về đào tạo đã được thực hiện thông qua nghiên cứu:
+ Có 1 bài báo được đăng
Nguyễn Văn Mười, Nguyễn Tấn Đạt, Nguyễn Ngọc Huỳnh Trân, Vương Tố Trinh và
Trần Thanh Trúc (2010). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính pectin
methylesterase từ Aspergillus niger. Kỷ yếu hội nghị khoa học: Phát triển nông
nghiệp bền vững thích ứng với sự biến đổi khí hậu, 26/11/2010, phần II, NXB
Nông Nghiệp, trang 92-101..
+ 1 luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ ngành Công nghệ thực phẩm và Đồ uống
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
Hỗ trợ cho việc đào tạo Nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học
Tài liệu giảng dạy ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ thực phẩm
& Đồ uống.
Ngày tháng năm 2011

Xác nhận của Trường Đại học Cần Chủ nhiệm đề tài
Thơ (ký, họ và tên)
(ký, họ và tên, đóng dấu)
Trang viii
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information
Project Title: Factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus

niger.
Code number: NCST 2011 - 05
Coordinator: MsC. Tran Thanh Truc Tel: 0710.3831530 (8309)
E-mail: tttruc@ctu.edu.vn
Implementing Institution: Can Tho University
Duration: from 01/05/2011 to 31/12/2011
2. Objectives
To find out factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus niger:
temperature, time, pH and role of NaCl and CaCl2.
3. Creativeness and innovativeness
Pectin methylesterase (PME) has important applications in the field of processed

vegetables and fruits, especially in improving the structure of materials. However,
research and application of this enzyme in Vietnam has been still a new concept,
while imported prices of this enzyme is very high. Determination the basic fators of
this enzyme from biosynthesis A. niger PME has great significance of appliccation .
4. Results obtained
The result showed that, ethanol was the suitable precipitant for PME purification.
Firstly, cold ethanol was added to the crude enzyme solution with the ratio of 3: 1
(v/v) for PME precipitation. In this case, specific activity of PME was 10.02
U/mgprotein,the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield
obtained 91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity
of PME reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89
fold in comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme
was found to be 43 kDa and Michealis–Menten constant Km was 0.6668 ± 0.0379 g/L.
In addition, temperature and pH optimum of A. niger PME were 40 oC and 5.0,
respectively. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl or CaCl 2. Isothermal
inactivation of partial purified A. niger PME could be described by a fractional–
conversion model and the inactivation rate constants increase with increasing
temperatures from 50 to 70 oC.
Trang ix
The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field of
biotechnology. Based on experimental data, the optimal fermentation condition can be
determined.
5. Products
Some parameters of characteristic A.niger PME

Papers were submitted:
Nguyen Van Muoi, Nguyen Tan Dat, Nguyen Ngoc Huynh Tran, Vuong To Trinh and
Tran Thanh Truc, 2010. Factors effect to activity of pectin methylesterase from
Aspergillus niger. Proceedings of Conference: Development of sustainable
agricultural techniques for adapting to climate change, part II, The Agricultural
Publishing House, 92-101pp.
One master students of Food technology and Drinking.
6. Effects, technology transfer means and applicability
This supplied to the PhD Thesis in the filed of Microbiology.
The studied resutls can be applied in teaching and researching in the field of
biotechnology, microbiology and food technology & drinking.
Trang x
CHƯƠNG 2 PHẦN 1. MỞ ĐẦU
2.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong vài thập kỷ trở lại đây,
các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong
các lĩnh vực kinh tế. Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, điều khiển hoạt động PME
đóng vai trò hết sức quan trọng, cụ thể là trong sản xuất nước quả citrus đục (Nath &
Ranganna, 1977), giúp tăng độ nhớt trong sản xuất nước quả và puree cà (Nath et al.,
1983), hoặc góp phần cải thiện cấu trúc và độ cứng chắc trong quá trình chế biến một
số loại rau quả (Pilnik & Voragen, 1993).
Hiện nay vi sinh vật là nguồn cung cấp enzyme chủ yếu do những ưu điểm như tốc độ
sinh sản nhanh, nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ thu hồi, cùng lúc thu được nhiều loại
enzyme... (Favelar - Torres et al., 2006). Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy sinh enzyme
PME từ A. niger cũng như các loại vi sinh vật khác, sản phẩm thu được là một hỗn
hợp protein gồm rất nhiều enzyme. Hầu hết các enzyme pectinase thương mại được sử
dụng trong quá trình chế biến hiện nay đều là hỗn hợp pectin methylesterase, pectin
acetylesterase và rhamnogalacturonan acetylesterase; polygalacturonase,
rhamnogalacturonan hydrolase, và pectate lyase; pectin lyase và rhamnogalacturonan
lyase (Benen et al., 2003). Mặt khác, PME là enzyme khởi đầu cho quá trình thủy
phân pectin, tạo điều kiện cho các enzyme còn lại của hệ enzyme pectinase hoạt động.
Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng PME độc lập vào từng loại sản phẩm cụ thể
nhằm mang lại hiệu quả như mong muốn.
Do vậy, quá trình tinh sạch enzyme thô cần được tiến hành nhằm thu được enzyme
PME thuần nhất, có hoạt tính cao. Bên cạnh đó, đặc tính của enzyme và động học sự
vô hoạt enzyme cũng có vai trò đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng
enzyme.
2.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ pectin
methylesterase từ A. niger, đồng thời xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme thu được.
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết
tủa và lọc màng trước khi xác định các tính chất cơ bản.
- Xác định hằng số Michaelis-Menten của enzyme PME từ A. niger.
Trang 0
- Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger theo nhiệt độ và pH môi
trường.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại từ 3 lần. Kết quả của các thí nghiệm so
sánh, chọn nghiệm thức tối ưu được thống kê và phân tích theo chương trình
Stagraphic 4.0. Các biến đổi động học được phân tích theo chương trình Prism 5.0.
Các kết quả được phân tích, đo đạc bằng các thiết bị hiện đại: điện di, máy quang phổ,
sử dụng phương pháp phân tích tin cậy.
2.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài sẽ được tiến hành với enzyme pectin methylesterase (PME) đã được lên men
rắn từ Aspergillus niger, sử dụng bã táo ta. Enzyme PME sau khi trích ly từ nấm mốc
A. niger sẽ được kết tủa với dung dịch ethanol theo tỉ lệ 1 : 3 và ly tâm sau 2 giờ để
thu lấy phần kết tủa. Làm khô kết tủa trong tủ lạnh khoảng 1 ngày trước khi hòa tan
trong dung dịch đệm citrate/phosphate ở pH 4,5 để hòa tan kết tủa. Dựa trên nghiên
cứu đã thực hiện của nhóm tác giả và các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước có
liên quan đến đề tài, tiến hành thí nghiệm khảo sát đặc điểm enzyme.
Trang 1
PHẦN 2
CHƯƠNG 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
3.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE

3.1.1 Khái quát chung
Enzyme pectin methylesterase (PME) còn được gọi là pectin esterase (PE), được đánh
số trong hệ thống phân loại là (EC 3.1.1.11). Enzyme PME thuộc nhóm enzyme
pectinase, nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân pectin. Enzyme PME chủ yếu thủy
phân trên các nhóm methylester nằm kề đơn vị không bị este hóa của D–galacturonan
tạo thành acid pectinic và methanol (Willats et al., 2001). Tuy nhiên, PME không thể
phản ứng trên các pectin ester hóa bởi nhóm ethyl, propyl hoặc methyl aginate.
Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết methyl ester của pectin với xúc tác của enzyme PME
Nguồn: Rexova–Benkova et al., 1976
Hầu hết các PME nguồn gốc thực vật thủy phân liên kết ester của pectin từ đầu khử
hoặc đầu không khử, hoặc gần với nhóm carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng
cơ chế chuỗi đơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Bởi vì hoạt động cần có nhóm carboxyl
tự do trên mạch galacturonic nên PME từ thực vật hoạt động kém trên các cơ chất
pectin có độ ester hóa cao hơn 20 30% (Willats et al., 2006). Ngược lại, PME từ nấm
mốc Aspergillus có thể thuỷ phân ngẫu nhiên các nhóm methylester trên chuỗi
D–galacturonan (Ishii et al., 1979; Limberg et al., 2000). Các pectin đã bị khử ester
hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của ion canxi giúp cho thành tế bào trở nên cứng
chắc hơn (Micheli, 2001).
3.1.2 Đặc tính sinh lý của enzyme PME
Enzyme PME có phân tử khối trung bình vào khoảng 25 ÷ 54 kDa và điểm đẳng điện
pI khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc sản xuất ra chúng (Benen et al., 2003). Hầu hết
PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trường hợp có PME
có tính acid. Điểm đẳng điện của PME từ nấm mốc và từ cà chua lần lượt là 3,1 và 11
(Bordenave, 1996).
Trang 2
Việc xác định các tính chất đã cho thấy có sự khác biệt giữa PME từ thực vật và vi
sinh vật, thậm chí PME trích ly từ các bộ phận khác nhau, ở các giai đoạn phát triển
khác nhau của cây cũng khác nhau (Bordenave et al., 1993).
Nhìn chung, hoạt động của PME rất nhạy cảm đối với các yếu tố của môi trường như
nhiệt độ, pH, cation, anion,... Enzyme PME thường được hoạt hóa bởi các cation như
Na+, Ca2+ và Mg2+. Hầu hết PME thực vật có pH tối ưu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH
tối ưu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996). Giá trị pH
tối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là pH
tối ưu cho hoạt động của PME từ Aspergillus (Duvetter, 2007).
3.1.3 Các nguồn enzyme PME tự nhiên
Enzyme PME được sinh tổng hợp từ hai nguồn chủ yếu là thực vật và vi sinh vật. Đối
với vi khuẩn thì không có sự đa dạng về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một
PME duy nhất được tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu trên vi khuẩn (Benen et al.,
2003).
(i) Enzyme PME từ thực vật
PME hiện diện trong hầu hết cây ăn trái với hàm lượng khác nhau. Chúng thường nằm
trong vách tế bào và hàm lượng gia tăng khi trái bắt đầu chín. Các loại trái chứa PME
nhiều nhất là cà chua, cam, chuối, kiwi, táo… PME nội bào của thực vật có liên quan
đến sự thoái hóa của pectin trong suốt quá trình phát triển của cây (Bordenave, 1996).
Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có tác dụng điều khiển sự thoái hóa
của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín. PME có ảnh hưởng đến
các quá trình sinh lý như tăng kích thước và năng suất của củ, sự phát triển của rễ và
sự mềm đi của trái (Smout et al., 2004).
Enzyme PME từ thực vật có khối lượng phân tử trong khoảng 21  57 kDa và pI
khoảng 9,0. Hầu hết PME từ thực vật hoạt động trong khoảng pH trung tính và nhiệt
độ tối ưu trong khoảng 55  60 oC (Ly Nguyen B., 2004) .
Đặc tính sinh hóa của PME sau tinh sạch từ thực vật được tóm tắt trong bảng 1.
PME thực vật thường tồn tại các dạng đồng phân. Thông thường, các dạng đồng phân
của chúng khác nhau ở điểm đẳng điện pI và khối lượng phân tử (Bordenave., 1996).
Mối quan hệ giữa tỷ lệ của các dạng đồng phân này có thể thay đổi tùy theo mức độ
tăng trưởng của trái và nguồn gốc PME (Bordenave et al., 1993). Cà chua có hai loại
đồng phân là PME1 và PME2, hàm lượng cả hai PME này đều tăng trong giai đoạn
trái bắt đầu chín nhưng ở giữa giai đoạn chín thì PME1 giảm xuống, PME2 tiếp tục
tăng đến cuối quá trình chín. Bên cạnh đó, hai dạng đồng phân của PME trong cam có
tính chất rất khác nhau, PME1 có pI là 10,05 và PME2 có pI >11. Các đồng phân
Trang 3
trong kiwi thì có cùng khối lượng phân tử, cùng pI nhưng lại khác nhau về tính bền
nhiệt (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Bảng 1: Đặc tính sinh hóa của một số enzyme PME sau tinh sạch từ thực vật
Nguồn PME Khối lượng phân tử (kDa) pI Nguồn tài liệu
Cà chua 23 – Tucker et al., 1982
Cà chua 23,8 9,3 Pressey & Woods, 1992
24,2 8,9
Cà chua 35 > 9,3 Giovane et al., 1994
Carrot 34,2 9,8 Markovic et al., 2002
Carrot 25 > 8,6 Alonso et al., 2003
Cherry 27,2 > 8,6 Alonso et al., 1996
55,9 7,05
55,9 6,36
55,9 5,24
Nho 36 > 10 Seymour et al., 1991b
53,5 > 10
Đu đủ 53 – Lourenco & Catutani,
1984
Đu đủ 28 >9 Lim & Chung, 1993
27 >9
Nguồn: Duvetter, 2007
(ii) Enzyme PME từ vi sinh vật
So với thực vật, vi sinh vật được sử dụng phổ biến hơn trong sản xuất các chế phẩm
pectinase thương mại. Các loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp PME gồm nấm mốc
và vi khuẩn.
Enzyme PME từ nấm mốc
Cũng như các enzyme pectinase khác, enzyme PME có thể được sản xuất từ nhiều loại
nấm mốc khác nhau như Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A. terrus, A.
saitoi, Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P. chrysogenum, P. expanam, P. cilrimim,
Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Rhizopus stolonifer,
Trichoderma sp., Neurospora crassa, etc., nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Joshi
et al., 2006 ).
PME từ nấm mốc thường là các enzyme ngoại bào, hoạt động tối ưu trong khoảng
nhiệt độ 30 ÷ 45 ºC và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 55 ºC. PME từ các loài Aspergillus
có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid. Hoạt động của PME từ A. niger đạt
tối ưu ở pH 4,5 và nhiệt độ 40 ºC (Fawole, 2003). Trong khi pH tối ưu của enzyme
Trang 4
PME từ A. species là 3,7 ÷ 4,2 và enzyme PME từ A. sojae là 5,5. Riêng với enzyme
PME từ A. repens có nhiệt độ tối thích là 30 ºC và pH tối ưu là 6,5 (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Enzyme PME từ vi khuẩn
Enzyme PME cũng có thể được sinh tổng hợp từ các loài vi khuẩn khác nhau như
Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella aerogenes...
Khác với enzyme PME từ nấm mốc, enzyme PME từ vi khuẩn không có tính acid mà
có tính hơi kiềm, pH tối ưu của chúng nằm trong khoảng 7  8 và hầu hết bị vô hoạt ở
85 oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004). PME từ vi khuẩn Erwinia chrysanthemi có pI là
9,64 (Đặng Thị Thu et al., 2004).
3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PME
(i) Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME
Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt
động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. Thông thường, ở pH tối
thích, enzyme có điện tích tổng cực tiểu nên pH tối thích khá gần với điểm đẳng điện
pI của enzyme (Đặng Thị Thu et al., 2004). Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH
môi trường vì pH có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá các gốc R của các acid amin
trong phân tử enzyme, ion hoá các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hoá
cơ chất. Do đó, pH ảnh hưởng đến cả hai tham số động học K m và Vmax của enzyme
(Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2007).
Enzyme PME từ các nguồn gốc khác nhau có pH tối thích khác nhau. Hầu hết các
PME thực vật có pH tối thích trong khoảng 6,0  8,0 (Ly Nguyen B., 2004) nhưng
PME từ vi sinh vật có pH tối thích từ 4,0 đến 9,0 (Bordenave, 1996). Enzyme PME từ
cà chua có pH tối thích là 8,0. Trong khi đó, pH tối thích của PME từ Aspergillus là
4,5 (Duvetter, 2007).
(ii) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme PME
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Cũng như các phản ứng hoá học
thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên, do enzyme
có bản chất là protein nên dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao. Do đó, tốc độ phản ứng chỉ
tăng đến một giới hạn cao nhất gọi là nhiệt độ tối thích. Vượt quá nhiệt độ này, tốc độ
phản ứng enzyme sẽ giảm dần đến mức triệt tiêu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh
nhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50 °C và bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70 °C (Lê Ngọc Tú,
2004). Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích của enzyme còn phụ thuộc nhiều vào sự có mặt
của cơ chất, các ion kim loại, pH (Lê Ngọc Tú, 2004).
Trang 5
Giống như các phản ứng của enzyme khác, tốc độ của phản ứng phân giải pectin do
enzyme PME sẽ gia tăng cùng với sự gia tăng nhiệt độ đến nhiệt độ tối thích. Nhiệt độ
tối thích cho hoạt động của enzyme PME dao động trong khoảng từ 45 ÷ 55 oC và bị
vô hoạt ở 55 ÷ 62 °C, phụ thuộc vào nguồn enzyme (Sila et al., 2003).
(iii) Ảnh hưởng của các ion đến hoạt tính của enzyme PME
Enzyme thường được hoạt hóa bởi các cation Na +, K+, Ca2+, Mg2+ và Zn2+ (Arotupin et
al., 2008). Theo Nari et al., (1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng độ
ion kim loại và đạt đến nồng độ tối thích, ở trên nồng độ này hoạt động của PME
thường giảm. Trong phản ứng khử ester hóa xúc tác bởi PME thực vật, ion kim loại
thúc đẩy cho phản ứng thủy phân xảy ra nhanh hơn. Ion kim loại phản ứng với nhóm
mang điện tích âm (nhóm carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kết ester và
cắt đứt liên kết này. Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme. Điều
này được giải thích dựa trên nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóng cho
phép phản ứng tiếp diễn nhưng những nhóm này có thể bị khóa bởi ion kim loại làm
cho enzyme không thể tiếp tục xúc tác (Nari et al., 1991).
Với NaCl, nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M. Theo Leiting & Wicker,
(1997) ở cùng mức độ ion hóa, khả năng hoạt hóa PME của những cation hóa trị II là
khác nhau. Hiệu ứng của cation hóa trị II trên hoạt động của PME xuất hiện phức tạp
hơn so với ion hóa trị I. Trong số những ion hoá trị II, calcium là một trong những ion
quan trọng nhất. Ở nồng độ thấp (5  25 nM), calcium tăng khả năng hoạt động của
PME. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, calcium làm giảm tốc độ phản ứng của PME do có
sự hình thành gel calcium–pectate (Leiting & Wicker, 1997). Đối với nấm mốc Vigra
radiata, magnesium là chất hoạt hóa mạnh hơn calcium. Magnesium có khả năng cân
bằng hoạt tính PME tự do và PME cố định, trong khi calcium chỉ kích hoạt enzyme cố
định (Bordenave et al., 1993). Bên cạnh đó, anion cũng có khả năng kích hoạt enzyme
dựa vào tác dụng hạ pH tối thích của enzyme xuống giá trị acid (Moustacas et al.,
1991).
(iv) Ảnh hưởng của chất ức chế enzyme (PMEI) đến hoạt tính của PME
Chất ức chế glycoprotein của PME (PMEI) có thể được trích ly từ trái kiwi. PMEI có
thể phản ứng cạnh tranh và ngăn cản hoạt động của PME thực vật. Nhờ khả năng ức
chế của PMEI đối với PME thực vật, việc tinh sạch và cô đặc PME thực vật có thể
được tiến hành theo phương pháp sắc ký ái lực (Laratta et al., 1995; Ly Nguyen B.,
2004). Trong khi đó, việc tinh sạch PME vi sinh vật cần phải sử dụng một quy trình
hoàn toàn khác biệt và phức tạp hơn. PMEI được xác định không ảnh hưởng đến hoạt
tính của PME từ vi sinh vật (Laratta et al., 1995, Ly Nguyen B., 2004). Tuy nhiên,
catechin từ trà xanh cũng được chứng tỏ là chất có khả năng ức chế hoạt động của
Trang 6
PME (Lewis, 2008). Đây cũng là một thông tin hữu ích trợ giúp cho việc tìm ra
phương thức phù hợp cho việc tinh sạch enzyme PME đạt hiệu quả cao nhất.
3.1.5 Ứng dụng của enzyme PME trong chế biến thực phẩm
(i) Cải thiện cấu trúc
Enzyme PME có vai trò quan trọng trong việc cải thiện cấu trúc cho các sản phẩm rau
cải muối chua, trái cây đóng hộp. Enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết ester
của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca 2+ tạo cấu trúc theo mong muốn
(Duvetter, 2007).
Hình 2: Phức hợp pectate calcium

Nguồn: Liners et al., 1992
Việc ứng dụng enzyme PME vào chế biến thực phẩm có thể thực hiện bằng cách kích
hoạt enzyme nội bào hoặc bổ sung enzyme ngoại bào. Enzyme PME của carrot có thể
được kích hoạt ở 60 ºC trong 40 phút hay 70 ºC trong 30 phút. Do đó, độ cứng của
carrot được duy trì khi tiền xử lý nhiệt kết hợp với ngâm trong dung dịch CaCl 2 nồng
độ 0,5% (Smout et al., 2004). Độ cứng của bí đỏ cũng được cải thiện khi chần một
phút trong dung dịch CaCl2 nồng độ 2,5% ở 40ºC (Luna et al., 1999). Tuy nhiên, một
số loại rau quả chứa rất ít PME nội bào, đồng thời việc tiền xử lý ở nhiệt độ
(50 ÷ 70ºC) có thể làm hoạt hóa một số loại enzyme không muốn. Vì vậy, nhiều
phương pháp khác nhau được đề nghị bổ sung enzyme vào mô thực vật ở trạng thái
nguyên vẹn (Baker & Wicker, 1996). Phương thức bổ sung đơn giản nhất là phương
pháp ngâm thông thường. Quá trình này thường xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào
mô chỉ giới hạn ở bề mặt. Ngâm dưới áp lực trực tiếp hoặc trong chân không đã được
áp dụng thành công đối với việc bổ sung PME ngoại bào vào mô tế bào quả dâu tây và
một số loại trái cây khác (Duvetter, 2007).
(ii) Trích ly dịch quả
Pectin là thành phần quan trọng trong cấu tạo vách tế bào. Quá trình trích ly dịch quả
có thể gặp khó khăn do pectin tạo độ nhớt cao, thành tế bào vững chắc ngăn cản dịch
Trang 7
bào thoát ra ngoài. Vì vậy, hiệu quả trích ly có thể được cải thiện khi sử dụng hệ
enzyme pectinase. Trong đó, enzyme PME xúc tác thuỷ phân các liên kết ester tạo
điều kiện cho enzyme PG và PL phân cắt pectin. Quá trình này thường kết hợp với
việc sử dụng enzyme cellulase để cho hiệu quả tối ưu (Tucker et al., 1993).
(iii) Làm trong nước quả
Một trong những vấn đề quan trọng trong việc sản xuất nước quả là tránh được sự vẩn
đục của sản phẩm. Khi ép dịch quả, một lượng lớn protopectin sẽ theo dịch quả, gây
đục và tăng độ nhớt sản phẩm. Phức hệ protopectin gồm protein mang điện dương và
lớp vỏ pectin mang điện âm. Do lớp vỏ ngoài tích điện cùng dấu nên chúng đẩy nhau
và ở trạng thái lơ lửng, gây vẩn đục. Khi xử lý với hệ enzyme pectinase, lớp vỏ pectin
sẽ bị phân cắt làm cho các protein lộ ra. Khi đó, các phân tử protopectin sẽ hút nhau
và kết tủa (Bali, 2003). Ishii et al., (1972, trích dẫn bởi Ishii et al., 1979) đã thử
nghiệm và cho thấy hiệu quả tương tự khi ứng dụng xử lý làm trong nước táo bằng
cách kết hợp PME với PG (polygalacturonase) hoặc sử dụng PL (pectat lyase) độc lập.
Tuy nhiên, đến năm 1973, Ishii et al. lại cho thấy việc sử dụng PL độc lập không hiệu
quả bằng việc kết hợp PME và PG (Ishii et al., 1979)
Hình 3: Tác dụng của enzyme PME trong quá trình làm trong nước quả
Nguồn: Ishii et al., 1979
(iv) Một số ứng dụng khác

Ngoài lĩnh vực chế biến nước quả, pectinase từ vi sinh vật còn có nhiều triển vọng
trong công nghiệp chế biến ca cao và cà phê. Khi xử lý bằng hệ enzyme pectinase
trong quá trình lên men ca cao và cà phê, lớp chất nhầy xung quanh các hạt này bị
phân hủy nhanh hơn và bị rửa khỏi hạt trước khi hạt được sấy khô.
Trang 8
Ngoài ra, hệ enzyme pectinase còn được ứng dụng trong việc tạo hương vị đặc trưng
cho sản phẩm rượu do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc trong
nguyên liệu (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
3.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER

Aspergillus niger được biết đến như loại nấm mốc có màu đen (Abarca et al., 2004),
thuộc nhóm sinh sản vô tính. Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạch
và bảo quản các loại thực phẩm như đậu phộng, bắp, táo, lê, đào, nho, dâu tây, cà chua
và dưa (Pitt & Hocking, 1997).
Hình 4: Nấm mốc A. niger

Nguồn: http://www.moldbacteria.com/newsletters/2005/dec2005.html
Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme (như
–galactosidases, lipases, proteases, hemicellulases, cellulases và pectinases) và acid
hữu cơ. Trong công nghiệp thực phẩm, A. niger đã được ứng dụng hơn mười thập kỷ
qua mà không có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người (Schuster et al., 2002).
Thêm vào đó, sản phẩm từ A. niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và dược
phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là sản phẩm an toàn (GRAS) (Abarca et al., 2004).
PME từ A. niger đã được sản xuất thương mại ở Công ty DSM Food Specialties,
Seclin, Pháp (Degraeve et al., 2003).
Sản xuất enzyme từ A. niger có thể được thực hiện trên rất nhiều cơ chất khác nhau
theo phương pháp lên men trạng thái rắn hay lỏng. Cơ chất thường được sử dụng cho
quá trình lên men sinh enzyme là các nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật như ngũ
cốc, gạo, bắp, thực vật thân củ, cây họ đậu, các nguồn nguyên liệu giàu protein, lipid
hoặc các phụ phẩm nông nghiệp (Ashok P. et al., 2002). Tuy nhiên, một số các nghiên
cứu gần đây cho thấy, có thể ly trích PME hay các pectinase khác từ nấm mốc trên các
cơ chất giàu pectin như bã táo (Joshi et al., 2006), vỏ cam (Hamdy, 2005).
A. niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử
pectin như pectin methylesterase (EC 3.1.1.11), pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6),
Trang 9
endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), pectate

lyase (EC 4.2.2.2) và pectin lyase (EC 4.2.2.10). Hoạt động của pectin methylesterase
cần thiết để tạo ra pectin có độ methyl ester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho
polygalacturonases và pectate lyase. Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất
có độ methyl ester bất kỳ. Hệ enzyme pectinase từ A. niger có nhiều ứng dụng trong
công nghiệp thực phẩm và thức uống. Tuy nhiên, các enzyme này thường ở dạng hỗn
hợp sau khi trích ly, gây khó khăn trong việc ứng dụng. Chính vì thế, quá trình tinh
sạch nhằm loại bỏ các hệ enzyme khác, thu được enzyme PME thuần nhất đóng vai
trò rất quan trọng.
3.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE

Việc tinh sạch enzyme PME có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau. Phổ
biến nhất là phương pháp kết tủa, sắc ký lỏng (sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, sắc ký
lọc gel) (Ishii et al., 1979) hay ức chế chọn lọc pectin polymerase (sốc nhiệt, thay đổi
pH hay sử dụng chất hóa học) (Schmitz, 2002).
3.3.1 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh
học, đặc biệt là các phân tử có bản chất protein như enzyme. Cấu tạo phân tử enzyme
rất phức tạp, chúng có cả những nhóm kỵ nước và ưa nước nên tính tan phụ thuộc vào
sự phân bố của các nhóm này trên bề mặt.
Có thể dùng nhiều cách khác nhau để tủa enzyme như tủa bằng muối, bằng các dung
môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa enzyme. Các dung môi hoặc các
hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn enzyme nên có thể lôi kéo nước ra khỏi
phân tử enzyme, làm cho chúng mất lớp áo nước và tủa xuống.
Hỗn hợp enzyme thô thu được sau khi nuôi cấy nấm mốc A. niger được loại bỏ một
phần tạp chất bằng phương pháp tủa. Kết tủa được xem như là bước đầu tiên trong qui
trình tinh sạch enzyme thô. Sau khi tủa, tiến hành ly tâm hoặc lọc hỗn hợp lỏng–rắn
thu được phần rắn. Tiếp theo là hoà tan phần rắn bằng nước hoặc dung dịch đệm. Sau
đó là khử muối nếu cần thiết (Harris, 1995).
Kết tủa bằng muối ammonium sulfate
Ammonium sulfate thường được sử dụng để tủa enzyme ở bước đầu trong quy trình
tách chiết và tinh sạch. Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt
enzyme sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước
quanh phân tử. Khi thêm muối ammonium sulfate vào với nồng độ cao, các phân tử
muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho
enzyme mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Banerjee, 2006).
Trang 10
Các loại muối thường được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4. Nhiều nghiên cứu
cho thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì có khả năng ổn định hầu hết các loại enzyme.
Có thể dùng muối (NH4)2SO4 dạng rắn hoặc dạng dung dịch bão hòa.
Phương pháp này cũng được sử dụng để kết tủa và thu phân đoạn các enzyme trong
hỗn hợp dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở
một nồng độ muối khác nhau.
Enzyme được kết tủa bằng muối ít bị biến tính nhưng cần phải tiến hành thêm bước
thẩm tích để loại muối ra khỏi dung dịch trước khi tiến hành sắc ký.
Túi thẩm tích là một màng bán thấm, có những lỗ nhỏ cho phép các phân tử nhỏ đi
qua trong khi các phân tử lớn như enzyme được giữ lại (hình 5). Khi đặt trong môi
trường có nồng độ muối thấp hay không có muối, muối từ trong túi sẽ khuếch tán ra
bên ngoài để cân bằng nồng độ, lặp lại nhiều lần muối sẽ được loại khỏi enzyme. Thời
gian thẩm tích thường là 24 đến 28 giờ (Đỗ Quý Hai, 2005).
Hình 5: Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein
Nguồn: Đỗ Quý Hai, 2005
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở độ hòa tan của protein phụ thuộc vào
sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử enzyme với các phân tử nước.
Khả năng hydrate hóa của enzyme sẽ bị giảm khi thêm vào dung dịch các dung môi
hữu cơ, các phân tử enzyme liên kết lại với nhau và kết tủa xuống. Dung môi hữu cơ
thường dùng là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.
Ở phương pháp này cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5 oC trở xuống) nhằm
tránh gây biến tính enzyme. Có thể dùng các dung môi hữu cơ này để tách phân đoạn
enzyme dưới 0 oC, như vậy sẽ có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme.
Khi đã có kết tủa, phải tách nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng máy li tâm. Phương
pháp này có ưu điểm là không cần loại muối, các dung môi hữu cơ có nhiệt độ bay hơi
Trang 11
thấp nên dễ dàng tách khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ nhưng nhược điểm là hay có
màu (Lương Đức Phẩm, 2004).
3.3.2 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme
Enzyme cũng là một protein cao phân tử, do vậy các phương pháp phân tách protein
sử dụng màng lọc phân tử khá hữu hiệu (Đặng Thị Thu et al., 2009). Các kỹ thuật
phân tách protein hay enzyme theo kích thước phân tử của chúng nhờ một màng bán
thấm hoặc màng lọc phân tử. Dung dịch enzyme khi đó được phân thành hai pha: pha
(1) không đi qua màng lọc chứa các cao phân tử, trong đó có protein hay enzyme
muốn thu nhận và pha (2) đi qua màng lọc chỉ chứa các phân tử có kích thước nhỏ hơn
kích thước màng lọc (peptid, glucid đơn giản, muối…) với nồng độ cân bằng với
chúng trong pha (1). Trong một số trường hợp, quá trình lọc được áp dụng với mục
đích thu nhận thành phần enzyme trong pha (2) – pha chứa phân tử có kích thước nhỏ
hơn. Enzyme có thể được tách ra khỏi các protein/enzyme khác nhờ vào kích thước
phân tử của chúng, theo kỹ thuật sàng phân tử hay “siêu lọc” với khoảng phân đoạn
phù hợp (Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009a)
Nghiên cứu ứng dụng lọc màng theo siêu lọc, lọc chéo nano đã được ứng dụng khá
thành công trên một số enzyme như pectinase (Huỳnh Ngọc Oanh & Trần Ngọc
Hùng, 2008). Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Oanh & Trần Ngọc Hùng (2008) cho thấy,
sau khi kết tủa bằng ethanol, mức độ tinh sạch của pectinase tăng 3,1 lần khi enzyme
được đưa qua hệ thống lọc màng có khoảng phân đoạn 50 kDa, tốc độ bơm mẫu 150
rpm và áp suất lọc nhỏ hơn 5 Psi. Việc gia tăng tốc độ bơm mẫu lên đến 200 rpm là
nguyên nhân làm tăng áp lực lọc và làm giảm hiệu quả tinh sạch enzyme.
Mặc dù phương pháp tinh sạch bằng lọc màng không thể loại bỏ hoàn toàn các hợp
chất cao phân tử có cùng khoảng khối lượng phân tử với enzyme muốn tinh sạch, tuy
nhiên đây vẫn là giải pháp hữu hiệu do tính tiện dụng, đơn giản, kinh phí thấp
(Dubbin, 2005).
3.4 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENZYME BẰNG KỸ THUẬT
ĐIỆN DI
Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện trong điện trường. Các phân
tử protein enzyme được tách riêng dựa vào sự tích điện và khối lượng phân tử. Khả
năng tách riêng các protein theo phương pháp này khá cao nhưng khó phát triển ở quy
mô lớn.
Điện di được thực hiện trên một khuôn đỡ như giấy, celluloseacetate, gel tinh bột, gel
agarose hoặc gel polyacrylamide. Chúng có vai trò giống như một cái rây phân tử sẽ
làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel có thể di chuyển
xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di
Trang 12
chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc
khác nhau.
Điện di là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích
thước, sẽ bị tác động một lực để di chuyển trong cùng một cơ chất. Các protein có thể
được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị
biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate
(SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của
protein ban đầu.
Mercaptoethanol (2–thioethanol) hay dithiothreitol được thêm vào để khử các cầu
disulfide (–S–S–) và sodium dodexyl sulfate (SDS), tạo sự biến tính protein. Chuỗi
polypeptide đã bị dãn ra sẽ được phủ kín bằng phân tử SDS để tạo ra polyanion có mật
độ điện tích trên một đơn vị chiều dài gần như không đổi và không phụ thuộc vào
trình tự của chuỗi peptide.
Dưới tác dụng của một điện trường, các protein đã được SDS phủ kín sẽ di chuyển
trên gel arylamit về phía anot (cực +). Do các mắt lưới của gel, những protein nhỏ di
chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu.
Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ
với khối lượng của chúng.
Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng
bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue hay Amiden.
Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp X
quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
SDS–PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide) có độ phân tách cao, cho kết
quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0,1 ug (~2 pmol) protein đã cho
vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0,02 ug) vẫn có thể
được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng
2% vẫn có thể phân biệt được bằng SDS–PAGE. Vì vậy, SDS–PAGE giúp đánh giá
được hiệu quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy
gồm rất nhiều protein, nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ
có một băng ngày càng đậm, tương ứng với protein mục tiêu. (Đặng Thị Thu &
Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009a, b).
3.5 ĐỘNG HỌC ENZYME

3.5.1 Khái niệm enzyme và cấu tạo hóa học
Enzyme được sản xuất ra bởi các tế bào sống (động vật, thực vật, vi sinh vật) và có vai
trò như là chất xúc tác bắt buộc cho các phản ứng sinh học (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Trang 13
Dựa vào thành phần hóa học, có thể chia enzyme thành hai loại:
Enzyme đơn giản (enzyme một cấu tử): trong thành phần cấu tạo của nó chỉ gồm
các gốc acid amin.
Enzyme phức tạp (enzyme hai hoạc nhiều cấu tử): trong thành phần của nó ngoài
acid amin (protein) còn có các nhóm phụ khác có phân tử lượng thấp gọi là phần phi
protein hoặc là những yếu tố kết hợp gọi tắt là cofactor (các ion kim loại, vitamin,
nucleotid, nhân pocfirin…) Phần protein của enzyme 2 cấu tử gọi là apoenzyme. Phần
phi protein (cofactor) quyết định kiểu phản ứng và tham gia trực tiếp vào cơ thể xúc
tác của enzyme, thực hiện cầu nối của enzyme và cơ chất, giúp ổn định bền vững cấu
trúc của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004 ; Lê Ngọc Tú et al., 2004)
3.5.2 Động học phản ứng enzyme
Enzyme là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu với tốc độ nhanh, cả trong điều kiện
nhiệt độ thấp (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình
động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản
ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình
này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S).
Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng
enzyme. Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới.
Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được
trình bày theo sơ đồ:
k1 k2
E+S ES E+P
k-1 k-2
Trong đó: k1, k–1, k2, k–2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
Sự hình thành phức hợp ES thường xảy ra nhanh, nhưng ngược lại sự chuyển hóa
thành sản phẩm thì chậm hơn. Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan
trọng nhất.
k2
ES E+P
Trong đó, k2 tỉ lệ với nồng độ ES

v = k2.[ES] (v: vận tốc phản ứng)
Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Trang 14
Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua
ba giai đoạn:
Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt động
của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E–S). Ở
giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ
E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần có
một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính
riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết
ion, liên kết kỵ nước lực Vander–Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.
Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ
bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trong
phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.
Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liên
kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dễ dàng tham gia phản ứng.
Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được
tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử
cơ chất khác
(Mathewson, 1998).
Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme sẽ có bản chất khác nhau, thông số động học Km đặc
trưng cho mỗi enzyme (Bảng 2).
Bảng 2: Thông số động học Km của một số enzyme
Enzyme Tên quốc tế Nguồn gốc Cơ chất Km
a–Amylase 3.2.1.1 Dịch tụy heo Tinh bột 1,0

b–Amylase 3.2.1.2 Khoai lang Amylose 0,07
Bromelin 4.3.1.1 Trái khóm Benzoyl–L–arginine 170
ethyl ester
Glucose–isomerase 5.3.1.5 Lactobacillus brevis D–Glucose 920
Lipoxygennase 1.13.11.12 Đậu nành Linoleate 1,0

Papain 3.4.22.2 Nước đu đủ Benzoyl–L–arginine 1,89
ethyl ester
Urease 3.5.1.5 Đậu Urea 10,5
Nguồn: Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2002
Trang 15
3.5.3 Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme

(i) Mô hình động học bậc một (First order kinetic model)
Sự vô hoạt enzyme ở một điều kiện nhiệt độ nhất định có thể được mô tả bởi mô hình
phương trình bậc một (Ludikhuyze et al., 2001; Eagerman & Rouse, 1976).
(1)
Phương trình (1) được chuyển thành dạng đường thẳng theo phương trình (2)
(2)
Trong đó:
A: hoạt tính của enzyme ở thời điểm t
A0: hoạt tính ban đầu của enzyme t = 0
k: hằng số tốc độ vô hoạt (phút –1)
t: thời gian xử lý nhiệt (phút)
Hằng số tốc độ phản ứng (k) có thể được xác định bằng cách lập một đồ thị của
ln(A/A0) theo thời gian gia nhiệt. Hằng số tốc độ phản ứng (k) có thể suy ra trực tiếp
từ hệ số gốc của đường hồi quy.
ln(A/A0)
Thời gian xử lý
Hình 6: Hình minh họa động học theo phản ứng bậc một
Nguồn : Ly Nguyen,, 2004
(ii) Mô hình động học biến đổi một phần (Fractional–conversion model)
Phương trình chuyển đổi một phần là một trường hợp đặc biệt của phản ứng bậc một,
được ứng dụng trong trường hợp hàm lượng của chất nghiên cứu không giảm đến giá
trị không và hàm lượng của chất này sau khi giảm đến một mức nào đó sẽ không đổi
khi kéo dài thời gian xử lý nhiệt (A) và có thể được biểu diễn như:
(3)
Với:
Trang 16
f: hệ số chuyển đổi một phần

A : hàm lượng của một chất còn lại sau quá trình xử lý nhiệt kéo dài
A gần bằng 0 và phương trình (3) có thể được viết thành:
(4)
Đồ thị logarithm của (1–f) theo thời gian là một đường thẳng với hằng số tốc độ phản
ứng được biểu thị bằng giá trị âm của hệ số góc.
(5)
Vậy phương trình (5) giống phương trình (1) khi A gần bằng 0.
Để tính toán hàm lượng còn lại sau quá trình xử lý nhiệt kéo dài, mô hình chuyển đổi
một phần sau nên được sử dụng:
(6)
Sắp xếp lại phương trình (6), nhận được phương trình (7):
(7)
A/A0
A∞
Thời gian xử lý
(phút)
Hình 7: Hình minh họa động học theo phản ứng chuyển đổi một phần
Nguồn : Ly Nguyen, 2004
(iii) Sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng (k) vào nhiệt độ (T)
Dựa vào quan điểm động học (phương trình đẳng áp, đẳng tích của phản ứng hóa
học), sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng vào nhiệt độ có thể biểu diễn bằng
phương trình:
(9)
Đây là dạng phương trình vi phân của Arrhenius, có thể biến đổi phương trình (9)
thành các dạng khác:
Trang 17
(10)
(11)
(12)
Với T0= Tref , k0 = kref
Hoặc (13)
Trong đó:
T: nhiệt độ xử lý (K)
k: hằng số tốc độ phản ứng (phút –1)
kref: hằng số tốc độ phản ứng ở nhiệt độ tham chiếu Tref (phút –1)
R: hằng số khí lý tưởng (R = 8,314 J/mol.K)
Ea: năng lượng hoạt hóa (kJ/mol)
ln(k)
1/T
Hình 8: Hình minh họa ảnh hưởng của nhiệt đến hằng số tốc độ phản ứng
Nguồn : Ly Nguyen, 2004
Năng lượng hoạt hóa (Ea) thường được sử dụng để chỉ sự phụ thuộc vào nhiệt độ của
hằng số tốc độ phản ứng. Hơn nữa, năng lượng hoạt hóa có thể được xác định theo
phương pháp đồ thị bằng cách biểu diễn logarithm của hằng số tốc độ phản ứng theo
nhiệt độ tuyệt đối. Hệ số nhiệt độ có thể được tính toán từ hệ số góc (hình 8)
(Duvetter, 2007).
(iv) Xác định R2 và SD
Chất lượng của các mô hình toán được đánh giá thông qua tính toán hệ số “corrected
R2” và “standard deviation” (SD) theo công thức sau:
Trang 18
(14)
(15)
Trong đó
m: số lượng các thí nghiệm (observation)
j: là số tham số của phương trình
SSQ: các tổng bình phương (sum of squares)
Nguồn: SAS Institute Inc. (2003)
3.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

Trích ly và tinh sạch PME từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã được
thực hiện và đưa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới.
Schmitz (2002) đã công bố bản quyền nuôi cấy, thu nhận PME từ A. niger theo
phương pháp nuôi cấy rắn với môi trường bột mì, cám mì, peptone và một số
khoáng chất, sau đó tinh sạch bằng phương pháp lọc màng và bảo quản ở dạng bột
sấy phun.
Arotupin et al. (2008) đã nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất của PME từ
Aspergillus repens. Theo đó, độ tinh sạch PME từ Aspergillus repens gấp 7,93 lần
ban đầu, hoạt tính riêng của PME gia tăng từ 0,82 U/mg protein đến 6,5 U/mg protein sau
các bước kết tủa bằng (NH 4)2SO4, lọc gel kết hợp khử bỏ muối bằng Sephadex G–
100 và áp dụng sắc ký trao đổi ion với SP Sephadex C–50.
Duvetter (2007) cũng đã khẳng định hiệu quả của việc tinh sạch PME từ A.
aculeatus thông qua sắc ký lọc gel với đoạn mồi Alka (Alka prime, GE Helthcare),
sử dụng cột Superdex 75. Kết quả cho thấy, hoạt tính riêng của A. aculeatus PME
gia tăng từ 120 U/mg protein PME thô, Novozyme) đến giá trị 180 U/mg protein sau khi
tinh sạch.
Bên cạnh việc kết tủa sơ bộ hỗn hợp protein chứa enzyme sau quá trình lên men
bằng (NH 4)2SO4, dung môi acetone lạnh cũng được sử dụng làm tác nhân kết tủa
enzyme trước khi tinh sạch bằng sắc ký. PME từ Botrytis cinerea có thể được tinh
sạch bằng acetone lạnh với tỷ lệ dung môi: dung dịch chứa protein là 4 : 1 ở nhiệt
độ 3 ÷ 4 °C. Sau khi kết tủa, kết tủa chứa enzyme PME được phân tách bằng ly tâm
ở tốc độ 27000 g trong thời gian 10 phút, sau đó hòa tan lại trong dung dịch đệm
sodium acetate ở pH 4,5. Mức độ tinh sạch PME (so với enzyme thô) tăng 1,6 lần
Trang 19
sau khi kết tủa bằng acetone nhưng gia tăng đến 37,5 lần sau quá trình tinh sạch
bằng sắc ký trao đổi ion CM–Sepharose (CL–6B, Pharmaci). Hoạt tính riêng đạt
được là 1,69 U/mg (so với giá trị 0,04 U/mg ở enzyme thô) (Reignault et al.,
1994).
Nhìn chung, các nghiên cứu tinh sạch PME từ vi sinh vật, chủ yếu là nấm mốc
Aspergillus spp. cho thấy, hoạt tính của PME và mức độ tinh sạch gia tăng đáng kể
khi enzyme thô thu được sau quá trình lên men được kết tủa với (NH4)2SO4 hay
dung môi hữu cơ, tiếp theo đó là quá trình tinh sạch bằng sắc ký cột thích hợp. Đây
cũng chính là cơ sở cho việc nghiên cứu tinh sạch PME thu nhận từ A. niger.
Cũng như các loại enzyme khác, hoạt tính PME rất dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố
môi trường. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Phần
lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 ÷ 50 °C. Tùy thuộc vào nguồn gốc,
nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì hoàn toàn khác nhau. Enzyme
pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 ÷ 45 °C và bị vô hoạt ở 55 ÷ 62
°
C (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều
khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực
phẩm. Bên cạnh yếu tố nhiệt độ, enzyme cũng rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của
môi trường. pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, đặc biệt là ảnh
hưởng đến độ bền của enzyme. PME từ các loài Aspergillus spp. là điển hình cho
các PME có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong vùng acid. Tuy nhiên, cùng họ
Aspergillus spp. nhưng pH tối thích của các loài Aspergillus cũng rất khác nhau.
Chẳng hạn pH tối ưu của enzyme PME từ A. species là 3,7 ÷ 4,2 và trong khi pH
tối ưu của enzyme PME từ A. sojae là 5,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Riêng với
enzyme PME từ A. repens thì có hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,5. Theo Nari et al.
(1991), hoạt động của PME tăng cùng với sự tăng nồng độ ion kim loại và đạt đến
cực đại, ở trên giá trị này hoạt tính enzyme giảm dần. Ion kim loại phản ứng với
nhóm mang điện tích âm (nhóm carboxyl) cho phép enzyme phản ứng trên liên kết
ester và giải phóng nó. Ở nồng độ cao, ion kim loại ức chế hoạt động của enzyme.
Điều này được hiểu dựa trên nhóm carboxyl kế cận liên kết ester được giải phóng
cho phép phản ứng tiếp diễn. Nếu những nhóm này được khóa bởi ion kim loại,
phản ứng enzyme không xảy ra (Nari et al., 1991). Theo Leiting & Wicker (1997)
ở cùng mức độ ion hóa, những ion hóa trị 2 kích hoạt PME khác nhau. Với NaCl,
nồng độ tối ưu cho hoạt động PME là 0,2M. Trong số những ion hoá trị 2, calcium
là một trong những ion quan trọng nhất. Tại nồng độ thấp (5  25 nM), calcium
tăng khả năng hoạt động của PME, trong khi đó ở nồng độ cao, có lẽ vì sự hình
thành gel pectate mà tốc độ phản ứng của PME giảm (Leiting & Wicker, 1997).
Trang 20
Trong nghiên cứu này, các điều kiện môi trường có tác động đến hoạt động của
PME sau quá trình tinh sạch sơ bộ, chẳng hạn như điều kiện pH môi trường, nhiệt
độ, độ bền nhiệt, nồng độ ion CaCl 2 và NaCl, nồng độ cơ chất sử dụng (pectin)
được đề nghị khảo sát.
Trang 21
CHƯƠNG 4 PHƯƠNG TIỆN VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

4.1.1 Địa điểm, thời gian
Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực
phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng và Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện
Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian: từ tháng 05 năm 2011 đến tháng 12 năm 2011
4.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Enzyme thô thu được từ quá trình lên men rắn A. niger trên môi trường bã táo và cam
sành.
4.1.3 Thiết bị, hoá chất
(i) Thiết bị
Thiết bị thanh trùng
Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp (Rotana 46 R, Germany)
Hệ thống sắc ký gel SP– Streamline SP
Hệ thống điện di Miniprotein II (BioRad)
Máy đo pH (TOA pH meter HM – 12P)
Bộ điều nhiệt (water bath Memmert)
Bộ hệ thống lọc màng QuixStand Benchtop Systems (hãng Amersham
Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa.
Tủ cấy, tủ ủ
Các dụng cụ phổ biến trong phân tích vi sinh và enzyme
(ii) Hóa chất
Pectin táo (DE = 75%, Sigma)
(NH4)2SO4 (Merck)
Ethanol (Merck)
D (+) galacturonic acid monohydrate (Fluka)
Acetone (Merck)
Coomassie Brillant Blue (CBB) G 250 (Merck)
Trang 22
Bovine serum albumin (Merck)

Bộ protein chuẩn của GenScript bao gồm 6 protein tái tổ hợp thay đổi từ 15 kDa
đến 100 kDa.
Một số hóa chất khác sử dụng trong phân tích
4.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

4.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm mốc gồm 5 gam bã táo có bổ sung thêm 0,075 gam
CaCl2, 0,025 gam MgCl2, 0,01 gam urea, hỗn hợp được trộn đều với 15 mL đệm citrat
(sử dụng bình tam giác 250 mL). Môi trường nuôi cấy được tiệt trùng ở 121 oC trong
15 phút. Sau khi để nguội, cho 2 mL bào tử nấm mốc A. niger vào (khoảng 105 bào
tử/mL), ủ ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ. Hỗn hợp enzyme thô được trích ly bằng
dung dịch đệm citrat/phosphate ở pH 4,5. Lọc qua hệ thống vi lọc có đường kính 0,2
m trước khi tiến hành tinh sạch (Tran et al., 2010).
4.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả
Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích, đo đạc theo phương pháp được tổng hợp ở bảng 3
Bảng 3: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu
Chỉ tiêu Phương pháp
Hoạt tính của PME (U/mL) Phương pháp chuẩn độ điện thế (Crelier el al., 1995; trích
dẫn bởi Duvetter, 2007)
Hàm lượng protein tổng Phương pháp Bradford (1976), sử dụng bovine serum
(mg/mL) albumin (BSA) làm đường chuẩn, với chỉ thị màu
Coomassie Brillant Blue và đo ở bước sóng 595 nm.
Hiệu suất thu hồi PME, Y
%
TA0: tổng hoạt tính PME có trong mẫu thô (U)
TA1: tổng hoạt tính PME có trong mẫu sau trích ly (U)
Hoạt tính riêng S (U/mg)
A: hoạt tính PME (U/mL)

Cprotein: nồng độ protein trong mẫu tương ứng (mg/mL)
Độ tinh sạch P
S1: hoạt tính riêng của PME sau tinh sạch (U/mg)
S0: hoạt tính riêng của PME trong mẫu thô (U/mg)
Nhận diện PME và kiểm Điện di trên gel SDS–PAGE (Sodium dodecyl sulfate
tra độ tinh khiết của protein polyacrylamide gel electrophoresis).
Trang 23
4.3 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm được chia làm hai phần chính
Phần 1. Khảo sát khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng
phương pháp kết tủa
4.3.1 Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng
đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger
Mục đích
Tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa enzyme PME
từ A. niger tốt nhất mà không làm biến tính PME A. niger.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành theo phương thức kết hợp 2 nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhân tố A: Hóa chất dùng để kết tủa enzyme PME từ A. niger, có 4 loại hóa chất
A1: Ammonium sulfate A2: Sodium chloride
A3: Ethanol A4: Acetone
Nhân tố B1: Nồng độ ammonium sulfate trong dung dịch PME từ A. niger thô (w/v),
thay đổi ở 8 mức độ:
B1.1: 0 - 15% B1.2: 15 - 25% B1.3: 25 – 35%
B1.4: 35 - 45% B1.5: 45 - 55% B1.6: 55 - 65%
B1.7: 65 – 75% B1.8: 75 – 85%
Nhân tố B2: Nồng độ sodium chloride trong dung dịch PME từ A. niger thô (w/v),
thay đổi ở 5 mức độ
B2.1: 0 - 15% B2.2: 15 - 20% B2.3: 20 - 25%
B2.4: 25 - 30% B2.5: 30 - 35%
Nhân tố B3: Tỷ lệ ethanol : PME từ A. niger thô (v/v), thay đổi ở 6 mức độ
B3.1: 1,5 : 1 B3.2: 2 : 1 B3.3: 2,5 : 1
B3.4: 3 : 1 B3.5: 3,5 : 1 B3.6: 4 : 1
Nhân tố B4: Tỷ lệ acetone : PME từ A. niger thô (v/v), thay đổi ở 4 mức độ
B4.1: 1 : 1 B4.2: 1,5 : 1
B4.3: 2 : 1 B4.4: 2,5 : 1
Số nghiệm thức thí nghiệm: 21 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 21 x 3 = 63 mẫu
Trang 24
Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch enzyme thô được làm lạnh đến 4 oC trước khi tiến hành thí nghiệm này.
Đối với trường hợp kết tủa bằng muối, dịch enzyme thô được tiến hành kết tủa phân
đoạn bằng muối ammonium sulfate bão hòa bắt đầu từ 15% đến 85% hoặc sodium
chloride bão hòa từ 15% đến 35%. Đầu tiên, cho một thể tích xác định của dịch
enzyme thô đã làm lạnh vào trong ống ly tâm. Từ bảng tra nồng độ bão hòa muối
(NH4)2SO4, NaCl, tính toán được khối lượng muối cần thiết phải cho vào dung dịch để
đạt được nồng độ bão hòa tương ứng.
Cho muối từ từ vào dung dịch enzyme và lắc đều cho đến khi muối tan hoàn toàn. Quá
trình kết tủa được thực hiện trong vòng 2 giờ ở 4 °C, tiếp theo kết tủa được tách ra
bằng máy ly tâm 10000 g trong 20 phút ở 4 ºC. Sau quá trình ly tâm, kết tủa được tách
ra và phần dung dịch còn lại được đem đi xác định thể tích và tiến hành tính toán xác
định lượng muối cần thiết cho vào để đạt được nồng độ bão hòa kế tiếp. Các bước tiếp
theo cũng được thực hiện như lúc đầu và cho đến nồng độ bão hòa cuối cùng.
Sau đó, kết tủa thu được ở các phân đoạn muối bão hòa khác nhau sẽ được hòa tan trở
lại bằng dung dịch đệm citrate-phosphate (pH 4,5) với thể tích vừa đủ. Tiếp theo, phần
kết tủa được hòa tan sẽ đem đi thẩm tích trong dung dịch đệm citrate-phosphate (pH
4,5) bằng màng cellophane trong vòng 12 giờ. Sau cùng, ứng với từng phân đoạn
muối bão hòa xác định hoạt tính, hàm lượng protein của PME và tính toán hiệu quả
tinh sạch enzyme.
Đối với kết tủa bằng dung môi hữu cơ, dung môi hữu cơ được làm lạnh trước đến
nhiệt độ –5 ± 0,5 oC, cho chầm chậm vào các ống nghiệm chứa enzyme thô theo các tỷ
lệ như đã bố trí, lắc nhẹ và để ổn định 2 giờ ở 4 oC. Sau khi kết tủa, hỗn hợp được ly
tâm ở 4 oC, 10000 vòng/phút (khoảng 11173 g) trong 15 phút thu được phần kết tủa.
Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm citrat/phosphate pH 4,5. Xác định hoạt
tính PME, đo hàm lượng protein và tính toán hiệu quả tinh sạch enzyme.
Kết quả thu nhận
Chọn ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp cho quá trình kết tủa PME từ A. niger
dựa trên hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi. Kết quả tối ưu của thí
nghiệm này sẽ làm cơ sở thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
4.3.2 Thí nghiệm 2. Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme PME từ A. niger bằng
phương pháp lọc màng
Mục đích: Đánh giá khả năng tách loại, thu nhận PME bằng cách sử dụng hệ thống
màng có khoảng phân đoạn 50 kDa.
Trang 25

Dựa trên kết quả kết tủa protein bằng muối và dung môi
hữu cơ khác nhau, chọn mẫu protein sau kết tủa có hoạt
tính riêng và độ tinh sạch cao nhất để tiến hành khảo sát
lọc màng. Tiến hành bơm 50 mL kết tủa đã hòa tan trong
dung dịch đệm citrate/phosphate có pH 4,5 với tốc độ
150 rpm qua hệ thống lọc màng QuixStand Benchtop
Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng
(membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa. Điều chỉnh
sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi
(hình 9). Thu dịch qua lọc, xác định hiệu suất thu hồi
enzyme và hoạt độ tương ứng. Nhiệt độ trong quá trình
lọc duy trì trong khoảng 4 oC.
Hình 9: Thiết bị lọc màng
QuixStand Benchtop System

Hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch và hoạt tính riêng của PME sau quá trình lọc.
Phần 2. Xác định tính chất của enzyme PME từ A. niger sau khi được tinh sạch
sơ bộ bằng phương pháp kết tủa
4.3.3 Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất pectin đến hoạt
tính enzyme PME từ A. niger
Mục đích
Xác định hằng số Km, Vmax của enzyme PME từ A. niger đối với cơ chất pectin.
Thí nghiệm được tiến hành với 1 nhân tố.
Nhân tố C: Nồng độ dung dịch pectin (g/L), thay đổi ở 9 mức độ và 3 lần lặp lại.
C1: 0 C2: 0,25 C3: 0,5
C4: 1 C5: 2 C6: 3,5
C7: 4 C8: 6 C9: 8
C9: 10
Số nghiệm thức: 10 x 1 = 10 nghiệm thức
Trang 26

Dung dịch cơ chất có chứa NaCl 0,12 M và pectin ở các nồng độ khác nhau từ
0 ÷ 10 g/L được điều chỉnh đến pH 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,01 N. Hỗn hợp cơ
chất này được sử dụng để đo hoạt tính enzyme PME từ A. niger sau khi tinh sạch sơ
bộ theo kết quả tối ưu của thí nghiệm 1 và 2.
Xác định hằng số Km và Vmax của enzyme PME từ A. niger dựa vào sự thay đổi hoạt
tính của enzyme này theo nồng độ cơ chất pectin.
4.3.4 Thí nghiệm 4. Nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger
theo nhiệt độ
Mục đích
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger nhằm tìm ra
nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme này.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố D: Nhiệt độ xử lý (oC), thay đổi ở 7 mức độ
D1 : 30 D2 : 35 D3 : 40
D4 : 45 D5 : 50 D6 : 55
D7 : 60
Hỗn hợp dung dịch pectin (3,5 g/L) và NaCl 0,12 M ở các mức nhiệt độ khác nhau
được sử dụng để đo hoạt tính enzyme PME. Mẫu enzyme được cho vào các eppendorf
với thể tích mỗi mẫu là 1 mL. Tiến hành xử lý nhiệt các mẫu trong hệ thống điều nhiệt
trong thời gian 1 giờ. Sau khi xử lý, các mẫu enzyme được làm lạnh nhanh trong nước
đá và xác định hoạt tính còn lại của PME ứng với từng mức nhiệt độ khác nhau.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của enzyme PME từ A. niger.
4.3.5 Thí nghiệm 5. Động học sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger
Mục đích
Xác định tính ổn định của enzyme PME do tác động của nhiệt.
Trang 27

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố, lặp lại 3 lần.
Nhân tố E : Nhiệt độ xử lý (0C), thay đổi ở 3 mức độ
E1: 50 E2: 60 E3: 70
Nhân tố F : Thời gian xử lý (phút), thay đổi ở 11 mức độ
F1: 0 F2: 5 F3: 10
F4: 15 F5: 20 F6: 25
F7: 30 F8: 35 F9: 40
F10: 45 F11: 50
Tiến hành xử lý enzyme ở các khoảng nhiệt độ và thời gian khác nhau như bố trí thí
nghiệm. Sau khi xử lý, các mẫu enzyme được làm nguội nhanh và xác định hoạt tính
còn lại của enzyme PME trong từng mẫu.
Phương trình động học sự biến đổi hoạt tính của PME theo thời gian.
4.3.6 Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính
enzyme PME từ A. niger
Mục đích
Xác định pH tối thích cho hoạt động của enzyme PME từ A. niger.
Thí nghiệm được tiến hành với 1 nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhân tố G: Giá trị pH môi trường, thay đổi ở 8 mức độ
G1 : 2,5 G2 : 3 G3 : 3,5
G4 : 4 G5 : 4,5 G6 : 5
G7 : 5,5 G8 : 6
Trang 28
Enzyme PME từ quá trình sinh tổng hợp A. niger sau khi tinh sạch sơ bộ sẽ được hòa
tan trở lại bằng dịch đệm citrate–photphate ở các mức pH như đã bố trí. Cơ chất pectin
cũng được điều chỉnh pH đến các mức tương ứng bằng dung dịch HCl 0,01 M và
NaOH 0,01 M. Sau đó, các mẫu enzyme được xác định hoạt tính ứng với từng mức
pH khác nhau.
Xác định được pH tối thích cho hoạt động xúc tác của enzyme PME từ A. niger.
4.3.7 Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl và CaCl2 đến hoạt tính
Mục đích
Tìm ra quy luật thay đổi hoạt tính của enzyme PME từ A. niger do ảnh hưởng của
NaCl và CaCl2 ở các nồng độ khác nhau.
Thí nghiệm được tiến hành với 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố H1: Nồng độ NaCl (M), thay đổi ở 6 mức độ
H1.1: 0 H1.2: 0,05 H1.3: 0,10
H1.4: 0,12 H1.5: 0,15 H1.6: 0,20
Nhân tố H2: Nồng độ CaCl2, thay đổi ở 6 mức độ
H2.1: 0 H2.2: 0,0050 H2.3: 0,0075
H2.4: 0,0100 H2.5: 0,0125 H2.6: 0,0150
Số nghiệm thức: 6 + 6 = 12 nghiệm thức
Dung dịch pectin 3,5 g/L được bổ sung NaCl hay CaCl 2 ở các nồng độ khác nhau như
bố trí thí nghiệm. Hỗn hợp này được dùng để xác định hoạt tính của enzyme PME từ
A. niger sau khi tinh sạch sơ bộ.
Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme PME từ A. niger ở các nồng độ Na+ và Ca2+
khác nhau.
Trang 29
4.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Kết quả của các thí nghiệm so
sánh, chọn nghiệm thức tối ưu dựa vào chương trình thống kê Stagraphic 4.0 và
Sas 9.1. Thông số tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Trang 30
CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
5.1 ẢNH HƯỞNG CỦA LOẠI HÓA CHẤT VÀ TỶ LỆ SỬ DỤNG ĐẾN KHẢ
NĂNG KẾT TỦA ENZYME PME TỪ ASPERGILLUS NIGER
Quá trình nuôi cấy A. niger sinh ra một hỗn hợp nhiều loại enzyme như PME, PG, PL,
hemicellulase, endo–β–glucanase, protease,... Mỗi loại enzyme đều có tác dụng khác
nhau, thậm chí trái ngược nhau, trong chế biến thực phẩm. Điều này gây khó khăn cho
việc ứng dụng hỗn hợp enzyme thô sau nuôi cấy (Sajjaanantakul & Pitifer, 1991). Vì
vậy, quá trình tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa protein được tiến hành nghiên
cứu nhằm thu được enzyme PME có hoạt tính riêng cao hơn, làm cơ sở cho các bước
tinh sạch tiếp theo.
Quá trình kết tủa protein có thể tiến hành dựa vào tính chất hòa tan của chúng trong
các hóa chất khác nhau. (NH4)2SO4 và NaCl là hai muối trung tính thường được sử
dụng cho khảo sát khả năng tinh sạch sơ bộ enzyme (Scopes, 1994). Trong khi đó, tác
động của dung môi hữu cơ đến khả năng tủa enzyme cũng được đánh giá dựa trên việc
sử dụng ethanol và aceton ở các nồng độ khác nhau (Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị
Xuân Sâm, 2009b).
5.1.1 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng
(NH4)2SO4
Trong thí nghiệm này, enzyme PME thô được kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 ở các tỷ lệ
khác nhau. Qua khảo sát sơ bộ cho thấy tỷ lệ (NH 4)2SO4 và PME thô nhỏ hơn 30%
(w/v) gây kết tủa rất ít protein. Do đó, thí nghiệm chỉ được bố trí các phân đoạn kết
tủa (NH4)2SO4 từ 35% đến 85% (w/v). Hiệu quả của quá trình kết tủa được đánh giá
thông qua các chỉ tiêu như hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch. Số liệu
được thu thập, xử lý và tổng hợp ở bảng 4.
Bảng 4: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 : Protein Hoạt tính Hoạt tính riêng Hiệu suất Độ tinh sạch
PME thô (w/v) (mg/mL) (U/mL) (U/mg protein) thu hồi (%) (lần)
Đối chứng 38,30 44,60 1,26a 100a 1,00a
35 - 45% 7,75 14,50 1,87a 32,51de 1,49a
45 - 55% 5,65 16,75 2,98b 37,56c 2,39b
55 - 65% 4,05 27,75 6,87d 62,23b 5,45d
65 - 75% 3,04 15,50 5,11c 34,75cd 4,06c
75 - 85% 2,73 12,50 4,58c 28,03e 3,63c
85 - 95% 2,32 8,50 3,66b 19,06f 2,91b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%
Trang 31
Dựa vào bảng số liệu có thể thấy, sự thay đổi nồng độ (NH 4)2SO4 trong dung dịch
PME thô có ảnh hưởng đến lượng protein kết tủa, hoạt tính, hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch của enzyme.
Ở các phân đoạn muối ammonium sulfate càng cao thì lượng protein kết tủa càng
nhiều. Điều này được giải thích là do các ion của phân tử (NH 4)2SO4 liên kết với các
phân tử nước làm cho protein mất lớp áo nước, liên kết lại với nhau và hình thành kết
tủa (Mukherjee & Banerjee, 2006). Tuy nhiên, kết quả từ bảng 4 cho thấy hàm lượng
protein hòa tan trở lại sau khi kết tủa càng thấp khi nồng độ hóa chất kết tủa tăng.
Hàm lượng protein hòa tan sau kết tủa cho biết hiệu quả thu hồi của tất cả các enzyme
và protein trong hỗn hợp enzyme thô. Tuy nhiên, hoạt tính PME, hoạt tính riêng, hiệu
suất thu hồi cũng như độ tinh sạch có ý nghĩa quan trọng hơn trong việc đánh giá hiệu
quả giữa các phương pháp áp dụng. Kết quả thí nghiệm cho thấy, hoạt tính PME cũng
như hoạt tính riêng và độ tinh sạch không quan hệ tuyến tính với hàm lượng protein
hòa tan sau kết tủa. Điều này là do mỗi loại enzyme có mức độ ion hóa, hydrate hóa
và ái lực với nước khác nhau. Do vậy, đối với mẫu kết tủa ở phân đoạn 35 ÷ 45 %
(NH4)2SO4, hoạt tính enzyme PME cũng như độ tinh sạch khá thấp mặc dù hàm lượng
protein cao nhất. Trái lại, mẫu kết tủa ở phân đoạn 55 ÷ 65% (NH4)2SO4 cho hiệu quả
tinh sạch tốt nhất (hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao). Khi nồng độ
(NH4)2SO4 được sử dụng ở các phân đoạn cao hơn 55 ÷ 65% thì hiệu quả tinh sạch
giảm dần, phù hợp với kết quả về hàm lượng protein thu hồi. Điều này cho thấy, việc
sử dụng nồng độ (NH4)2SO4 quá cao cũng làm biến tính không thuận nghịch enzyme
PME (Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b). Theo nghiên cứu của Jaffar et
al. (1993), nồng độ muối bão hòa được sử dụng cho quá trình kết tủa enzyme tùy
thuộc vào loại enzyme, nguồn gốc thu nhận enzyme và thường từ 60 đến 80%. Tuy
nhiên, nghiên cứu hiệu quả kết tủa bằng muối (NH 4)2SO4 cho polygalacturonase từ
A. awamori, một trong những enzyme của hệ pectinase của Ngo et al. (2008) cũng xác
nhận, nồng độ muối thích hợp cho quá trình kết tủa là 47,2%. Arotupin et al. (2008)
cũng tìm thấy hiệu quả của việc ứng dụng (NH4)2SO4 trong kết tủa PME thô từ
A. repens, tuy nhiên hiệu suất thu hồi của tiến trình này cũng chỉ đạt 56,82% và độ
tinh sạch 2,5 lần.
Trang 32
Như vậy, phân đoạn sử dụng thích hợp nhất của (NH4)2SO4 cho quá trình kết tủa
enzyme PME là 55%, khi đó hoạt tính riêng của PME đạt 6,87 U/mg protein, độ tinh
sạch 5,45 lần và hiệu suất thu hồi là 62,23%. Nhìn chung, hiệu suất thu hồi PME từ
quá trình kết tủa với (NH4)2SO4 vẫn khá thấp. Chính vì vậy, nghiên cứu sử dụng loại
chất tan khác trong quá trình kết tủa protein cũng được đề nghị.
5.1.2 Đánh giá khả năng kết tủa enzyme PME từ Aspergillus niger bằng NaCl
Bên cạnh (NH4)2SO4, NaCl cũng có tác dụng tương tự trong kết tủa protein. Muối
NaCl có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao cũng như tính hút nước mạnh nên dễ làm
kết tủa enzyme. Chính vì vậy, thí nghiệm được bố trí với các phân đoạn NaCl từ 15%
đến 35% (w/v) (thấp hơn so với tỷ lệ (NH4)2SO4 và PME thô). Hiệu quả của quá trình
kết tủa cũng được đánh giá thông qua các chỉ tiêu như hoạt tính riêng, hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch. Kết quả được trình bày ở bảng 5.
Bảng 5: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với NaCl
NaCl : PME Protein Hoạt tính Hoạt tính riêng Hiệu suất Độ tinh sạch
thô (w/v) (mg/mL) (U/mL) (U/mg protein) thu hồi (%) (lần)
Đối chứng 38,30 44,60 1,26a 100a 1,00a
0 - 15% 7,56 15,50 2,05b 34,75f 1,62a
15 - 20% 5,37 23,50 4,34c 52,13e 3,44b
20 - 25% 5,88 34,95 5,95d 78,36d 4,76c
25 - 30% 4,94 41,30 8,37f 92,60b 6,67d
30 - 35% 4,99 37,90 7,60e 84,98c 6,06d
Tương tự như tác dụng kết tủa của muối (NH4)2SO4, các protein khác không phải PME
kết tủa nhiều ở nồng độ muối thấp, tương ứng với hàm lượng protein thu được nhiều.
Hiệu quả tinh sạch PME tối ưu ở phân đoạn NaCl sử dụng là 25% - 30%.
Ở nồng độ muối NaCl cao hơn cũng làm biến tính bất thuận nghịch enzyme PME nên
hoạt tính và hiệu suất thu hồi cũng như độ tinh sạch thấp.
Ngo et al. (2008) cũng tìm thấy tỷ lệ NaCl tối ưu 35% cho việc kết tủa PG từ
Aspergillus awamori với độ tinh sạch tăng 5,3 lần, tuy nhiên hiệu suất thu hồi chỉ đạt
48,87%.
Muối (NH4)2SO4, NaCl là các chất kết tủa protein rẻ tiền, dễ kiếm và ít làm biến tính
protein. Tuy nhiên, muối phải được loại ra khỏi enzyme sau quá trình kết tủa. Trái lại,
ethanol, aceton là các dung môi hữu cơ đắt tiền hơn nhưng công đoạn loại dung môi
sau kết tủa được thực hiện dễ dàng hơn bằng cách cho dung môi bay hơi tự nhiên.
Hiệu quả của việc kết tủa enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà quan trọng nhất là
đặc tính của từng enzyme và nguồn gốc của nó. Do vậy, việc khảo sát ảnh hưởng của
Trang 33
nhiều loại hóa chất khác nhau đến hiệu quả kết tủa enzyme PME từ A. niger được thực
hiện nhằm tìm ra biện pháp kết tủa thích hợp nhất.
5.1.3 Ảnh hưởng của việc sử dụng dung môi hữu cơ đến khả năng kết tủa
Đối với kết tủa bằng dung môi hữu cơ, aceton và ethanol được làm lạnh trước đến
nhiệt độ –5 ± 0,5 oC, cho chầm chậm vào các ống nghiệm chứa enzyme thô với các tỷ
lệ khác nhau, lắc nhẹ và để ổn định 2 giờ ở 4 oC.
Sau đó, kết tủa thu được bằng cách ly tâm mẫu ở 4 oC, 10000 vòng/phút (khoảng
11173 g) trong 15 phút. Phần kết tủa được hòa tan bằng dung dịch đệm
citrat/phosphate pH 4,5. Hoạt tính PME, hàm lượng protein và độ tinh sạch được xác
định. Kết quả được trình bày ở bảng 6 và 7.
Bảng 6: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với ethanol
Ethanol và
Protein Hoạt tính Hoạt tính riêng Hiệu suất Độ tinh sạch
PME thô
(mg/mL) (U/mL) (U/mg protein) thu hồi (%) (lần)
(v/v)
Đối chứng 38,30 44,60 1,26a 100a 1,00a
1,5 8,83 14,70 1,67a 30,96f 1,33ab
2,0 7,19 22,80 3,17b 51,12d 2,53b
2,5 6,80 34,60 5,09c 77,58c 4,04c
3,0 4,07 40,80 10,02e 91,48b 7,98d
3,5 4,13 35,80 8,67d 80,27c 6,93d
4,0 6,54 18,25 2,81b 40,92e 2,26ab
Bảng 7: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng phương pháp kết tủa với aceton
Aceton và
Protein Hoạt tính Hoạt tính riêng Hiệu suất Độ tinh sạch
PME thô
(mg/mL) (U/mL) (U/mg protein) thu hồi (%) (lần)
(v/v)
Đối chứng 38,30 44,60 1,26a 100a 1,00a
1,0 5,22 6,66 1,28a 14,84d 1,01a
1,5 3,45 14,96 4,40c 33,54b 3,47d
2,0 3,33 8,45 2,55b 18,94c 2,02c
2,5 3,14 6,02 1,92ab 13,49d 1,52b
Một tỷ lệ thích hợp của acetone và dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi
của môi trường, giúp các phân tử nước áo bên ngoài protein có khuynh hướng bị đẩy
đi, vì thế các phân tử protein có cơ hội liên kết với nhau và kết tủa xuống. Theo
Trang 34
Rosenberg (2005), thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme làm giảm điểm đẳng
điện của chúng, vì vậy tăng khả năng liên kết của các phân tử protein, dẫn đến tăng
hiệu suất thu hồi của enzyme thu được. Ở các tỷ lệ tiếp theo, hoạt tính enzyme và hiệu
suất thu hồi đều giảm dần. Điều này có thể được giải thích là do enzyme PME thô thu
được ít bền vững, đồng thời bản chất enzyme là protein nên khi gặp dung môi hữu cơ
có hoạt tính khá mạnh như acetone, enzyme dễ dàng bị phá hủy khi bổ sung lượng
acetone quá nhiều vào để kết tủa. Trên thế giới chưa có nhiều kết quả công bố về hiệu
quả kết tủa protein để tinh sạch enzyme PME từ A. niger bằng acetone, tuy nhiên sự
thành công của việc sử dụng acetone đối với một vài enzyme khác cũng được ghi
nhận. Quá trình tinh sạch enzyme endo-PG từ A. awamori cũng cho thấy hiệu quả kết
tủa protein ở tỷ lệ enzyme và dung môi là 40:60 (v/v) (Ngo et al., 2008).
Việc ứng dụng phương pháp kết tủa bằng ethanol cho thấy hiệu quả tinh sạch PME tốt
hơn trường hợp sử dụng acetone. Ứng với các tỷ lệ enzyme : ethanol tăng dần từ
1 : 1,5 đến 1 : 3, hiệu suất thu hồi enzyme, độ tinh sạch cũng như hoạt tính riêng của
PME gia tăng. Khi lượng dung môi sử dụng tăng vượt quá 1: 3 thúc đẩy sự phá hủy
enzyme, dẫn đến hiệu quả tinh sạch giảm. Ở tỷ lệ enzyme và ethanol là 1 : 3, hoạt tính
riêng đạt cực đại (10,02 U/mg protein), hiệu suất thu hồi cũng khá cao (91,48%) và độ
tinh sạch tăng đáng kể so với mẫu đối chứng (3,47 lần).
Mỗi loại enzyme có khả năng kết tủa khác nhau với từng loại hóa chất cụ thể cũng
như tỷ lệ sử dụng chúng. Do vậy, bên cạnh việc tìm ra tỷ lệ sử dụng thích hợp nhất
của từng loại hóa chất trong quá trình kết tủa PME thì hiệu quả sử dụng của các loại
hóa chất cần được so sánh nhằm tìm ra biện pháp tối ưu nhất cho kết tủa PME cho
enzyme có độ tinh sạch cao, tỷ lệ thu hồi lớn cũng như gia tăng khả năng ứng dụng
enzyme. Hiệu quả kết tủa PME của các loại hóa chất khác nhau ở tỷ lệ thích hợp nhất
của từng loại hóa chất được thống kê và trình bày ở bảng 8.
Bảng 8: So sánh hiệu quả tinh sạch enzyme PME bằng các loại hóa chất khác nhau
Hóa chất Tỷ lệ Hoạt tính riêng Hiệu suất Độ tinh
hóa chất và PME thô (U/mg protein) thu hồi (%) sạch (lần)
Đối chứng 1,26a 100a 1,00a

(NH4)2SO4 55 - 65% (w/v) 6,87c 62,23c 5,45c
NaCl 25 - 30% (w/v) 8,37d 92,60b 6,67d
Ethanol 3:1 (v/v) 10,02e 91,48b 7,98e
Aceton 1,5:1 (v/v) 4,40b 33,54d 3,47b
Dựa vào kết quả tổng hợp ở bảng 8 cho thấy phương pháp kết tủa cải thiện đáng kể
hoạt tính PME. Hoạt tính riêng của PME của các mẫu kết tủa đều cao hơn và có sự
Trang 35
khác biệt ý nghĩa so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên, các loại hóa chất khác nhau có
hiệu quả kết tủa PME rất khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê 5%. Phương pháp kết tủa
bằng aceton cho hiệu quả kết tủa nhỏ nhất ở tất cả các chỉ tiêu về hoạt tính riêng cũng
như hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch. Điều này có thể do hằng số điện môi do aceton
tạo ra không thích hợp hoặc chưa đủ kết tủa PME. Đặc biệt, PME dễ bị biến tính khi
thêm aceton vào dung dịch enzyme. So với aceton thì muối (NH4)2SO4 cho hiệu quả
kết tủa tương đối cao hơn và có sự khác biệt ở mức ý nghĩa thống kê 5%. Tuy nhiên,
hiệu suất thu hồi cũng như các chỉ tiêu về độ tinh sạch và hoạt tính riêng vẫn còn thấp
hơn so với phương pháp kết tủa bằng NaCl.
Điều này cho thấy, việc lựa chọn loại hóa chất thích hợp cho việc kết tủa enzyme còn
tùy thuộc vào từng loại enzyme riêng biệt và điều kiện nuôi cấy khác nhau.
5.1.4 Tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ Aspergillus niger bằng phương pháp lọc
màng
Trong thí nghiệm này, hai mẫu enzyme đã được kết tủa trước đó bằng ethanol (tỷ lệ
3:1) và phân đoạn NaCl 25 - 30% được hòa tan lại trong dung dịch đệm ở pH 4,5 và
bơm qua hệ thống màng (hollow fibre) ở khoảng phân đoạn 50 kDa và tốc độ bơm
mẫu 150 rpm.
Bảng 9: Hiệu quả tinh sạch enzyme PME từ A. niger sau quá trình lọc màng
Hoạt tính riêng Độ tinh sạch Hiệu suất
Mẫu enzyme
(U/mgprotein) (lần) (%)
PME thô sau kết tủa bằng ethanol (3:1) 15,63 ± 1,12 12,40 ± 0,89 31,67 ± 2,01
PME thô sau kết tủa bằng NaCl 25-30% 11,14 ± 0,87 8,84 ± 0,69 28,72 ± 2,16
Kết quả thu được ở bảng 9 cho thấy, hiệu quả thu hồi PME đạt được cho hai trường
hợp này là 31,67% và 28,72% tương ứng với PME thô đã được kết tủa với ethanol và
NaCl. Hoạt tính riêng của PME đã qua kết tủa bằng ethanol trước khi lọc màng là
15,63 U/mgprotein trong khi trường hợp của mẫu kết tủa bằng NaCl, hoạt tính riêng thu
được chỉ đạt 11,14 U/ mgprotein. Hoạt tính riêng cao của mẫu enzyme sau bước kết tủa
bằng ethanol có lẽ là điều kiện thuận lợi cho việc thu nhận PME có độ tinh sạch cao
hơn.
Kết quả cũng cho thấy hiệu quả của việc sử dụng ethanol trong việc kết tủa sơ bộ
enzyme, tăng hiệu quả tinh sạch PME ở các bước tiếp theo.
Tiến hành chạy điện di PME sau khi lọc màng nhằm khẳng định hiệu quả tinh sạch
PME và xác định khối lượng phân tử của enzyme thu được.
Trang 36
100 kDa
75 kDa
50 kDa
37 kDa
29 kDa
15 kDa
0 1 2 3
Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE các mẫu enzyme PME từ A. niger
0: Thang chuẩn
1: Mẫu enzyme thô sau trích ly, siêu lọc 0,2 m
2: Enzyme PME sau quá trình kết tủa ethanol 1: 3 (v/v), lọc màng 50 kDa
3: Enzyme PME sau quá trình kết tủa bằng NaCl 30%, lọc màng 50 kDa
Từ kết quả điện di trên gel SDS–PAGE ở hình 10, có thể nhận thấy mẫu enzyme thô
ngay sau trích ly (giếng 2, mẫu 1) có sự hiện diện cao của protein nằm trong khoảng
khối lượng phân tử từ 37 đến 50 kDa, phù hợp với các khảo sát trước đó cho enzyme
PME. Duvetter (2007) đã xác định được khối lượng phân tử của enzyme PME tái tổ
hợp từ A. aculeatus là 41 kDa, Reignaut (1994) cũng xác định được khối lượng phân
tử của enzyme PME từ Botrytis cinerea trên SDS–PAGE là 42 kDa. Khanh et al.
(1991) đã phân lập pectin methylesterase từ A. niger RH5344 và xác định đây chính là
glycoprotein chứa 314 acid amin, có khối lượng phân tử 45 kDa.
Enzyme thô sau khi qua siêu lọc 0,2 µm nhằm loại bỏ vi khuẩn và các tạp chất cho kết
quả điện di với 4 băng phân tách rõ nằm ở khoảng 100 kDa, 65 kDa, 37 ÷ 50 kDa và
32 kDa. Hàm lượng protein tập trung cao nhất ở khoảng khối lượng phân tử từ
37 ÷ 50 kDa với dải băng rõ và đậm nhất. Trong trường hợp PME đã qua kết tủa
ethanol và NaCl kết hợp với lọc màng, kết quả điện di chỉ cho thấy có sự hiện diện
của hai băng với một băng chính lớn nhất có khối lượng phân tử là 43 kDa và một
Trang 37
băng nhạt hơn nằm ở khoảng khối lượng phân tử 32 kDa. Điều này cho phép kết luận
enzyme PME từ A. niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa, phù hợp với các
nghiên cứu trước đó cho PME từ vi sinh vật. Tuy nhiên, sự hiện của một protein khác
có khối lượng phân tử 32 kDa cho thấy, phương pháp lọc màng chưa là giải pháp hữu
hiệu để tinh sạch hoàn toàn enzyme PME. Chính vì vậy, cần phải có các giải pháp tiếp
theo nhằm tinh sạch PME hiệu quả hơn.
Do mức độ tinh sạch enzyme sau lọc màng còn thấp, chính vì thế việc xác định pI của
enzyme này chưa được tiến hành. Mặc dù vậy, việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến
hoạt tính enzyme PME từ A. niger vẫn được xác định, làm cơ sở cho việc sử dụng
enzyme này trong tương lai.
5.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỐNG ĐỘ PECTIN ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME
PME TỪ ASPERGILLUS NIGER
Bên cạnh nhiệt độ và pH thì Km và Vmax là hai thông số đặc biệt quan trọng trong
nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Tốc độ phản ứng cực đại (V max) cho biết khả năng
phản ứng của enzyme trên một cơ chất nhất định ở điều kiện giống nhau về nhiệt độ,
pH…Do đó, giá trị Vmax của một enzyme có vai trò quan trọng trong việc lựa chọn
nồng độ enzyme và cơ chất thích hợp trong các quá trình ứng dụng. Ngoài ra, việc
đánh giá hoạt động của enzyme còn dựa vào ái lực của enzyme và cơ chất thông qua
giá trị Km của enzyme đó. Km lớn cho thấy ái lực giữa enzyme và cơ chất thấp và
ngược lại (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Giá trị Vmax và Km của enzyme PME từ Aspergillus niger được xác định bằng cách bổ
sung enzyme PME vào 30 mL dung dịch pectin ở các nồng độ khác nhau. Mối quan
hệ giữa nồng độ pectin và hoạt tính enzyme PME được trình bày ở hình 11.
Từ kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ cơ chất có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt
tính enzyme PME từ A. niger (hình 11). Nhìn chung, sự tăng nồng độ cơ chất sẽ thúc
đẩy sự gia tăng hoạt tính enzyme. Kết quả ở bảng 10 cho thấy hoạt tính enzyme tăng
nhanh khi nồng độ cơ chất pectin tăng từ 0 đến 4 g/L. Sự tăng hoạt tính do tăng nồng
độ cơ chất có thể là do gia tăng sự tiếp xúc và liên kết giữa cơ chất và enzyme. Tuy
nhiên, ở các nồng độ cơ chất pectin cao hơn (4 ÷ 10 g/L) thì hoạt tính enzyme PME từ
A. niger hầu như không có sự thay đổi. Murray et al., (1990) đã chứng minh rằng sự
tăng nồng độ cơ chất vượt qua nồng độ tối ưu sẽ không làm tăng hoạt tính enzyme.
Trang 38
Hình 11: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger
Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ pectin đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger
Nồng độ pectin (g/L) Hoạt tính PME (U/mL)

0 0a
0,25 14,5b
0,50 22,2c
1,00 33,4d
2,00 42,3e
3,50 46,0f
4,00 47,2g
6,00 49,0h
8,00 49,2h
10,0 49,4h
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%
Chữ số in đậm thể hiện đổi hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại
Thông qua việc thống kê các số liệu thí nghiệm và phương trình Michaelis – Menten,
giá trị Km và Vmax của enzyme PME từ A. niger lần lượt là 0,6668 ± 0,0379 g/L và
54,1105 ± 0,6660 U/mL.
Kết quả này cho thấy enzyme PME từ A. niger có khả năng ứng dụng cao do độ nhạy
của enzyme lớn (Km nhỏ) so với PME từ các chủng nấm mốc khác. Duvetter (2007) đã
kết luận giá trị Km của PME từ A. aculeatus là 1,4 ± 0,07 g/L theo cùng phương pháp
xác định. Bên cạnh đó, Christgau et al., (1996) đã xác định giá trị Km của PME từ A.
aculeatus là 2,7 g/L khi sử dụng phương pháp xác định hoạt tính enzyme ở nhiệt độ
30 0C và không bổ sung NaCl vào cơ chất.
Trang 39
So với giá trị Km của PME từ nấm mốc, giá trị K m của PME từ thực vật thường có giá
trị thấp hơn. Giá trị Km của PME từ thực vật như dâu, chuối, carrot và táo lần lượt là
0,42 g/L, 0,15 g/L, 0,20 g/L và 0,10 g/L (Denes et al., 2000, Ly Nguyen et al., 2002).
Điều này chứng tỏ, hằng số K m tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme và phương pháp xác
định hoạt tính.
5.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH PECTIN

METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính xúc tác enzyme. Cũng
như các phản ứng hoá học thông thường, vận tốc phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ
tăng. Tuy nhiên, enzyme có bản chất là protein nên không bền dưới tác dụng của nhiệt
độ cao hơn 70 oC, tại nhiệt độ này phần lớn phân tử enzyme bị biến tính hoàn toàn dẫn
đến mất hoạt tính xúc tác của nó (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Chính vì thế, thí nghiệm
khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến hoạt tính PME từ nấm mốc A. niger
được thực hiện.
Enzyme PME từ A. niger được gia nhiệt ở 7 mức nhiệt độ khác nhau và hoạt tính
enzyme với từng mức nhiệt độ khảo sát được tổng hợp ở bảng 11.
Bảng 11: Sự thay đổi hoạt tính enzyme PME từ A. niger do ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ Mức độ thay đổi hoạt tính (A/A0)
30 1,00b
35 1,64d
40 2,83g
45 2,16f
50 1,83e
55 1,18c
60 0,49a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%
Chữ số in đậm thể hiện mức độ thay đổi hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại (với hoạt tính của PME
ở nhiệt độ 30ºC được xem là mẫu đối chứng)
Từ kết quả thu được ở bảng 11 cho thấy, nhiệt độ môi trường tối thích cho hoạt động
của enzyme PME từ A. niger là 40 °C. Ứng với điều kiện nhiệt độ này, hoạt tính
enzyme PME thể hiện cao nhất (tăng gấp 2,83 lần so với mẫu đối chứng) và khác biệt
có ý nghĩa ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại.
Khi nhiệt độ thấp hơn hay cao hơn so với nhiệt độ tối ưu sẽ làm giảm hoạt tính
enzyme. Thông thường, nhiệt độ tối thích của hầu hết enzyme thay đổi trong khoảng
40 ÷ 60 °C (Mathewson, 1998). Trong trường hợp khảo sát, tương ứng với khoảng
nhiệt độ phản ứng từ 35 °C đến 55 °C, hoạt tính PME từ A. niger có xu hướng gia tăng
từ 1,18 lần đến 2,83 lần đối với mẫu PME hoạt động ở nhiệt độ 30 °C. Khi nhiệt độ
Trang 40
môi trường tiếp tục tăng (trường hợp khảo sát là 60 ºC), có sự giảm đáng kể hoạt tính
của PME được ghi nhận. Hoạt tính của PME ở nhiệt độ 60ºC giảm còn 50% khi so
sánh với mẫu đối chứng (ở 30ºC). Kết quả này cũng trùng hợp với các nghiên cứu
trước đó về mức nhiệt độ tối thích cho hoạt động của PME. Theo nghiên cứu của
Nikolic & Mojovic (2007), nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme PME từ nấm
mốc là 45 oC ở pH 3,5. Theo nghiên cứu của Duvetter (2007), nhiệt độ thích hợp cho
phản ứng của enzyme PME từ A. aculeatus là 30 ÷ 55ºC.
Từ kết quả đã khảo sát, nhiệt độ môi trường là 40 oC được chọn là điều kiện thích hợp
cho hoạt động PME từ A. niger.
5.4 ĐỘNG HỌC SỰ VÔ HOẠT NHIỆT CỦA PECTIN

Nhiệt độ cao thường được sử dụng trong các quá trình chế biến thực phẩm. Tuy nhiên,
nhiệt độ cao có thể gây bất hoạt enzyme PME, ảnh hưởng đến hiệu quả sử dụng
enzyme này. Trong một số tiến trình chế biến, enzyme PME có thể được kích hoạt
trong công đoạn này nhưng sự hoạt động của nó ở các giai đoạn tiếp theo lại tạo sự bất
lợi cho sản phẩm. Do vậy, bên cạnh việc xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu thì hiệu
quả vô hoạt nhiệt PME cũng không kém phần quan trọng trong việc ứng dụng enzyme
này (Sajjaanantakul & Pitifer, 1991). Thí nghiệm được thực hiện nhằm đưa ra những
đề xuất thích hợp trong các quá trình ứng dụng PME trong chế biến thực phẩm .
Enzyme PME sau khi tinh sạch sơ bộ được xử lý nhiệt ở 50 °C, 60 °C và 70 °C trong
các khoảng thời gian khác nhau từ 0 đến 50 phút. Hoạt tính còn lại của enzyme này
được xác định bằng phương pháp chuẩn độ điện thế. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự
vô hoạt nhiệt PME từ A. niger tuân theo mô hình động học biến đổi một phần
(Fractional conversion model) (hình 12).
Hình 12 cho thấy sự vô hoạt nhiệt PME từ A. niger phụ thuộc lớn vào nhiệt độ và thời
gian xử lý. Quá trình xử lý nhiệt càng dài, nhiệt độ càng cao thì enzyme bị vô hoạt
càng nhiều. Sự vô hoạt nhiệt phụ thuộc lớn vào nhiệt độ khi xử lý nhiệt trong thời gian
ngắn. Tốc độ vô hoạt nhiệt tăng khi tăng nhiệt độ xử lý tăng từ 50 đến 70 °C. Khi thời
gian xử lý nhiệt tăng từ 0 đến 10 phút thì hoạt tính enzyme giảm hơn 60%. Phần
không bền nhiệt của enzyme chiếm khoảng 60%, phần này sẽ bị bất hoạt nhiệt rất
nhanh trong thời gian ngắn. Phần bền nhiệt tương đối ổn định với nhiệt độ do đó hoạt
tính enzyme giảm chậm hơn trong thời gian sau đó. Trái lại, tốc độ vô hoạt nhiệt hầu
như không có sự khác biệt ý nghĩa khi xử lý nhiệt trong thời gian dài. Từ sau khoảng
thời gian 30 phút, tốc vô hoạt nhiệt không có sự khác biệt giữa các mẫu xử lý ở các
nhiệt độ khác nhau.
Trang 41
Hình 12: Phương trình biểu thị sự vô hoạt nhiệt của enzyme PME từ A. niger
Bảng 12: Các thông số động học của quá trình bất hoạt nhiệt enzyme PME từ A. niger
Nhiệt k (1/phút) D (phút) A∞ (%) Phương trình động học

độ (oC)
50 0,135 ± 0,002 17,056 ± 0,244 2,291 ± 0,132 A = 2,2905 + 43,7095.exp(–0,1350t)

60 0,187 ± 0,005 12,320 ± 0,318 1,788 ± 0,194 A = 1,7881 + 44,2119.exp(–0,1869t)
70 0,286 ± 0,005 8,043 ± 0,146 0,888 ± 0,102 A = 0,8884 + 45,1116.exp(–0,2863t)
Ea = 34,566 ±
REa2 = 0,995
3,289 kJ/mol
Hệ số tốc độ vô hoạt (k) PME từ A. niger ở 50 0C, 60 0C và 70 0C lần lượt là 0,135,

0,187 và 0,286 phút–1 tương ứng với giá trị D là 17,0562, 12,320 và 8,043 phút. Kết quả
này cho thấy PME từ A. niger kém bền nhiệt hơn so với PME từ các nguồn khác.
Christgau et al. (1996) kết luận PME từ A. aculeatus có hệ số tốc độ vô hoạt k = 0,009
phút–1 ở 57 0C. Bên cạnh đó, hệ số k của PME chuối, carot và dâu tây lần lượt là 0,009
(65 oC); 0,6814 (60 oC); 0,1271 phút–1 (60 oC) (Ly Nguyen et al., 2002).
Dựa trên kết quả thu được ở bảng 12, phần ổn định nhiệt của enzyme PME từ A. niger
ở nhiệt độ 50 oC chiếm tỷ lệ khoảng 2,29% so với tổng hoạt tính và giảm dần ở các
điều kiện nhiệt độ cao hơn (A ở 60 và 70 oC lần lượt là 1,7881 % và 0,884%). So sánh
với khảo sát trước đó của Ly Nguyen et al. (2002), phần ổn định nhiệt của PME từ
dâu tây chiếm 11,2 % ± 1,4 ở nhiệt độ 60 oC. Năng lượng hoạt hóa cho tốc độ vô hoạt
PME từ A. niger là 34,566 ± 3,289 kJ/mol, thấp hơn hẳn các enzyme PME có nguồn
gốc từ thực vật (Ea của PME từ dâu tây là 206,7 ± 38,4 kJ/mol) (Ly Nguyen et al.,
Trang 42
2002). Điều này góp phần khẳng định một lần nữa tính không bền nhiệt của PME từ
A. niger.
5.5 ẢNH HƯỞNG CỦA PH ĐẾN SỰ ỔN ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PECTIN
Hoạt động của enzyme rất nhạy với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi enzyme đều
có một khoảng pH thích hợp mà tại đó tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Ngoài
khoảng giá trị pH đó thì tốc độ phản ứng của enzyme sẽ giảm dần (Nguyễn Đức
Lượng, 2004). Tuy nhiên, mỗi loại enzyme có pH tối thích khác nhau phụ thuộc vào
nguồn gốc, nhiệt độ, cơ chất... Thông thường, enzyme PME từ thực vật và vi khuẩn có
pH tối thích trong khoảng từ 6 ÷ 8. Trái lại, enzyme PME từ nấm mốc thường có pH
tối ưu thấp hơn (4 ÷ 6) (Benen et al., 2003). Vì thế, việc nghiên cứu ảnh hưởng của
pH của môi trường đến hoạt tính enzyme cần phải được thực hiện cho từng loại
enzyme cụ thể. Từ đó, có những đề xuất thích hợp cho quá trình ứng dụng enzyme
này.
Thí nghiệm được thực hiện ở điều kiện pH thay đổi với 8 mức độ. Hoạt tính của
enzyme PME từ A. niger tương ứng với từng giá trị pH được đo đạc, kết quả được
thống kê và tổng hợp ở bảng 13.
Bảng 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger
pH Hoạt tính PME (U/mL)

2,5 0a
3,0 2,0b
3,5 12,8 c
4,0 29,9e
4,5 46,0f
5,0 91,2h
5,5 61,2g
6,0 22,2d
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% .
Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME cao nhất so với các mẫu còn lại.
Kết quả ở bảng 13 cho thấy, enzyme PME có hoạt tính cao nhất tương ứng với pH
môi trường 5,0 và có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% so với các nghiệm thức còn lại.
Trong điều kiện khảo sát, khi pH môi trường tăng từ giá trị 3,5 đến 5,0 hoạt tính PME
có xu hướng tăng, nhưng khi pH môi trường tiếp tục tăng đến 6,0 thì có sự giảm đáng
kể hoạt tính của PME. Đối với mẫu có pH từ 2,5 ÷ 3,0 thì enzyme hầu như không có
Trang 43
hoạt tính. Sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào pH do sự thay đổi mức độ ion hóa
của cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme (Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn
Nghĩa, 2002).
Kết quả này cũng trùng hợp với các nghiên cứu trên thế giới cho các PME khác.
Maldonado et al., (1994) cũng tìm ra pH tối thích cho hoạt động của PME từ A. niger
(phân lập từ đất) là 5,0. Theo nghiên cứu của Christgau et al., (1996), giá trị pH tối
thích của PME từ A. aculeatus là 4,5 ÷ 4,6 ở nhiệt độ 30 oC. Tuy nhiên, nghiên cứu
gần đây của Duvetter (2007) cũng trên PME từ A. aculeatus lại cho thấy, enzyme này
hoạt động mạnh ở khoảng nhiệt độ 44–45 0C kết hợp với pH dao động trong khoảng
4,1÷ 4,2 trong khi giá trị pI là 3,9.
Từ kết quả thu được cho phép kết luận, hoạt độ của enzyme phụ thuộc rất lớn vào pH
môi trường. Enzyme PME trong điều kiện khảo sát đạt hoạt tính cao nhất ở pH 5,0,
điều này cho phép dự đoán pI nằm gần khoảng pH tối thích này.
5.6 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NACℓ VÀ CACℓ2 ĐẾN HOẠT TÍNH
CỦA PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER
Hoạt động của enzyme còn chịu sự ảnh hưởng của các chất hoạt hóa cũng như kìm
hãm enzyme. Các hợp chất ion được biết đến như chất hoạt hóa có ảnh hưởng đáng kể
đến đặc tính ổn định nhiệt của nhiều enzyme theo nhiều phương thức khác nhau
(Plaza et al., 2008). Nhiều nghiên cứu cho thấy ion Na+ và ion Ca2+ là những ion hoạt
hóa hiệu quả cho hoạt động của enzyme PME. Khả năng hoạt hóa enzyme của các ion
này phụ thuộc rất lớn vào nồng độ của chúng, loại enzyme và nguồn gốc thu nhận
enzyme (Arotupin, 2008; Plaza et al., 2008). Nồng độ ion Na+ và ion Ca2+ phù hợp sẽ
giúp hoạt hóa enzyme, nhưng nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế, làm cho enzyme giảm
hoạt tính. Do đó, việc lựa chọn nồng độ NaCl và CaCl2 thích hợp giúp tăng cao hoạt
tính enzyme PME từ A. niger là điều cần thiết.
5.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger
Thí nghiệm đã được tiến hành để khảo sát sự ảnh hưởng của NaCl ở các nồng độ khác
nhau đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger. Kết quả thu nhận thể hiện ở bảng 14.
Từ kết quả phân tích thống kê, có thể nhận thấy nồng độ NaCl có ảnh hưởng tích cực
đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger. Hoạt tính của PME khi được đo đạc trong
điều kiện có sự tham gia của NaCl đều gia tăng khác biệt có ý nghĩa (từ 2,5 đến 3,63
lần) khi so sánh với mẫu đối chứng (không có NaCl). Ở nồng độ NaCl 0,15 M (trong
dung dịch pectin 3,5 g/L), hoạt tính của PME tăng cao nhất (3,63 lần) khi so sánh với
trường hợp không có sự tham gia của NaCl.
Trang 44
Bảng 14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger
Nồng độ NaCl (M) Mức độ thay đổi hoạt tính (A/A0)

0 1,00a
0,05 3,00c
0,10 3,25d
0,12 3,38d
0,15 3,63e
0,20 2,50b
Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME còn lại cao nhất so với các mẫu khảo sát.
Tuy nhiên, tác động của NaCl đối với sự hoạt hóa enzyme có giá trị tới hạn. Ở nồng
độ NaCl cao hơn giá trị tối ưu (trường hợp này là 0,2 M), mức độ hoạt hóa enzyme
giảm dần, thể hiện ở giá trị hoạt tính của enzyme giảm, tuy nhiên vẫn cao hơn khi
không có sự hiện diện của ion Na+. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu
khác, ở mức nồng độ NaCl phổ biến (đến 0,2 M), hoạt tính của PME tăng cao ít nhất 2
lần khi so sánh với trường hợp không có sự tham gia của NaCl (Christgau,1996;
Duvetter, 2007; Arotupin, 2008).
5.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính của enzyme PME từ A. niger
Trong trường hợp sử dụng CaCl2, nồng độ ion Ca2+ sẽ thay đổi ở 6 giá trị: 0; 0,005;
0,075, 0,01; 0,0125; 0,015M. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 15.
Bảng 15: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger
Nồng độ CaCl2 (M) Mức độ thay đổi hoạt tính (A/A0)

0 1,00a
0,005 2,23c
0,0075 2,33c
0,01 2,60d
0,0125 2,67d
0,015 2,00b
Chữ số in đậm thể hiện hoạt tính PME còn lại cao nhất so với các mẫu khảo sát.
Kết quả ở bảng 15 cho thấy, CaCl2 cũng có vai trò tích cực trong việc hoạt hóa enzyme
PME, tuy nhiên hiệu quả kém hơn trường hợp sử dụng NaCl. Khi có sự hiện diện của
Trang 45
CaCl2, hoạt tính PME từ A. niger tăng từ 2 đến 2,67 lần khi so sánh với trường hợp
không có sự hiện diện của ion này. Hoạt tính PME đạt giá trị cao nhất trong khoảng
nồng độ CaCl2 từ 0,005 ÷ 0,0125M. Duvetter (2007), Christgau et al. (1996) cũng đưa
ra những kết quả và nhận xét tương tự. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, hoạt tính
của PME giảm nhẹ khi sử dụng CaCl2 ở nồng độ rất cao (2 M) và pH thấp (pH 3,0)
(Plaza et al., 2008).
Nói chung, tác dụng hoạt hóa của ion kim loại phụ thuộc rất lớn vào nồng độ của
chúng. Mức độ hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp
trong một giới hạn xác định, khi vượt qua ngưỡng nồng độ này, lại có tác dụng kìm
hãm hoạt động enzyme (Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2002).
Trang 46
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Việc nghiên cứu về phương pháp tinh sạch sơ bộ và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt
tính PME từ nấm mốc A. niger tạo tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả cho thấy, việc tinh sạch sơ bộ PME bằng ethanol với tỷ lệ enzyme và ethanol
là 1 : 3 (v/v) kết hợp với lọc màng ở khoảng phân đoạn 50 kDa đạt kết quả tốt nhất,
với hoạt tính riêng thu được là 15,63 U/mgprotein, độ tinh sạch đạt được là 12,40 ± 0,89
khi so sánh với mẫu enzyme thô. Kết quả nhận diện PME trên SDS–PAGE đã xác
định khối lượng phân tử của enzyme này đạt khoảng 43 kDa.
PME từ A. niger có hằng số Michaelis–Menten Km là 0,6668 ± 0,0379 g/L. Đồng thời,
nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của PME là 40 ºC ứng với độ tăng hoạt tính gấp 2,83
lần so với điều kiện chuẩn độ thông thường (30 ºC).
Phương trình bậc 1 chuyển đổi một phần được sử dụng để xác định sự bất hoạt nhiệt
PME của PME (pH 4,5). Hằng số tốc độ vô hoạt k tăng dần theo sự gia tăng nhiệt độ
và năng lượng hoạt hóa cho tiến trình này là 34,566 ± 3,289 kJ/mol.
Khi sử dụng dung dịch đệm citrate–phophate để điều chỉnh pH môi trường, ở pH 5,0
hoạt tính PME từ A. niger thu được cao nhất và có trị số 132,3 U/mL.
Ngoài ra, NaCl và CaCl2 đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của enzyme
PME từ A. niger. Khi bổ sung NaCl 0,15 M hoặc CaCl2 0,01 M thì hoạt tính enzyme
PME từ A. niger lần lượt tăng gấp 3,625 và 2,67 lần so với mẫu đối chứng.
ĐỀ NGHỊ
– Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp tinh sạch khác như sắc ký lọc gel, sắc ký
trao đổi ion…
– Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp nhiệt độ và pH đến hoạt tính PME từ A. niger.
– Nghiên cứu ứng dụng enzyme PME trong các quá trình chế biến thực phẩm.
Trang 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm (2009a), Công nghệ protein. Trích dẫn từ: Cơ sở công nghệ
sinh học (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
Đặng Thị Thu và Nguyễn Thị Xuân Sâm (2009b), Công nghệ enzyme. Trích dẫn từ: Cơ sở công nghệ
sinh học (chủ biên Đặng Thị Thu), NXB Giáo dục, Việt Nam.
Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy và Nguyễn Xuân Sâm, (2004). Công nghệ
enzyme, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, Việt Nam.
Đỗ Quý Hai, Trần Thanh Phong, (2005). Giáo trình enzyme, NXB Đại học Huế, Việt Nam
Huỳnh Ngọc Oanh và Trần Ngọc Hùng, 2008. Thu nhận enzyme pectinase từ A.niger – Tinh sạch
bằng phương pháp lọc gel và lọc màng. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, số 8, tập số
11, Việt Nam.
Lê Ngọc Tú (2002). Hóa Sinh Công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Việt Nam.
Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức
Hợi, Lưu Dzuẫn, Lê Doãn Diên. (2004). Hóa sinh Công nghiệp. NXB Khoa Học và Kỷ Thuật, Hà
Nội, Việt Nam.
Lương Đức Phẩm, (2004). Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.
Nguyễn Đức Lượng, (2004). Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,
Việt Nam.
Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa. (2002). Enzyme và ứng dụng. NXB Giáo Dục. Hà Nội,
Việt Nam.
Tiếng Anh
Abarca M.L., F. Accensi , Cano J., F.J. Cabañes (2004), Taxonomy and significance of black
aspergillus. Antonie Van Leeuwenhoek 86, pp 33–49.
Arotupin, D.J, F.A. Akinyosoye, A.K. Onifade (2008), Purification and characterization of
pectinmethylesterase from Aspergillus repens isolated from cultivated soil. Africa Journal of
biotechnology, vol. 7(2), pp 1991-1998.
Ashok P., P. Selvakumar, R.S. Carlos & N. Poonam (2000), Solid state fermentation for the
production of industrial enzymes (I) , Process Biochem. 27, pp 109-117.
Baker, R.A. & L. Wicker (1996), Enzyme applications for agro–processing in developing countries:
an inventory of current and potential applications. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 14 (5), pp 611–619.
Bali R. (2003), Isolation of extracellular fungal pectinolytic enzymes and extraction of pectin using
kinnow waste as substrate. Thesis of master of science (biotechnology), India.
Banerjee R. (2006), Isolation and Purification of Enzyme. In: Enzyme Technology, A. Pandey, C.
Webb, C.R. Soccol, C. Larroche (Editors), Springer, pp. 515 – 532
Trang 48
Benen, J. A. E., Van Alebeek, G.–J. W. M., Voragen, A. G. J and Visser (2003a), Pectin esterases. In:
Handbook of food Enzymology; J. R. Whitaker, Voragen, A. G. J and Wong, D. W. S., Eds.;
Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 849 – 856.
Bordenave M. (1996), Analysis of pectin mtehyl esterases. In: Plant Cell Wall Analysis; Linskens, H.
F., Eds.; Springer, Berlin, 165–180.
Bordenave, M. & R. Goldberg (1993), Purification and characterization of pectin methylesterases
from mung bean hypocotyl cell walls. Phytochemistry, 33, pp: 99 – 1003
Bradford, M. M. (1976), A rapid and sensitive method for the Chemistry and Biochemistry, 33: pp
323–385.
Christgau S., Kofood, L. V. Halkier, T. Andersen, L. N. Hockauf, M.. Dorreich, K., H. Dalboge, And
Kauppinen, S. (1996), Pectin methyl esterases from Aspergillus aculeatus: expression cloning in
yeast and characterization of the recombinant enzyme. Biochemical Journal, 319, pp 705–712.
Degraeve P., R. Saurel & Y. Coutel (2003). Vacuum impregnation pretreatment with pectin
methylesterase to improve firmness of pasteurized fruits. Journal of Food Science, 68, pp 716–
721.
Denes J. M., A. Baron & J.F. Drilleau (2000). Purification, properties and heat inactivation of pectin
methyl esterase from apple (cv Golden Delicious). Journal of Science of Food and Agriculture,
80, pp. 1503–1509.
Dubbin D. (2005), A concentration and purification method using cross flow membrane filtration,
Filtration Techniques, 2, pp 1-3.
Duvetter T. (2007), Understanding the role of fungal pectin methylesterase in fruit texture
engineering, Docteraasproefschrift Nr. 729 aan de Faculteit Bio–ingenieurswetenschappen van de
KU. Leuven
Fawole O.B., S.A.Odunfa (2003), Some factors affecting production of pectic enzymes by Aspergillus
niger, Journal of International Biodeterioration 52 (4), pp 223 – 227.
Favelar-Torres E., T. V. Sepulveda and Vinneigra-Gonzales (2006), Production of hydrolytic
depolymerising pectinase, Biotechnol, 44(2), pp. 221-227.
Hamdy S., (2005). Purification and characterization of the pectin lyase produced by Rhizopus oryzae
grown on orange pells. Annal of Microbiology, 55 (3), 205 – 211.
Harris E. L. V. (1995), Concentration of Extracts, In: Protein Purification Techniques, Edited by
Harris E. L. V., and Angal S, Oxford University Press, New York, 125–161.
Ishii, S., K. Kiho, S. Sugiyama & H. Sugimoto (1979), Low–methoxyl pectin prepared by
pectinesterase from Aspergillus japonicus. Journal of Food Science, 44, 611–614.
Jaffar M.B., S. Oommen (1993), Production, purification and characterization of pectin
methylesterase (PME) from Arthrobotrys Oligospora. Journal of food biochemistry, 17 (1), pp
53-65.
Joshi V.K., M. Parmar, S. Rana (2006), Pectin Esterase Production from Apple Pomance in Solid–
State and Submerged Fermentation. Food Technology Biotechnology 44 (2), pp 253–256
Trang 49
Khanh N.Q., E. Ruttkowski , K. Leidinger , H. Albrecht, M. Gottschalk (1991), Characterization and

expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus niger, Gen, 106
(1), pp 71-77.
Laratta, B., R. Loiudice, A. Giovane, L. Quagliuolo, L. Servilllo and D. Castaldo (1995),
Thermostability of three pectinesterase isoenzymes in tomato fruit. Food Chemistry, 52, pp 415 –
418.
Leiting, V. A. & L.Wicker (1997), Inorganic cations and polyamines moderate pectinesterase activity.
Journal of Food Science, 62, pp 253–275.
Lewis K. C., T. Selzer, C. Shahar, Y. Udi, D. Tworowski and I. Sagi (2008), Inhibition of pectin
methyl esterase activity by green tea catechins, Phytochemistry, 69 (14), pp 2586-2592
Limberg G., R. Korner, H.C. Buchholt, T.M. Christensen, P. Roepstorff and J.D. Mikkelsen (2000),
Analysis of different de–esterification mechanisms for pectin by enzymatic fingerprinting using
endopectin lyase and endopolygalacturonase II from A. niger. Carbohydrate Research 327, pp
293–307.
Liners F., J. F. Thibault & P. Vancutsem (1992), Influence of the degree of polymerization of
oligogalacturonates and of esterification pattern of pectin on their recognition by monoclonal–
antibodies. Plant Physiology, 99, pp 1099–1104.
Luna G. I., M. Cantwell, D.M. Barrett (1999), Fresh–cut cantaloupe: effects of CaCl 2 dips and heat
treatments on firmness and metabolic activity, Postharvest Biology and Technology, 17, pp 201–
213.
Ly Nguyen, B., Van Loey, A., Fachin, D., Verlent, I. and Hendrickx, M. (2002). Purification,
characterization, thermal, and high-pressure inactivation of pectin methylesterase from bananas
(cv Cavendish). Biotechnology and Bioengineering, 78, 683-691.
Ly Nguyen B., (2004). The combined pressure temperature stability of plant pectin methylesterase
and their inhabitor, Docteraasproefschrift Nr. 630 aan de Faculteit Bio–ingenieurswetenschappen
van de KU. Leuven.
Maldonado M.C., A.M. Strasser de Saad, D. Callieri (1994), Purification and characterization of
Pectinesterase Produced by a Strain of Aspergillus niger, Current Microbiology, 28, pp 193-196.
Mathewson P.R. (1988), Enzymes. Inc., United State of American, pp 20-35
Micheli F (2001), Pectin methylesterase: cell wall enzymes with important roles in plant physiology.
Trends in plant Science, 6, pp 414–419.
Moustacas A.M. & J. Natri (1991), Pectin methylestarases metal–ions and plant cell–eall extension–
the role of metal–ions in plant cell–wall extension. Biochemistry Journal, 279, pp 351–354.
Mukherjee G. and R. Banerjee (2006), Effects of temperature, pH and additives on the activity of
tannase produced by a co-culture of Rhizopus oryzae and Aspergillus foetidus, World Journal
Microbiology Biotechnology, 22, pp 207-212.
Nari J., G. Noat and J. Ricard (1991), Pectin methylesterase, metal ions and plant cell–wall extension.
Hydrolysis of pectin by plant cell–wall pectin methylesterase, Biochemical Journal, 279, pp 343–
350.
Trang 50
Nath N. & S. Ranganna (1977), Tim/temperature relationship for thermal inactivation of

pectinestarse in madarine orange (Citrus leticulata Blanco), Journal of Food Technology, 12,
pp. 411 – 419
Nath N., A. Rao & R. Gupta (1983), Thermal resistance of pectin methylesterase in juice of pusa –
ruby tomatoes, Ind Food Packer. 37, pp 30 – 38.
Ngo L. T. A., T. L. Pham & V. V. M Le (2008), Purification of Endopolygalacturonase from
ubmerged Culture of Aspergillus awamori L1 Using a Two-step Procedure: Enzyme
recipitation and Gel Filtration. International Food Research Journal 15(2): 135-140
Nikolic, M.V and L. Mojovic (2007), Hydrolysis of apple pectin by the coordinated activity of pectic
enzymes, Food Chem 101 (1), pp.1-9.
Pilnik W. and A. G. J. Voragen (1993), Pectic enzymes in Fruit and Vegetable Juice Manufacture.
Enzymes in Food Processing, Academic Press Limited, London,Third Edition, 363– 392.
Pitt, J. I. and A. D. Hocking (1997), Fungi and Food Spoilage. Journal of Food Science, 44, pp 210–
241.
Reignault P., M. Mercier, G. Bompeix & M. Boccara (1994), Pectin methylesterase from Botrytis
cinerea: physiological, biochemical and immunochemical studies, Microbiology, 140, pp 3249-
3255.
Rexova–Benkova L. & O. Markovic (1976). Pectin enzymes, Advances in Carbohydrate Chemistry
and Biochemistry, 33, :pp 323–385.
Rosenberg I. M. (2005), Protein analysis and purification: Benchtop techniques. Birkhauser Boston,
The United Stated of America.
Sajjaanantakul T. & L. A. Pitifer (1991), Pectin. In: The Chemistry and Technology of Pectin, R.H.
Walter, (Editor), Academic Press, San Diego, CA, 135 – 145.
Schmitz T. (2002), A process for the preparation and purification of the enzyme pectin methyl
esterase. WO 03/000876.
Scopes R.K. (1994), Protein purification, principle and practice. Springer. New York Inc.
Sila, D., C. Smout, T.S. Vu & M. Hendrickx (2003), Effects of high pressure pretreatment and calci
soaking on the texture degradation kinetics of carrots. Poster presentation at ‘9th PhD Symposium
on Applied Biological Sciences’, October 16, 2003, Leuven, Belgium (Proceedings pp. 263–266).
Smout C., D.N. Sila, T.S. Vu, A.M.L. Van Loey, M.E.G. Hendrickx (2004), Effect of preheating and
calci pre–treatment on pectin structure and thermal texture degradation: a case study on carrots.
Journal of Food Engineering.
Schuster E., N. Dunn-Coleman, J.C. Frisvad and P. van Dijck (2002), On the safety of Aspergillus
niger – A review. Apply of Microbiology and Biotechnology, 59, pp 426-435
Tran T.T., T.N.H Le and V.M. Nguyen (2010), Optimal of medium composition for pectin esterase
(EC 3.1.1.11) biosynthesis in solid state fermentation by Aspergillus niger. Proceedings of Oral
presentation of the Food Innovation Asia Conference 2010: Indigenous Food Research and
Development to Global Market, June 17-18 2010, BITEC, Bangkok, Thailand, 381 – 390.
Trang 51
Tucker G.A (1993), Introduction. In: Seymorr G., J. Taylor and G. Tucker (edition), Biochemistry of
fruit ripening, Chapman and Hall, London.
van Dijck P. W.M., G.C.M. Selten and R.A. Hempenius (2003), On the safety of a new generation of
DSM Aspergillus niger enzyme production strains, Regulatory Toxicology and Pharmacology 38,
pp 27–35
Willats W. G. T., L. McCartney, W. Mackie & J. P. Knox, (2001). Pectin: cell biology and prospects
for functional analysis. Plant Molecular Biology, 47, pp 9–27.
Willats W. G. T., P. Knox & J. D. Mikkelsen, (2006). Pectin: new insights into an old polymer are
starting to gel. Trends in Food Science & Technology, 17, pp 97– 104.
Trang 52
Trang xi
Trang
PHỤ LỤC
P.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1. Phương pháp trích ly PME
Trích ly bằng dung dịch đệm sodium acetat
Để trích ly enzyme, bổ sung dung dịch đệm sodium acetat 0,05 N, pH 4,5 với tỉ lệ
40mL/100g sinh khối, khuấy gián đoạn trong khoảng 1 giờ. Sau đó lọc hỗn hợp bằng
vải lọc, khi đó dung dịch được xem là dịch chứa enzyme thô.
Phương pháp xác định hoạt tính của PME
2. Phương pháp xác định hoạt tính của PME (theo Crelier et al., 1995; trích dẫn
bởi Duvetter, 2007)
(i) Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân dung dịch pectin bởi enzyme PME. Hoạt tính
PME được xác định bằng cách đo lường lượng acid galacturonic giải phóng ra trên
đơn vị thời gian ở nhiệt độ và pH không đổi.
(ii) Hóa chất
– Dung dịch pectin 3,5g/L (Pectin táo DE 75%, Sigma) trong dung dịch NaCl 0,12M.
Cân khối lượng pectin và NaCl cần thiết. Trộn đều NaCl và pectin (để tránh pectin vón
cục), rắc từ từ hỗn hợp vào cốc nước cất đã được đun nóng sẵn đồng thời khuấy đều
bằng máy khuấy từ. Để yên 2 giờ ở nhiệt độ phòng để pectin trương nở và hòa tan, sau
đó để khoảng 12 giờ ở nhiệt độ 4 ÷ 6 °C. Sau đó dung dịch được làm nóng đến 20 °C
và chuyển vào bình định mức có dung tích thích hợp và định mức tới vạch ngấn bằng
nước cất, lắc đều và lọc qua hai lớp vải màn có bông ở giữa. Bảo quản dung dịch nhận
được trong tủ lạnh trong thời gian 2 ngày.
– Dung dịch NaOH 0,01N.
(iii) Tiến hành
Chuẩn bị 2 cốc thủy tinh nhỏ. Lấy 30mL dung dịch pectin đã pha sẵn cho vào mỗi cốc,
điều chỉnh pH dung dịch pectin đến 4,5 bằng dung dịch NaOH 0,01N. Sau đó bổ sung
250µL dung dịch enzyme vào 1 cốc, cốc còn lại bổ sung 250µL dung dịch enzyme đã
bị vô hoạt (100 0C, 30 phút) làm mẫu đối chứng. Trong suốt quá trình enzyme thủy
phân pectin, pH dung dịch đuợc giữ không đổi (pH 4,5 ở nhiệt độ 30±1 °C) bằng cách
bổ sung NaOH 0,01N.
Trang xii
Trang
(iv) Kết quả: Hoạt tính PME là số mili đương lượng của este được thủy phân trong 1
phút bởi 1g enzyme.
3. Cách pha dung dịch đệm citrate–phosphate (pH 2,2 ÷ 8,0)
pH Na2HPO4 0,2M (mL) Acid citric 0,1M (mL)
2,2 0,4 19,6
2,4 1,24 18,76
2,6 2,18 17,82
2,8 3,17 16,83
3,0 4,11 15,89
3,2 4,94 15,06
3,4 5,7 14,3
3,6 6,44 13,56
3,8 7,1 12,9
4,0 7,71 12,29
4,2 8,28 11,72
4,4 8,82 11,18
4,6 9,35 10,65
4,8 9,86 10,14
5,0 10,3 9,7
5,2 10,72 9,28
5,4 11,15 8,85
5,6 11,6 8,4
5,8 12,09 7,91
6,0 12,63 7,37
6,2 13,22 6,78
6,4 13,85 6,15
6,6 14,55 5,45
6,8 15,45 4,55
7,0 16,47 3,53
7,2 17,39 2,61
7,4 18,17 1,83
7,6 18,73 1,27
7,8 19,15 0,85
8,0 19,45 0,55
(Phạm Thị Trân Châu & Phan Tuấn Nghĩa, 2002)

4. Xác định protein theo phương pháp Bradford
Trang xiii
Trang
Hàm lượng protein được xác định với thuốc thử Coomassie Brillant Blue (CBB) G 250
theo Bradford (1976). CBB G 250 kết hợp với protein trong điều kiện acid tạo nên một
phức màu tím hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu tỉ lệ thuận với hàm
lượng protein trong dung dịch. Thiết lập đường chuẩn protein, Bovin serum Albumin
(BSA) với các nồng độ tăng dần từ 20– 300g/ml, dựa vào đường chuẩn này suy ra
nồng độ protein trong mẫu.
Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100 mg CBB G 250 trong 50 mL ethanol 95% ,
thêm 100 mL acid phosphoric 85% khuấy đều, thêm nước cất dến 1 lít. Sau đó lọc
bằng giấy lọc Whatman No1 và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng.
Phương pháp điện di SDS – PAGE xác định khối lượng phân tử và điểm đẳng điện
Mẫu SDS–PAGE được thực hiện theo phương pháp Laemmli (1970, trích dẫn bởi
Đặng Thị Thu & Nguyễn Thị Xuân Sâm, 2009b), trên hệ thống điện di mini protein II
(Bio–Rad), với nồng độ gel tập trung là 4% và gel phân tích là 10%. Điện di được tiến
hành với cường độ dòng điện 20 mA và điện thế 40V, trong 2 giờ. Gel được nhuộm
trong dung dịch Coomassie Blue G 250 và giải nhuộm trong dung dịch methanol: acid
acetic: nước (25:10:75).
Hiệu suất trích ly
P = S1 / So Trong đó: S1 : hoạt tính riêng của PME sau khi tinh sạch
So : hoạt tính riêng của PME trước khi tinh sạch
5. Bảng tra nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa
(Nguồn: Scopes, 1994)
Trang xiv
Trang
P.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
1. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger
1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến hoạt tính riêng của enzyme
PME từ A. niger sau khi kết tủa
Bảng phân tích phương sai

Analysis of Variance for Hoat tinh rieng PME – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Source Sum of Squares Df Mean Square F–Ratio P–Value
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le ammoniumsul 64.9364 6 10.8227 163.42 0.0000
RESIDUAL 0.927163 14 0.066226

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
TOTAL (CORRECTED) 65.8636 20
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Bảng kiểm định LSD
Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng PME by Ty le ammoniumsulfat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Method: 95.0 percent LSD
Level Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.23013 X
35-45 3 1.87009 X
45-55 3 3.08454 X
85-95 3 3.59636 X
75-85 3 4.49899 X
65-75 3 5.06633 X
55-65 3 6.75081 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME
từ A. niger sau khi kết tủa

Analysis of Variance for Hieu suat thu hoi – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le amoniumsul 13818.1 6 2303.01 895.74 0.0000
RESIDUAL 35.9951 14 2.57108

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le ammoniumsulfat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
85-95 3 18.6846 X
75-85 3 27.6532 X
35-45 3 32.287 X
65-75 3 34.5291 X
45-55 3 38.3408 X
55-65 3 61.5097 X
0 3 100.0 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xv
Trang
1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ (NH4)2SO4 sử dụng đến độ tinh sạch của enzyme PME
từ A. niger sau khi kết tủa

Analysis of Variance for Do tinh sach – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le ammoniumsul 43.0229 6 7.17048 130.95 0.0000
RESIDUAL 0.766611 14 0.0547579

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le ammoniumsulfat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
35-45 3 1.52836 X
45-55 3 2.53865 X
85-95 3 2.92842 X
75-85 3 3.66338 X
65-75 3 4.13406 X
55-65 3 5.49864 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2. Ảnh hưởng của NaCl đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger
2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaCl sử dụng đến hoạt tính riêng của enzyme PME từ
A. niger sau khi kết tủa

Analysis of Variance for Hoat tinh tieng PME – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le natri chlo 129.498 5 25.8997 624.78 0.0000
RESIDUAL 0.49745 12 0.0414542

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hoat tinh tieng PME by Ty le natri chloride
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.16449 X
0-0.15 3 1.99029 X
0.15-0.2 3 4.23667 X
0.2-0.25 3 6.02516 X
0.3-0.35 3 7.56056 X
0.25-0.3 3 8.35859 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xvi
Trang
2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaCl sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A.
niger sau khi kết tủa

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le natri chlo 9931.32 5 1986.26 474.75 0.0000
RESIDUAL 50.2054 12 4.18379

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le natri chloride
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0-0.15 3 33.7818 X
0.15-0.2 3 51.42 X
0.2-0.25 3 78.849 X
0.3-0.35 3 84.7534 X
0.25-0.3 3 93.1988 X
0 3 100.0 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaCl sử dụng đến độ tinh sạch của enzyme PME từ A.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le natri chlo 82.0925 5 16.4185 87.11 0.0000
RESIDUAL 2.26188 12 0.18849

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le natri chloride
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
0-0.15 3 1.61665 X
0.15-0.2 3 3.44589 X
0.2-0.25 3 4.93658 X
0.3-0.35 3 5.87234 X
0.25-0.3 3 6.82998 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xvii
Trang
3. Ảnh hưởng của ethnol đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger
3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethnol sử dụng đến hoạt tính riêng của enzyme PME từ

Analysis of Variance for Hoat tinh rieng PME – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le ethanol 215.41 6 35.9017 924.17 0.0000
RESIDUAL 0.543864 14 0.0388474

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng PME by Ty le ethanol
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Ty le ethanol Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.23013 X
1.5 3 1.66063 X
4 3 2.9039 X
2 3 3.19575 X
2.5 3 5.02759 X
3.5 3 8.7617 X
3 3 10.0323 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethnol sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ A.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le ethanol 12208.7 6 2034.78 727.10 0.0000
RESIDUAL 39.179 14 2.7985

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le ethanol
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
1.5 3 32.5859 X
4 3 41.4051 X
2 3 51.42 X
2.5 3 76.6816 X
3.5 3 80.568 X
3 3 92.003 X
0 3 100.0 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xviii
Trang
3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethnol sử dụng đến độ tinh sạch của enzyme PME từ A.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le ethanol 133.649 6 22.2748 98.81 0.0000
RESIDUAL 3.15612 14 0.225437

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le ethanol
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
1.5 3 1.35651 X
4 3 2.38915 X
2 3 2.61569 X
2.5 3 4.09846 X
3.5 3 7.1759 X
3 3 7.78306 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
4. Ảnh hưởng của aceton đến khả năng kết tủa enzyme PME từ A. niger
4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton sử dụng đến hoạt tính riêng của enzyme PME từ

Analysis of Variance for Hoat tinh rieng – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le aceton 17.9001 4 4.47503 35.22 0.0000
RESIDUAL 1.27052 10 0.127052

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Ty le aceton
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Ty le aceton Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.23013 X
1 3 1.24864 X
2,5 3 1.90947 X
2 3 2.46907 X
1,5 3 4.19114 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xix
Trang
4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton sử dụng đến hiệu suất thu hồi enzyme PME từ

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le aceton 16061.9 4 4015.48 3571.56 0.0000
RESIDUAL 11.2429 10 1.12429

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le aceton
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2,5 3 13.4155 X
1 3 15.0747 X
2 3 18.6547 X
1,5 3 32.9671 X
0 3 100.0 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton sử dụng đến độ tinh sạch của enzyme PME từ

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Ty le aceton 11.66 4 2.91499 171.70 0.0000
RESIDUAL 0.169776 10 0.0169776

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le aceton
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
1 3 1.0151 X
2,5 3 1.55969 X
2 3 2.004 X
1,5 3 3.39104 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xx
Trang
5. So sánh hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme PME từ A. niger bằng các loại hoá
chất ở các tỷ lệ tối ưu
5.1 Ảnh hưởng của loại hoá chất ở tỷ lệ tối ưu đến hoạt tính riêng của enzyme

Analysis of Variance for Hoat tinh rieng – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Hoa chat 94.785 4 23.6963 118481.30 0.0000
RESIDUAL 0.001 5 0.0002

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Hoa chat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Hoa chat Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Enzyme tho 2 1.26 X
Aceton 1,5:1 2 4.4 X
Amoniumsulphat 2 6.87 X
Sodiumcloride 32 8.37 X
Ethanol 3:1 2 10.02 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
5.2 Ảnh hưởng của loại hoá chất ở tỷ lệ tối ưu đến hiệu suất thu hồi của enzyme

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Hoa chat 6167.3 4 1541.83 9636407.52 0.0000
RESIDUAL 0.0008 5 0.00016

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Hoa chat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Aceton 1,5:1 2 33.54 X
Ethanol 3:1 2 91.48 X
Enzyme tho 2 100.0 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xxi
Trang
5.3 Ảnh hưởng của loại hoá chất ở tỷ lệ tối ưu đến độ tinh sạch của enzyme

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Hoa chat 60.3514 4 15.0879 94299.12 0.0000
RESIDUAL 0.0008 5 0.00016

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Do tinh sach by Hoa chat
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Enzyme tho 2 1.0 X
Aceton 1,5:1 2 3.47 X
Ethanol 3:1 2 7.98 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
6. Ảnh hưởng của nồng độ pectin (g/L) đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger

Analysis of Variance for Hoat tinh PME – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Nong do pectin 8289.83 9 921.093 6181.83 0.0000
RESIDUAL 2.98 20 0.149

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Hoat tinh PME by Nong do pectin
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Nong do pectin Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 0.0 X
0.25 3 14.4667 X
0.5 3 22.3667 X
1 3 33.4333 X
2 3 42.4 X
3.5 3 46.3 X
4 3 47.3667 X
6 3 49.1333 X
8 3 49.4 X
10 3 49.6333 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xxii
Trang
Giá trị tính toán Km và Vmax cho PME từ A.niger

Approx
Parameter Estimate Std Error Approximate 95% Confidence Limits
vmax 54.1105 0.6660 52.5746 55.6463
Km 0.6668 0.0379 0.5793 0.7542
Approximate Correlation Matrix

vmax Km
vmax 1.0000000 0.7726469
Km 0.7726469 1.0000000
7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger

Analysis of Variance for Muc do thay doi hoat tinh – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Nhiet do 10.9464 6 1.8244 21284.67 0.0000
RESIDUAL 0.0012 14 0.0000857143

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Multiple Range Tests for Muc do thay doi hoat tinh by Nhiet do
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
60 3 0.49 X
30 3 1.0 X
55 3 1.18 X
35 3 1.64 X
50 3 1.83 X
45 3 2.16 X
40 3 2.83 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
8. Tham số động học sự vô hoạt nhiệt enzyme PME từ A. niger

8.1 Ở 50 oC
Sum of Mean Approx
Source DF Squares Square F Value Pr > F
Model 2 1.4305 0.7153 17540.7 <.0001
Error 9 0.000367 0.000041
Uncorrected Total 11 1.4309
Approx
Ffinal 2.2905 0.1316 1.9929 2.5882
k 0.1350 0.00193 0.1306 0.1394
8.2 Ở 60 oC
Sum of Mean Approx
Model 2 1.2246 0.6123 5326.66 <.0001
Error 9 0.00103 0.000115
Approx
Trang xxiii
Trang

Ffinal 1.7881 0.1943 1.3486 2.2277
k 0.1869 0.00483 0.1760 0.1979
8.3 Ở 70 oC
Sum of Mean Approx
Model 2 1.0719 0.5360 14002.6 <.0001
Error 9 0.000344 0.000038
Approx
Ffinal 0.8884 0.1022 0.6571 1.1197
k 0.2863 0.00519 0.2746 0.2981
9. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger

Analysis of Variance for Hoat tinh enzyme – Type III Sums of Squares
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:pH 20806.7 7 2972.38 182915.84 0.0000
RESIDUAL 0.26 16 0.01625

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme by pH
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
pH Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
2.5 3 0.0 X
3 3 2.0 X
3.5 3 12.8 X
6 3 22.2 X
4 3 29.9 X
4.5 3 46.0 X
5.5 3 61.2 X
5 3 91.2 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
10. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Nong do NaCl 13.75 5 2.75 330.00 0.0000
RESIDUAL 0.1 12 0.00833333

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Muc do thay doi hoat tinh by Nong do NaCl
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Nong do NaCl Count LS Mean Homogeneous Groups
Trang xxiv
Trang
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
0.2 3 2.5 X
0.05 3 3.0 X
0.1 3 3.25 X
0.12 3 3.375 X
0.15 3 3.625 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
11. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hoạt tính enzyme PME từ A. niger

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
MAIN EFFECTS
A:Nong do CaCl2 5.56765 5 1.11353 133.62 0.0000
RESIDUAL 0.1 12 0.00833333

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Multiple Range Tests for Muc do thay doi hoat tinh by Nong do CaCl2
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Nong do CaCl2 Count LS Mean Homogeneous Groups
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
0 3 1.0 X
0.015 3 2.0 X
0.005 3 2.23 X
0.0075 3 2.33 X
0.01 3 2.6 X
0.0125 3 2.67 X
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Trang xxv
Trang

Cá yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cá yếu tố ảnh hưởng đến tính chất pectin

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT

Mã số: NCST 2011-05

Chủ nhiệm đề tài

NCS. Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, tháng 12/2011

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TÍNH CHẤT

Mã số: NCST 2011-05

Cần Thơ, tháng 12/2011

2.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN.......................................................................20

CHƯƠNG 1 DANH SÁCH HÌNH

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. niger Aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

Ngày tháng năm 2011

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

Project Title: Factors effect to activity of pectin methylesterase from Aspergillus

Pectin methylesterase (PME) has important applications in the field of processed

Some parameters of characteristic A.niger PME

CHƯƠNG 2 PHẦN 1. MỞ ĐẦU

2.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

2.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.5 ĐỐI TƯỢNG & PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

CHƯƠNG 3 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3.1 GIỚI THIỆU VỀ PECTIN METHYLESTERASE

(ii) Enzyme PME từ vi sinh vật

Hình 2: Phức hợp pectate calcium

(iv) Một số ứng dụng khác

3.2 CƠ SỞ CỦA VIỆC THU NHẬN ENZYME TỪ ASPERGILLUS NIGER

Hình 4: Nấm mốc A. niger

endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), pectate

3.3 CÁC BIỆN PHÁP TINH SẠCH PECTIN METHYLESTERASE

Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

3.5 ĐỘNG HỌC ENZYME

Trong đó, k2 tỉ lệ với nồng độ ES

a–Amylase 3.2.1.1 Dịch tụy heo Tinh bột 1,0

Lipoxygennase 1.13.11.12 Đậu nành Linoleate 1,0

3.5.3 Phân tích động học quá trình xử lý nhiệt enzyme

f: hệ số chuyển đổi một phần

Với T0= Tref , k0 = kref

3.6 CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

CHƯƠNG 4 PHƯƠNG TIỆN VÀ

4.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

Bovine serum albumin (Merck)

4.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

A: hoạt tính PME (U/mL)

4.3 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Tiến hành thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm

Kết quả thu nhận

Tiến hành thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm

4.4 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THẢO LUẬN