Dƣơng Phƣơng Quỳnh: Trƣờng Đại Học Nguyễn Tất Thành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH
TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

TRONG CÂY DỪA CẠN
( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
TP. Hồ Chí Minh – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

TRONG CÂY DỪA CẠN
( CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON APOCYNACEAE)
Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc
TP. Hồ Chí Minh - 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Chữ ký SV

LỜI CẢM ƠN
Không có thành công nào mà không có những bàn tay dìu dắt và giúp đỡ. Em xin
chân thành cảm ơn Ban giám hiệu của trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo
cơ hội và điều kiện để em có thể thực hiện đề tài này.
Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến
Cô PGS. TS Võ Thị Bạch Huệ
Cô Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc
đã dìu dắt và chỉ dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và giúp em hoàn thành
khóa luận này.
Em xin cảm ơn Thầy, Cô trong hội đồng đã đồng ý phản biện cho đề tài của em.
Em cũng xin gởi lời cảm ơn tới các anh chị kỹ thuật viên bộ môn đã giúp đỡ vào tạo
điều kiện về cơ sở vật chất và dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này.
Em xin gởi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô ở các bộ môn của khoa Dƣợc – trƣờng Đại
học Nguyễn Tất Thành đã cho em mƣợn thiết bị, dụng cụ và hóa chất nhằm phục vụ
cho mục đích nghiên cứu.
Em xin trân trọng cảm ơn.

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .............................................................. iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................v
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2
1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT .............................................................................2
1.1.1. Catharanthus .............................................................................................2
1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don .............................................................3
1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don .........6
1.1.4. Các Vinca alkaloid chính ........................................................................10
1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, định tính và định lƣợng alkaloid ............................14
1.2.1. Chiết xuất ................................................................................................14
1.2.2. Định tính..................................................................................................18
1.2.3. Định lƣợng ..............................................................................................20
1.3. Tối ƣu hóa bằng phần mềm ............................................................................22
1.3.1. Giới thiệu chung ......................................................................................22
1.3.2. Phƣơng pháp tối ƣu hóa ..........................................................................22
1.3.3. Phần mềm tối ƣu hóa Modde 5.0 ............................................................23
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................24
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.....................................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................24
2.1.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................24
2.1.3. Trang thiết bị ...........................................................................................25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................26
2.2.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết .........................................................26
2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn........................28
i
2.2.3. Tối ƣu hóa quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn ...
...........................................................................................................30
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................32
3.1. Chọn alkaloid để định hƣớng chiết ................................................................32
3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin .....................................32
3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm ...............................................................34
3.1.3. Xác định khối lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (MS ) ....................................34
3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin
10mg/ 10ml bằng phƣơng pháp quang phổ.......................................................35
3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc .................................36
3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn...............................38
3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật ...........................................................................38
3.2.2. Định tính alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn............................................40
3.2.3. Xây dựng quy trình chiết alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa
cạn ...........................................................................................................43
3.3. Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid (định hƣớng vinblastin) từ cây Dừa
cạn .........................................................................................................................49
3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tối ƣu hóa .......................................................49
3.3.2. Kết quả tối ƣu hóa ...................................................................................51
3.3.3. Phân tích tƣơng tác ảnh hƣởng giữa các yếu tố ......................................54
3.3.4. Kết quả dự đoán ......................................................................................56
3.4. Bàn luận .........................................................................................................57
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................58
4.1. Kết luận ..........................................................................................................58
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh ng tiếng Việt

1 VB Vinblastin
2 VC Vincristine
3 SKLM Sắc ký lớp mỏng
4 UV-Vis Ultra violet–visible Tử ngoại – khả kiến
High-performance liquid
5 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography
Electrospray Ionization - Phƣơng pháp khối phổ với

6 ESI-MS
Mass Spectrometer ion hóa phun điện
7 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam
iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1. Công thức cấu tạo Vinblastin ...................................................................10
Hình 1. 2. Công thức cấu tạo Vincristin....................................................................12
Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trƣờng kiềm
...................................................................................................................................15
Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid ................................................16
Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu ..................................... 29
Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm Cytoblastin
(1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2)......................................................................... 33
Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin ....................34
Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc ........................................35
Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol ...................................36
Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của
vinblastine sulfat .......................................................................................................37
Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn ........................................................................39
Hình 3. 7. Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) trong dịch chiết (T) cây Dừa cạn .....41
Hình 3. 8. Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết ..............................................43
Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 ...........................................44
Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung môi loại chlorophyll (dịch A) ...............................46
Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (dịch B) ..........................................47
Hình 3. 12. Sắc ký đồ so sánh dung môi chiết tách alkaloid base toàn phần (dịch B)
...................................................................................................................................48
Hình 3. 13. Sắc ký đồ của các dung dịch trong thí nghiệm ......................................51
Hình 3. 14. Kết quả thể hiện mức ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hóa ..................53
Hình 3. 15. Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng ............................................53
Hình 3. 16. Đƣờng cong thể hiện tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát ......................54
Hình 3. 17. Đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đoán và kết quả thực
tế ................................................................................................................................56
iv
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2. 1. Dung môi và hóa chất cần dùng ..............................................................24

Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng .................................................................................25
Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc .............................................................27
Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi ..............................................31
Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng
pháp hóa học ............................................................................................................. 32
Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin .................. 36
Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu ........................................40
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1) .....................44
Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bƣớc 2.............................46
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 ................48
Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hóa đã xây dựng đƣợc ..........................................50
Bảng 3. 8. Kết quả các thông số đánh giá mô hình thiết kế tối ƣu hóa .....................52
Bảng 3. 9. Điều kiện tối ƣu hóa dự đoán ..................................................................56
Bảng 3. 10. Kết quả thực hiện 3 lần điều kiện tối ƣu ................................................57
v
Khóa luận tốt nghiệp dƣợc s đại học - Năm ọc 2017 – 2018
Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)
Dƣơng P ƣơng Quỳnh
Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, ung thƣ đã trở thành căn bệnh nguy hiểm đe dọa đến tính mạng con ngƣời. Tuy
nhiên, các thuốc điều trị ung thƣ vẫn còn hạn chế. Từ những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà
khoa học đã tìm ra đƣợc công dụng giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid trong
Dừa cạn. Thế nhƣng, hàm lƣợng các alkaloid này trong cây không nhiều, vì vậy, nhằm xác
định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn, đề tài “Tố ƣu ó quy
trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)” đã đƣợc
thực hiện.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Dƣợc liệu là toàn cây Dừa cạn khô mua tại hiệu thuốc đông y trên
đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Chất đối chiếu là vinblastin
sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin của công ty Cipla Pharma.
Phương pháp nghiên cứu: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm; khảo sát các hợp chất alkaloid
trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đƣa ra và thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, SKLM, khối phổ MS. Sử dụng
vinblastin này làm chất đối chiếu trong định tính alkaloid từ bột dƣợc liệu. Khảo sát đƣợc cực
đại hấp thụ và xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin bằng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis.
- Định tính sơ bộ dƣợc liệu Dừa cạn bằng phƣơng pháp soi bột và định tính các alkaloid trong
bột Dừa cạn bằng phƣơng pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng.
- Khảo sát các dung môi và xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid toàn phần (định
hƣớng vinblastin) với dung môi chiết ban đầu là ethanol 80 %, dung môi loại chlorophyll là
hexan và dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid là chloroform.
- Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde 5.0 và đã
chọn đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn: tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu là 5:1
(tt/kl), thời gian ngâm lạnh là 18 giờ và pH kiềm hóa là 8.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Sau 2 tháng, đề tài đã đã thực hiện đƣợc 3 mục tiêu đề ra: Xác định vinblastin từ thuốc tiêm,
khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn và tối ƣu hóa quy trình chiết xuất
alkaloid trong cây Dừa cạn.
Từ khóa: Dừa cạn, tối ƣu hóa, Catharanthus roseus, vinblastin, alkaloid.
Final essay for the degree of BS Pharm - Academic year 2017 – 2018
Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from periwinkle
(Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace)
Duong Phuong Quynh
Adviser: M.S.Pharm. Nguyen Thi Hong Phuc
INTRODUCTION
These days, cancer has become a life-threatening disease. However, the cancer treatment is
still limited. Since the 1960s, scientists have found a therapeutic use of the vinca alkaloid
which is extracted from Catharanthus roseus. However, the content of these alkaloids in the
plant is not much, so to determine the optimal conditions for alkaloid extraction from
periwinkle, the subject "Optimizing conditions for the extraction of alkaloid from
periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace" was done.
MATERIALS AND METHOD
Material: Dried periwinkle plants was purchased at herbal medicine store on Hai Thuong Lan
Ong Street, District 5, Ho Chi Minh City. The comparator is vinblastine sulfate extracted from
the Cytoblastin injection solution of Cipla Pharma.
Method: Determination of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in
periwinkle and optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle.
RESULTS AND DISCUSSTION
The project has achieved the following objectives and results:
- Determination of vinblastine from injection by: chemical reaction, thin layer
chromatography, mass spectrometry. Use vinblastine (which had been determinated) as a
comparator to do alkaloid qualitative analysis in dried periwinkle plant. Determination
vinblastine's wavelength of maximum absorbance and preparation of calibration curve of
vinblastine by UV-Vis spectroscopy.
- Preliminary qualification of dried periwinkle powder and carry out the qualitative analysis of
alkaloid in dried periwinkle powder by chemical method and thin layer chromatography.
- Investigating the solvents and complete the alkaloid extraction proceduce (orientation of
vinblastine) with an initial extraction solvent is ethanol 80%, chlorophyll removal solvent is
hexane and the solvent using to extract based alkaloid from an acidic solution is chloroform.
- Optimizing the proceduce to extract alkaloid from periwinkle plant using Modde 5.0 and
selecting the optimal conditions for alkaloid extraction from periwinkle: ratio of solvent and
dried periwinkle powder 5: 1 (v/w), extracting duration is 18 hours and pH is 8.
CONCLUSION
After 2 months of researching on the subject, the essay have finished 3 target: determination
of vinblastine from injection; examination of alkaloid compounds in dried periwinkle and
optimization conditions of the alkaloid extraction process from periwinkle.
Keywords: Periwinkle, Catharanthus roseus, optimizing conditions, alkaloid, vinblastine.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, khi thế giới ngày càng phát triển, con ngƣời ta tập quen dần với lối sống
hiện đại hơn. Tuy nhiên, cũng từ những lối sống hiện đại này lại kéo theo những hệ
lụy khác nghiêm trọng ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Con ngƣời của thế
kỉ 21 càng ngày càng bị đe dọa bởi các chứng bệnh nguy hiểm, mà một trong số đó
là ung thƣ. Khác với ngày xƣa, ung thƣ ngày nay đã trở thành một căn bệnh thế kỉ,
đe dọa đến tính mạng của hàng trăm triệu ngƣời trên khắp thế giới. Dù là căn bệnh
nguy hiểm nhƣng đến nay, ung thƣ chỉ đƣợc điều trị triệt để khi phát hiện bệnh ở
những giai đoạn sớm. Tuy nhiên, giới hạn các thuốc điều trị và giá cả các thuốc này
đã khiến cho việc điều trị trở nên càng khó khăn hơn.
Thuốc điều trị ung thƣ, từ trƣớc đến nay đều khá đắt đỏ bởi vì việc nghiên cứu các
loại thuốc này vẫn còn hạn chế và đòi hỏi phải có nguồn kinh phí lớn. Tuy nhiên,
vào những năm 60 của thế kỉ trƣớc, các nhà khoa học đã khám phá ra đƣợc công
dụng thần kì giúp điều trị ung thƣ của các hợp chất vinca alkaloid (đặc biệt là
vinblastin và vincristin) trong Dừa cạn, một loài cây tƣơng đối thân quen, từ đó mở
ra một hƣớng đi mới cho việc nghiên cứu các loại thuốc chống ung thƣ.
Các hợp chất vinca alkaloid trong cây Dừa cạn có tác động tốt trong điều trị ung thƣ,
thế nhƣng hàm lƣợng các alkaloid này trong cây không nhiều. Vì vậy, nhằm nghiên
cứu và xác định những điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn,
chúng tôi đã thực hiện đề tài “Tố ƣu ó quy trìn c ết xuất alkaloid trong cây
Dừa cạn”, với các mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm.
- Khảo sát các hợp chất alkaloid trong Dừa cạn.
- Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn.
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT

1.1.1. Catharanthus
Chi Dừa cạn Madagascar (danh pháp khoa học: Catharanthus) là một chi gồm 8
loài cây thân thảo sống lâu năm, trong số này có 7 loài là đặc hữu của Madagascar.
Trong thực tế, các loài trong chi này chia sẻ cùng một tên gọi chung (Dừa cạn) với
các loài trong chi Vinca (Dừa cạn Châu Âu).
Các loài trong chi:

+ Catharanthus coriaceus Markgr, 1970.
+ Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon, 1948.
+ Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon, 1949.
+ Catharanthus ovalis Markgr, 1970.
+Catharanthus pusillus (Murray) G. Don, 1837.
+ Catharanthus roseus (L.) G. Don, 1837: Dừa cạn, trƣờng xuân hoa, hải đằng,
bông dừa.
+ Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon, 1949.
+ Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon, 1949.
Số lƣợng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n = 16. Trong các
loài của chi Catharanthus thì Catharanthus roseus là loài có giá trị ứng dụng và
kinh tế cao nhất. Ngoài việc đƣợc biết đến nhƣ một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết
alkaloid từ Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng trong y học dân gian nhƣ một loại
thuốc chống đái tháo đƣờng, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thƣơng
mau lành, chống viêm mắt, làm se da... và ngày nay ngƣời ta còn tìm đƣợc một
công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus, đó là khả năng điều trị
bệnh ung thƣ rất hiệu quả.
2
1.1.2. Catharanthus roseus (L.) G. Don
1.1.2.1. Tên gọi
Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G. Don; Vinca roseus L.; Lochnera rosea
Reich.
Tên gọi khác: Trƣờng xuân hoa, dừa tây, bông dừa, hải đằng, phjắc pót đông (Tày),
dƣơng giác, Madagascar periwinkle, pervenche de Madagascar.
Bậc phân loại thực vật:
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa Môi (Lamiidae)
Bộ: Trúc Đào (Apocynales)
Họ: Trúc đào (Apocynaceae)
Chi: Catharanthus
Loài: Catharanthus roseus (L.) G. Don [30]
1.1.2.2. Bộ phận dùng

Lá Dừa cạn đƣợc phơi nắng nhẹ hoặc sấy ở 30-50 oC đến khô. Lá chiếm 20-25 % so
với toàn cây. Lá phải chứa ít nhất 0,7 % alkaloid toàn cây.
Rễ chiếm 14,5 % so với toàn cây [3].
1.1.2.3. Đặc điểm thực vật

Dừa cạn là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm, phân nhiều cành thẳng
đứng, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên, mọc thành bụi.
Lá mọc đối, thuôn dài, đầu hơi nhọn, phía cuống hẹp, nhọn, dài 3-8 cm, rộng 1-2,5
cm, không có nhựa mủ.
3
Hoa trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở kẽ lá phía trên, đài hợp thành ống
ngắn. Tràng hợp hình đinh. Phiến có 5 thùy, 5 nhị đính trên tràng, 2 lá noãn hợp với
nhau ở vòi.
Quả gồm 2 quả đại, dài 2,5-5 cm, rộng 2-3 mm, mọc thẳng đứng hơi ngả sang hai
bên, trong có 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có những mụn
nổi thành hàng dọc. Mùa hoa, quả gần nhƣ quanh năm [6].
1.1.2.4. Phân bố và trồng trọt

Chi Catharanthus G. Don có nguồn gốc ở đảo Madagascar với 8 loài, trừ loài C.
pusillus (Murr.) G. Don có thể tìm thấy rải rác ở Ấn Độ và Srilanca. Từ Madagascar,
mọc hoang và đƣợc trồng ở nhiều nƣớc nhiệt đới cũng nhƣ ôn đới.
Ở nƣớc ta, dừa cạn mọc hoang khá nhiều ở vùng bãi cát ven biển từ Hải Phòng đến
Kiên Giang. Nơi tập trung nhiều nhất là các tỉnh Kiên Giang, đảo Phú Quốc và Côn
Đảo, có nhiều ở Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam – Đà Nẵng,
Bình Định, Phú Yên.
Ở nguyên quán, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan cây bụi trên đất pha cát
hoặc sỏi đá, độ cao tới 1500 m. Dừa cạn là loài cây ƣa sáng, ƣa ẩm và có khả năng
chịu đƣợc hạn. Cây ra hoa, quả nhiều hằng năm.
Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào. Trƣớc năm 1975, miền
Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu. Những năm gần đây, xuất khẩu sang Pháp
thƣờng xuyên hơn nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [3].
1.1.2.5. Công dụng chủ yếu

Trong dân gian
Từ xa xƣa, Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng để chữa trị nhiều loại bệnh khác
nhau. Loài cây này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học dân gian.
Ở Madagascar, chiết xuất của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ một loại thuốc
an thần, hạ huyết áp, sát trùng và thuốc điều trị tiểu đƣờng.
Ở Ấn Độ, chiết xuất từ lá của Dừa cạn đã đƣợc sử dụng để xử lý vết ong đốt.
4
Ở Trung Quốc, Dừa cạn đƣợc biết đến nhƣ một loài cây giúp lợi tiểu, trị ho và làm
săn se niêm mạc.
Ở Trung và Nam Mỹ, Dừa cạn đƣợc sử dụng để chữa viêm mắt và đau họng.
Ở Việt Nam, Catharanthus roseus từ lâu đã đƣợc dùng để hạ huyết áp, trị đái tháo
đƣờng, điều kinh, chữa lỵ, thông tiểu tiện. Có ngƣời dùng để trị ung thƣ máu, ung
thƣ phổi có hiệu quả. Cách dùng: Thƣờng dùng thân và lá phơi khô sắc uống, có thể
dùng tới 50 g [4].
Trong y học hiện đại
Nghiên cứu về dƣợc lý đã tiết lộ rằng Dừa cạn có chứa hơn 70 loại alkaloid (indol
alklaloids) khác nhau và mang đến hiệu quả trong điều trị các loại ung thƣ nhƣ ung
thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ tử cung, u ác tính, u lympho Hodgkin và không
Hodgkin [25]. Catharanthus alkaloids ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ
bằng cách liên kết với các tubulin trong quá trình phân bào. Catharanthus alkaloids
cũng gây nên apoptosis (trình tự hủy diệt của tế bào theo chƣơng trình có sẵn trong
gen). Chúng cũng ức chế sự lây lan của nhiều loại ung thƣ khác nhau [10, 11].
Chiết xuất từ cây Dừa cạn cho các tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn và vi nấm
khác nhau. Theo một vài nghiên cứu, các hợp chất trong cây Dừa cạn có tác động
kháng khuẩn trên một số các vi khuẩn chọn lọc [12, 18].
Các nhà khoa học hiện đại đã tiến hành nghiên cứu và chứng minh đƣợc khả năng
điều trị tiểu đƣờng của các alkaloid trong loài cây này [17, 28].
Không những vậy, một vài nghiên cứu khác đã chứng minh đƣợc tác dụng hạ huyết
áp và lipid huyết của chiết xuất từ lá Dừa cạn. Các chiết xuất từ lá Dừa cạn có thể
đƣợc dùng làm thuốc hoặc bổ sung vào chế độ ăn đối với những ngƣời có nguy cơ
mắc bệnh cao huyết áp [9].
Bên cạnh đó, chiết xuất từ cây Dừa cạn còn có các tác dụng khác nhƣ làm lành vết
thƣơng nhanh chóng [21], điều trị tiêu chảy [16].
5
1.1.3. Các hợp chất alkaloid trong cây Catharanthus roseus (L.) G. Don
1.1.3.1. Alkaloid
a. Khái niệm
Đã từ lâu các nhà khoa học tìm thấy trong cây các hợp chất tự nhiên, những hợp
chất tự nhiên, những hợp chất này thƣờng là những acid hoặc những chất trung tính.
Nhƣng đến năm 1819, dƣợc sĩ Wilhelm Meissner mới đề nghị xếp các chất có tính
kiềm lấy từ thực vật ra thành một nhóm riêng và gọi là alkaloid, do đó ngƣời ta ghi
nhận Meissner là ngƣời đầu tiên đƣa ra khái niệm về alkaloid: “Alkaloid là những
hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, có phản ứng kiềm và lấy từ thực vật ra”.
Sau này, Polonopski đã định nghĩa: “Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa
nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thƣờng gặp trong thực vật và đôi khi
trong động vật, thƣờng có dƣợc lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với
một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid”.
Tuy nhiên, cũng có một số chất đƣợc xếp vào alkaloid nhƣng nitơ không ở dị vòng
mà ở mạch nhánh nhƣ: ephedrin trong Ma hoàng, capsaicin trong ớt, hordenin trong
mầm mạch nha, colchicin trong hạt cây tỏi độc...[5]
b. Phân loại
Alkaloid là những base bậc 1, bậc 2 hay bậc 3, đôi khi các alkaloid có nitơ bậc 4.
Hầu hết các alkaloid có nitơ tham gia vào nhân dị vòng nhƣng cũng có alkaloid mà
nitơ ở ngoài vòng.
Ngày nay, ngƣời ta thƣờng chia các alkaloid ra thành các loại:
Alkaloid thật: Những alkaloid đƣợc tạo nên từ acid amin và nitơ nằm trong dị vòng
là và gọi là những chất tạo ra từ acid amin.
Protoalkaloid: Nitơ nằm ở mạch thẳng.
Pseudoalkaloid: là những chất đƣợc tạo ra do sự ngƣng tụ amoniac với các hợp chất
không có nitơ.
6
Ngoài ra, ngƣời ta cũng phân loại alkaloid dựa theo cấu trúc của nhân:
Alkaloid không có nhân dị vòng: Những alkaloid thuộc nhóm này có nitơ nằm ở
mạch thẳng, còn gọi là “protoalkaloid”.
Alkaloid có nhân dị vòng: Các alkaloid loại này có thể có một vòng hay nhiều vòng.
Alkaloid có nhân sterol: Các alkaloid steroid có một khung

cyclopentanoperhydrophenantren và có 1 hoặc 2 nitơ trong mạch nhánh đã đóng
vòng ở vị trí C17 hoặc vị trí C3. Chúng là dẫn chất của dãy cholestan hoặc là dẫn
chất của dãy pregnan.
Alkaloid có cấu trúc terpen: Ngƣời ta mới thấy rất ít alkaloid có cấu tạo monoterpen
và sesquiterpen, cấu tạo diterpen có nhiều hơn nhóm mono và sesquiterpen.
Cũng có nhiều tác giả phân loại alkaloid theo họ thực vật [5].
1.1.3.2. Tính chất chung của alkaloid

a. Lý tính
Thể chất: Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên công thức cấu tạo có oxy, nghĩa là
trong công thức có C, H, N, O, những alkaloid này thƣờng ở thể rắn ở nhiệt độ
thƣờng. Những alkaloid không có oxy thƣờng ở thể lỏng (coniin, nicotin, spartein...),
tuy nhiên cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng nhƣ
arecolin (C8H13NO2), pilocarpin (C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy ở thể rắn
nhƣ sempervirin (C19H16N2), concessin (C24H40N2). Các alkaloid ở thể rắn thƣờng
kết tinh đƣợc và có điểm chảy rõ ràng, nhƣng cũng có một số alkaloid không có
điểm chảy vì bị phá hủy ở nhiệt độ trƣớc khi chảy. Những alkaloid ở thể lỏng bay
hơi đƣợc và thƣờng vững bền, không bị phá hủy ở nhiệt độ sôi nên cất kéo đƣợc
bằng hơi nƣớc để lấy ra khỏi dƣợc liệu.
Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ

capsaicin, piperin, chavicin...
7
Màu sắc: Hầu hết các alkaloid đều không màu trừ một số ít alkaloid có màu vàng
nhƣ berberin, palmatin, chelidonin...
Độ tan: Nói chung các alkaloid base không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung
môi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, ether, chloroform,... Trái lại, muối alkaloid thì
dễ tan trong nƣớc, hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực.
Năng suất quay cực: Phần lớn alkaloid có khả năng quay cực (vì trong cấu trúc có
carbon không đối xứng), thƣờng tả tuyền, một số nhỏ hữu tuyền [5].
b. Hóa tính
Hầu nhƣ alkaloid đều có tính base yếu, song cũng có chất có tác dụng nhƣ base
mạnh và có khả năng làm xanh giấy quỳ. Có vài trƣờng hợp ngoại lệ, những
alkaloid không có phản ứng kiềm và cá biệt cũng có chất có phản ứng acid yếu.
Tác dụng với các acid, alkaloid cho các muối tƣơng ứng.
Alkaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt...) tạo ra các muối phức.
Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid,
chia làm 2 loại:
Phản ứng tạo tủa: Có hai nhóm thuốc thử tạo tủa với alkaloid:
o Nhóm thuốc thử I cho tủa rất ít tan trong nƣớc. Tủa này sinh ra hầu hết là do
sự kết hợp của một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thƣờng là anion
phức hợp của thuốc thử.
 Thuốc thử Valse - Mayer (K2HgI4– Kali tetraiodomercurat): Cho tủa trắng
hay vàng nhạt.
 Thuốc thử Bouchardat (Iodo –Iodid): Cho tủa nâu.
 Thuốc thử Dragendorff (KBiI4– Kali tetraiodobismutat III): Cho tủa vàng
cam đến đỏ.
 Thuốc thử Bertrand (Acid silicotungstic): Cho tủa trắng hay trắng ngà.
 Thuốc thử Hager (Acid picric): Cho tủa màu vàng đến đỏ cam.
8
o Nhóm thuốc thử thứ hai cho những kết tủa ở dạng tinh thể.
 Dung dịch vàng clorid, acid picrolonic, acid styphnic.
 Dung dịch platin clorid.
 Dung dịch nƣớc bão hòa acid picric.
Phản ứng tạo màu: Có một số thuốc thử tác dụng với alkaloid cho những màu đặc
biệt khác nhau, do đó ngƣời ta cùng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid.
Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết
có alkaloid nào trong đó [5].
1.1.3.3. Alkaloid trong Catharanthus roseus (L.)

Dừa cạn là một nguồn dƣợc liệu có giá trị điều chế các indol alkaloid
monoterpenoid. Có khoảng 90 alkaloid khác nhau đƣợc tổng hợp từ loài cây này,
trong số đó các alkaloid thì G.H. Svohada và cộng sự (1991) đã phân loại thành
nhiều nhóm hóa học:
a. Alkaloid dưới dạng monomer

Alkaloid thuộc nhân indol: alstonin (vỏ rễ), amorosin (rễ), catharantin (lá, rễ)...
Alkaloid thuộc nhóm 2-acyl indol: perividin (lá), perivin (lá, rễ), perosin (lá, rễ),
reserpin, ajmalicin (rễ), tetrahydroalstonin, serpentin (rễ), akuammin.
Alkaloid thuộc nhóm oxindol: mitraphylin (lá, rễ).
Alkaloid thuộc nhóm α-methylen indolin: akuammicin (rễ), lochnericin (lá), ...
Các alkaloid khác: amocalin (rễ), pericalin (rễ), perimivin (lá), virosin (rễ) [5].
b. Alkaloid dưới dạng dimer

Alkaloid thuộc nhóm nhỏ dimer idol – indolin: desacetyl – vincaleucoblastin (lá),
isoleurosin (lá), leurocristin (lá, rễ), leurosidin (lá, rễ), leurosin (lá, rễ), leurosivin
(rễ), neuleurocristin (lá), rovidin (lá), neoleurosidin (lá), vinaleucoblastin (lá, rễ).
Alkaloid thuộc nhóm nhỏ dimer khác: carosidin (lá, rễ), vincamicin (lá), vindolidin
(lá), vincarodin (lá), vindolicin (lá), vinosidin (rễ), vinsedicin (hạt) [3].
9
1.1.4. Các Vinca alkaloid chính
Trong Dừa cạn có chứa khá nhiều alkaloid, tuy nhiên các vinca alkaloid lại đóng vai
trò quan trọng giúp hình thành giá trị điều trị bệnh và giá trị thị trƣờng của cây này.
Vinca alkaloid là tập hợp các alkaloid có khả năng kháng mitotic và kháng
microtubule. Chúng có tác động ngăn chặn liên kết beta-tubulin trong quá trình
phân chia tế bào ung thƣ. Từ đó có vai trò quan trọng trong điều trị ung thƣ. Hai
vinca alkaloid chủ yếu hay đƣợc sử dụng đó là vinblastin và vincristin. Ngoài ra còn
một số các vinca alkaloid khác nhƣ vindesine, vinorelbine, vincaminol, vineridine
và vinburnine cũng đang đƣợc nghiên cứu và đƣa vào liệu trình điều trị.
1.1.4.1. Vinblastin (VB)

Công thức phân tử: C46H58N4O9.
Vinblastin là methyl (3aR,4R,5S, 5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9 -

[32]indol-9-yl ]-5-hydroxy-8-methoxy-6-methyl-3a,4,5,5a,6,11,12,13a-octahydro-
1H-indolizino [31] carbazol-5-carboxyl.
Vinblastin còn có tên gọi khác là vincaleucoblastine.
CH3
OH
N
N H CH3
O CH3
N H
H H
O OO
H3C N OH
O H3C O
O
CH3 CH3
Hình 1. 1. Công thức cấu tạo Vinblastin
10
a. Đặc điểm
Là tinh thể hình kim, kết tinh từ methanol.
Trọng lƣợng phân tử: 810,989 g/mol.
Điểm chảy: 211-216 oC
Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của vinblastin trong ethanol là 214 nm và 259 nm.
Không tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat,
chloroform [3].
Vinblastin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, tạo ra khí nitơ oxit [24].
b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

Vinblastin là vinca alkaloid đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1958 bởi Robert Noble
và Charles Thomas Beer tại đại học Western Ontario từ Dừa cạn [22].
Trong số các tác dụng dƣợc lý đƣợc nghiên cứu của VB thì hoạt tính chống ung thƣ
đƣợc nghiên cứu và đƣa vào ứng dụng nhiều nhất. Mặc dù cơ chế tác dụng của hợp
chất này còn chƣa thật sáng tỏ, nhƣng có lẽ vinblastin thể hiện tác dụng độc tế bào
bằng cách ức chế sự tạo thành các vi ống trên thoi gián phân, dẫn đến ngừng phân
chia tế bào ở pha giữa (pha M). Ở nồng độ cao, vinblastin còn thể hiện nhiều tác
dụng phức tạp trên tổng hợp acid nucleic và protein .VB có tác dụng chống ung thƣ
còn do tác động đối với chuyển hóa của glutamat và aspartat [2].
Vinblastin đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ: Ung thƣ vú [29], ung
thƣ phổi [15], ung thƣ bàng quang [26], ung thƣ tinh hoàn [14], ung thƣ các dòng tế
bào máu (bệnh máu ác tính), ung thƣ cổ và ung thƣ dạng nấm da [3]...
Từ năm 1970, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc điều trị bệnh
Letterer-Siwe (bệnh hệ lƣới lan tỏa nhiều phủ tạng) bằng VB [23].
Vinblastin có mặt trong liệu trình điều trị hội chứng mô bào (là hội chứng rối loạn
hiếm gặp gây ra bởi sự phát triển bất thƣờng của một loại tế bào máu trắng gọi là
mô bào) ở trẻ em. Không chỉ ở trẻ em, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng
vinblastin để điều trị hội chứng này ở ngƣời lớn và nghiên cứu cho kết quả khả quan
[27].
11
Vinblastin cũng có mặt trong danh sách các thuốc đƣợc dùng để trị bệnh Hodgkin
(một loại ung thƣ hạch, bệnh ung thƣ máu bắt đầu trong hệ bạch huyết) ở giai đoạn
III và IV. Thay vì dùng riêng lẻ, ngƣời ta hay phối hợp sử dụng đồng thời 4 thuốc là
mechloretamin, vinblastin, procabazine và prenisone để điều trị căn bệnh này [13].
Vinblastin còn đƣợc dùng để điều trị bệnh leukemia cấp, u lympho không Hodgkin,
lympho mô bào (u lympho mô bào), u sùi dạng nấm, sarcom cơ vân, u nguyên bào
thần kinh và u Wilm.
Vào năm 2016, các nhà khoa học Canada đã nghiên cứu đƣợc rằng, vinblastin mang
đến hiệu quả điều trị cũng nhƣ thể hiện ít độc tính trên các trẻ em bị u thần kinh
đệm cấp thấp [19].
1.1.4.2. Vincristin (VC)

Công thức phân tử: C46H56N4O10
Vincristin là methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-(acetyloxy)-12-ethyl-4-

[33]nonadeca-4(12),5,7,9-tetraen-13-yl]-8-formyl-10-hydroxy-5-methoxy-8,16-
diazapentacyclo[34]nonadeca-2(7),3,5,13-tetraene-10-carboxylate.
Vincristin còn có tên gọi khác là leurocristine.
N OH
C2H5
N N
H
CH3OOC
C2H5
OH 3C N OCOCH 3
H OH
COOCH 3
CHO
Hình 1. 2. Công thức cấu tạo Vincristin
12
a. Đặc điểm
Là tinh thể hình phiến
Điểm chảy: 218-220 oC
Trọng lƣợng phân tử: 824,972 g/mol
Bƣớc sóng hấp thụ cực đại trong ethanol là 220 nm, 255 nm và 296 nm.
Không tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol aceton, ethyl acetat,
chloroform [3].
b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

Vincristin là một alkaloid chống ung thƣ có tác dụng kích ứng mạnh các mô. Cơ chế
tác dụng còn chƣa đƣợc biết thật chi tiết nhƣng vincristin là chất ức chế mạnh tế bào.
Thuốc liên kết đặc hiệu với tubulin là protein ống vi thể, phong bế sự tạo thành các
thoi phân bào cần thiết cho sự phân chia tế bào. Do đó vincristin có tính đặc hiệu
cao trên chu kì tế bào, và ức chế sự phân chia tế bào ở kì giữa. Ở nồng độ cao, thuốc
diệt đƣợc tế bào, còn ở nồng độ thấp, làm ngừng phân chia tế bào. Do thuốc có tính
đặc hiệu với kì giữa của sự phân chia tế bào nên độc lực của tế bào thay đổi theo
thời gian tiếp xúc với thuốc, nhờ có nửa đời thải trừ dài và độ lƣu giữ thuốc cao
trong tế bào nên không cần phải truyền kéo dài.
Cũng nhƣ VB, VC phối hợp với các chất khác trong điều trị bệnh leukemia cấp,
bệnh Hodgkin, u lympho không Hodgkin, sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh
và u Wilm. Vincristin cũng tỏ ra có ích trong điều trị bệnh leukemia mạn, sarcom
Ewing, u sùi dạng nấm, sarcom Kaposi, các sarcom mô mềm, sarcom xƣơng, u
melanin, đa u tủy, ung thƣ lá nuôi, ung thƣ trực tràng, não, vú, cổ tử cung, ung thƣ
tuyến giáp và ung thƣ phổi [2].
Vincristin cũng gây độc thần kinh, tuy nhiên không mạnh nhƣ vinblastin.
13
1.2. P ƣơng p áp c ết xuất, địn tín và địn lƣợng alkaloid
1.2.1. Chiết xuất
Việc chiết xuất alkaloid dựa vào tính chất chung nhƣ sau:
Alkaloid nói chung là những base yếu, thƣờng tồn tại trong cây dƣới dạng muối của
acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi có dạng kết hợp với tanin nên phải tán nhỏ dƣợc
liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những
kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh.
Hầu hết các alkaloid base không tan trong nƣớc nhƣng lại dễ tan trong dung môi
hữu cơ ít phân cực. Trái lại, các muối alkaloid thƣờng tan trong nƣớc, cồn và không
tan trong các dung môi ít phân cực. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid
nhƣ loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phƣơng pháp chiết thích hợp.
Thông thƣờng, ngƣời ta sử dụng một trong 4 phƣơng pháp sau đây để chiết tách
alkaloid từ dƣợc liệu [5].
1.2.1.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong mô trƣờng kiềm

Dƣợc liệu đƣợc tán nhỏ rồi tẩm bột dƣợc liệu với dung dịch kiềm trong nƣớc.
Chiết bột dƣợc liệu đã kiềm hóa nhƣ trên bằng dung môi hữu cơ không phân cực
thích hợp, dung môi này dùng để hòa tan các alkaloid base vừa đƣợc giải phóng.
Cất thu hồi dung môi hữu cơ dƣới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung
dịch acid loãng. Các alkaloid đƣợc chuyển sang dạng muối tan trong nƣớc, còn mỡ,
sắc tố và sterol... ở lại dung môi hữu cơ.
Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hóa để chuyển alkaloid sang dạng
base, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid base.
Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid base, ngƣời ta thƣờng loại
nƣớc bằng muối trung tính khan nƣớc (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc
bốc hơi dung môi sẽ thu đƣợc alkaloid thô [5].
14
Bột dƣợc liệu (2-5 g)
- Kiềm hóa vừa đủ ẩm

- Chiết bằng 20-30 ml dung môi hữu cơ ở nhiệt độ
phòng hoặc bằng Sohxlet
Dịch chiết dung môi hữu cơ
- Lắc dịch với dung dịch acid loãng
Dịch chiết nƣớc acid
- Kiềm hóa đến pH = 10

- Chiết bằng 20-30 ml dung môi hữu cơ
- Bốc hơi đến cắn khô
Cắn alkaloid base
Hình 1. 3. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi
trƣờng kiềm
1.2.1.2. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc (P ƣơng
pháp STAS-OTTO)
Thấm ẩm bột dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất.
Chiết bột dƣợc liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dƣợc liệu sẽ
chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên.
15
Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dƣới áp suất giảm, dùng ether rửa dịch
chiết đậm đặc còn lại. Trong môi trƣờng acid, ether thƣờng hòa tan 1 số hợp chất
chứ không hòa tan alkaloid.
Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nƣớc rồi lấy alkaloid base đƣợc giải
phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp. Cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc
hơi tới khô sẽ thu đƣợc cắn alkaloid thô [5].
- 20 ml dung môi chiết

- Đun 15 phút, lọc (2 lần x 20 ml)

- Chiết với dung môi hữu cơ
- Acid hóa bằng acid loãng (5 ml x 2 lần)
Hình 1. 4. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng nƣớc acid
1.2.1.3. Chiết bằng cồn acid
Có một số alkaloid trong dƣợc liệu tồn tại dƣới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi
trƣờng trung tính. Do đó, sau khi tán nhỏ dƣợc liệu ở kích thƣớc thích hợp đem
thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic tới kiệt alkaloid. Quy trình tiếp theo đƣợc thực
hiện tƣơng tự [5].
16
- 20 ml – 30 ml cồn có 5% acid
- Đun hồi lƣu 10 phút, lọc (2 lần x 20 ml)
Dịch chiết cồn acid
- Trung hòa đến pH 5-6

- Bay hơi cồn trên bếp cách thủy đến cắn
- Hòa tan cắn trong nƣớc nóng (10 ml x 2 lần), lọc

- Chiết bằng dung môi hữu cơ
- Chiết với dung dịch acid
Hình 1. 5. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cồn acid
1.2.1.4. Chiết bằng cất kéo ơ nƣớc

Đây là phƣơng pháp dùng để chiết tách những alkaloid bay hơi đƣợc nhƣ coniin,
nicotin, spartein... Sau khi sấy khô dƣợc liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid
dạng muối ra dạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi dƣợc liệu theo phƣơng pháp cất kéo
bằng hơi nƣớc [5].
17
Bột dƣợc liệu (10 g)
- Kiềm hóa sau đó cất kéo theo hơi nƣớc

- Hứng vào bình có sẵn dung dịch acid loãng
Dịch cất (50 ml)

- Chiết với dung môi hữu cơ
- Bay hơi dung môi
Cắn alkaloid
Hình 1. 6. Sơ đồ chiết xuất alkaloid bằng cất kéo hơi nƣớc
1.2.2. Định tính

1.2.2.1. Định tính trên tiêu bản thực vật
Muốn xác định xem trên tiêu bản thực vật có alkaloid hay không và có ở vị trí nào
thì ngƣời ta hay dùng thuốc thử Bouchardat (iodo-iodid). Vì protid cũng có thể cho
kết tủa với thuốc thử này nên để kết luận chắc chắn thì thƣờng tiến hành song song
hai tiêu bản:
 Tiêu bản 1: Ngay sau khi mới cắt, nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, đợi
một lúc rồi soi kính hiển vi sẽ thấy kết tủa màu nâu.
 Tiêu bản 2: Đem ngâm tiêu bản vào cồn tartric, sau đó rửa sạch cồn tartric,
đặt lên phiến kính rồi nhỏ một giọt thuốc thử Bouchardat, để một lúc rồi đem
soi kính.
Nếu tế bào có chứa alkaloid thì alkaloid đã hòa tan trong cồn và trên vi phẫu 2
không quan sát thấy tủa nâu. Còn nếu vẫn thấy tủa thì phải nghĩ ngay tới tủa của
protid [5].
18
1.2.2.2. Địn tín trong dƣợc liệu và trong các chế phẩm
a. Định tính bằng thuốc thử chung
Để phát hiện alkaloid trong dƣợc liệu bằng các thuốc thử chung, thƣờng ngƣời ta
chiết alkaloid ra khỏi cơ quan thực vật bằng phƣơng pháp chiết thích hợp rồi dùng
các thuốc thử để phát hiện và đánh giá sơ bộ sự có mặt của chúng trong dƣợc liệu.
Tùy theo phản ứng mà sử dụng dịch chiết thích hợp. Các phản ứng với thuốc thử
chung thƣờng đƣợc thực hiện với muối alkaloid trong môi trƣờng nƣớc acid.
Các thuốc thử chung cho với các alkaloid một tủa vô định hình có màu sắc không
đặc trƣng thay đổi tùy theo thuốc thử. Với một số thuốc thử, tủa này có thể tan lại
trong một lƣợng thuốc thử thừa.
Các thuốc thử thƣờng dùng là Bouchardat, Valse-Mayer, Dragendorff, Hager và

acid tannic [5].
b. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM)

SKLM đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp phát hiện sự có mặt, đồng thời đánh giá
sơ bộ thành phần alkaloid của dƣợc liệu khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp.
Tiến hành sắc ký song song với 1 alkaloid chuẩn còn cho phép nhận định sự có mặt
của một alkaloid nào đó trong dƣợc liệu. SKLM còn hữu dụng trong việc xác định 1
dƣợc liệu khi sắc ký so sánh với dƣợc liệu chuẩn.
Pha tĩnh: Trong định tính alkaloid bằng SKLM, ta thƣờng dùng silica gel G, F254,
GF254 .Các pha tĩnh khác nhƣ nhôm oxyd, silica gel pha đảo đôi khi cũng đƣợc dùng.
Dung môi khai triển: Dung môi khai triển sắc ký alkaloid thƣờng là hỗn hợp 2 hay 3
dung môi hữu cơ, từ phân cực yếu tới phân cực trung bình. Đôi khi, các dung môi
phân cực mạnh hơn nhƣ butanol, ethanol, methanol, nƣớc, các acid nhƣ acid acetic,
acid formic cũng đƣợc dùng đối với alkaloid phân cực mạnh. Mẫu thử thƣờng là
alkaloid base hay hỗn hợp alkaloid base toàn phần đƣợc hòa tan trong các dung môi
ít phân cực và dễ bay hơi. Các hệ dung môi khai triển sắc ký thƣờng dùng cho
alkaloid là:
19
 CHCl3– MeOH – NH4OH (50:9:1)
 n-butanol – CH3COOH – NH4OH (4:1:5)
 Cyclohexane – CHCl3– dietylamine (5:4:1)
 CHCl3– MeOH (4:1)
Phát hiện vết: Để phát hiện vết alkaloid trên bản sắc ký, ngƣời ta thƣờng phun hoặc
nhúng với thuốc thử Dragendorff. Các alkaloid sẽ cho các vết màu đỏ cam trên nền
vàng cam. Cách phát hiện thông thƣờng nhƣ soi đèn UV (254 nm và 365 nm) hoặc
hơ trong hơi iod cũng đƣợc dùng nhƣ là phƣơng pháp bổ sung nhƣng không đặc
hiệu.
Ghi nhận kết quả: Ghi nhận số lƣợng các vết quan sát đƣợc trên sắc ký đồ về màu
sắc với các phƣơng pháp phát hiện, Rf và tỉ lệ tƣơng đối của các vết alkaloid trong
hỗn hợp [5].
1.2.3. Địn lƣợng

1.2.3.1. P ƣơng p áp cân
Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng khi đã chiết đƣợc alkaloid tinh khiết, nghĩa là đã
loại đƣợc hoàn toàn những tạp chất kèm theo.
Phạm vi sử dụng: Áp dụng với những alkaloid có tính base rất yếu, vì những
alkaloid này không chuẩn độ đƣợc bằng phƣơng pháp acid-base, do hằng số điện ly
quá bé sẽ không có bƣớc nhảy trên đƣờng cong chuẩn độ nên không quan sát đƣợc
sự chuyển màu rõ rệt của chỉ thị.
Thực hiện: Khi định lƣợng, ngƣời ta phải chiết đƣợc alkaloid tinh khiết bằng một
dung môi thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cắn đến khối lƣợng không đổi rồi
đem cân [5].
20
1.2.3.2. P ƣơng p áp trung ò (t ừa trừ)
Phạm vi sử dụng: Thƣờng dùng nhiều với những alkaloid họ Cà, áp dụng với các
alkaloid chiết ra ở dạng base.
Thực hiện: Sau khi đã có dịch chiết alkaloid base, có thể tiến hành định lƣợng bằng
cách lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ với lƣợng chính xác acid chuẩn độ dƣ, sau
đó định lƣợng acid thừa bằng kiềm tƣơng ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ,
cắn alkaloid còn lại đƣợc định lƣợng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Chỉ
thị thƣờng dùng trong phƣơng pháp chuẩn độ thừa trừ này là metyl da cam hoặc
metyl đỏ [5].
1.2.3.3. P ƣơng p áp chuẩn độ trong mô trƣờng khan

Phạm vi sử dụng: Áp dụng với các alkaloid có tính base rất yếu.
Thực hiện: Hòa tan alkaloid vào dung môi không phải nƣớc, thƣờng dùng acid
acetic khan (gọi là môi trƣờng khan). Sau đó dùng acid percloric để định lƣợng và
chỉ thị là tím tinh thể [5].
1.2.3.4. P ƣơng p áp đo qu ng
Phạm vi sử dụng: Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng với các alkaloid có màu tự nhiên
hoặc các alkaloid có thể tác dụng với thuốc thử hoặc biến đổi để tạo thành các chất
có màu.
Thực hiện:
- Đối với các alkaloid có màu tự nhiên, có thể đo trực tiếp màu dung dịch
- Với những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lƣợng trực
tiếp, ngƣời ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách
riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp để thu đƣợc dung dịch có màu để
định lƣợng.
- Một số alkaloid có thể biến đổi để tạo thành một dẫn chất có màu hoặc dùng
phản ứng giáng phân alkaloid thành những phần nhỏ, lấy riêng phần cần thiết
rồi cho tác dụng với thuốc thử tạo ra dung dịch có màu để định lƣợng [5].
21
1.2.3.5. P ƣơng p áp sắc ký lỏng hiệu năng c o (HPLC)
Phạm vi sử dụng: Áp dụng cho nhiều alkaloid khác nhau.
Thực hiện: Để tến hành định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC cần:
- Có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn.

- Xây dựng phƣơng pháp chiết kiệt alkaloid trong dƣợc liệu đáp ứng đủ nhu cầu
định lƣợng.
- Xây dựng đƣợc chƣơng trình sắc ký trên máy HPLC (pha tĩnh, pha động,
detector, tốc độ dòng, thể tích tiêm, nhiệt độ phân tích) [5].
1.3. Tố ƣu ó bằng phần mềm

1.3.1. Giới thiệu chung
Trong điều kiện chiết, ngoài bản chất của mẫu chiết thì kết quả của quá trình chiết
còn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố bên ngoài. Vì vậy, cần tối ƣu hóa các điều
kiện này để đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Tối ƣu hóa có thể đƣợc định nghĩa là quá
trình tìm kiếm các yếu tố ảnh hƣởng để hạm mục tiêu đạt lớn nhất hoặc nhỏ nhất
theo mong muốn, trong khi vẫn đáp ứng đủ các điều kiện ban đầu.
1.3.2. P ƣơng p áp tố ƣu ó
Thông thƣờng, có 2 phƣơng pháp để tối ƣu hóa một mô hình :
- Phƣơng pháp cổ điển (phƣơng pháp thực nghiệm một biến số): ta thay đổi lần
lƣợt từng yếu tố (biến độc lập) để thu đƣợc kết quả (biến phụ thuộc), thực hiện
lần lƣợt với từng yếu tố. Phƣơng pháp này tƣơng đối đơn giản nên chỉ áp dụng
cho mô hình có từ một đến hai biến độc lập. Phƣơng pháp không có hiệu quả
trong các mô hình nhiều yếu tố.
- Phƣơng pháp tối ƣu hóa bằng phần mềm chuyên dụng: phƣơng pháp này cho
phép xây dựng đƣợc các mô hình có nhiều yếu tố ảnh hƣởng. Đánh giá đƣợc sự
ảnh hƣởng nhiều hay ít giữa các yếu tố, từ đó xác định đƣợc kết quả dự đoán
bằng các phép tính toán trong phần mềm. Có nhiều phần mềm chuyên dụng cho
việc tối ƣu hóa nhƣ MODDE, JMP, Design – Expert [8].
22
1.3.3. Phần mềm tố ƣu ó Modde 5.0
Modde 5.0 là phần mềm tối ƣu hóa đƣợc phát triển bởi Umetrics AB. Đây là phần
mềm đƣợc xây dựng để thiết kế và đánh giá các thử nghiệm với nhiều biến số khác
nhau. Phần mềm này giúp ngƣời sử dụng định hƣớng cải thiện và tối ƣu hóa đƣợc
các sản phẩm cũng nhƣ quy trình với lƣợng thử nghiệm tối thiểu, do đó giảm đƣợc
công sức và tiết kiệm đƣợc thời gian hơn so với dùng các phƣơng pháp đắt tiền khác.
Phần mềm Modde có những công dụng nhƣ sau:

- Thiết kế thử nghiệm.
- Phân tích dữ liệu và đánh giá kết quả.
- Dự đoán và tối ƣu hóa quy trình [20].
23
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đố tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Dược liệu (Toàn cây Dừa cạn)
Dƣợc liệu đƣợc thu mua tại hiệu thuốc đông y trên đƣờng Hải Thƣợng Lãn Ông,
Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu dƣợc liệu sau khi sơ chế đƣợc sấy khô.
Dƣợc liệu khô đƣợc xay nhỏ đến dạng bột thô. Bảo quản trong bao nylon kín.
Alkaloid định hướng chiết từ thuốc tiêm:

Vinblastin sulfat chiết từ dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1
mg vinblastin sulfat) của công ty Cipla Pharma.
Thành phần của dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/10ml:
Vinblastin sulfat ................................................ 1mg

Natri clorid....................................................... 9 mg
Benzyl alcohol ............................................ 0,9% v/v
Nước cất pha tiêm ........................... vừa đủ thể tích
2.1.2. Dung môi, hóa chất

Bảng 2. 1. Dung môi và hóa chất cần dùng
Stt Tên dung môi, hóa chất Xuất xứ

1 Chloroform Trung Quốc
2 Dicloromethan Trung Quốc
3 Ethyl acetat Trung Quốc
4 Hexan Trung Quốc
5 Toluen Trung Quốc
6 Methanol Trung Quốc
7 Ethanol 50%, 80%, 96% Việt Nam
8 Amoniac đậm đặc Trung Quốc
9 Acid hydrochloric Trung Quốc
24
2.1.3. Trang thiết bị
Bảng 2. 2. Các thiết bị sử dụng
Stt Tên thiết bị Model Hãng sản xuất
1 Bếp cách thủy WNB 14 Memmert (Đức)
2 Cân phân tích 0,1mg Entris 224I-1S Sartorius (Đức)
3 Đèn UV 254 nm & 365 nm UVP10 Spectroline (Mỹ)
4 Máy đo quang UV UV 1800 Shimadzu (Nhật)
5 Tủ hood BS-122 Tran Vu (Việt Nam)
6 Máy xay An Phú Tân (Việt Nam)
7 Tủ sấy UN 110 Memmert (Đức)
8 Máy cô quay RV 10 Control IKA (Đức)
9 Kính hiển vi CX 22 Olympus (Nhật)
25
2.2. P ƣơng p áp ng ên cứu
2.2.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết
Sử dụng dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin
sulfat) của công ty Cipla Pharma.
2.2.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin

a. Phương pháp hóa học
Chuẩn bị mẫu: Hút 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg
vinblastin sulfat), pha loãng với nước cất vừa đủ 10 ml.
Sau khi chuẩn bị mẫu nhƣ trên, tiến hành định tính alkaloid bằng phƣơng pháp hóa
học với các thuốc thử chung alkaloid.
b. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu 1: Thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1 mg vinblastin sulfat).

+ Mẫu 2: Hút chính xác 1 ml dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin cho vào bình
định mức 20 ml, thêm nước cất đến vạch. Acid hóa dịch nƣớc với HCl 1M (TT)
đến pH 1-2, sau đó kiềm hóa dung dịch bằng amoniac đậm đặc (TT) đến pH 9-
10. Chiết vinblastin base trong dung dịch bằng chloroform. Cô thu hồi bớt dung
môi.
Tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng và quan sát ở những điều kiện khác nhau.
2.2.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) của phần 2.2.1.1.
2.2.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của alkaloid chiết đƣợc
Thực hiện đo khối phổ của mẫu dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm bằng hệ ESI-
MS/MS (Phƣơng pháp ion hóa phun điện).
Ghi nhận lại phổ đồ và xác định số khối của hoạt chất trong mẫu thử.
26
2.2.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10
mg/ 10 ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ
Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu 3: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm Cytoblastin 10 mg/10 ml (có chứa 1
mg vinblastin sulfat) vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch để thu
đƣợc dung dịch có nồng độ 0,001 g/l (1 ppm)
+ Mẫu 4: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1. Cô dịch chloroform đến
cắn. Hòa tan cắn với methanol, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol
đến vạch.
Tiến hành quét phổ của 2 mẫu trên bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 để
khảo sát cực đại hấp thụ của các mẫu này.
2.2.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn của alkaloid sulfat trong nƣớc
Chuẩn bị mẫu: Tiến hành chuẩn bị 6 dung dịch mẫu nhƣ sau để thu đƣợc các dung
dịch có nồng độ (g/l) khác nhau.
Trộn 5 ống thuốc tiêm lại, lắc đều cho đồng nhất. Hút lƣợng thuốc tiêm nhƣ sau:
Dung dịch 1: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 50 ml.
Dung dịch 2: Hút chính xác 18 ml dung dịch 1 pha vào bình định mức 20 ml.
Dung dịch 4: Hút chính xác 1 ml thuốc tiêm pha vào bình định mức 100 ml.
Thêm nước cất vừa đủ thể tích.

Bảng 2. 3. Nồng độ các dung dịch thu đƣợc
Dung dịch 1 2 3 4 5 6
Nồng độ thu đƣợc (g/l) 0,002 0,0018 0,0014 0,001 0,0008 0,0006
27
Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu bằng máy quang phổ Shimadzu UV 1800 và
vẽ đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastin
sulfat.
2.2.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn
2.2.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật
Soi bột: Quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị) trƣớc khi soi trên kính hiển
vi.
2.2.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu dừa cạn

a. Phương pháp hóa học
Chuẩn bị mẫu: Lấy 3 g bột dƣợc liệu cho vào một bình nón nút mài, làm ẩm bột
dƣợc liệu bằng amoniac đậm đặc (TT) trong 30 phút. Thêm 30 ml chloroform (TT),
lắc kỹ trong 30 phút, lọc vào bình lắng gạn. Chiết 3 lần bằng dung dịch acid
hydrocloric 2 % (TT), mỗi lần với 5 ml, thu đƣợc dịch chiết acid.
Tiến hành thử với các thuốc thử chung alkaloid để xác định sự có mặt của alkaloid.
b. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu chuẩn: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1.

+ Mẫu thử: Chuyển dung dịch acid đã chiết ở phần phản ứng hóa học còn lại
vào bình gạn, kiềm hóa bằng amoniac đậm đặc (TT) tới pH 9-10, lắc với
chloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết chloroform, cô trên cách thủy
đến còn khoảng 5 ml.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định sự có mặt của alkaloid.
28
2.2.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn
Quy trình chiết alkaloid cơ bản:
Bột dƣợc liệu
- Ngâm lạnh với dung môi chiết 1

Bƣớc 1
- Cô thu hồi bớt dung môi, lọc
Dịch lọc
- Lắc phân bố với dung môi 2 để loại

Bƣớc 2 chlorophyll.
- Loại bỏ dịch dung môi
Dịch nƣớc còn lại
- Chiết với dung môi 3

Bƣớc 3
Dịch chiết dung môi
Hình 2. 1. Sơ đồ tổng quát chiết xuất alkaloid từ dƣợc liệu
Tiến hành khảo sát các dung môi thích hợp cần dùng để thu đƣợc quy trình ổn định
và phù hợp nhằm chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Các bƣớc tiến hành khảo
sát đƣợc tiến hành nhƣ sau:
a. Khảo sát dung môi chiết ở bước 1 (theo hình 2.1)

Tiến hành khảo sát dung môi chiết bƣớc 1 theo quy trình chiết với các dung môi:
+ Ethanol 50 %
+ Ethanol 80 %
+ Ethanol 96 %
Các dung môi dùng ở bƣớc 2 và 3 tùy chọn. Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid
toàn phần (m2) và tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn
phần thu đƣợc.
29
b. Khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bước 2 (theo hình 2.1)
Sau khi đã khảo sát xong dung môi chiết bƣớc 1, chiết alkaloid trong Dừa cạn bằng
dung môi đã chọn, sau đó tiến hành khảo sát dung môi 2 loại chlorophyll theo quy
trình chiết cơ bản (hình 2.1) với các dung môi sau:
+ Hexan
+ Toluen
+ Ethyl acetat
+ Dicloromethan
Dùng dung môi tùy ý để chiết ở bƣớc 3. Ghi nhận lại khối lƣợng tủa (m1) sau khi
loại chlorophyll và khối lƣợng cao alkaloid toàn phần (m2).
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu đƣợc.
c. Khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bước 3 (theo hình 2.1)
Dùng các dung môi đã khảo sát đƣợc ở mục (a), (b) và tiến hành khảo sát tiếp dung
môi để chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) nhƣ
trên. Khảo sát dung môi chiết alkaloid base với các dung môi sau:
+ Chloroform
+ Ethyl acetat
+ Dicloromethan
Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid toàn phần (m2) thu đƣợc.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid toàn phần thu đƣợc.
2.2.3. Tố ƣu ó quy trìn c ết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn

Từ kết quả nghiên cứu sơ bộ ở trên, ta có thể chọn đƣợc các dung môi thích hợp để
thu đƣợc quy trình chiết alkaloid ổn định và phù hợp. Để chiết xuất đƣợc alakloid từ
cây Dừa cạn, ta dùng phƣơng pháp ngâm lạnh, tuy nhiên, hiệu suất của phƣơng
pháp này lại phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau nhƣ thời gian chiết xuất,
30
dung môi chiết xuất, tỉ lệ dung môi và dƣợc liệu, nhiệt độ chiết... Vì vậy, tiến hành
tìm những điều kiện chiết tối ƣu để thu đƣợc lƣợng alkaloid toàn phần nhiều nhất.
Áp dụng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm với 3 yếu tố độc lập: Tỷ lệ dung môi
và dƣợc liệu, thời gian ngâm lạnh (giờ), pH dùng để kiềm hóa. Yếu tố phụ thuộc
hay thông số tối ƣu hóa là khối lƣợng alkaloid toàn phần cân đƣợc (g). Giá trị các
yếu tố độc lập và khoảng biến thiên đƣợc trình bày ở bảng 2.4 [7].
Sử dụng phần mềm Modde 5.0 theo mô hình D-Optional để thiết kế 13 thí nghiệm
chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đó thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm
tại mức độ cơ bản của các yếu tố. Thực hiện 16 thí nghiệm đã thiết kế, nhập số liệu
thu đƣợc và phân tích kết quả dựa trên các phân tích toán học của phần mềm Modde
5.0.
Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi
Yếu tố Ký Mức Mức Mức Khoảng biến

Stt
hiệu cơ bản trên (+) dƣới (-) thiên ()
Tỷ lệ dung môi
1 và dƣợc liệu X1 10:1 15:1 5:1 5
(ml/g)
Thời gian ngâm

2 X2 24 30 18 6
lạnh (giờ)
pH dùng để
3 X3 9,0 10,0 8,0 1,0
kiềm hóa
31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết
3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin
3.1.1.1. P ƣơng p áp ó ọc
Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.1.1, sau đó lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào
6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.
- Ống 1 (Ống chứng): Không thêm thuốc thử.
- Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).
- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).
- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).
- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).
- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).
Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1
(ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.1:
Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng
pháp hóa học
Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á

1 Không thêm thuốc thử
2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++
3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++
4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +
5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng +
6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++
Chú thích: (+) dung dịch đục mờ nhƣng không lắng
(++) Dung dịch đục, có tủa lắng sau vài phút
(+++) Có tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2.
Nhận xét: Khi cho thêm các thuốc thử vào, thấy xuất hiện kết tủa và dung dịch bị
đục, chứng tỏ trong mẫu thuốc tiêm Cytoblastin có alkaloid.
32
3.1.1.2. Sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (b) phần 2.2.1.1 và tiến hành sắc ký với điều kiện:
- Bản mỏng: Silica gel F254.
- Dung môi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).
- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.
(a) (b) (c) (d)

Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm
Cytoblastin (1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2)
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff
33
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng
bƣớc sóng 254 nm, vết vinblastin sulfat trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và vết của
dịch chiết từ thuốc tiêm (2) có Rf bằng nhau và hiện màu tím lơ. Đồng thời, sắc ký
đồ của 2 dung dịch sau khi phun thuốc thử Dragendorff cho 2 vết màu cam.
3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Thực hiện chiết nhƣ mẫu 2, thu đƣợc dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm.
3.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng
p ƣơng p áp sắc ký lỏng g ép đầu dò khối phổ (MS )
Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu nhƣ phần 2.2.1.3. Tiến hành đo khối phổ của mẫu thử
bằng hệ ESI-MS/MS (Phƣơng pháp ion hóa tia điện).
- Thời gian chạy: 1 phút

- Năng lƣợng ion hóa: 70 eV
- Tốc độ dòng: 2 ml/ phút
Hình 3. 2. Phổ khối ESI-MS của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin
Nhận xét: Sau khi quan sát phổ khối của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin, ta
thấy số khối của hoạt chất trong dịch thử là [M] = 811,36 m/z và [M+1] = 812,50
m/z. Phổ khối ESI-MS của chất thử cho pic ion phân tử, ở dạng [M+1] với cƣờng
độ khá mạnh, các pic ion phân tử với số khối phù hợp với trọng lƣợng phân tử lý
thuyết của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V là M = 811,0 g/mol [1].
34
Kết luận: Từ kết quả của các mục 3.1.1, 3.1.2 và 3.1.3 có thể khẳng định rằng trong
thuốc tiêm Cytoblastin có chứa vinblastin.
3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin
10mg/ 10ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ
Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 2.2.1.4. Tiến hành quét phổ để tìm cực đại hấp thụ của
vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
- Mẫu 1: Có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng λ= 258,0 nm, A = 0,327.
- Mẫu 2: Có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng λ= 258,0 nm, A = 0,127.
Hình 3. 3. Phổ UV-Vis của vinblastine sulfat trong nƣớc
35
Hình 3. 4. Phổ UV-Vis của vinblastine base trong methanol
Nhận xét: Mẫu 3 và mẫu 4 đều có cực đại hấp thụ tại max = 258 nm. Vậy chọn
bƣớc sóng 258 nm để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.
3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 ở bƣớc sóng
258 nm, kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2:
Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin
Mẫu Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ

1 0,0020 0,641
2 0,0018 0,576
3 0,0014 0,441
4 0,0010 0,319
5 0,0008 0,259
6 0,0006 0,197
36
0.7
0.6
0.5
Độ hấp thu A
0.4
y = 317.0x + 0.003
0.3 R² = 0.999
0.2
0.1
0
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025
Nồng độ vinblastine sulfate (g/l)
Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ
của vinblastine sulfat
Trắc nghiệm t: Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b theo phƣơng trình hồi quy:
y = 317x + 0,003.
Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”.

HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”.
- t0,05 (n-2) = 2,77.
- t0 = 0,86 < t0,05 (n-2) = 2,77  chấp nhận H0  hệ số b không có ý nghĩa
thống kê.
- t0 = 94,39 > t0,05 (n-2) = 2,77  chấp nhận HA  hệ số a có ý nghĩa thống kê.
Trắc nghiệm f: Kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy.
Giả thuyết H0: Bj = 0 “Phƣơng trình hồi quy không tƣơng thích”.
HA: Bj ≠ 0 “Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích”.
- f0,05 = 7,71.
- f = 8910,16 > f0,05  chấp nhận HA  phƣơng trình hồi quy tƣơng thích.
37
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ
hấp thụ của vinblastin sulfat theo phƣơng trình y = 317x, R2= 0,999 trong khoảng
nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006 - 0,002 g/l.
Nhận xét chung:
Ta chiết vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng cách chuyển vinblastin ở dạng
muối thành vinblastin base và dùng dung môi hữu cơ để chiết vinblastin base ra
khỏi dung dịch. Sau khi tiến hành định tính dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin và
dịch chiết đƣợc từ thuốc tiêm thì kết quả cho thấy có alkaloid trong cả 2 dung dịch.
Đồng thời, khi xác định khối lƣợng phân tử của chất đã chiết đƣợc bằng phƣơng
pháp MS, ta thấy khối lƣợng phân tử của chất đã chiết tƣơng đƣơng với khối lƣợng
phân tử của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V (M = 811,0 g/mol). Chứng tỏ có
alkaloid (định tính vinblastin) trong dịch chiết này.
Khảo sát cực đại hấp thụ của chất đã chiết và vinblastin sulfat trong thuốc tiêm, ta
thấy cả 2 mẫu đều có cực đại hấp thụ tại 258 nm. Chọn bƣớc sóng 258 nm là bƣớc
sóng để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.
Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thấy có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và
độ hấp thụ của vinblastin sulfat trong môi trƣờng nƣớc ở khoảng nồng độ vinblastin
sulfat từ 0,0006-0,002 g/l.
3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn
3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật
Bột Dừa cạn toàn cây có màu vàng nhạt, không mùi, vị đắng. Các cấu tử đƣợc tìm
thấy trong bột dƣợc liệu gồm có: mảnh bần, mảnh mô mềm có chứa tinh bột, mảnh
mạch vòng, mạch xoắn, mạch vạch, lông che chở đơn bào hay đa bào.
Nhận xét: Bột dƣợc liệu Dừa cạn có các cấu tử đặc trƣng của bột cây Dừa cạn theo
DĐVN V [1].
38
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn
(a) Mảnh bần (b) Mảnh mô mềm có tinh bột (c) Mạch vòng
(d) Mạch xoắn (e) Mạch vạch (f) Lông che chở đơn bào
39
3.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu Dừa cạn
3.2.2.1. Phản ứng hóa học
Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.2.2, sau đó lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào
6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.
- Ống 1 (Ống chứng): Không thêm thuốc thử.

- Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).
- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).
- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).
- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).
- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).
Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1
(ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.3:
Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu
bằng phƣơng pháp hóa học
Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á

1 Không thêm thuốc thử
2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++
3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++
4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +
5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng ++
6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++
Chú thích: (+) Dung dịch đục mờ nhƣng không lắng

(+++) Có tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2
Nhận xét: Dịch chiết cho phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử chung
alkaloid, điều đó chứng tỏ trong mẫu dƣợc liệu có chứa alkaloid.
40
3.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị 2 mẫu nhƣ mục (b) phần 2.2.2.2 và tiến hành sắc ký với điều kiện:
- Bản mỏng: Silica gel F254.
- Dung môi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).
- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.
(a) (b) (c) (d)
Hình 3. 7. Sắc ký đồ xác định vinblastine (C) trong dịch chiết (T) cây Dừa cạn
41
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng
bƣớc sóng 254 nm, sắc ký đồ của dịch chiết từ cây Dừa cạn (T) cho vết tƣơng
đƣơng với vết trên sắc ký đồ của vinblastin (C). Đồng thời, khi phun thuốc thử
Dragendorff, trên sắc ký đồ của 2 dung dịch cho 2 vết màu cam có cùng Rf.
Nhận xét chung:

Từ kết quả thực nghiệm ở các mục 3.2.2.1, 3.2.2.2 thu đƣợc:
+ Khi thực hiện phản ứng hóa học, dịch chiết Dừa cạn cho phản ứng dƣơng tính
với thuốc thử chung alkaloid, chứng tỏ đƣợc rằng Dừa cạn có chứa các hợp chất
alkaloid.
+ Khi tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu là vinblastin (đã xác định
đƣợc trong mục 3.2.1) thì chứng minh đƣợc rằng trong mẫu dịch chiết Dừa cạn
có chứa vinblastin, một vinca alkaloid có trong cây Dừa cạn.
Vậy mẫu dƣợc liệu đã thu mua ở trên là mẫu cây Dừa cạn.
42
3.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa
cạn
Bột dƣợc liệu (50 g)
- Ngâm lạnh với dung môi 1

- Rút dịch chiết, cô bớt dung môi để đƣợc cao lỏng
- Lọc
Dịch lọc
- Lắc phân bố với dung môi 2 (10 ml x 3 lần)
Dịch dung môi (A) Dịch nƣớc còn lại
- Cô thu hồi dung môi - Acid hóa bằng HCl 2% đến pH = 1-2
- Kiềm hóa bằng NH3 đđ đến pH = 10
Cắn khô (m1)
- Chiết bằng dung môi hữu cơ 3
Dịch dung môi (B) Triển khai SKLM

Định tính alkaloid bằng
- Cô thu hồi dung môi
thuốc thử chung và
SKLM - Sấy đến khối lƣợng không đổi
Cao khô (m2)
Hình 3. 8. Sơ đồ quy trình chiết xuất alkaloid chi tiết
3.2.3.1. Khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1)
Thực hiện chiết bột Dừa cạn với ethanol 50%, 80% và 96% theo quy trình chiết
xuất hình 3.8. Sử dụng dung môi khảo sát ở bƣớc 2 là Toluen và bƣớc 3 là
Chloroform. Đánh giá bằng cách xác định khối lƣợng cao alkaloid toàn phần thu
đƣợc (m2), sắc ký đồ của các dịch chiết (dịch B) cũng nhƣ các yếu tố khác ảnh
hƣởng đến quy trình chiết xuất. Thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.4:
43
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1)
Stt Dung môi chiết Khối lƣợng cao alkaloid

1 Ethanol 50 % toàn0,4976
phần (g)
2 Ethanol 80 % 0,5013
3 Ethanol 96 % 0,4797
(a) (b) (c) (d)

Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết ở bƣớc 1
Chú thích: (C) Vinblastine đối chứng
(50) Cao chiết với ethanol 50 %
44
Nhận xét: Hiệu suất chiết cao alkaloid trong trƣờng hợp chiết bằng ethanol 50 % và
80 % là gần bằng nhau, trên sắc ký đồ dịch chiết từ ethanol 50 % cũng có các vết
tƣơng đƣơng với các vết của dịch chiết từ ethanol 80 %. Trong khi đó, cao alkaloid
thu đƣợc khi chiết bằng ethanol 96 % ít hơn, đồng thời cũng có ít vết trên sắc ký đồ
hơn so với 2 dịch chiết trên.
Vậy ethanol 50 % hoặc 80 % sẽ thích hợp để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn hơn
ethanol 96%.
Tuy nhiên, trong quá trình chiết, sau khi cô loại bỏ dung môi ở bƣớc 1, khi lọc cao
lỏng, phần cao lỏng ethanol 50% khó lọc hơn phần cao lỏng ethanol 80% vì có
nhiều tủa li ti gây tắc lọc, do đó gây khó khăn cho quá trình chiết xuất. Vậy chọn
ethanol 80% làm dung môi chiết ở bƣớc 1.
3.2.3.2. Khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bƣớc 2 (theo hình 2.1)
Thực hiện chiết bột Dừa cạn, sau đó khảo sát khả năng loại chlorophyll của 4 dung
môi khác nhau. Sử dụng dung môi bƣớc 1 là dung môi đã khảo sát đƣợc ở mục
3.2.3.1, dung môi ở bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá các dung môi này dựa trên:
Cao alkaloid toàn phần, sắc ký đồ của dịch dung môi loại chlorophyll (dịch A), định
tính alkaloid trong dịch A, sắc ký đồ của dịch alkaloid toàn phần (dịch B).
45
Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung môi loại chlorophyll ở bƣớc 2
Dung môi loại Khố lƣợng alkaloid Định tính alkaloid

Stt
chlorophyll toàn phần (g) có trong dịch A
1 Hexan 0,5081 (-)

2 Toluen 0,5067 (+)
3 Ethyl acetat 0,5013 (+)
4 Dicloromethan 0,4831 (++)
Chú thích: (-) Dung dịch trong suốt
(+) Dung dịch đục mờ nhƣng không lắng
(a) (b) (c) (d)

Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung môi loại chlorophyll (dịch A)
Chú thích: (H): Dịch hexan

(T): Dịch toluen
(E): Dịch ethyl acetat
(D): Dịch dichloromethan
46
(a) (b) (c) (d)
Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid toàn phần (dịch B)
Chú thích:
(H): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng hexan
(T): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng toluen
(E): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng ethyl acetat
(D): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng dichloromethan
Nhận xét: Khi xét cao alkaloid toàn phần thu đƣợc, các trƣờng hợp đƣợc loại
chlorophyll bằng dung môi hexan và toluen cho lƣợng alkaloid nhiều hơn so với 2
trƣờng hợp còn lại. Tuy nhiên, khi định tính alkaloid trong phần dịch A, ta thấy chỉ
có dịch chiết hexan không cho kết tủa với thuốc thử chung alkaloid, còn 3 dịch còn
lại đều cho kết tủa với thuốc thử chung. Đồng thời trên sắc ký đồ của dịch A, sau
khi nhúng thuốc thử Dragendorff, các bản khác đều xuất hiện các vết cho màu cam
với thuốc thử, chỉ có dịch hexan là không, chứng tỏ trong các dịch toluen, ethyl
acetat và dicloromethan có chứa alkaloid. Có nghĩa là alkaloid có thể hòa tan trong
các dung môi này, gây thất thoát lƣợng alkaloid toàn phần. Vậy chọn hexan là dung
môi để loại chlorophyll ở bƣớc 2.
47
3.2.3.3. Khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 (theo hình 2.1)
Thực hiện khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 với 3 dung môi khác
nhau là Chloroform, Ethyl acetat và Dicloromethan. Dung môi sử dụng ở bƣớc 1 và
2 là các dung môi khảo sát đƣợc ở 2 mục 3.2.3.1 và 3.2.3.2. Đánh giá kết quả khảo
sát dựa trên khối lƣợng cao alkaloid toàn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của dịch
alkaloid (dịch B) và các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất.
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung môi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3
Stt Dung môi chiết tách alkaloid base Khố lƣợng alkaloid toàn phần (g)
1 Dichloromethan 0,4895
2 Chloroform 0,4952
3 Ethyl acetat 0,4737
(a) (b) (c) (d)

Hình 3. 12. Sắc ký đồ so sánh dung môi chiết tách alkaloid base toàn phần (dịch B)
Chú thích:
(D): Dịch dicloromethan (C): Dịch chloroform (E): Dịch ethyl acetat
48
Nhận xét: Lƣợng cao alkaloid toàn phần chiết với dung môi chloroform cao hơn
khi chiết với dung môi dicloromethan và ethyl acetat. Ngoài ra, chloroform là dung
môi ít hỗn hòa với ethanol nhất, dễ chiết hơn 2 dung môi còn lại. Chọn chloroform
làm dung môi chiết ở bƣớc 3.
Nhận xét chung:
Theo kết quả của 3 phần 3.2.3.1, 3.2.3.2 và 3.2.3.3, ta chọn đƣợc các dung môi nhƣ
sau:
- Dung môi chiết ban đầu: Ethanol 80%
- Dung môi loại chlorophyll: Hexan
- Dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid: Chloroform
Từ đó, ta xây dựng đƣợc quy trình chiết alkaloid đầy đủ nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Ngâm lạnh 50 g dƣợc liệu với ethanol 80% trong thời gian xác định.
Rút dịch chiết và cô bớt dung môi đến khi thu đƣợc cao lỏng toàn phần. Lọc.
- Bƣớc 2: Dịch lọc đƣợc đem đi lắc phân bố với 30 ml dung môi hexan để loại
bỏ chlorophyll. Sau khi lắc với dung môi sẽ thu đƣợc 2 phần dịch là dịch dung
môi và dịch nƣớc.
- Bƣớc 3: Dịch nƣớc đƣợc acid hóa với HCl 2% (TT) đến pH 1-2, thử bằng giấy
quỳ tím. Sau đó, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac (TT) đến khoảng pH 10, thử
độ pH bằng giấy quỳ tím. Sau khi đã kiềm hóa, dung dịch đƣợc lắc với 100 ml
dung môi chiết xuất chloroform. Dịch dung môi đƣợc thu vào bình định mức
100 ml, thêm chloroform vừa đủ (dịch B).
3.3. Tối ƣu ó quy trìn c ết xuất lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây

Dừa cạn
3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tố ƣu ó
Dùng phần mềm Modde 5.0 theo mô hình D-Optional, ta thiết kế đƣợc 13 thí
nghiệm chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đó thực hiện lặp lại 3 lần thí
nghiệm tại mức độ cơ bản của các yếu tố.
49
Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hóa đã xây dựng đƣợc
Tỷ lệ giữa dung Khố lƣợng cao

Thời gian
Stt mô / dƣợc liệu pH kiềm hóa alkaloid toàn phần
ngâm (giờ)
(ml/g) (g)
(ml/g)
1 5:1 18 8 0,5921
2 15:1 18 8 0,3851
3 5:1 30 8 0,5307
4 15:1 30 8 0,4801
5 5:1 18 10 0,5184
6 15:1 18 10 0,3332
7 5:1 30 10 0,4932
8 15:1 30 10 0,4831
9 5:1 18 9 0,5387
10 5:1 24 8 0,5079
11 5:1 24 10 0,5184
12 10:1 18 10 0,4451
13 10:1 24 9 0,4580
14 10:1 24 9 0,4496
15 10:1 24 9 0,4328
16 10:1 24 9 0,4515
50
3.3.2. Kết quả tố ƣu ó
Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng, sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ sau:
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3. 13. Sắc ký đồ của các dung dịch trong thí nghiệm
51
Từ các số liệu thực nghiệm, sử dụng phần mềm Modde 5.0, thu đƣợc các thông số
tối ƣu hóa nhƣ bảng 3.8:
Bảng 3. 8. Kết quả các thông số đánh giá mô hình thiết kế tối ƣu hóa
Stt Thông số Kết quả

1 Lack of fit (giá trị p) 0,157
2 R2 0,972
3 R2 điều chỉnh 0,930
4 Q2 0,767
5 p của mô hình > F < 0,001
Từ bảng 3.8, ta thấy hệ số tƣơng quan R2 và R2 hiệu chỉnh của mô hình này đều lớn
hơn 0,9 nên có thể xem rằng mô hình thiết kế này phù hợp gần với gần 90 % dữ liệu
thu đƣợc. Có nghĩa là, gần 90 % biến phụ (3 yếu tố tối ƣu hóa) đƣợc giải thích bởi
biến độc lập (khối lƣợng alkaloid toàn phần).
Hệ số lack–of–fit có ý nghĩa rằng sai số trong phần mềm khác nhau không có ý
nghĩa thống kê. Hệ số này phải lớn hơn 0,05 (p > 0,005) thì mới có thể bỏ qua sai số
trong hệ thống phần mềm (vì sai số không đáng kể). Dựa theo bảng 3.8, hệ số lack-
of-fit của mô hình thiết kế là 0,157, lớn hơn 0,005, vì vậy, ta có thể cho rằng sai số
trong hệ thống phần mềm là không đáng kể, có thẻ bỏ qua các sai số này.
Nhận thấy, R2 = 0,972 (R2 < 0,995), điều đó cho thấy sự tƣơng quan của tỉ lệ dung
môi/dƣợc liệu, thời gian ngâm và pH kiềm hóa gần nhƣ có ý nghĩa với độ tin cậy
95% (p < 0,05).
52
Hình 3. 14. Kết quả thể hiện mức ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hóa
Theo nhƣ kết quả thể hiện mức độ ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hóa, ta nhận
thấy các yếu tố tỉ lệ dung môi/dƣợc liệu (X1), thời gian ngâm (X2) và pH kiềm hóa
(X3) đều có ảnh hƣởng đến khối lƣợng alkaloid toàn phần thu đƣợc. Trong đó, tỉ lệ
dung môi/ dƣợc liệu có ảnh hƣởng lớn nhất, pH kiềm hóa có ảnh hƣởng ít nhất.
Ngoài ra, tƣơng tác giữa tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm cũng có ảnh
hƣởng đến khối lƣợng cao alkaloid toàn phần thu đƣợc.
Hình 3. 15. Hệ số biến thiên của các yếu tố ảnh hƣởng
53
Từ đó, ta xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng cong của mô hình:
Y=0,4484 0,0558X1 0,0181X2 0,0135X3 0,0429X1 X2
Trong đó:
- Y là khối lƣợng alkaloid toàn phần thu đƣợc.
- X1 là tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu.
- X2 là thời gian ngâm lạnh.
- X3 là pH dùng để kiềm hóa.
Đƣờng cong cho thấy mối quan hệ giữa các biến độc lập và biến phụ thuộc là đáng
tin cậy 95% và hệ sô tƣơng quan R2 = 0,972.
3.3.3. P ân tíc tƣơng tác ản ƣởng giữa các yếu tố
Hình 3. 16. Đƣờng cong thể hiện tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát
54
3.3.3.1. Ản ƣởng của tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu lên khố lƣợng alkaloid toàn
phần
Theo nhƣ đƣờng cong, ta thấy tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu càng tăng thì khối lƣợng
alkaloid toàn phần càng giảm. Điều này cho thấy rằng alkaloid có thể hòa tan trong
dung môi với một tỉ lệ nhất định. Khi quá nhiều dung môi, alkaloid có thể không
tăng hoặc giảm. Đây có thể là do các yếu tố bên ngoài tác dụng vào, hoặc do sự
không bền vững của một vài alkaloid trong môi trƣờng chiết.
3.3.3.2. Tƣơng tác g ữa tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm
Theo sơ đồ, ta thấy ở những pH khác nhau, tỉ lệ dung môi/ dƣợc liệu và thời gian
ngâm có sự tƣơng tác với nhau. Khi tăng thời gian ngâm, khối lƣợng alkaloid toàn
phần tăng lên đến một giới hạn rồi giảm dần. Điều này có thể là do tƣơng tác của tỉ
lệ dung môi/ dƣợc liệu lên thời gian ngâm.
3.3.3.3. Ản ƣởng của yếu tố pH kiềm hóa

pH là yếu tố ít có ảnh hƣởng nhất lên khối lƣợng alkaloid toàn phần tạo thành.
Thêm vào đó, pH cũng ít có ảnh hƣởng lên hai biến số còn lại là tỉ lệ dung
môi/dƣợc liệu và thời gian ngâm. Tuy nhiên, có thể nhận thấy, khi tăng pH, khối
lƣợng alkaloid sẽ giảm dần đến một giới hạn rồi không giảm nữa. Điều này có thể
giải thích là do khi tăng pH lên cao, việc tạo thành tủa trong dung dịch gây mất mát
một phần alkaloid.
55
3.3.4. Kết quả dự đoán
Hình 3. 17. Đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đoán và kết quả
thực tế
Kết quả dự đoán và kết quả thực tế đều nằm trong vùng cho phép với R2 = 0,877
Dựa vào phần mềm tối ƣu hóa Modde 5.0, thu đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất
alkaloid từ cây Dừa cạn nhƣ sau:
Bảng 3. 9. Điều kiện tối ƣu hóa dự đoán
Stt Yếu tố Giá trị Khố lƣợng alkaloid toàn phần

dự đoán (g)
1 Tỉ lệ dung môi/dƣợc liệu (ml/g) 5:1
2 Thời gian ngâm (giờ) 18 0,5841
3 pH kiềm hóa 8
Thực hiện lại 3 lần thử nghiệm với điều kiện tối ƣu hóa đã dự đoán đƣợc, đánh giá
điều kiện tối ƣu hóa đã dự đoán.
56
Bảng 3. 10. Kết quả thực hiện 3 lần điều kiện tối ƣu
Stt Số lần Khố lƣợng alkaloid toàn phần t u đƣợc (g)
1 Lần 1 0,6021
2 Lần 2 0,5794
3 Lần 3 0,5869
Nhận xét: Thực nghiệm cho kết quả p = 0,029 < 0,050 với khoảng tin cậy là 95%,
vậy kết quả có ý nghĩa thống kê.
3.4. Bàn luận

Trong việc thực hiện đề tài,chúng tôi đã gặp một vài khó khăn nhƣ sau:
Vì là dƣợc liệu lấy toàn thân nên hàm lƣợng alkaloid ở từng bộ phận của cây là
khác nhau. Vậy nên, mặc dù đã kiểu soát sơ bộ về kích thƣớc dƣợc liệu nhƣng
lƣợng alkaloid toàn phần của từng thực nghiệm vẫn có thể bị ảnh hƣởng bởi sự
không đồng nhất bột dƣợc liệu.
Việc sử dụng phƣơng pháp định lƣợng alkaloid bằng phƣơng pháp cân và định tính
sơ bộ qua sắc ký lớp mỏng vẫn còn nhiều hạn chế và sai lệch trong quá trình thực
hiện, định lƣợng bằng phƣơng pháp cân rất dễ sai số và có mức độ đáng tin cậy
chƣa cao.
Việc sử dụng các acid và base khác nhau để chuyển dạng alkaloid cũng phần nào
ảnh hƣởng đến khối lƣợng alkaloid toàn phần tạo thành. Tuy nhiên vì thời gian
không cho phép nên vẫn chƣa thể thực hiện khảo sát sự ảnh hƣởng của các acid và
base này lên khối lƣợng alkaloid toàn phần tạo thành.
Phƣơng pháp chiết ngâm lạnh và lắc phân bố có hiệu suất không đƣợc cao so với
các phƣơng pháp khác, tuy nhiên lại dễ thực hiện với số lƣợng mẫu lớn. Việc lắc
phân bố có thể gặp nhiều sai số trong quá trình lắc nên khi lắc phải cẩn thận.
57
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận

Sau 2 tháng thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đƣa ra và thu đƣợc các kết
quả nhƣ sau:
- Xác định đƣợc vinblastin từ thuốc tiêm bằng: phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng,
khối phổ MS và sử dụng vinblastin này làm chất đối chiếu trong định tính alkaloid
từ bột dƣợc liệu. Đồng thời cũng khảo sát đƣợc cực đại hấp thụ của vinblastin và
xây dựng đƣờng chuẩn vinblastin bằng phƣơng pháp quang phổ UV-Vis.
- Định tính sơ bộ dƣợc liệu Dừa cạn:
+ Soi bột và tìm thấy các cấu tử chính của bột Dừa cạn.
+ Định tính các alkaloid trong bột Dừa cạn bằng phƣơng pháp hóa học và sắc
ký lớp mỏng.
- Khảo sát các dung môi và xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất alkaloid toàn phần
(định hƣớng vinblastin) từ Dừa cạn. Kết quả đã chọn đƣợc các dung môi:
+ Dung môi chiết ban đầu: Ethanol 80 %.
+ Dung môi loại chlorophyll: Hexan.
+ Dung môi chiết tách alkaloid base từ dịch acid: Chloroform.
- Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn bằng phần mềm Modde
5.0, nhận thấy các yếu tố: tỷ lệ dƣợc liệu/ dung môi, thời gian ngâm và pH kiềm hóa
đều có ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất alkaloid từ cây Dừa cạn. Và đã chọn
đƣợc điều kiện tối ƣu để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn là:
+ Tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu (tt/kl): 5:1
+ Thời gian ngâm lạnh: 18 giờ
+ pH kiềm hóa: 8
58
4.2. Kiến nghị
Vì thời gian thực hiện có hạn, nếu tiếp tục, chúng tôi sẽ dựa trên những kết quả đã
đạt đƣợc từ nghiên cứu này để:
Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng alkaloid toàn phần (định hƣớng
vinblastin) bằng các phƣơng pháp: chuẩn độ acid-base trong môi trƣờng khan,
quang phổ UV-Vis, HPLC.
Dùng quy trình chiết alkaloid đã tối ƣu hóa để chiết alkaloid toàn phần, sau đó phân
lập và tinh chế các alkaloid có giá trị trong y học nhƣ vinblastin, vincristin và
ajmacilin.
Ứng dụng quy trình chiết alkaloid từ cây Dừa cạn ở nhiều nguồn thu hái khác nhau
và đánh giá hàm lƣợng alkaloid toàn phần (định hƣớng vinblastin) có trong dƣợc
liệu ở các nguồn này.
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 974-
975, 1144-1146.
2. Bộ Y tế (2017), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội, tr. 1467-1468.
3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong,
Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn,
Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc
ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 689-694.
4. Võ Văn Chi (2000), Cây thuốc trị bệnh thông dụng, Nhà xuất bản Thanh Hóa,
Thanh Hóa, tr. 115-116.
5. Phạm Thanh Kỳ (2015), Dược liệu học tập II, Bộ Y Tế, Hà Nội, tr. 9-174.
6. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,
Hà Nội, tr. 307-309.
7. Trần Văn Thanh (2002), Nghiên cứu chiết xuất ajmacilin từ rễ Dừa cạn
(Catharanthus roseus G. Don) và bào chế viên nén ajmacilin, Luận án tiến sĩ
Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh
8. A JMP, Marcel Proust (2012), "Modeling and multivariate methods", JMP Inc.,
Cary, pp. 1-9.
9. Naznin Ara, Mamunur Rashid, MS Shah Amran (2009), "Comparison of
hypotensive and hypolipidemic effects of Catharanthus roseus leaves extract
with Atenolol on Adrenaline induced hypertensive rats ", Pakistan Journal of
Pharmaceutical Sciences 22, pp. 267-271.
10. Rajesh Arora (1998), Biotechnological Studies in Catharanthus roseus L (G)
Don vis-à-vis Secondary Metabolite Production, PhD, Lucknow and Chaudhary
Charan Singh.
11. Rajesh Arora, Poonam Malhotra, Ajay K Mathur, Archna Mathur, Cm Govil, Ps
Ahuja (2009), "Anticancer Alkaloids of Catharanthus roseus: Transition from
Traditional to Modern Medicine", Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive
and Therapeutic Perspective, pp. 293-310.
12. S. Balaabirami, S.Patharajan (2012), "Invitro antimicrobial and antifungal
activity of Catharanthus roseus leaves extract against important pathogenic
organisms", International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4,
pp. 487-490.
13. Bonadonna, Gianni, Zucali, Roberto, Monfardini, Silvio, de Lena, Mario,
Uslenghi, Carlo (1975), "Combination chemotherapy of Hodgkin's disease with
adriamycin, bleomycin, vinblastine, and imidazole carboxamide versus MOPP",
Cancer, 36(1), pp. 252-259.
14. Lawrence H Einhorn, John Donohue., (1977), "Cis-diamminedichloroplatinum,
vinblastine, and bleomycin combination chemotherapy in disseminated testicular
cancer", Annals of internal medicine, 87(3), pp. 293-298.
15. PA Ellis, IE Smith, JR Hardy, MC Nicolson, DC Talbot, SE Ashley, K Priest
(1995), "Symptom relief with MVP (mitomycin C, vinblastine and cisplatin)
chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer", British journal of cancer,
71(2), pp. 366.
16. Kyakulaga A. Hassan, Alinda T. Brenda, Vudriko Patrick, Ogwang E. Patrick
(2011), "In vivo antidiarrheal activity of the ethanolic leaf extract of
Catharanthus roseus Linn. (Apocyanaceae) in Wistar rats", African Journal of
Pharmacy and Pharmacology, 5(15), pp. 1797-1800.
17. M. A. Islam, M. Afia Akhtar, M. R. I. Khan, M. S. Hossain, M. K. Alam, M. I.
I. Wahed, B. M. Rahman, A. S. M. Anisuzzaman, S. M. Shaheen, Maruf Ahmed
(2009), "Antidiabetic and Hypolipidemic Effects of Different Fractions of
Catharanthus Roseus (Linn.) on Normal and Streptozotocin-induced Diabetic
Rats", JOURNAL OF SCIENTIFIC RESEARCH, 2, pp. 334-344
18. Kratika Kumari, Sharmita Gupta (2011), "Antifungal properties of leaf extract
of Catharanthus roseus (G.) Don", American Journal of Phytomedicine and
Clinical Therapeutics.
19. Alvaro Lassaletta, Katrin Scheinemann, Shayna M. Zelcer, Juliette Hukin,
Beverley A. Wilson, Nada Jabado, Anne Sophie Carret, Lucie Lafay-Cousin,
Valerie Larouche, Cynthia E. Hawkins, Gregory Russell Pond, Ken Poskitt,
Daniel Keene, Donna L. Johnston, David D. Eisenstat, Rahul Krishnatry,
Matthew Mistry, Anthony Arnoldo, Vijay Ramaswamy, Annie Huang, Ute
Bartels, Uri Tabori, Eric Bouffet (2016), "Phase II Weekly Vinblastine for
Chemotherapy-Naïve Children With Progressive Low-Grade Glioma: A
Canadian Pediatric Brain Tumor Consortium Study", Journal of Clinical
Oncology, 34(29), pp. 3537-3543.
20. Giuseppe Musumarra, Salvatore Scire (2001), "MODDE, Version 5.0, available
from UMETRICS AB", Journal of Chemometrics, pp. 199-200.
21. B.S. Nayak, M. Anderson, L.M. Pinto Pereira (2007), "Evaluation of wound-
healing potential of Catharanthus roseus leaf extract in rats", Fitoterapia 78, pp.
540–544.
22. R.L. Noble, C.T. Beer, J.H. Cutts (1958), "Role of chance observations in
chemotherapy: Vinca rosea", Annals of the New York Academy of Sciences,
76(3), pp. 882–894.
23. Al Rashid (1970), "Successful treatment of an infant with Letterer-Siwe disease
with Vinblastine sulfate", Clinical Pediatrics 9(8), pp. 494–496.
24. N.Irving Sax (1984), Dangerous Properties of Industrial Materials, Van
Nostrand Reinhold Company, New York.
25. Magdi El-Sayed, Young H. Choi, M. Frédérich, Sittiruk Roytrakul1, Rob
Verpoorte (2004), "Alkaloid accumulation in Catharanthus roseus cell
suspension cultures fed with stemmadenine", Biotechnology Letters 26, pp. 793–
798.
26. CN Sternberg, A Yagoda , HI Scher, RC Watson, N Geller, HW Herr, MJ
Morse, PC Sogani, ED Vaughan, N Bander (1989), "Methotrexate, vinblastine,
doxorubicin, and cisplatin for advanced transitional cell carcinoma of the
urothelium. Efficacy and patterns of response and relapse", Cancer, 64(12), pp.
2448-2458.
27. A Tazi, G Lorillon, J Haroche, A Neel, S Dominique, A Aouba, J.D Bouaziz, C
de Margerie-Melon, E BugnE , V Cottin, T Comont, C Lavigne, J.E Kahn, J
Donadieu, S Chevret (2017), "Vinblastine chemotherapy in adult patients with
langerhans cell histiocytosis: a multicenter retrospective study", Orphanet J Rare
Dis, 12(1), pp. 95.
28. Robert Verpoorte, A. Contin, J. Memelink (2002), "Biotechnology for the
production of plant secondary metabolites", Phytochemistry Reviews, 1(1), pp.
13-25.
29. Widowati, Wahyu, Mozef, Tjandrawati, Risdian, Chandra, Yellianty, Yellianty
(2013), "Anticancer and free radical scavenging potency of Catharanthus roseus,
Dendrophthoe petandra, Piper betle and Curcuma mangga extracts in breast
cancer cell lines", Oxidants and Antioxidants in Medical Science, 2(2), pp. 137-
142.
30. "Classification for Kingdom Plantae Down to Species Catharanthus roseus (L.)
G. Don",
https://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=CAR
O14, <ngày truy cập: 26/09/2018>.
ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
KHOA DƢỢC TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018
GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHÓA LUẬN THEO Ý

KIẾN ĐÓNG GÓP CỦA HỘI ĐỒNG
Tên đề tài khóa luận: Tối ƣu hóa quy trình chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceace).
Họ và tên sinh viên: DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH
Giảng viên hƣớng dẫn: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc
Khóa luận đã đƣợc bổ sung, sửa chữa các nội dung sau:
1. Bổ sung chi tiết thiếu trong Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt.
2. Bổ sung tài liệu tham khảo các mục 1.2.1, 1.2.2 và 1.2.3 và phần chọn các yếu tố
độc lập ở mục 2.2.3.
3. Bổ sung R2 của đƣờng thẳng thể hiện mối quan hệ giữa kết quả dự đoán và kết
quả thực tế .
4. Chia các tài liệu tham khảo ra thành các mục Tiếng Việt, Tiếng Anh và Web.
5. Chỉnh sửa các giá trị của yếu tố “Tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu”.
Giảng v ên ƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
Chủ tịch Hộ đồng Giáo viên phản biện

Dƣơng Phƣơng Quỳnh: Trƣờng Đại Học Nguyễn Tất Thành

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Dƣơng Phƣơng Quỳnh: Trƣờng Đại Học Nguyễn Tất Thành

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

TP. Hồ Chí Minh – 2018

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT ALKALOID

Chuyên ngành: Sản xuất và phát triển thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hƣớng dẫn khoa học: Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc

TP. Hồ Chí Minh - 2018

DƢƠNG PHƢƠNG QUỲNH

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến

Cô PGS. TS Võ Thị Bạch Huệ

Cô Ths. Nguyễn Thị Hồng Phúc

Em xin trân trọng cảm ơn.

STT C ữ v ết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh ng tiếng Việt

Electrospray Ionization - Phƣơng pháp khối phổ với

Bảng 2. 1. Dung môi và hóa chất cần dùng ..............................................................24

- Xác định vinblastin từ thuốc tiêm.

- Khảo sát các hợp chất alkaloid trong Dừa cạn.

1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT

Các loài trong chi:

+ Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon, 1949.

+ Catharanthus ovalis Markgr, 1970.

+Catharanthus pusillus (Murray) G. Don, 1837.

+ Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon, 1949.

+ Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon, 1949.

Bậc phân loại thực vật:

Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

1.1.2.2. Bộ phận dùng

Rễ chiếm 14,5 % so với toàn cây [3].

1.1.2.3. Đặc điểm thực vật

1.1.2.4. Phân bố và trồng trọt

1.1.2.5. Công dụng chủ yếu

Protoalkaloid: Nitơ nằm ở mạch thẳng.

Alkaloid có nhân sterol: Các alkaloid steroid có một khung

1.1.3.2. Tính chất chung của alkaloid

Mùi vị: Đa số alkaloid không có mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ

1.1.3.3. Alkaloid trong Catharanthus roseus (L.)

a. Alkaloid dưới dạng monomer

Alkaloid thuộc nhóm oxindol: mitraphylin (lá, rễ).

b. Alkaloid dưới dạng dimer

1.1.4.1. Vinblastin (VB)

Vinblastin là methyl (3aR,4R,5S, 5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9 -

Vinblastin còn có tên gọi khác là vincaleucoblastine.

Hình 1. 1. Công thức cấu tạo Vinblastin

b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

1.1.4.2. Vincristin (VC)

Vincristin là methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-(acetyloxy)-12-ethyl-4-

Vincristin còn có tên gọi khác là leurocristine.

Hình 1. 2. Công thức cấu tạo Vincristin

Điểm chảy: 218-220 oC

Trọng lƣợng phân tử: 824,972 g/mol

b. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

1.2.1.1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong mô trƣờng kiềm

- Kiềm hóa vừa đủ ẩm

Dịch chiết dung môi hữu cơ

- Lắc dịch với dung dịch acid loãng

Dịch chiết nƣớc acid

- Kiềm hóa đến pH = 10