CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI
Biên Soạn:
PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
www.hutech.edu.vn
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Ấn bản 2014
3 HƯỚNG DẪN MỤC LỤC III
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. I

HƯỚNG DẪN........................................................................................................... IV
BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ THAO TÁC TRONG PHÒNG …. SINH HỌC ..................... 1
1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM ................................ 1
1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ................................................................................ 2
1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT.................................................................... 4
TÓM TẮT .................................................................................................................. 7
CÂU HỎI ÔN TẬP ...................................................................................................... 7
BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC ............... 8
2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC ................................................................ 8
2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC ................................................................ 15
2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ ....................................................................... 16
2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ........................................................................................... 17
2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE ......................................................................... 18
2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID .......................................................................................... 19
2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC .................................................................................. 24
2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN.................................................................................. 29
2.9 TẠO TINH THỂ PROTEIN ................................................................................... 32
2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER ......................................................... 34
TÓM TẮT ................................................................................................................ 37
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 38
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SỬ DỤNG TRONG ....SINH HỌC................................... 39
3.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ .............................................................. 39
3.2 SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG .................................................................. 42
3.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG SẮC KÝ CỘT ........................................................... 45
3.3.1 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion ........................................................................... 46
3.3.2 Sắc ký lọc gel .............................................................................................. 51
3.3.3 Phương pháp sắc ký ái lực ( affinity chromagraphy)........................................... 54
3.3.4 Phương pháp sắc ký cột lỏng ....(high-performance liquid chromatography) .......... 57
3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP ..................................................................... 57
3.5 SẮC KÝ KHÍ GC (GAS CHROMATOGRAPHY) ............................................................... 61
TÓM TẮT ................................................................................................................ 63
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 64
BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI .............................................................. 65
4.1 KHÁI NIỆM VỀ ĐIỆN DI ..................................................................................... 65
4.2 ĐIỆN DI TRÊN GEL .... (POLYCRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS)
.............................. 66
4.2.1 Giới thiệu phương pháp PAGE......................................................................... 66
4.2.2 Điện di không liên tục ................................................................................... 69
4.2.3 Điện di SDS-PAGE ....................................................................................... 71
4.2.4 Điện di protein theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric Focusing of Protein) ............. 72
4.2.5 Điện di hai chiều (Two-dimensional Electrophoresis).......................................... 73
4.2.6 Điện di mao dẫn CE (Capillary Electrophoresis)................................................. 75
4.2.7 Điện di miễn dịch IE (Immunoelectrophoresis) ................................................. 75
4.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN ............................................................ 77
TÓM TẮT ................................................................................................................ 80
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 80
BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE ................................................ 81
5.1 ĐỘNG HỌC ENZYME .......................................................................................... 81
5.2 THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME.................................... 83
5.2.1 Khái niệm chung .......................................................................................... 83
5.2.2 Xác định họat tính enzyme ............................................................................ 85
5.3 ENZYME TYROSINASE ...................................................................................... 85
5.3.1 Nội dung thí nghiệm ..................................................................................... 86
5.3.2 Các bước tiến hành....................................................................................... 86
5.3.3 Phân tích kết quả ......................................................................................... 89
5.3.4 Đơn vị họat tính của enzyme.......................................................................... 90
5.3.5 Đánh giá các bước tinh chế enzyme ................................................................ 92
TÓM TẮT ................................................................................................................ 93
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................... 94
BÀI 6: BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ.............................................. 95
6.1 NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ QUANG PHỔ.......................................... 95
6.1.1 Khái niệm chung .......................................................................................... 95
6.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ SINH CHẤT ....................................................................... 98
6.3 QUANG PHỔ HÙYNH QUANG ........................................................................... 101
6.4 PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG DUNG DỊCH ....................................................... 105
TÓM TẮT .............................................................................................................. 108
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 108
BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID .................................................... 109
7.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN THU NHẬN NUCLEIC ACID .......................................... 109
7.1.1 Thu nhận DNA gồm 3 bước .......................................................................... 109
7.1.2 Thu nhận RNA tòan phần và mRNA ............................................................... 111
7.2 THU NHẬN DNA TỪ VI KHUẨN ......................................................................... 111
7.2.1 Sơ đồ tách chiết phân đọan DNA từ tế bào vi khuẩn ........................................ 112
7.2.2 Thu nhận DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn ..................................................... 113
7.3 TINH SẠCH NUCLEIC ACID.............................................................................. 114
7.3.1 Tinh sạch nucleic acid bằng siêu ly tâm ......................................................... 114
7.3.2 Tinh sạch nucleic acid bằng sắc ký ................................................................ 115
7.4 ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID .......................................................................... 115
7.4.1 Định lượng nucleic acid bằng quang phổ kế .................................................... 116
7.4.2 Định lượng nucleic acid bằng điện di.............................................................. 116
7.4.3 Tinh chế DNA từ gel điện di.......................................................................... 117
TÓM TẮT .............................................................................................................. 118
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 118
BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ ............................................ 119
8.1 CÁC ENZYME DÙNG TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN........................................... 119
8.1.1 Các enzyme cắt giới hạn RE (restrictase) ...................................................... 119
8.1.2 Các enzyme thông dụng khác....................................................................... 120
8.2 ĐIỆN DI NUCLEIC ACID .................................................................................. 122
8.3 LAI PHÂN TỬ .................................................................................................. 123
8.3.1 Cơ sở khoa học của sự lai phân tử................................................................. 123
8.3.2 Các kiểu lai phân tử .................................................................................... 125
8.4 MẪU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU MẪU DÒ .............................................. 130
8.4.1 Mẫu dò ..................................................................................................... 130
8.4.2 Tác nhân đánh dấu ..................................................................................... 131
8.4.3 Phương pháp đánh dấu ............................................................................... 131
8.5 TÁCH DÒNG DNA (CLONING DNA) .................................................................. 133
8.6 PHẢN ỨNG CHUỖI NHÂN SỢI DNA PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) ......
139
8.6.1 Các bước thực hiện PCR .............................................................................. 139
8.6.2 Ứng dụng của PCR...................................................................................... 140
8.6.3 Hạn chế của PCR ........................................................................................ 142
8.7 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA ............................................................................... 142
8.8 MICROARRAY ................................................................................................. 146
TÓM TẮT .............................................................................................................. 148
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 148
BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ ............................................................................ 149
9.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LỌAI KINH ĐIỂN .................................................... 149
9.2 PHÂN LỌAI PHÂN TỬ ...................................................................................... 149
9.2.1 Các phương pháp dùng trong phân lọai phân tử .............................................. 149
9.2.2 Các gen thường dùng trong phân lọai học phân tử........................................... 151
9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA ở prokaryote ............................................ 153
9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium).............................. 155
TÓM TẮT .............................................................................................................. 163
CÂU HỎI ÔN TẬP .................................................................................................. 163
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 164
HƯỚNG DẪN
MÔ TẢ MÔN HỌC
Giáo trình Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học cung cấp kiến thức cơ bản cho sinh
viên đào tạo theo định hướng Công nghệ sinh học về nguyên lý, các kỹ thuật và các thiết bị thường sử
dụng trong các lĩnh vực nghiên cứu của Công nghệ sinh học hiện đại. Chủ yếu tập trung vào nhóm các
phương pháp và thiết bị phân tích protein và nucleic acid, hai đối tượng nghiên cứu chính của Công
nghệ sinh học hiện đại. Giáo trình gồm 9 bài giảng.
NỘI DUNG MÔN HỌC
Bài 1: Giới thiệu phòng thí nghiệm nghiên cứu CNSH và các thao tác cơ bản chuẩn bị làm việc trong
phòng thí nghiệm CNSH.
Bài 2: Giới thiệu tổng quan những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu CNSH gồm phương pháp sử
dụng các lọai điện cực và biosensor, phương pháp chuẩn bị đệm, các phương pháp phân tích hóa
sinh truyền thống, phương pháp thẩm tích và lọc, ly tâm theo mẻ và liên tục, sấy phun và đông
khô, tạo tinh thể và các phương pháp xác định MW của biopolymer.
Bài 3: Giới thiệu nguyên lý của phương pháp sắc ký, chủ yếu tập trung vào sắc ký trao đổi ion, lọc
gel, sắc ký ái lực và HPLC trong thu nhận và tinh sạch protein. Các phương pháp này được trình bầy
theo các bước trong quy trình thu nhận và tinh sạch protein gồm 4 modul. Cuối cùng là các phương
pháp sắc ký thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp, sự phát triển của các phương pháp sắc ký
ái lực, từ sử dụng nguyên lý ái lực kháng nguyên/kháng thể đến ái lực enzyme/cơ chất trong cột
GST và ái lực thứ tự amino acid His với Ni trong cột Nikel.
Bài 4: Giới thiệu phương pháp điện di bao gồm nguyên lý của phương pháp điện di, các kiểu điện di
phân tách, tinh sạch và thu nhận protein và nucleic acid.
Bài 5: Giới thiệu về enzyme tyrosinase. Phân tích các bước trong nghiên cứu động học tyrosinase. Đây
như là bài thực hành lớn nhằm giúp sinh viên biết cách tiếp cận phương pháp phân tích động học
phản ứng xúc tác bởi enzyme.
8 HƯỚNG DẪN HƯỚNG DẪN V
Bài 6: Giới thiệu phương pháp phân tích quang phổ bao gồm nguyên lý, cấu tạo của 3 lọai thiết bị đo
quang hấp phụ (OD) thường sử dụng là máy so mầu, quang phổ khả kiến và UV, quang phổ
hùynh quang. Giới thiệu sơ lược về công hưởng từ hạt nhân, phương pháp ghi phổ nhiễu xạ tia X
và khối phổ MS. Sử dụng 5 phương pháp phân tích quang phổ để định lượng protein.
Bài 7: Tách chiết và định lượng nucleic acid giới thiệu các phương pháp cơ bản thu nhận DNA và RNA
tòan phần từ tế bào vi khuẩn, thực vật và đông vật. Thu nhận plasmid từ tế bào vi khuẩn. Tinh sạch
nucleic acid bằng ly tâm, bằng sắc ký, định tính và định lượng nucleic acid bằng quang phổ, bằng
điện di. Tinh chế nucleic acid bằng điện di.
Bài 8: Giới thiệu các kỹ thuật cơ bản sử dụng trong sinh học phân tử bao gồm các nhóm enzyme sử
dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử, điện di nucleic acid, phương pháp lai phân tử, Các lọai
mẫu dò và phương pháp chế tạo, tách dòng DNA, phương pháp PCR và mục đích sử dụng, xác
định thứ tự nucleotide và microarray.
Bài 9: Phân lọai học phân tử giới thiệu cơ sở khoa học của phương pháp phân lọai truyền thống và
phương pháp phân lọai phân tử. Giới thiệu bản chất của phương pháp phân lọai phân tử, các gen
thường sử dụng cho phân lọai ở tế bào prokaryote và eukaryote. Giới thiệu các bước thực hiện
trong phân lọai phân tử vi khuẩn và hoa lan.
KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ
Môn học Phương pháp nghiên cứu trong Công nghệ sinh học mô đòi hỏi sinh viên có nền tảng về
Hóa sinh, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học.
YÊU CẦU MÔN HỌC
Người học phải dự học đầy đủ các buổi lên lớp và làm bài tập đầy đủ ở nhà.
9 HƯỚNG DẪN HƯỚNG DẪN V
CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC
Để học tốt môn này, người học cần ôn tập các bài đã học, trả lời các câu hỏi và làm đầy đủ bài
tập; đọc trước bài mới và tìm thêm các thông tin liên quan đến bài học.
Đối với mỗi bài học, người học đọc trước mục tiêu và tóm tắt bài học, sau đó đọc nội dung bài
học. Kết thúc mỗi ý của bài học, người đọc trả lời câu hỏi ôn tập và kết thúc toàn bộ bài học, người đọc
làm các bài tập.
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC
Môn học được đánh giá gồm:
Điểm quá trình: 30%. Hình thức và nội dung do GV quyết định, phù hợp với quy chế đào tạo và tình
hình thực tế tại nơi tổ chức học tập.
Điểm thi: 70%. Hình thức bài thi tự luận trong 60 phút. Nội dung thuộc bài thứ 1 đến bài thứ 9.
1 BÀI 1: QUYBÀI 1: QUY
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
PHÒNG THÍPHÒNG THÍ
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 1
BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ
THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Yêu cầu:
- Nắm được nội dung trong Quy định an tòan trong phòng thí nghiệm CNSH
- Nắm được yêu cầu và cách thức chuẩn bị và bảo quản dung dịch và hóa chất thí
nghiệm
- Hiểu được cách thức chuẩn bị nước cất và nước siêu tinh khiết sử dụng trong phòng thí
nghiệm.
1.1 QUY ĐỊNH AN TÒAN LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Trước khi bắt đầu làm việc trong phòng thí nghiệm, việc đầu tiên là phải nắm vững những quy định an
toàn trong phòng thí nghiệm, làm quen với các chỉ dẫn về độ độc hại hóa chất sử dụng, các yếu tố gây
nguy hiểm. Các biện pháp và thiết bị bảo vệ. Trong đó việc tuân thủ quy định làm việc trong phòng thí
nghiệm có ý nghĩa rất quan trọng.
1. Phải luôn đeo kính phòng hộ khi làm thí nghiệm.
2. Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm.
3. Phải nắm vững tính chất hóa học và tính chất vật lý của tất cả hóa chất sử dụng trong phòng thí
nghiệm. Tuân thủ bảng hướng dẫn sử dụng hóa chất. Luôn phải đeo găng tay khi làm việc với hóa
chất hay yếu tố lây nhiễm.
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 2
4. Nghiêm cấm ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.
5. Nghiêm cấm thực hành thí nghiệm chưa được dạy.
6. Không dùng miệng hút hóa chất bằng pipet hay ống hút.
7. Làm quen với hướng dẫn an tòan trong phòng thí nghiệm. Phải biết rõ vị trí bình cứu hỏa, tủ
thuốc y tế, vị trí nguồn cấp điện, cấp nước.
8. Phải tuân thủ hướng dẫn của người có trách nhiệm. Phải ghi kết quả thí nghiệm hoặc những vấn đề
nẩy sinh, khúc mắc... trong nhật ký phòng thí nghiệm của mình.
Hình 1.1: Bảng đánh giá an tòan hóa chất của acetic acid theo HMIS (Hazardous
Materials Indentification System)
1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Hiện dụng cụ thí nghiệm bằng nhựa, chủ yếu từ polyethylene được sử dụng khá phổ biến. Trước
khi sử dụng lần đầu phải rửa dung cụ nhựa bằng dung dịch urea 8M ( điều chỉnh về pH 1 bằng HCl).
Sau đó tráng bằng nước cất. Rửa tiếp bằng dung dịch KOH 1 N, tráng lại bằng nước cất. Sau đó tráng
bằng dịch EDTA 10-3 M để lọai bỏ kim lọai ở dạng vết. Sau lần xử lý này, chỉ cần rửa bằng dịch tẩy rửa
(dịch xà bông) và tráng bằng nước cất là đạt yêu cầu.
Nhiều chất hữa cơ và kim lọai hay bám trên bề mặt dung cụ thí nghiệm. Thông
thường có thể lọai bỏ chúng bằng dịch xà bông 0,5%. Sau đó tráng kỹ bằng nước cất
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 3
hoặc nước trao đổi ion là đủ. Trong nhiều trường hợp phải sử dụng dụng cụ thí nghiệm khô.
Có thể làm khô bằng cách tráng dụng cụ thí nghiệm bằng acetone. Nhưng tốt hơn cả là sau khi
rửa sạch bằng nước cất, hong cho khô và sấy trong tủ sấy. Lưu ý không sấy ống ly tâm bằng
cellulose nitrate trong tủ sấy, vì cellulose nitrate là chất dễ nổ.
Không rửa cuvette, đặc biệt là cuvette bằng thạch anh hoặc dụng cụ quang học, bằng dịch KOH pha
trong cồn, vì dịch này có thể ăn mòn bề mặt của chúng. Chỉ cần rửa bằng dịch xà bông 0,5%, dùng que
cuốn bông để rửa và sau đó tráng lại bằng nước cất là đạt yêu cầu. Trong thực hành phòng thí nghiệm,
để định lượng dung dịch người ta thường sử dụng một số dạng pipet và công cụ hỗ trợ hút dịch như
mô tả trong hình sau.
Hình 1.2: Một số dụng cụ định lượng thể tích dịch truyền thống
Hút dịch vào pipet nhờ quả bóp cao su. Chú ý không cho dịch tràn vào quả bóp cao su. Tiện dụng
hơn cả là dùng pipet tự động.
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 4
Hình 1.3: Thao tác lấy dịch bằng pipet tự động
1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT
Nước dùng trong phòng thí nghiệm thường ở các dạng phổ biến sau: nước trao đổi ion, nước thẩm
tinh sạch bằng thấu ngược và nước cất. Tuỳ thuộc mục đích sử dụng, người ta cân nhắc nên sử dụng
loại nước nào cho phù hợp. Nước nhận được từ cột trao đổi ion chứa rất ít ion kim loại, nhưng vẫn
còn chứa các chất hữu cơ bị thôi ra từ nhựa trao đổi ion, làm gia tăng độ hấp phụ tia UV của nước. Do
vậy trong thí nghiệm sử dụng phép đo UV, nên sử dụng nước cất, không nên dùng nước trao đổi ion.
Nước cất được tạo thành trong quá trình ngưng tụ nước sôi từ nồi cất kim loại hoặc thuỷ tinh. Nước
cất ngưng tụ từ nồi chưng cất kim loại vẫn còn chứa một ít ion kim loại, có thể ảnh hưởng đến kết quả
thí nghiệm. Do chúng kết hợp với hoá chất sử dụng hoặc với mẫu đo. Nước cất hầu như không
chứa chất hữu cơ, nếu tốc độ cất nước tương đối chậm. Nước cất bằng thiết bị thuỷ tinh là tốt nhất.
Tốt nhất là sử dụng nước khử ion để cất nước. Không nên sử dụng nước máy, vì muối trong nước máy
sẽ bám cặn lên bộ đốt, làm giảm chất lượng của nước cất. Khi bộ đốt bị bám cặn muối, làm sạch nó
bằng cách ngâm vào nước giấm hoặc dung dịch HCl 10%.
Nước cất tinh khiết thường bị nhiễm bẩn trong quá trình bảo quản. Do tia UV giải phóng một số chất
hữu cơ từ thùng, can nhựa, ion kim loại tạo lớp trên bề mặt chai thủy tinh đựng nước cất. Nước cất
bằng thiết bị chưng cất thuỷ tinh ít khi bị vi sinh vật gây nhiễm. Thực nghiệm cho thấy nước cất tinh
khiết có thể bảo quản được lâu trong bình thủy tinh, nút chặt và để trong tủ lạnh. Nếu trong bình chứa
nước cất thấy có vi sinh vật phát triển, phải đổ bỏ, không sử dụng. Để phá huỷ chất hữu cơ gây nhiễm
bẩn, người ta thường cất hỗn hợp (1lít nước + 1 g potassium permanganate
+1ml 85% phosphour acid).
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 5
Hình 1.4: Hệ thống thu nhận nước cất (trái) và nước trao đổi ion (phải)
Quá trình lọai bỏ khóang khỏi nước gọi là làm mềm nước nhờ trao đổi ion. Người ta cho nước chẩy
qua nền nhựa tẩm Na. Ion Ca+2 trong nước sẽ bị hấp phụ lên hạt nhựa thế chỗ của Na+. Quá trình trao
đổi ion từ từ, các hạt nhựa cũng từ từ hấp phụ Ca+2, và nhả vào nước Na+ và K+ không ảnh hưởng
đến sức khỏe của người.
Hình 1.5. Hệ thống thu nhận nước thẩm thấu ngược
Nước tinh khiết tạo thành trong quá trình thẩm thấu ngược nhờ áp suất ép nước qua màng được
chế tạo đặc biệt, có khả năng giữ lại cả các ion khóang.
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 6
Chuẩn bị dịch và bảo quản hóa chất:
Việc chuẩn bị dung dịch và bảo quản hóa chất phải tuân thủ qui định của nhà sản xuất. Nồng độ của
dung dịch hóa chất thường thể hiện theo độ mol, độ chuẩn hoặc theo %. Theo trọng lượng hoặc theo thể
tích, hoặc theo trọng lượng/thể tích (mg/ml hoặc g/lit) ... Tốt nhất là bảo quản dung dịch trong tủ lạnh.
Khi chuẩn bị dung dịch phải tính đến độ ngậm nước của hoá chất để tạo được dung dịch đạt nồng độ
mong muốn.
Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm thu được bằng cách tính thông thường hoặc sử dụng phần
mềm phù hợp.
ĐỊNH ĐỊNHVÀ
AN TOÀN ANTHAO
TOÀNTÁC
VÀ THAO
TRONGTÁC TRONG
NGHIỆM NGHIỆM
CÔNG NGHỆCÔNG
SINHNGHỆ
HỌC SINH HỌC 7
TÓM TẮT
Trong bài này, học viên làm quen với các quy định chung về an tòan làm việc trong phòng thí
nghiệm CNSH. Trước tiên là phải thực hiện đầy đủ nội quy làm việc trong phòng thí nghiệm. Đặc biệt
lưu ý đến an tòan phòng chống cháy, nổ và hóa chất độc hại. Sinh viên phải làm quen và hiểu các ký
hiệu ghi trên các lọ hóa chất.
Điểm tiếp theo là sinh viên phải làm quen và biết những đặc thù làm việc với các đối tượng sống
như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men...và các quy định an tòan sinh học.
Sinh viên phải biết các lọai dụng cụ, các lọai thiết bị thường sử dụng trong phòng thí nghiệm
CNSH. Phải biết cách sử dụng các dụng cụ và thiết bị này cũng như việc chuẩn bị và bảo quản chúng.
Sinh viên phải làm quen với các công tác chuẩn bị làm việc trong phòng thí nghiệm CNSH. Đó là
việc chuẩn bị các lọai nước cất, nước siêu tinh khiết sử dụng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau.
Cách thức bảo quản và sử dụng nước cất và nước siêu tinh khiết. Sinh viên phải làm quen và nắm
được cách thức chuẩn bị dung dịch và hóa chất thí nghiệm. Những điểm cần lưu ý trong quá trình
chuẩn bị cũng như cách thức bảo quản dung dịch và hóa chất thí nghiệm.
CÂU HỎI ÔN TẬP
Câu 1: Cho biết các ký hiệu hay sử dụng liên quan đến an tòan đối với hóa chất sử dụng trong
phòng thí nghiệm CNSH?.
Câu 2: Trình bầy cách thức chuẩn bị dung dịch hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm CNSH?.
Câu 3: Trình bầy cách thức chuẩn bị và bảo quản dụng cụ và thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
CNSH?.
Câu 4: Trình bầy các lọai nước thường sử dụng trong phòng thí nghiệm CNSH và cách thức tạo và bảo
quản chúng?
Câu 5: Trình bầy lý do tại sao phải nắm bắt được yêu cầu an tòan sinh học khi làm việc trong phòng
thí nghiệm CNSH?.
8 BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢNBÀI 2: CÁC
TRONG KỸ THUẬT
NGHIÊN CỨU CƠ BẢN
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
SINH HỌC CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC 8
BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN
TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của dung dịch đệm, độ pH, điện cực
- Biết khái niệm về đầu dò sinh học
- Nắm được kỹ thuật thẩm tích, siêu lọc, định lượng nitơ, carbohydrate, lipid
- Nắm được kỹ thuật đông khô, sấy phun
- Hiểu được cách xác định trọng lượng đại phân tử
2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC
Thông thường độ pH của dịch thí nghiệm được đo bằng pH kế. Bộ phận quan trọng nhất là điện cực.
Các điện cực có thể sử dụng đơn lẻ (gồm điện cực thuỷ tinh nhạy với sự thay đổi nồng độ H+ và điện
cực so sánh, còn gọi là điện cực calomel). Hiện phổ biến hơn cả là sử dụng điện cực kép, kết hợp 2
điện cực trên.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra dung dịch KCl bão hoà bên trong điện cực. Nếu mức dung dịch
KCl bão hoà trong điện cực thấp, phải bổ sung thêm dung dịch KCl bão hoà mới qua lỗ bên hông
điện cực. Trước khi chuẩn máy đo pH, phải điều chỉnh nhiệt độ về nhiệt độ của dung dịch pH chuẩn và
dung dịch cần đo. Nhấc điện cực ra khỏi dung dịch bảo quản, rửa kỹ bằng nước cất và lau khô bằng
giấy thấm. Ngâm điện cực vào dung dịch đệm chuẩn thứ nhất và điều chỉnh giá trị pH về giá trị pH của
đệm chuẩn, cho đến khi chỉ số pH trên máy đo ổn định. Lấy điện cực ra khỏi dung dịch đệm thứ
nhất, rửa và lau điện cực như mô tả ở trên. Lặp lại thao tác đo pH đối
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
với dung dịch đệm chuẩn thứ hai. Giá trị pH đo được phải nằm trong khoảng sai số 
0,05 đơn vị so với giá trị của dung dịch đệm chuẩn thứ nhất. Nếu không đạt, phải chỉnh lại pH theo giá
trị chuẩn nói trên và kiểm tra lại đối với dung dịch đệm chuẩn thứ nhất. Điện cực rất dễ hỏng, do
vậy phải rất cẩn thận trong thao tác. Điện cực thuỷ tinh luôn được bảo quản trong dung dịch KCl 3M.
Sau khi được rửa sạch và lau khô. Khi đo dịch protein, thường protein bám màng trên bề mặt điện cực,
làm sai lệch kết quả. Trong trường hợp này có thể xử lý bằng cách nhúng điện cực vào dịch
pepsin 5% trong 0,1 N HCl khoảng 2 giờ. Sau đó rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô và giữ trong
dung dịch bảo quản.
Dịch đệm có nồng độ muối cao ảnh hưởng khá mạnh lên kết quả đo, vì giá trị pH phụ thuộc vào độ
hoạt động của ion, chứ không phụ thuộc vào nồng độ muối. Ở dung dịch loãng, độ hoạt động của ion
thường tương ứng với nồng độ. Còn ở dung dịch nồng độ muối cao, độ hoạt động của ion
không tương ứng với nồng độ của muối.Trong thực tế, thường người ta chuẩn bị sẵn dung dịch
mẹ (stock). Khi tiến hành thí nghiệm, người ta sẽ chuẩn bị dung dịch sử dụng, từ dung dịch mẹ. Do
vậy, phải xác định pH của dung dịch sử dụng, sau khi pha loãng từ dung dịch mẹ.
Nhiệt độ cũng ảnh hưởng lên phép đo pH, do hằng số phân ly pKa phụ thuộc vào nhiệt độ theo giá
trị pKa/ 0C = - 0,031. Thí dụ đệm Tris ở 40C có giá trị là 7,0, trong
khi ở 370C giảm xuống chỉ còn 5,95. Do vậy trong thực tế phải điều chỉnh pH của dịch đệm về
giá trị sử dụng là 5,95.
Phương trình Henderson-Hasselbalch cho phép tính giá trị pH khi biết tỷ lệ nồng độ mol của cặp
acid-base [A-]/[HA] và pKa của HA (giá trị pKa có trong các sách tra cứu
hóa học).
[A
pH  pKa  log 
][
HA]
Trong thực tế, đệm tốt nhất là đệm chứa nồng độ tương đương của HA và A-. Khi [A-] = [HA] thì
pH = pKa. Có nghĩa là pKa của cặp acid-base nằm ở tâm của vùng đệm hoạt động. Một số hệ đệm dùng
phổ biến trong nghiên cứu sinh học được ghi nhận trong bảng.
Phần lớn các thao tác nghiên cứu sinh học xẩy ra ở vùng đệm pH nằm trong khỏang giá trị
từ 6 đến 8. Tuy nhiên cũng có trường hợp xảy ra ở vùng đệm có giá trị rộng hơn từ 2 đến 12. Khó có
cặp acid và base nào phù hợp cho cả khoảng rộng pH nói trên. Do vậy thường người ta dùng kết hợp
một số hệ đệm, thông dụng hơn cả là hệ đệm phosphate, citrate và succinate.
Đệm phosphate được sử dụng rộng rãi nhất, độ đệm của nó nằm trong khoảng pH
6,5-7,5 và bản thân phosphate là muối phổ biến trong tế bào. Chủ yếu đệm phosphate được tạo
từ dung dich Na-phosphate và K-phosphate. Nhược điểm chủ yếu là đệm phosphate thường tạo cặn với
một số ion cần cho hoạt động sống, là Ca+2 và Mg+2 . Đôi khi đệm phosphate ức chế một số enzyme.
Hình 2.1: Các hệ đệm thường dùng trong nghiên cứu sinh học
Hình 2.2: Hệ điện cực đo pH cổ điển (trái) và điện cực kép (phải)
Đệm Tris là đệm tổng hợp Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane], một lọai đệm có tính lưỡng
tính, được sử dụng rộng rãi với vùng pH tối ưu nằm trong khoảng
7,5-8,5. Tris ở dạng tinh thể có tính base, dễ định lượng và hoà tan tốt trong nước.
Thí dụ để chuẩn bị 1 lít 0,1 M đệm Tris, người ta cân 12,11 g (0,1mol), hoà tan trong
950-975 ml nước cất. Bổ sung HCl đậm đặc, khuấy và điều chỉnh cho đến khi đạt pH mong muốn. Cuối
cùng bổ sung nước cất đến 1 lít. Tuy là amine bậc một, Tris hầu như không ảnh hưởng đến các phản
ứng sinh hoá, không tạo tủa với Ca+2. Tuy nhiên pH của đệm phụ thuộc vào nồng độ. Giá trị pH giảm
0,1 đơn vị khi pha loãng 10 lần. Đệm Tris có thể có ảnh hưởng đến một số loại điện cực và sự thay đổi
do nhiệt của nó cao hơn so với các loại đệm khác. Để khắc phục, nên đo pH sau khi đã pha loãng
đệm, sử dụng điện cực phù hợp và chuẩn bị đệm ở nhiệt độ thực hiện.
Đệm carboxylic acid bao gồm các đệm acetate, fumarate, citrate và suscinate, chủ yếu dùng cho
vùng đệm có giá trị pH từ 3 đến 6. Do tất cả chúng đều là chất trao đổi, nên có ảnh hưởng tới các phản
ứng sinh học. Ngoài ra, citrate và suscinate còn tạo phức với Fe+3, Zn+2, Mg+2… Đệm fumarate có ưu
thế là dễ bay hơi, nên trong một số trường hợp có thể loại bỏ dễ dàng nhờ áp suất âm. Đệm borate có giá
trị vùng đệm trong khỏang pH từ 8,5 đến 10. Nhược điểm chủ yếu là nó dễ tạo phức với nhiều chất trao
đổi, đặc biệt là với các chất carbohydrate.
Đệm lưỡng tính (Zwitterionic buffer hay Good’s buffer) (1972), khắc phục được một số hạn chế
của các hệ đệm nói trên. Do vậy hiện được sử dụng rất rộng rãi. Hạn chế chủ yếu là giá thành cao.
Lưu ý là những đệm lưỡng tính phổ biến như Tris, HEPES và PIPES, thường chứa các gốc tự do nên
không thể sử dụng trong nghiên cứu phản ứng oxyhoá – khử.
Điện cực oxy là điện cực đo nồng độ oxy tan trong dung dịch. Điện cực oxy gồm: catod bằng Pt,
anod bằng Ag gắn vào tấm epoxy. Đầu cực bọc màng teflon và được cố định bằng khuyên tròn.
Màng này ngăn cách hai điện cực ngâm trong dung dịch KCl bão hoà với dung dịch cần đo trong
ngăn đựng mẫu. Màng teflon cho phép O2 và các khí khác qua lại dễ dàng. Khi tiếp xúc với bề mặt
catod Pt, phân tử khí O2 sẽ bị
khử trên bề mặt điện cực: O2 +4 e- + 2H2O  4 OH-. Còn trên anode sẽ xẩy ra phản
ứng 4 Ag0 + 4 Cl-  4AgCl- + 4e-. Tổng thể sẽ là 4 Ag0 + O2 + 4 Cl- +2 H2O  4
AgCl +4 OH-.
Hình 2.3: Sơ đồ họat động của điện cực đo oxy trong dung dịch
Như vậy dòng điện đi qua hệ điện cực tỷ lệ thuận với O2 thẩm thấu qua màng. Đồng nghĩa với số
lượng O2 hoà tan trong dung dịch. Dòng điện trên được khuyếch đại và ghi nhận theo đơn vị bão hoà
oxy. Điện cực oxy được sử dụng trong các nghiên cứu liên quan đến trao đổi oxy (phản ứng oxyhoá
khử, kiểm soát cung cấp khí cho quá trình lên men trong các bioreactor). Cần đặc biệt chú ý tới
màng teflon, nếu màng bị nhàu, bị thủng, bề mặt màng bị bẩn, thì kết quả nhận được sẽ bị sai lệch.
Không được lấy tay sờ lên màng, không làm bẩn màng bằng hoá chất hoặc chất có dầu khi tiến hành
bọc màng lên điện cực. Màng cũng hay bị bít bởi protein hay hoá chất có mặt trong ngăn đựng mẫu đo.
Kinh nghiệm cho thấy cần thường xuyên kiểm tra màng bằng kính hiển vi có độ phóng đại thấp. Cực
anod bằng bạc thường xuyên phải được rửa bằng dung dịch NH4OH nhằm tẩy Ag sulfate, giữ bề mặt
điện cực sáng bóng. Nhiệt độ đo cũng rất quan trọng. Do vậy điện cực đo thường đặt trong buồng ổn
nhiệt, có khuấy từ tránh làm suy giảm oxy trên bề mặt cathode. Sự xuất hiện bọt khí trong buồng
mẫu đo hoặc trong dung dịch KCl sẽ làm sai lệch kết quả đo, vì bọt khí chứa O2 nhiều hơn trong nước
bão hoà tới 20 lần.
Bảng 1.1: Thành phần và tính chất của một số đệm lưỡng tính tổng hợp
2.2 ĐIỆN CỰC ION VÀ ĐẦU DÒ SINH HỌC
Cho đến nay điện cực đo ion H+ và O2 đã được phát triển rất mạnh. Tuy nhiên một số ion, hoặc khí
khác cũng có thể đo được nhờ các hệ điện cực đặc hiệu hoạt động tương tự như điện cực oxy. Mỗi loại
điện cực ion được chế tạo từ vật liệu màng đặc biệt khác nhau, cho phép từng loại ion thẩm thấu qua
lại dễ dàng. Điện cực ion có độ nhạy cao, thiết bị đơn giản, thao tác nhanh. Nhược điểm chủ yếu
là kết quả đo thường bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các ion khác. Do vậy thao tác chủ yếu trong phép
đo dùng điện cực ion là tìm cách ngụy trang ion cần đo, hoặc loại bỏ ảnh hưởng của các ion khác.
Bảng 1.2: Điện cực ion đặc hiệu
Hình 2.4: Sơ đồ họat động của đầu dò sinh học

Đầu dò sinh học giống điện cực ion ở chỗ là cũng dùng để đo nồng độ phân tử sinh học (thường là
chất trao đổi). Thí dụ đo nồng độ urea, carbohydrate, enzyme, kháng thể và các chất trao đổi... Về bản
chất, đầu dò sinh học là thiết bị đo gồm đầu dò chứa yếu tố sinh học, làm nhiệm vụ phát hiện, tạo tín
hiệu sinh học. Chúng thường là enzyme, kháng thể, tế bào, thậm chí bào quan … ở dạng cố định và bộ
biến tín hiệu sinh học thành tín hiệu thể hiện trên thiết bị đo.
Lực ion của dung dịch biểu hiện nồng độ của ion trong dung dịch, có ảnh hưởng lên tính chất
của các chất tham gia quá trình sinh học cụ thể nào đấy. Lực ion I của dung dịch liên quan đến tất cả các
ion có mặt trong dung dịch và được tính bằng công thức:
Trong đó ci là nồng độ mol (M, mol/L) của ion i. Đối với chất điện phân như NaCl, thì lực ion bằng
nồng độ. Nhưng đối với MgSO4, thì lực ion lại gấp 4 lần. Ion đa hóa trị có lực ion mạnh hơn ion đơn
hóa trị. Thí dụ lực ion của 0,050 M của Na2SO4 trong dung dịch 0,020 M trong dịch KCl sẽ là:
2 2 2
I = 1/2 × [(0.050 M × 2 × (+1) ) + (0.050 M × 1 × (−2) ) + (0.020 M × 1 × (+1) )
2
+ 0.020 M × 1 × (−1) )] = 0.17 M
2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ
Dung dịch hóa chất thường được chuẩn bị theo một số cách thể hiện nồng độ sau:
- Nồng độ % tính theo khối lượng, là số g chất trong 100 g hỗn hợp (độ Brix)
- Nồng độ % tính theo thể tích, là số g trong 100 ml
- Nồng độ mol (M), là số gram mol/1 lít.
- Nồng độ nguyên chuẩn N, là số gram nguyên chuẩn/1 lít. Gram nguyên chuẩn bằng tỷ lệ của
phân tử lượng/số ion H+ (đối với acid) hay OH- (đối với kiềm) trao đổi. Thí dụ HCL trao đổi 1 H+,
còn H2SO4 trao đổi 2 ion H+. Để biết độ N, so sánh dung dịch ta chuẩn bị với dịch có số N chuẩn
đã bíết.
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ
Nitơ tổng số xác định theo nguyên tắc là khi vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4, thì nitơ trong mẫu sẽ trở
thành dạng ammonium sulfate. Chất này khi cho tác dụng với kiềm sẽ phóng thích NH3 ở dạng
(NH4OH).
(NH4)2SO4 + NaOH  NH4OH + Na2 SO4

Hơi nước lôi cuốn NH3 từ dịch nhờ máy Parnas-Wargner, tạo sự dư acid trong dịch. Chuẩn độ
lượng acid dư sẽ biết được lượng NH3 phóng thích. Từ đó sẽ biết được tổng lượng đạm trong mẫu phân
tích.
Hình 2.5: Thiết bị lôi cuốn NH3 trong máy Parnas-Wargner cổ điển và thiết bị tự
động
N formol (phương pháp Sorensen) để xác định đạm “protein” trong dịch chứa hỗn hợp nhiều lọai
đạm (protein, peptide, amino acid, ammoniac, amine...) người ta dùng phương pháp Sorensen. Trong đó
formol sẽ tác dụng với nhóm –NH2 tạo phức methylene (mono-, tri- và hexamethylene)
HOOC-CH(R)-NH2 + HCHO  HOOC-CH(R)-N=CH2 + H2O R-

+
NH4 Cl + HCHO  R-N=CH2 + H2O + HCl
Gốc HOOC- và HCl xuất hiện sẽ được xác định bằng cách chuẩn độ để biết lượng –
NH2.
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
N-ammonium (ở dạng muối ammonium hay amine) là sản phẩm phân hủy của protein, là dạng đạm
mất phẩm chất. Chúng có tính kiềm yếu, được xác định bằng cách dùng MgO đuổi NH4+ ra khỏi dịch
và lôi cuốn theo hơi nước qua bình đựng lượng acid dư. Định lượng acid còn lại sau phản ứng sẽ gián
tiếp biết được lượng đạm amon có trong mẫu phân tích.
+ +2
2(NH4) + Mg(OH)2  2 NH3 + 2H2O + Mg
2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4
2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE
Định lượng đường hòa tan dựa vào phản ứng mầu của đường khi có sự hiện diện của H2SO4.
Tiến hành như sau: Ly trích đường từ mẫu sinh khối bằng cồn 90o, đun cách thủy, lọc lấy phần dịch
trong (dịch cồn chứa đường), không lấy cặn. Bổ sung cồn
80o vào phần cặn, chiết tiếp để lấy đường. Cuối cùng cho phần bã lên giấy lọc và rửa
bằng cồn vài lần, để ly trích và thu hết đường có trong mẫu. Tiếp theo cho bay hơi cồn ở nhiệt độ
phòng, hay đun cách thủy ở điều kiện nhẹ nhàng. Cặn khô trong cốc thủy tinh pha với nước cất. Lọc lấy
dịch trong và cho tác dụng với:
- Phenol: Dịch đường + Phenol + H2SO4 đậm đặc, sẽ xuất hiện mầu
- Orcinol: Dịch đường + Orcinol + H2SO4 đậm đặc, đun cách thủy ở 80oC, để lạnh sẽ xuất
hiện mầu, đo ở bước sóng 520 nm hoặc 470 nm
- Anthrol: Dịch đường + Anthrol đun sôi khỏang 7 phút, để nguội, dịch xuất hiện mầu, đo ở
630 nm.
Đường khử : Đun cách thủy mẫu với H2SO4 (hay HCl) trong khỏang 1 giờ, trung hòa bằng NaOH.
Định lượng đường khử bằng thuốc thử Schaffer-Hartmann khử Cu. Để xác định lượng iod phóng
thích, dùng tinh bột làm chất chỉ thị. Cũng có thể xác định đường khử bằng phương pháp so mầu khi
dịch chứa Fe+3 bị khử thành Fe+2. Đo ở bước sóng 690 nm.
Phân tích thành phần đường trong dung dịch

Carbohydrate có mặt trong tất cả các cơ thể sống. Điều đặc biệt là chúng có mặt ở một số dạng cấu
trúc không gian lập thể khác nhau, do chứa nhiều nguyên tử C bất đối xứng. Có thể xác định các
đơn vị đường thành phần tạo nên carbohydrate bằng
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
phương pháp đo độ quay quang bằng phân cực kế hoặc bằng phương pháp hóa học. Trong
đó phương pháp đo độ quay quang của dịch đường bằng phân cực kế phổ biến hơn.
Trước hết cần xác định độ quay quang []20D. Đổ đầy dịch đường cần định danh tên hoặc xác
định nồng độ vào buồng đo (cuvette) của phân cực kế. Khi đo phải giữ
nhiệt độ của buồng đo luôn ổn định bằng cách điều chỉnh nhiệt độ của áo nước bọc xung quanh. Thông
thường người ta điều chỉnh nhiệt độ về 20oC, được chọn là nhiệt độ chuẩn. Tuy nhiên, do phân tử
đường còn tồn tại ở dạng hỗn hợp, nên cũng cần phải xác định thêm giá trị quay quang của hỗn hợp.
Hai kết quả nhận được cho phép định danh đường cần xác định theo bảng chuẩn.
Hình 2.6: Sơ đồ họat động của phân cực kế
Hình 2.7: Biến đổi qua lại giữa 2 dạng đồng phân quang học -D-glucose và -
D glucose trong dung dịch
2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID
Lipid tổng số được xác định bằng cách dùng ether, phổ biến nhất là ether dầu hỏa, để ly trích lipid từ
mẫu chứa trong các gói giấy thấm đặt trong buồng ly trích của máy
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Soxhlet. Ly trích cho kiệt lipid, lấy các túi ra, để khô, sấy cho đến trọng lượng không đổi. % lipid tổng
số (gr hay mg) là hiệu số của khối lượng túi giấy trước khi ly trích m1 (gr hay mg) - khối lượng túi
giấy lọc sau ly trích m2 (gr hay mg) chia cho khối lượng túi giấy trước khi ly trích m1 và nhân với
100. % lipid = (m1 - m2)/m1 x
100.
Chỉ số xà phòng là số mg KOH để xà phòng hóa acid béo trong 1 g chất béo.
Chỉ số acid là số mg KOH để trung hòa tất cả các acid béo tự do trong 1 g chất
béo.
Chỉ số iod là số g I2 kết hợp với 100 g chất béo (2 iod kết hợp với 1 liên kết đôi).
Hình 2.8: Hệ soxhlet cổ điển và máy chiết lipid hiện đại
Phân tích thành phần lipid

Lipid là nhóm phân tử sinh chất có MW không lớn chiết tách từ sinh khối bằng dung môi hữu
cơ. Các nhóm lipid chủ yếu là triacylglycerol, glycerophospholipid, sphingolipid, glycolipid và sterol.
Tuy cấu trúc của lipid có vẻ đơn giản, nhưng chức năng sinh học của chúng lại rất phức tạp. Thể hiện
trong họat động chức năng của màng tế bào, vitamin tan trong dầu, cơ chế nhận biết và truyền tải thông
tin hóa học giữa tế bào và năng lượng sinh học.
Để nghiên cứu thành phần lipid của hạt nhụ đầu khấu (làm thí dụ), trước tiên tiến hành ly trích lipid
từ đối tượng bằng các lọai dung môi có độ phân cực khác nhau, kết
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
hợp xử lý nhiệt và lọc tách lấy bã và dịch. Do lipid kém phân cực, nên dung môi hữu cơ là phù hợp để
chiết tách chúng. Người ta thường sử dụng riêng từng lọai dung môi hữu cơ, có độ phân cực khác nhau,
để tách chiết các nhóm lipid có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên phổ biến hơn cả là sử dụng hệ dung
môi gồm một số dung môi hữu cơ pha trộn theo các tỷ lệ khác nhau, để lần lượt thu nhận các phân đọan
lipid.
Dịch sau đó thường được cô quay chân không, để lọai bớt dung môi. Dùng hexane hòa tan tủa. Lọc
tách cặn và dịch chứa lipid thô. Xử lý dịch lipid thô bằng silicagel, hay tạo tinh thể bằng cách hòa
tan trong acetone. Kết quả nhận được lipid tinh sạch. Phân tích thành phần lipid bằng sắc ký bản mỏng,
hay sắc ký khí.
Hình 2.9: Sơ đồ tách chiết phân đọan lipid từ hạt nhục đầu khấu
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Hình 2.10: Thiết bị cô quay chân không
Hình 2.11: Thứ tự rửa thôi các phân đọan lipid từ cột sắc
ký trên nền silica gel
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Hình 2.12: Sắc ký bản mỏng TLC tách lipid. Hệ dung môi chạy là hexane- diethylether-
acetic acid (90:10:1). (1) cholesterol, (2) acid béo, (3)
triacylglycerol, (4) methyl ester của acid béo, (5) Cholesterol ester, (6) glycerophosphatide, (7)
sphingolipid, (8) 1,3- hay 1,2- diacylglycerol, (9) 1- hay 2- monoacylglycerol.
Rf đối với (5) là cholesterol ester tính như sau:
Rf = Khỏang di chuyển của cholesterol ester/Khỏang di chuyển của dung môi =

A/B = 72 mm/85 mm = 0,85
Cuối cùng để biết thành phần acid béo từ nguồn sinh khối ban đầu nói trên, người ta tiến hành tách
phân đọan theo sơ đồ. Trong đó có sử dụng kỹ thuật sắc ký khí.
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Hình 2.13: Sơ đồ phân tích acid béo
2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC
Thẩm tích (dialysis) Ứng dụng chủ yếu của phương pháp thẩm tích là để loại muối và các phân tử
nhỏ, từ hỗn hợp dung dịch chứa phân tử sinh học lớn (protein). Thí dụ thẩm tích tách (NH4)2SO4 từ
dịch tủa với protein chẳng hạn. Thẩm tích thực hiện trong túi bán thấm, ngâm trong dung dịch đệm có
lực ion thấp (trong một số trường hợp ngâm trong nước cất). Các lỗ thành túi thẩm tích có kích thước rất
nhỏ, chỉ cho phép những phân tử có MW nhỏ khuếch tán qua, còn protein thì không. Cân bằng sẽ đạt
khỏang 4-6 giờ. Nếu cần lọai bỏ triệt để hơn nữa các phân tử nhỏ khỏi dịch chứa protein, người ta lặp
lại thao tác trên. Thẩm tích nên thực hiện ở nhiệt độ thấp 3-40C, được khuấy nhẹ bằng khuấy từ. Thực tế
cho thấy nên để chừa một khoảng trống, khoảng 10% thể tích túi, để khi thẩm tích, túi thẩm tích nổi trên
mặt nước, không bị hư do khuấy từ.
Màng túi thẩm tích khá đa dạng. Thường là vật liệu collodion, celophane và cellulose. Trên cơ sở
vật liệu cellulose, người ta chế tạo ra các lọai màng Spectropor cellulose khác nhau cho phép tách theo
khối lượng (molecular cutoff) từ 1.000 Da đến
50.000 Da. Thẩm tích được ứng dụng trước tiên cho mục đích lọai muối khỏi tủa với
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
protein. Vì sự có mặt của muối sẽ cản trở quá trình tinh sạch protein tiếp theo (thí dụ bằng điện di hay
sắc ký). Phương pháp thẩm tích đơn giản trong thực hiện, và nhất là không tốn kém. Thẩm tích cũng
được sử dụng để tách những phân tử nhỏ hay ion liên kết yếu với biopolymer. Thí dụ tách các cofactor
của enzyme-protein như NAD, FAD hay ion kim lọai.
Túi thẩm tích mới sử dụng thường còn chứa glycerol, kim lọai nặng, gốc sulfur dạng vết, đôi
khi có cả vết protease. Do vậy trước tiên cắt tạo túi thẩm tích kích thước 10-20 cm và ngâm trong
dung dịch 1% acetic acid 1 giờ. Sau đó chuyển sang ngâm trong nước cất. Để lọai vết kim lọai, đun sôi
túi thẩm tích trong dung dịch 1% EDTA kiềm (1% Na-carbonate, 10-3 M EDTA) 1 giờ. Ngâm và thay 5
lần nước cất. Bảo quản lạnh trong nước cất, bổ sung Na-azide và vài giọt chloroform để ức chế vi khuẩn
phát triển.
Hình 2.14: Hệ thống thẩm thấu

TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Standard Regenerated Cellulose (RC) broad range, low cost lab applications
Membrane Biotech Standard
Grade:
CE RC RC
Membrane Type:
100-500, 500-
1000, 3.5-5K, 1k, 2k, 3.5k, 5k,
3.5k, 8k, 10k, 15k,
8-10K, 20K, 50K, 6-8k, 10k, 12-14k,
MWCO (Daltons): 25k
100K, 15k, 25k, 50k
300K, 1000K
Opaque, Rigid, Opaque, Flexible,

Physical Clear Flexible, Hydrophilic
Hydrophilic Hydrophilic
Properties:
Organic Fair Good Good
Resistance:
2-9 2 - 12 2 - 12
pH Range:
Temperature 60°C 121°C
37°C
Limit: (Autoclavable)
NO
Flat Sheet: NO YES
Universal Only
Recommended
Universal Only Universal orSpectra/Por®
Closures:
NO
Ready-to-Use Float-A-Lyzer G2
Dialysis Sacks
Dialysis Devices: Tube-A-Lyzer
Molecular Weight Cut Off (MWCO)
Siêu lọc
Tuy phương pháp thẩm tích hãy còn được sử dụng để tinh sạch protein, nhưng hiện phổ biến
và tiện lợi hơn là phương pháp lọc gel và siêu lọc. Vì nhược điểm chủ yếu của phương pháp thẩm
tích là rất mất thời gian (có khi đến vài ngày), trong khi lọc gel và siêu lọc chỉ mất 1-2 giờ. Siêu lọc
có thể sử dụng để lọc dung tích khá lớn đến 50 l.
Vi lọc protein
Vi lọc là việc dùng màng xốp vi lỗ để tách các thành phần nhỏ của dịch lỏng. Vi lọc có nhiều ứng
dụng: Có 2 phương pháp lọc thường được áp dụng: lọc sâu (depth filter) và thông dụng hơn là
lọc màng. Lọc sâu là dạng màng sợi xốp cấu tạo từ sợi
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
thủy tinh hoặc cellulose, sắp xếp một cách ngẫu nhiên. Màng có khả năng giữ tế bào và các mảnh vỡ của
nó không những trên bề mặt, mà cả ở sâu bên trong màng.
Phương pháp lọc màng thường sử dụng các tấm lọc polymer như cellulose acetate, cellulose
nitrate, nylon, polytetrafluoroethylene (PTFE) xốp chứa các lỗ nhỏ li ti
khoảng 0,2 đến 10 m. Màng có kích thước lỗ nằm trong khoảng 0,2-0,45 m có khả
năng giữ tế bào vi sinh vật trên bề mặt màng, và do vậy, lọc màng luôn phải kèm theo nén. Phương
pháp lọc màng rẻ tiền và đơn giản trong thao tác. Màng lọc thường ở dạng đĩa, hoặc cuốn nhiều lớp
thành dạng hình trụ sắp xếp trong ống thép không rỉ. Đa số các dạng lọc này hiện đều có thể khử
trùng trong nồi áp suất hoặc dùng hơi
nước. Chúng họat động có hiệu quả ở nhiệt độ tới 70-75oC.
Hình 2.15: Thiết bị lọc và phụ kiện
Nhược điểm lớn nhất là màng là dễ bị bít bởi sinh khối lọc làm tăng áp suất nén, giảm tốc độ dòng,
đôi khi làm màng bị thủng. Để khắc phục người ta thường sử dụng hệ thống màng lọc nhiều lớp với
kích thước lỗ giảm dần, cho phép tăng hiệu quả hoạt động của màng. Trong quá trình sử dụng, người ta
thường xuyên dùng phương pháp thử bọt và thử áp suất để kiểm tra độ nguyên vẹn của màng.
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Hình 2.16: Hình chụp hiển vi điện tử màng siêu lọc. Hạt lớn hơn 0,1 µm sẽ bị giữ lại trên mặt
hoặc trong lỗ bên trong màng
Làm trong dịch mẫu vì dịch chứa biopolymer có MW cao, hay dịch chiết tế bào thường bị đục.
Điều này sẽ cản trở quá trình phân tích, đặc biệt là phân tích quang phổ. Do vậy cần phải làm trong
dịch. Làm trong dịch thể tích nhỏ thường thực hiện trong phễu lọc dưới áp suất hút nhỏ (thường
dùng bơm vòi nước). Trong một số trường hợp, người ta dùng biện pháp này để khử trùng dịch chứa
biopolymer không khử trùng được, như nucleic acid hay protein. Màng lọc khử trùng được sẽ ngăn và
giữ vi khuẩn trên màng lọc. Trong khi nucleic acid và protein đi qua màng lọc.
Hình 2.17: Hệ thống lọc màng phòng thí nghiệm

TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Thu tủa để phân tích cũng sử dụng lọc màng giống như mô tả ở trên. Chú ý để lọc tủa chứa chất
phóng xạ, người ta dùng màng cellulose nitrate và màng từ sợi thủy tinh. Vì những vật liệu này có thể
cho thẳng vào máy đếm nhấp nháy xác định phóng xạ.
Thu tế bào vi khuẩn từ dịch lên men thường được thực hiện nhờ lọc màng và ly tâm. Ly tâm
theo từng đợt không hiệu quả bằng lọc màng. Để thu sinh khối tế bào từ mẻ lên men lớn, tốt hơn cả là
dùng ly tâm liên tục.
Hình 2.18: Sơ đồ cấu tạo máy ly tâm liên tục
Cô dịch chứa biopolymer Trong phòng thí nghiệm, người ta thường dùng thiết bị mô tả trong hình
để cô dịch chứa biopolymer phục vụ cho công tác phân tích. Trong đó dịch biopolymer được khuấy và
tách dịch qua màng bên dưới cánh khuấy nhờ máy bơm hút tạo chân không thấp.
2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN
Đông khô là quá trình hút chân không làm bay hơi nước từ trạng thái đóng băng để làm khô dịch
protein. Các chế phẩm protein đông khô có thể bảo quản ngay cả ở nhiệt độ phòng trong thời gian rất
lâu, có khi tới cả hàng chục năm, mà không mất họat tính. Trong đó có nhiều lọai protein dược dụng như
vaccine, enzyme dược dụng, hormone, kháng thể... Sở dĩ có thể bảo quản được lâu như vậy, là vì
chế phẩm protein đông khô thường có độ ẩm rất thấp, chỉ khỏang 3%. Trước hết phải làm lạnh sâu ống
đông khô (thông thường là ống hay lọ thủy tinh) đựng dịch protein đến
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
khỏang ½ thể tích ống. Do quá trình làm lạnh sâu xẩy ra nhanh, nên các tinh thể chứa nước cũng
xuất hiện khá nhanh. Cùng với sự
hình thành các khối tinh thể, nồng độ protein
(cũng như các chất tan khác như muối, thành phần
đệm, các hóa chất bổ sung khác) còn ở lại
pha dịch cũng gia tăng.
Đối với phần lớn protein nhiệt độ làm lạnh sâu thường
khỏang -40oC tới -60oC là phù hợp. Sau khi đạt nhiệt
độ lạnh sâu phù hợp, chuyển ống vào máy đông khô (gồm
buồng lạnh và hệ thống bơm chân không 2 cấp). Lúc này
phải nâng nhiệt độ lên trên 0oC, để đẩy nhanh sự thăng hoa
của tinh thể nước. Tiến hành cô dưới độ chân không
khỏang 5-25 mm Hg. Kết quả nhận được sinh khối

Hình 2.19: Thiết bị cô mẫu
protein khô ở dạng bông.
bioplolymer
Hình 2.30: Máy đông khô do hãng Savant sản xuất
Sấy phun là kỹ thuật rất hay đựợc sử dụng trong sản xuất chế phẩm protein thô dạng bột. Thường
các chế phẩm protein thương mại ở dạng lỏng và bột. Hai quy trình công nghệ sản xuất các sản
phẩm này có giai đọan đầu giống nhau là giai đọan thu nhận dịch protein (kể cả dịch ngọai bào và nội
bào). Dịch protein sau giai đọan ly tâm tách chiết dịch lên men đối với protein ngọai bào, hoặc tách
chiết thu nhận sinh
khối tế bào, phá tế bào để thu nhận dịch protein nội bào, thì đều được cô chân không ở nhiệt độ
khỏang 40oC để tránh làm protein bị biến tính. Sau đó tiến hành lọc để lọai tế bào hoặc mảnh vỡ tế
bào còn lại trong dịch.
Nếu sản phẩm protein thương mại sử dụng ở dạng dịch thô, thì người ta chỉ việc bổ sung thêm các
chất ổn định, thường là propylene glycol, glycerol và sorbitol, hoặc chất bảo vệ như là NH4-sulfate,
Na-sulfate hoặc NaCl. Nếu sản phẩm protein thương mại ở dạng bột, thì sau khi bổ sung chất ổn định
và bảo vệ, người ta tiến hành tạo bột từ dịch protein bằng phương pháp sấy phun.
Sấy phun là kỹ thuật trong đó người ta tạo các hạt aerosol từ dịch sinh phẩm (thí dụ dịch protein)
cô đặc và hướng các hạt này vào dòng khí nóng. Dòng khí nóng sẽ làm bốc hơi nước trong một
khỏang thời gian rất nhỏ, không làm biến tính sinh chất (thí dụ là protein). Kết quả tạo ra các hạt bột
protein. Bột protein có thể gây dị ứng da đối với người sản xuất và người tiêu dùng. Để khắc phục
người ta bọc các hạt protein trong gel ở dạng con nhộng. Bột protein, trong đó phần lớn là các
lọai enzyme, hiện được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bột giặt, chất tẩy rửa, mỹ
phẩm...
Hình 2.31: Sơ đồ nguyên tắc họat động của máy sấy phun
2.9 TẠO TINH THỂ PROTEIN
Là giai đoạn kết thúc của quá trình tách chiết và tinh sạch protein. Thường tinh thể tồn tại ở 2 dạng:
Dạng đồng hình (các chất khác nhau mà tạo ra dạng tinh thể đồng nhất giống nhau isomorphic). Dạng
đa hình (các chất đồng nhất về mặt hóa học, nhưng lại kết tinh ở các dạng tinh thể khác nhau
polymorphic). Điều kiện cơ bản trong quá trình tạo tinh thể là tạo được trạng thái quá bão hòa của
dung dịch chứa chất cần tạo tinh thể. Trạng thái quá bão hòa có thể đạt được nhờ làm lạnh dung
dịch, hay làm bay hơi nước từ dung dịch. Vì bề mặt bay hơi có trạng thái quá bão hòa, cao hơn so với
phần còn lại, nên mầm tinh thể sẽ được tạo thành ở bề mặt trước tiên, sau đó sẽ mọc lớn dần.
Quá trình tạo và hòa tan tinh thể là 2 quá trình trái ngược nhau. Thông thường tinh thể hòa tan
nhanh hơn mọc. Sở dĩ có hiện tượng trên là vì khi tinh thể mọc, các mặt cạnh của tinh thể phẳng. Còn
khi tan, thì các mặt của nó lại gồ ghề làm tăng diện tích tiếp xúc giữa phase rắn và phase nước. Độ hòa
tan còn phụ thuộc vào kích thước tinh thể. Độ hòa tan tinh thể nhỏ bao giờ cũng nhanh hơn tinh thể lớn.
Ngược lại, độ tạo tinh thể lớn bao giờ cũng dễ dàng hơn tạo tinh thể nhỏ. Hiện tượng này gây khó khăn
cho giai đoạn đầu tạo tinh thể. Kích thước tinh thể phụ thuộc vào sức căng bề mặt của dung dịch. Đại
lượng này lại phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch. Sức căng bề mặt của dung dịch càng lớn,
thì càng làm giảm mặt tiếp xúc giữa phase rắn và nước. Điều này dẫn đến tạo tinh thể có kích thước lớn,
vì diện tích mặt phẳng của nó nhỏ hơn so với mặt phẳng của tinh thể nhỏ. Tinh thể lớn bao giờ cũng có
độ tinh khiết thấp hơn so với tinh thể nhỏ, vì quá trình tạo tinh thể lớn thường kéo theo tạp chất.
Hình 2.32: Mô hình nuôi tinh thể
Tốc độ tạo tinh thể phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung dịch quá bão hòa. Ở giai đoạn đầu, tốc độ
mọc tinh thể gia tăng cùng sự khuấy trộn. Trong các tinh thể được giữ ở trạng thái lơ lửng nhờ khuấy
trộn, các tinh thể lớn sẽ mọc nhanh hơn các tinh thể nhỏ. Hình dạng tinh thể phụ thuộc nhiều vào tính
chất của chất hòa tan, pH dung dịch, sự có mặt của tạp chất, mức độ quá bão hòa, hoặc quá lạnh, tốc độ
làm lạnh, nhiệt độ tạo tinh thể, mức độ khuấy trộn.... Thông thường làm lạnh nhanh bao giờ cũng tạo
tinh thể hình kim. Cần lưu ý là hình dạng tinh thể có thể thay đổi do sự có mặt của tạp chất: các phân
tử hay nguyên tử tạp chất bị lôi kéo tới các mặt cạnh khác nhau của tinh thể protein, bị hấp phụ lên
đó và làm giảm diện tích tạo các tâm tạo tinh thể trên các mặt phẳng để lắng protein, làm tinh thể mọc
chậm lại. Tinh thể protein sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc 3D nhờ kỹ thuật ghi nhiễu xạ tia X.
Hình 2.33: Kỹ thuật nhiễu xạ tia X xác định cấu trúc protein
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER
Việc xác định MW của các biopolymer (thí dụ protein, nucleic acid hay cellulose) có
ý nghĩa quan trọng. Có một số phương pháp xác định sau: Xác định
MW protein bằng phương pháp hóa học Xác định MW protein
theo thành phần hóa học
Nguyên tắc của phương pháp này là phân tích thành phần hoa học của một nguyên
tố hay bộ phận tạo thành protein và dựa vào hàm lượng % của nó so với tòan bộ
protein, để xác định MW nhỏ nhất của phân tử protein theo công thức sau: MW min.
protein = W nguyên tố/hàm lượng % x 100
Thí dụ: Lysine chứa 19,17% N. Xác định MW min của Lysine.
MW min. = (14/19,17) x 100 = 73. Do lysine chứa 2 N, nên MW cùa Lysine sẽ là

73 x 2 = 146.
Đối với protein người ta không dựa vào việc xác định N, vì số lượng rất lớn, mà chủ yếu dựa vào
phân tích những nguyên tố hiếm gặp như S hay kim lọai. Có một cách tiếp cận khác là dựa vào số gốc
amino acid nào đó trong phân tử protein để xác định MW của nó. Phổ biến hơn cả là sử dụng bản đồ
peptide hình thành bằng cách dùng protease trypsin cắt đặc hiệu liên kết peptide tạo bởi nhóm –
COOH của Arg và Lys. Sau khi điện di, dựa vào số vạch để xác định MW protein.
Xác định MW biopolymer bằng phân tích cấu trúc đầu sợi
Điển hình là việc xác định MW sợi cellulose. Trước hết tiến hành methyl hóa tòan bộ sợi
cellulose. Sau đó cho thủy phân tòan bộ liên kết -1,4- glycoside. Trong sản phẩm có 1 phân tử 2,3,4,6-
tetramethyl glucose, còn lại là 2,3,6- tri-methyl glucose. Kết quả cho thấy sợi cellulose chứa khỏang
300 – 15.000 đơn vị glucose, tương ứng
50.000 – 2.500.000 Da. Sai số của phương pháp này có thể có do sự phân hủy sản phẩm thủy phân trong
quá trình methyl hóa. Đôi với protein, polysaccharide có mạch nhánh (glycogen, tinh bột) cần có sự điều
chỉnh.
Dựa vào áp suất thẩm thấu

TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Dựa vào màng ngăn dịch chất hòa tan và chất tan xác định áp suất thẩm thấu để xác định MW
protein theo công thức MW = cRT/P. R – 0,082, T – nhiệt độ tuyệt đối, c – nồng độ tính theo g/lít.
Thí dụ: Người ta đã xác định MW hemoglobin bằng 66.000 Da, thông qua xác định
áp suất thẩm thấu P dịch hemoglobin máu ngựa trong 0,2 M đệm phosphate.
Xác định MW protein bằng siêu ly tâm
Năm 1925 Svedberg thiết kế siêu ly tâm cho phép đạt tới gia tốc tới 250.000 g. Có một số phương
pháp xác định MW đại phân tử nhờ siêu ly tâm. Phổ biến hơn cả là xác định MW biopolymer thông qua
xác định tốc độ tủa biopolymer khi siêu ly tâm theo công thức: M = RTs/D (1-v).
D – hệ số khuếch tán cm2/s, biểu thị bằng số lượng chất khuếch tán trong 1s qua
mặt phẳng 1 cm2 dưới gradient chênh lệch nồng độ 1 đơn vị. v – thể tích riêng của biopolymer (thí dụ
protein) khỏang 0,74,  - tỷ trọng của dung dịch hòa tan. s –là hệ
số lắng có giá trị s bằng 10-13s, gọi là đơn vị Svedberg, ký hiệu là S. Protein có giá trị này nằm trong
khỏang từ 1S – 200S. Thí dụ rRNA của E.coli có MW 5S, có hệ số lắng là 5 x 10-13 s.
Thí dụ: Khảo sát tủa lắng độc tố bạch hầu do vi khuẩn hình que Corynebacterium diphthaeria gây
ra ở 20oC, người ta thu được kết quả sau: Hệ số lắng trung bình là
4,6 x 10-13 s, hệ số khuếch tán – 5,96 x 10-7 cm2/s. Thử nghiệm đối với dịch protein
(độc tố) có nồng độ 0,38-0,61%. Tỷ trọng nước ở 20oC là 0,998. Xác định MW độc tố biết rằng thể tích
riêng của nó là 0,736. Lưu ý R trong điều kiện thực nghiệm này có giá trị 8,314 x 107.
Thay dữ liệu vào công thức M = RTs/D (1-v), ta có:
M = 8,314x107x293x4,6x10-13/5,96x10-7(1 - 0,736x0,998) = 70.850
Xác định MW protein bằng phương pháp lọc gel
Phương pháp sắc ký lọc gel ngòai việc dùng để tách các biopolymer, còn được sử dụng để xác định
MW của chúng (protein). Bản chất của phương pháp này là so sánh thể tích thôi ra khỏi cột của phân
tử biopolymer sắc ký với thể tích thôi ra khỏi cột của một số phân tử biopolymer khác đã biết MW (ở
dạng bộ KIT bán sẵn). Tiếp theo xây dựng đường đồ thị phụ thuộc tuyến tính của log MW của từng
biopolymer trong bộ KIT đối với thể tích rửa thôi Ve của nó. Sau đó tiến hành xác định Ve
của
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
biopolymer cần xác định MW, cũng bằng cột sắc ký trên. Cuối cùng xác định MW của biopolymer dựa
vào đường đồ thị chuẩn. Đây có lẽ là phương pháp xác định MW của biopolymer phổ biến và dễ thực
hiện nhất.
Hình 2.34: Xác định thể tích Ve và MW biopolymer bằng lọc gel
Lưu ý tốc độ di chuyển của phân tử biopolymer (protein) dạng cầu khác với phân tử protein dạng
que. Do vậy, để xác định MW chính xác, các protein phải cùng hình dạng. Điều này có thể thực hiện
bằng cách bổ sung urea hoặc guanidine chloride, để biến đổi protein thành dạng cuộn ngẫu nhiên, làm
giảm sự khác nhau về hình dạng của chúng. Trong trường hợp không thể làm được bằng cách này,
người ta xác định MW phân tử protein dạng que thông qua hệ số điều chỉnh.
Xác định MW bằng phương pháp điện di
Cũng là phương pháp xác định MW biopolymer rất phổ biến và dễ dàng thực hiện. Nguyên tắc của
phương pháp này cũng giống phương pháp xác định MW biopolymer bằng sắc ký lọc gel. Chỉ khác là
thay vì cho các thành phần đã biết MW trong bộ KIT chuẩn chạy qua cột lọc gel, trong phương pháp
này người ta tách chúng bằng điện di. Sau đó cũng dựa vào MW của các biopolymer trong bộ KIT để
dựng đường phụ thuộc tuyến tính của logMW đối với MW của chúng thông qua độ di chuyển điện di.
Sau đó xác định MW của biopolymer cần xác định theo đường chuẩn, dựa vào độ di chuyển điện di của
nó.
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
Hình 2.35: Xác định MW biopolymer bằng điện di
TÓM TẮT
Trong bài này, sinh viên làm quen với bản chất của dung dịch đệm, độ pH, điện cực và các ứng
dụng của chúng. Đặc biệt là các ứng dụng của điện cực ion. Trên cơ sở điện cực ion, sinh viên phải
nắm được bản chất và nguyên lý họat động của đầu dò sinh học, nhóm thiết bị phân tích rất có triển
vọng. Nắm được các ứng dụng hiện tại của thiết bị đầu dò sinh học.
Tiếp theo sinh viên phải nắm được một số phương pháp phân tích căn bản thường hay sử dụng
trong phòng thí nghiệm CNSH. Đó là kỹ thuật thẩm tích, siêu lọc, ly tâm theo mẻ, ly tâm liên tục và siêu
ly tâm. Các phương pháp xác định nitơ, cabohydrate và lipid tổng số, cũng như xác định thành phần
cấu tạo của chúng.
Trong phần sau của bài trình bầy 2 phương pháp phổ biến thường sử dụng trong sản xuất và tạo
dạng sản phẩm CNSH, đặc biệt là sản phẩm protein sử dụng trong sản xuất công nghiệp và trong
chấn đóan và điều trị bệnh: Kỹ thuật sấy phun và
TRONG KỸ THUẬT
CÔNG TRONG
NGHỆ NGHIÊN
đông khô. Cuối cùng là phần giới thiệu các phương pháp xác định MW của các đại phân tử sinh
học.
Câu 1: Xác định pH của dịch HCL 0,001 M.
Câu 2: Xác định pH của dung dịch CH3COOH 0,001 N, biết hệ số phân ly của acetic
acid là Ka= 1,8 x 10-5.
Câu 3: Chọn acid yếu làm dịch đệm: Giải thích việc lựa chọn chất nào sau đây đẻ chủan bị dịch
đệm pH 5,0: formic acic (pKa = 3,8), acetic acid (pKa = 3,86) hay ethylamine (pKa = 9,0)?.
Câu 4: Chuẩn bị đệm acetate: Xác định nồng độ acetic acid (pKa = 4,76) và Na-
acetate để chuẩn bị đệm nồng độ 0,2 M có pH 5,0.
Câu 5: Xác định độ pH của dịch gây ngứa do kiến tiết ra khi bị tấn công. Phân tích thành phần dịch
cho biết nồng độ tổng số của formate và formic acid (pKa = 1,8 x 10-
4) là 1,45M. Biết nồng độ formate là 0,015M?.
Câu 6: Phân tích amino acid cho biết Trp chiếm 0,58% (Trp có MW 204), trong huyết thanh bò BSA
(bovine serum albumin). Hãy xác định:
Câu 7: MW tối thiểu của BSA (nghĩa là phân tử BSA chỉ chứa 1 gốc Trp)
Câu 8: Lọc gel xác định MW BSA là 70.000. Xác định số lượng gốc Trp có trong phân tử BSA?.
Câu 9: Phân tích amino acid sợi polypeptide cho biết có 24 gốc Lys và 45 gốc Arg trong 100.000
g protein. Sau khi thủy phân bằng trypsin, nhận được 36 vạch điện di. Xác định MW min của sợi
polypeptide trên?.
39 BÀISẮC
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP 3: PHƯƠNG PHÁP
KÝ SỬ DỤNG SẮC KÝ
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
CÔNG NGHIÊN CỨUHỌC
NGHỆ SINH CÔNG NGHỆ SINH HỌC 39
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ SỬ
DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của phương pháp sắc ký;
- Nắm được phương pháp sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng;
- Biết được cách thức tinh sạch protein bằng sắc ký cột trao đổi ion, lọc gel, ái lực và
HPLC;
- Nắm được các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp;
- Biết được nguyên lý họat động của sắc ký khí.
Sau khi thu nhận được hỗn hợp thô các họat chất sinh học từ sinh khối, việc tiếp theo là phải thu
nhận và tinh sạch họat chất đích từ hỗn hợp nói trên. Mức độ tinh sạch phụ thuộc vào mục đích sử
dụng. Thí dụ, chế phẩm protein dùng làm thuốc chữa bệnh và nghiên cứu, thì phải được tinh sạch ở
mức độ rất cao. Trong khi các chế phẩm protein hay enzyme dùng trong công nghiệp hay trong đời
sống hàng ngày của con người, thì chỉ cần tinh sạch ở mức độ vừa phải.
3.1 KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
Sắc ký là phương pháp phân tách dựa vào sự phân bố các thành phần giữa 2 pha: pha tĩnh chứa
các thành phần bám vào nền sắc ký và pha động tách và lần lượt mang các thành phần trên ra
khỏinền sắc ký.
Quá trình sắc ký thực chất là sự phân tách của các chất hòa tan, dựa theo khả năng phân ly của
chúng giữa 2 pha (trong hầu hết các trường hợp là pha rắn và pha
40 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
lỏng), tạo nên sự di chuyển khác nhau dọc theo cột (hoặc màng, lớp) chứa các hạt rắn cùng sự hiện
diện của pha lỏng.
Trong hầu hết các kiểu sắc ký, phần lớn sự hấp phụ xảy ra bên trong hạt. Chỉ một phần xẩy ra trên
bề mặt các hạt Sự di chuyển chất hòa tan xẩy ra dọc cột sắc ký theo nền chất hấp phụ, ở khoảng hở giữa
các hạt.
Hình 3.1: Mô hình các vị trí hấp phụ trên chất trao đổi ion.
Các phân tử protein có khả năng tương tác với 3, 4, và 5 điện tích (+) trên chất trao đổi. Các
nhóm tích điện có thể được phân bố ngẫu nhiên
Chất nền hấp phụ đối với protein có các yêu cầu khác với chất nền dùng cho các hợp chất có MW
thấp. Các chất hấp phụ protein phải có cấu trúc mở (xốp, có lỗ) để protein có thể xâm nhập vào bên
trong hạt, đến được vị trí gắn kết. Nếu chỉ gắn lên một vài vị trí trên bề mặt hạt, thì sức chứa của chất
hấp phụ sẽ là vô cùng nhỏ. Tiếp theo, chất hấp phụ không được làm hỏng protein, không tương tác quá
mạnh với protein. Hai yêu cầu trên cho phép một số chất hấp phụ trao đổi ion vốn được thiết kế cho sắc
ký để phân tách các chất có MW nhỏ, lại có thể dùng được để phân tách protein. Ví dụ, nhựa
polystyrene (resin polystyrene) mới đầu sử dụng cho sắc ký tách các phân tử nhỏ, nhưng hiện nó được
sử dụng phổ biến trong phân tách các phân tử có MW lớn, trong đó có protein.
41 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Hình 3.2: Nguyên lý họat động của phương pháp sắc ký.
Sự phân bố của các phân tử hòa tan trong cột hấp phụ.
Các phân tử hoặc bị hấp phụ bên trong các hạt, hoặc di chuyển tự do giữa các hạt
Chất hấp phụ đầu tiên được sử dụng thành công trong sắc ký protein cột, là chất trao đổi ion trên
nền cellulose do Peterson và Sober phát minh. Bột cellulose, nếu được xử lý thích hợp, sẽ nở và tạo
cấu trúc lỗ giúp protein có thể xâm nhập. Ngòai ra, việc ghép lên cellulose các nhóm mang điện, sẽ
làm tăng ổn định cấu trúc lỗ nhờ tương tác giữa các gốc tích điện. Agarose, một loại polymer-
carbohydrate có khả năng tạo gel ở nồng độ thấp, được dùng làm chất nền để tinh sạch protein (ngọai
trừ hệ thống sắc ký cao áp). Các hạt gel agarose, có ít liên kết chéo, khá ổn định dưới tốc độ dòng chảy
cao, là chất nền được ưa chuộng cho sắc ký protein ở quy mô vừa và lớn. Bản thân agarose là trơ,
không hấp phụ, lại có khả năng dẫn truyền cao, thích hợp để tạo chất trao đổi ion, hoặc vật liệu có
tính ái lực. Trong khi vẫn duy trì tính thẩm thấu và cả sức chứa đối với protein có MW lớn. Gần đây
xuất hiện xu hướng tạo chất nền thẩm thấu có khả năng chịu được áp suất cao và tốc độ dòng chảy
nhanh hơn agarose. Trong khi vẫn duy trì các đặc tính mong muốn của agarose như khả
42 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
năng gắn kết cao, tính trơ, và sự tương thích. Hạn chế lớn nhất là giá thành agarose tương đối cao.
Thông dụng nhất là sắc ký phân tích và sắc ký thu mẫu. Có nhiều phương pháp sắc ký. Để định
tính và định lượng thô người ta thường sử dụng sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng. Ở mức độ phân tích
tinh vi người ta sử dụng sắc ký trao đổi ion, lọc gel, sắc ký cột lỏng cao áp HPLC. Để tinh sạch
protein dược dụng người ta dùng sắc ký ái
lực. Để phân tích các chất bay hơi người ta dùng sắc ký khí. Tuy cách thức tiến hành có thể rất khác
nhau, nhưng chúng đều có chung nguyên lý họat động như đã nêu ở trên.
3.2 SẮC KÝ GIẤY VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG
Sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng TLC (thin layer chromatogarphy) thuộc dạng sắc ký phân chia.
Pha tĩnh là nền sợi cellulose ngậm nước, hoặc ở dạng bản mỏng tạo từ bột silica gel, oxyde nhôm hay
bột cellulose. Còn pha động là nước, dịch đệm hoặc dung môi hữu cơ.
Trước hết người ta dùng ống hút nhỏ để chấm dịch protein hay dịch sinh chất lên các vệt đã được
đánh dấu sẵn trên đường vạch ở một đầu giấy, hoặc bản sắc ký khô chuẩn bị sẵn. Mẫu dịch protein sẽ
hút nhanh vào nền giấy, hoặc bản sắc ký. Nếu nồng độ protein trong dịch thấp, nên lặp lại thao tác chấm
mẫu nhiều lần, để số lượng mẫu nạp đủ mức cần thiết. Sau đó đặt giấy, hoặc bản sắc ký vào buồng sắc
ký (thường là bằng thủy tinh) và đậy chặt nắp, tránh để thất thóat dung môi hay đệm chạy sắc ký, ảnh
hưởng tới sức khỏe của người sử dụng.
Có hai cách phát triển sắc ký giấy hoặc sắc ký bản mỏng: Theo chiều từ trên xuống hoặc
ngược lại theo chiều từ dưới lên. Điều này tùy thuộc vào mục đích cũng như thói quen của người sử
dụng. Dung môi hoặc đệm trong buồng sắc ký sẽ di chuyển theo hệ mao dẫn trong giấy hoặc bản
sắc ký. Khi đó các phân tử protein khác nhau trong vệt mẫu chấm, sẽ hòa tan khác nhau vào pha động,
và như vậy, sẽ di chuyển trong pha động khác nhau và bị tách riêng từ mẫu hỗn hợp chung ban đầu.
43 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Hình 3.3. Cách thức chạy sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng
Chấm mẫu lên bản sắc ký. (B) Đặt bản sắc ký vào buồng sắc ký.
(C) Dung môi di chuyển theo bản sắc ký. (D) Nhuộm mầu để phát hiện vệt protein và xác định
Rf
Thông thường người ta dừng chạy sắc ký khi đường biên chạy của dung môi hoặc đệm chạy gần tới
mép bản giấy sắc ký hay bản mỏng sắc ký. Lấy bản giấy sắc ký hay bản mỏng sắc ký ra khỏi buồng
sắc ký. Sấy khô bản sắc ký và tiến hành nhuộm với chất chỉ thị phù hợp để hiện vết và xác định hệ số
phân bố Rf.
Hình 3.4: Buồng chạy sắc ký bản mỏng

44 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Phát hiện và định dạng mẫu bằng cách phun chất chỉ thị tạo màu, tạo huỳnh quang hoặc chất
phóng xạ…lên bản sắc ký. Các chất này sẽ tương tác với các phân tử đã được tách riêng sẽ tạo ra các vệt
mầu.
Bảng 3.1: Vật liệu hấp phụ phổ biến dùng trong nghiên cứu
Dựa vào vị trí của các vệt này, người ta dễ dàng xác định được hệ số phân bố Rf. Biết được Rf, so
sánh với Rf của chất chuẩn, sẽ xác định các chất cần tách. Thí dụ xử lý H2SO4 đậm đặc tạo vết đen với
các chất hữu cơ. Những chất chưa bão hoà cho vết đậm hơn. Ngoài những chất tạo màu đa năng, người
ta thường sử dụng các chất tạo màu đặc hiệu: rhodamine để phát hiện lipid, ninhydrin phát hiện amino
acid, còn anilinephthalate để phát hiện carbohydrate.
Ngày nay người ta sử dụng sắc ký bản mỏng phổ biến hơn so với sắc ký giấy, vì thực hiện nhanh,
khá chính xác và dễ dàng thực hiện. Để phát hiện các chất chưa biết hoặc thu nhận những chất đã biết,
người ta làm như sau: Cắt khoanh giấy sắc ký hoặc khóet bản sắc ký tại nơi có vết mầu. Sau đó cho
thôi vào dung dịch thích hợp và mang đi phân tích để định danh chất. Đối với sắc ký thu mẫu
(preperative), người ta tiến hành chạy sắc ký bản mỏng trên bản mỏng dày tới 2 mm để thu được
nhiều mẫu.
45 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
3.3 TINH SẠCH PROTEIN BẰNG SẮC KÝ CỘT
Nguyên tắc chung của kỹ thuật sắc ký cột là người ta nạp mẫu chứa chất cần phân tách (protein,
enzyme, họat chất thứ cấp... vào cột). Các chất này sẽ bám vào nền cột theo các cơ chế khác nhau.
Sau đó cho dịch rửa thôi các chất này ra khỏi cột. Dịch này có đặc tính là tách lần lượt các chất cần tách
ra khỏi nền cột và đẩy chúng ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột, chúng sẽ được phát hiện và xác định bằng các
phương pháp phù hợp. Kết quả người ta sẽ thu được từng chất riêng biệt. Trong quá trình mẫu
di chuyển trong cột, một số protein gây nhiễm có thể bám lên chất nền, hoặc mắc kẹt trong lỗ nền. Việc
rửa cột sẽ đẩy chúng ra khỏi cột. Dòng chảy ra khỏi cột sắc ký phải đi qua đầu dò UV ở bước sóng 280
nm. Ngưng rửa cột khi tín hiệu OD nhận được từ đầu dò là 0. Rửa cột thường sử dụng cùng một loại
dịch đệm dùng để cân bằng cột.
Hình 3.5: Sơ đồ nguyên lý họat động của hệ sắc ký cột

46 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Hình 3.6: Máy sắc ký cao áp tách protein (Biorad, 2007)
3.3.1 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion
Sử dụng nền cột là polymer tổng hợp hữu cơ, thường gọi là resin, gắn nhóm trao đổi cation, trong
sắc ký trao đổi cation, hoặc gắn nhóm trao đổi anion, trong sắc ký trao đổi anion. Độ trao đổi ion giữa
phân tử sinh chất (protein) mang điện tích và nhóm điện tích gắn trên resin phụ thuộc vào pH. Vì độ
pH quyết định trạng thái mang điện của các phân tử protein khác nhau có mặt trong dịch protein thô nạp
vào cột. Sự tách được thực hiện một cách tuyến tính nhờ thay đổi pH, hoặc nồng độ muối của dịch
đệm dùng để thôi cột. Độ phân tách còn phụ thuộc vào thời gian tách và chiều cao cột sắc ký. Cột
càng dài, thời gian tách càng lâu. Càng cho kết quả tách tốt hơn. Điểm hạn chế là cột càng dài, càng
làm chậm tốc độ dòng chẩy của dịch qua cột, và do vậy, cũng ảnh hưởng xấu tới kết quả phân tách
protein.
Trong sắc ký trao đổi ion, rửa cột để tách họat chất có thể thực hiện theo 2 cách:
- Bằng sự thay đổi pH của đệm rửa cột
- Sử dụng dung dịch có lực ion tăng dần theo gradient hoặc theo bậc thang.
47 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Bảng 3.2: Vật liệu nền sắc ký trao đổi ion phổ biến
Bảo quản nền chất trao đổi ion cũng có ý nghĩa quyết định đối với thời gian sử dụng của nó.
Dùng dịch đệm và điều kiện bảo quản phù hợp với chất nền, phải theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Ngòai chất nền là polymer, nhiều vật liệu khác cũng được sử dụng làm chất nền cho sắc ký trao
đổi ion. Phổ biến hơn cả là chất trao đổi ion trên nền cellulose như DEAE cellulose (diethylaminoethyl
cellulose) và CM cellulose (carboxylmethyl cellulose). Người ta cũng tạo một số chất mang kết hợp lọc
gel và trao đổi ion. Thí dụ, DEAE-Sephadex và DEAE- Sephacel. Hãng Merck tạo chất mang trao đổi
ion có khả năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Đó là chất trao đổi ion kiểu tua (tentacle type).
Trong chất trao đổi ion truyền thống, nhóm chức trao đổi ion được gắn trực tiếp trên bề mặt chất
mang. Nên đoạn nối chúng ngắn và cứng, có thể làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử
protein, làm giảm hiệu suất tách và hoạt tính protein. Trong chất trao đổi ion kiểu tua, thay vì
gắn trực tiếp, các nhóm chức trao đổi ion gắn lên các tay nối (tua) trên bề mặt hạt chất mang, tạo
tay nối mềm hơn. Các tay nối thường là mạch polymer (thí dụ oligoacrylamide) chứa nhóm –OH.
Do
48 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
vậy, chất nền bên trong có thể là silica gel hoặc polymer hữu cơ, có độ cứng cơ học cao hơn nhiều so
với các chất nền truyền thống, nên có thể ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
Hình 3.7: Sắc ký trao đổi ion kiểu tua của hãng Merk và chất mang kết hợp
Thí dụ: Phân tích thành phần amino acid
Protein cấu tạo từ 20 amino acid dạng đồng phân L, quay phải, khác nhau theo độ phân cực và điện
tích. Để phân tách amino acid, người ta hay sử dụng sắc ký giấy và sắc ký cột trao đổi ion.
Độ phân cực và mang điện của amino acid phụ thuộc vào độ pH của đệm. Thông thường người ta
dùng đệm có pH khác nhau để tách các nhóm amino acid trong cột sắc ký trao đổi cation: Nhóm
mang điện tích dương (amino acid có tính acid) thôi ra khỏi cột bằng đệm citrate, pH 3,0. Nhóm amino
acid trung tính thôi ra khỏi cột bằng đệm citrate pH 6,0 và nhóm mang điện tích âm (amino acid có tính
kiềm) sẽ thôi ra khỏi cột bằng đệm citrate pH 9,0.
Người ta thường sử dụng nhựa trao đổi cation như AG50W (Bio-Rad) hay Dowex
50 (Dow) ở dạng H+. Trước tiên rửa hạt nhựa bằng 4N HCl để lọai hết ion kim lọai nhiễm bẩn. Sau đó
rửa bằng 2N NaOH để biến cation từ dạng H+ thành dạng Na+. Sau đó nạp vào cột.
Trước hết, nạp dịch hỗn hợp amino acid vào nền cột sắc ký trao đổi ion. Sau khi dịch hỗn hợp ngấm
hết vào cột, thì bắt đầu rửa lần lượt chúng ra khỏi cột. Nếu quá trình sắc ký thực hiện trên máy phân tích
amino acid tự động, ta sẽ nhận được sắc ký
49 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
đồ chỉ thứ tự và thời gian ra khỏi cột của từng amino acid. Khi ra khỏi cột từng amino acid sẽ tương tác
với chất chỉ thị mầu là ninhydrin ở khỏang 100oC, trong khỏang 10-
15 phút để tạo phức mầu hồng-tím. Đo OD sẽ cho biết cụ thể tên và hàm lượng của từng amino acid
trong mẫu phân tích, theo thời gian ra khỏi cột và độ đậm mầu của
chúng. Cũng có thể tách amino acid bằng sắc ký giấy.
Hình 3.8: Sắc ký đồ amino acid trên máy phân tích cổ điển
Thường sắc ký giấy được thực hiện trên bản giấy sắc ký kích thước 20 x 20 cm. Người ta chấm
dịch của từng amino acid lên các điểm riêng biệt (đường kính khỏang
0,2 – 0,3 cm), nằm trên vạch kẻ, cách mép bản giấy khỏang 2 cm. Thực hiện khỏang
5-6 lần chấm dịch trên mỗi vết chấm. Tiến hành chấm dịch thí nghiệm ở một số nồng độ khác nhau và
chấm dịch amino acid chuẩn đã biết thành phần và Rf của từng amino acid. Chú ý sau mỗi lần
chấm dịch, phải đợi cho dịch thấm hết vào nền giấy
50 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
sắc ký, mới chấm tiếp. Sau khi chấm và để khô mẫu dịch amino acid, cuộn bản giấy sắc ký thành hình
trụ, mép tiếp giáp mép, không cho chồng lên nhau.
Để trụ giấy sắc ký vào buồng sắc ký chứa đệm acetonitrile và 0,1 M ammonium acetate (tỷ lệ
60/40), pH 4,0. Đặt đầu chấm mẫu của cuộn giấy sắc ký vào dịch đệm sao cho dịch đệm không ngập quá
đường vạch chấm mẫu. Đậy buồng sắc ký và cho đệm thấm từ từ dâng lên theo bản sắc ký. Cho đến khi
cách mép trên của trụ giấy khỏang 1 cm, thì dừng lại. Lấy trụ giấy sắc ký ra khỏi buồng sắc ký, sấy khô,
thường bằng máy sấy tóc. Phun dịch chỉ thị ninhydrin lên bản giấy sắc ký, nên thực hiện trong tủ
hút, và cho hiện mầu ở 110oC bên trong tủ sấy khỏang 10 phút. Tiến hành xác định hệ số Rf và so
sánh với Rf của amino acid chuẩn để định danh amino acid trong các vệt tách.
Hiện amino acid thường được phân tích trên sắc ký HPLC với thời gian giảm đi nhiều (chỉ
khỏang 20 phút), so với phương pháp phân tích trên cột sắc ký trao đổi
cation họat động ở áp suất thấp hơn (thường khỏang 3 giờ).
Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC phân tích amino acid

51 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
3.3.2 Sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel còn được gọi là sắc kí rây phân tử, họat động theo nguyên lý tách các phân tử theo
kích thước và khối lượng khác nhau khi đi qua nền nhựa xốp. Khi hỗn hợp protein được nạp vào nền
cột, các phân tử protein nhỏ sẽ khuyếc tán vào các lỗ. Các phân tử protein lớn không chui vào lỗ, sẽ
tiếp tục di chuyển dọc theo cột và thôi ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Kích thước lỗ của hạt
và chiều dài cột quyết định sự thành công của sắc kí lọc gel.
Hình 3.10: A – Nạp mẫu vào cột lọc gel. B – Phân tử lớn không chui vào nền hạt, nên di chuyển
nhanh dọc theo cột. C – Phân tử lớn ra khỏi cột trước
Cột được cân bằng với dịch đệm thích hợp. Trong thực tế, mẫu thường được nạp ở một lượng nhỏ
(chiếm khỏang 0,5 – 5% thể tích cột), được rửa khỏi cột bằng dung dịch đệm, và được thu lại để phân
tích. Một số protein có thể biểu hiện tương tác ion hoặc kị nước với chất nền. Nên đôi khi chúng bị
rửa thôi chậm hơn, hoặc bị giữ lại trên cột. Trong trường hợp này, cần thay đổi phase động sao cho nó
có lực ion, pH, tính phân cực phù hợp, để khắc phục các tương tác bất lợi nói trên.
Thí dụ điển hình là sử dụng lọc gel để tinh sạch globulin IgG (MW 160 kDa) và
albumin (MW 67 kDa) từ huyết thanh cừu. Nạp huyết thanh cừu vào cột Sephadex G-
100, rửa cột và thu được 2 peak như mong đợi. Peak thứ nhất là IgG bị rửa thôi khỏi cột trước, trong
khi peak thứ hai là albumin do nhỏ hơn, nên khuyếc tán vào lỗ gel, và do vậy, bị giữ lại trong cột lâu
hơn và ra khỏi cột muộn hơn.
52 BÀISẮC
TRONG SỬ DỤNG
NGHIÊN CỨUTRONG
Hình 3.11: Lọc gel huyết thanh cừu trên cột Sephadex G-100 (30 cm,đường
kính 9 mm tốc độ dòng chảy 1 ml/phút)
Gel Sephadex được tạo từ polymer dextran
nối với nhau bởi epichlorohydrin, là vật liệu gel phổ
biến. Trong đó G-25 và G-50, là tương đối cứng về mặt
cơ học, vì có nhiều liên kết ngang, nên có l64 nhỏ. Còn
G-100 và G-200 ít liên kết ngang, nên yếu về mặt cơ
học, thường sử dụng để tách các phân tử kích
thước lớn, ở quy mô phòng thí nghiệm. Gel Sephacryl
tạo từ dextran nối ngang bằng N-N-methylene
bisacrylamide cứng hơn Sephadex, nên thường được sử
dụng trong công nghiệp. Sepharose tạo từ agarose thích
hợp để phân tách phân tử protein lớn, ít được
sử dụng trong sản xuất công nghiệp, vì Hình 3.12: Cấu trúc lỗ xốp của nền
chất sắc ký kiểu tua
không bền về mặt cơ học. Có thể gia tăng độ bền cơ học của Sepharose bằng cách tạo thêm các liên
kết ngang nhờ 2,3-dibromopropanol ở điều kiện kiềm. Bio-Gel P ở dạng hạt, tạo từ acrylamide nhờ
liên kết ngang N-N-methylene bisacrylamide. Bio- Gel A dạng hạt cấu tạo từ agarose có kích thước lỗ
được điều chỉnh nhờ thay đổi % agarose, là những sản phẩm thương mại quen thuộc.
Mới đây hãng Merck chế tạo vật liệu lọc Fractogel, là copolymer của
oligoethyleneglycol, glycidylmethacrylate và pentacrythroldimethacrylate có lỗ hình
thành nhờ sự cuộn lẫn nhau của các polymer, nên có độ bền cơ học cao, thích hợp sử dụng trong sản
xuất công nghiệp.
Thông thường độ dài nền cột lọc gel thường gấp 25-40 lần bề rộng. Cột sử dụng trong công nghiệp
thường đạt độ dài tới vài m. Để tránh sự cố tắc cột làm tăng áp suất nén và giảm tốc độ dòng chảy,
người ta thường sử dụng hệ thống gồm nhiều cột nhỏ, ngắn nhưng rộng, nối nhau nằm trong cột
lớn, gọi là cụm cột (stacking columns). Từng cột nhỏ riêng lẻ dễ dàng được thay thế trong trường hợp
bị tắc.
Bảng 3.3: Một số chất nền sắc ký thương mại dùng trong sắc ký protein
Chất nền Nhà sản xuất Tên thương mại Kích thước
sắc ký (µm)
Chất nền Sigma-Aldrich CM Sepharose, 45–165
trao đổi CM Cellulose,
ion CM Sephadex
Amersham CM Sephadex C-50, 110–400
Pharmacia CM Sepharose high
performance
Biotech SP Sepharose XL 34
Biorad AG 50W-X8 45–165
CM Bio-Gel A
Chất nền Sigma-Aldrich Q Sepharose, DEAE 45–165
trao đổi Amersham Sepharose 40–125
anion Pharmacia QAE Sephadex 40–160
Biotech DEAE Sephacel 45–190
Biorad DEAE Sephadex A-25
DEAE Bio-Gel A
Chất nền ái Sigma-Aldrich Blue dextran, 45–165
lực Amersham SHexylglutathione 45–165
Pharmacia Cellobiose 45–165
Biotech Heparin Sepharose 6
Biorad Fast Flow,
IgG Sepharose 6
Fast Flow
Protein A Sepharose 4
Fast Flow
Affi-Gel Protein A
Chất nền Sigma-Aldrich Benzylamine, Isopropyl, 45–165
kị nước Amersham Phenyl 45–165
Pharmacia Phenyl Sepharose CL-4B Octyl 50
Biotech Sepharose 4 Fast Flow Methyl, t-
Biorad Butyl
Lọc gel đựơc sử dụng cho một số mục đích sau:
Lọai muối, dung môi hữu cơ và các phân tử kích thước nhỏ là thao tác đơn giản, hiệu quả và nhanh.
Trong trường hợp này sử dụng hạt gel có kích thước lỗ nhỏ nhất.
Tinh sạch phân tử sinh chất trong sản phẩm cần tinh sạch ở thể tích mẫu nhỏ, thường được dùng để tinh
sạch chế phẩm protein (polishing) ở giai đọan cuối, khi protein đã đạt độ tinh sạch và chứa trong
thể tích mẫu nhỏ.
Sử dụng sắc ký lọc gel để xác định MW dựa vào thể tích thôi Ve phụ thuộc vào trọng lượng phân tử và
thông số cột, đã được đề cập ở bài 2.
3.3.3 Phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromagraphy)
Là phương pháp tách riêng biệt và đặc hiệu sinh chất, dựa vào khả năng gắn đặc hiệu của chúng
vào nền cột sắc ký thông qua tương tác giữa kháng nguyên-kháng thể, enzyme-cơ chất.... Sau đó
dùng đệm phù hợp để rửa thôi sinh chất mong muốn ra khỏi cột. Hiện đây là phương pháp tinh sạch đạt
hiệu quả cao nhất.
Tính năng của nền sắc ký ái lực liên quan đến sự bắt cặp của phối tử, cường độ tương tác protein-
phối tử, sự hiện diện của phân tử cạnh tranh, một số yếu tố môi trường và sự ổn định của phức chất nền-
phối tử.
Hình 3.13: Nguyên lý bắt cặp trong sắc ký ái lực

Các tay nối đặc hiệu sinh học thường là các chất có mặt trong các phản ứng sinh học. Sử dụng ATP
hoặc cofactor NAD+ gắn trên chất mang, để tách enzyme oxyhóa khử hoặc protein chức năng liên
quan đến ATP. Tương tác kháng nguyên-kháng thể, đặc biệt là kháng thể đơn dòng, được sử dụng để
tách protein rất có hiệu quả, và hiện là kỹ thuật có giá trị sử dụng nhiều tỷ USD. Protein A, một loại
protein có nguồn gốc từ Staphylococcus aureus có MW 42 kDa gắn đặc hiệu lên vùng Fc của
phân tử kháng thể, được sử dụng ở mức độ sản xuất lớn để tách đặc hiệu kháng thể. Lectin, một loại
protein phổ biến có trong hạt thực vật, còn gọi là phytohaemagglutinin, gắn rất đặc hiệu với một số
đường đơn (glucose, N-acetyl galactosamine), thường được sử dụng để tách đặc hiệu hormone, các
yếu tố tăng trưởng, cytokine, glycoprotein...
Người ta cũng lợi dụng khả năng một số chất mầu gắn đặc hiệu lên protein dùng trong phản ứng
chỉ thị tạo mầu, làm tác nhân gắn đặc hiệu protein. Thí dụ mầu triazine (cibacron blue) gắn trên
mạng agarose, thường được sử dụng để gắn đặc hiệu protein. Nguyên tử kim loại gắn cố định trên
chất mang cũng được sử dụng để gắn đặc hiệu protein. Chất mang phổ biến nhất trong sắc ký ái lực là
agarose, cellulose, silica gel và polymer hữu cơ. Trong đó agarose được sử dụng phổ biến hơn cả.
Hình 3.14: Mô hình nguyên tắc sắc ký ái lực tạo phức kim loại
Hình 3.15: Các bước thực hiện sắc ký ái lực và tay nối ái lực
1. Gắn ligand B vào gel; 2. Nhồi modified gel vào cột, gel sẽ gắn đặc trưng chất A từ hỗn hợp A,C,D
có trong pha động; 3. Thôi A ra khỏi cột nhờ phân ly phức Y
Hình 3.16: Một số tay nối sử dụng trong sắc ký ái lực

3.3.4 Phương pháp sắc ký cột lỏng cao áp HPLC (high- performance liquid
chromatography)
Là phương pháp sắc ký phân tách và định lượng sinh chất dưới áp suất cao, giúp giảm đáng kể thời
gian, tăng hiệu quả và chất lượng phân tích. Ưu điểm của kỹ thuật này là giảm thời gian tách và thu mẫu
nhờ quá trình sắc ký được thực hiện dưới áp suất nén cao (từ khỏang 500 đến 5.000 psi), trên nền cột
chứa các hạt kích thước rất nhỏ và có độ bền cơ học cao. Do vậy, cột sắc ký cũng nhỏ hơn nhiều so với
cột sắc ký truyền thống. Chất mang thường là polymer hữu cơ như polystyrene hoặc hạt silicagel
kích thước 5-55 m, khoảng 10 lần nhỏ hơn so với hạt nền trong kỹ thuật sắc ký
truyền thống. Cột sắc ký phân tích HPLC thường dài khoảng 10-30 cm với đường kính
4-4,6 mm. Còn cột sắc ký HPLC điều chế để thu mẫu thường dài khoảng 80 cm (đôi khi có thể dài
hơn 1 m) với đường kính có thể tới 5-10 cm.
Một dạng cải tiến của HPLC gọi là sắc ký lỏng tách protein nhanh FPLC (fast protein liquid
chromatography) hoạt động dưới áp suất nén nhỏ hơn, cũng hay đươc sử dụng. Kỹ thuật FPLC
thường sử dụng chất nền là agarose nhồi trong cột thủy tinh hoặc cột nhựa. Thiết bị FPLC (Biopilot
system) để tách protein ở quy mô sản xuất gồm hệ thống một số cột sắc ký khác nhau, có tốc độ
dòng chảy tới 400 lít/giờ cho
phép tinh sạch hàng kg protein.
Free How does it work?

-OH
groups
on Silica
Reverse Phase Chromatography
OH
Reverse Phase Chromatography
OH C 18 C8
OH C4 C 2 / C 18
C2 End Capped
OH
Hydrocarbon Stro Mildl Weakly
Phase Coating ngly y Hydrophobic
can be Hydr Hydr
Core Bead
Silica or different chain opho opho
Copolymer
lengths usually bic bic
18C, 8C or 2C
Hydrocarbon Phase Coating
Hình 3.17: Các lọai hạt nhựa dùng trong HPLC
3.4 TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Sự hình thành và phát triển kỹ thuật sắc ký ái lực trong tách và tinh sạch protein tái tổ hợp gắn
liền với sản xuất insulin tái tổ hợp. Vào những năm 1980, để tạo insulin
tái tổ hợp, người ta thiết kế gen mã hóa protein lai insulin-Met-β-galactosidase. Protein lai được
tinh sạch nhờ sắc ký ái lực trên nền nhựa gắn kháng thể của β- galactosidase. Sau đó insulin được cắt từ
protein lai nhờ BrCN cắt liên kết peptide ở vị trí Met. Cách làm này khó thực hiện, chi phí cao, mà lý
do chính là cột sắc ký ái lực đắt và khó bảo quản. Để giảm giá thành sản xuất, người ta phát triển 2
lọai cột sắc ký ái lực khác rẻ tiền và dễ bảo quản hơn. Trước tiên, người ta thiết kế cột sắc ký ái lực
dựa trên liên kết đặc enzyme-cơ chất là cột glutathione GST, một tripeptide gắn trên nền nhựa. Còn gen
insulin được thiết kế lai với gen mã hóa enzyme glutathione- S-transferase (GST tag) tạo protein lai
insulin-GST tag gắn đặc hiệu với cơ chất của nó là glutathione và bị giữ lại trong cột. Cột glutathione
chế tạo đơn giản, họat động rất ổn định. Hiện thường sử dụng lọai cột thứ 2 là cột Nikel gắn đặc hiệu
với thứ tự 6 (His)6 amino acid His, đươc thiết kế ở đầu của protein tái tổ hợp để tinh sạch protein tái tổ
hợp.
Tinh sạch protein dung hợp GST
Hệ GST được sử dụng rộng rãi ở E.coli, dễ dàng tách protein tái tổ hợp nhờ cột Glutathione-
Sepharose. Tế bào chủ là E.coli BL21 là dòng tế bào đột biến thiếu protease, có hiệu suất chuyển hóa và
mức độ biểu hiện protein dung hợp GST cao.
Hình 3.18: GST và cấu hình protein dung hợp với glutathione-s-transferase
Vector phù hợp tạo GST tag thuộc nhóm vector pGEX. Trong đó pGEX-6P có điểm cắt phù hợp với
PreScission Protease, pGEX-5X phù hợp với Factor Xa, pGEX-4T phù hợp với Thrombin... Có thể
thực hiện tinh sạch 1 lần protein GST dung hợp sử dụng
cột Glutathione Sepharose 4B. Trong đó glutathione nối với hạt Sepharose sẽ tạo cấu trúc tương thích
gắn đặc hiệu với enzyme glutathione s- transferase (GSTase).
Hình 3.19: Tinh sạch protein lai GST trên cột GSTrap 1 ml và kiểm tra bằng điện
di(Amersham Pharmacia Biotech)
Sau khi thu được protein tái tổ hợp dung hợp, tiến hành cắt tag GST bằng Prescission Protease.
Trong một số trường hợp có thể sử dụng trực tiếp protein dung hợp với GST. Tuy nhiên trong trường
hợp cần cắt GST (MW 46.000), thì khi thiết kế người ta đã chủ động tạo protein dung hợp có điểm cắt
phù hợp với Prescission Protease hoạt động ở 4oC, nên enzyme vừa cắt GST, vừa ổn định protein
đích. Người ta cũng có thể cắt tag GST bằng Thrombin hoặc Factor Xa.
Tinh sạch protein dung hợp (His)6
Tinh sạch protein dung hợp (His)6 được tiến hành trên cột chứa chất nền Sepharose gắn Ni
nhờ liên kết càng cua (Ni chelating Sepharose), gắn đặc hiệu với gốc His trên bề mặt phân tử protein
và được thôi khỏi cột bằng đệm imidazol. Nếu protein dung hợp (His)6 khu trú trong thể vùi, thì trước
hết cần hòa tan và tái tạo lại cấu trúc 3D của protein. Sau đó mới tiến hành tinh sạch. Cột Sepharose gắn
Ni nhồi sẵn có khả năng tách rất cao.1 ml Sepharose gắn Ni tách được 12 mg protein dung hợp (His)6
có MW 27.600.
Trong một số trường hợp có thể sử dụng trực tiếp protein dung hợp (His)6. Trong trường hợp cần
loại (His)6, thì khi thiết kế người ta phải gắn thêm đoạn cắt đặc hiệu đối với enzyme rTEV (MW
29.000). Enzyme này nhận biết được thứ tự amino acid Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Glu*-Gly. Trong đó
Glu,Tyr,Gln và Gly là cần thiết có mặt để vị trí cắt rơi vào liên kết -Glu*-Gly-. Như vậy (His)6 ở đầu N
được loại bỏ. Ưu điểm cắt bằng enzyme là khi sử dụng cột Ni Sepharose cả tag (His)6 và protease
rTEV đều gắn trên cột cho phép thu được protein đích trong 1 lần thao tác.
Hình 3.20: Tay nối Ni gắn với mạch bên của His trong thành phần protein lai
Sau các bước tinh sạch, một việc quan trọng cần làm là đánh giá mức độ tinh sạch đạt được. Để
thuận lợi, người ta lập bảng đánh giá mức độ tinh sạch của protein sau các bước xử lý. Thường người ta
đánh giá mức độ tinh sạch theo họat tính riêng, là tỷ lệ họat tính sinh học của protein trên số mg protein.
Họat tính riêng càng cao, thì độ tinh sạch đạt được càng lớn.
Bảng 3.4: Đánh giá mức độ tinh sạch của protein quan các bước xử lý
3.5 SẮC KÝ KHÍ GC (GAS CHROMATOGRAPHY)
Là phương pháp sắc ký để phân tích các chất ở dạng bay hơi. Trong đó pha động ở dạng khí, pha
tĩnh là lớp dịch bao quanh hạt chất mang, nhồi trong ống thép không rỉ, hoặc ống thuỷ tinh được ổn định
ở nhiệt độ tương đối cao. Pha khí nhờ áp suất nén sẽ di chuyển qua cột. Chất cần phân tách được cho
bay hơi vào phase khí mang, được đốt nóng, sau đó được hấp phụ vào phase tĩnh. Như vậy, các chất
cần phân tích sẽ phân bố giữa phase động và màng dung dịch bao quanh hạt chất mang và phân tách
theo mức độ tương tác với phase tĩnh, và đi ra khỏi cột ở các thời điểm khác nhau.
Phase động dùng trong GC thường là khí trơ như helium, nitơ hoặc argon. Dịch chất được đưa
vào qua nút cao su, cột, van tiêm mẫu và detector được ổn định ở nhiệt độ cao, phù hợp sao cho
chất cần phân tich luôn ở dạng bay hơi trong suốt thời
gian phân tích. Có 2 loại cột GC. Thường dùng là cột nhồi bằng các hạt trơ, có  0,5
cm, dài khỏang từ 1 đến 20 m. Riêng cột GC để thu mẫu (preparative GC) có thể có
 tới 5 cm, dài vài mét. Hạt chất mang thường là bột diatomaceous, bột teflon và hạt thuỷ tinh. Pha
tĩnh ở dạng lỏng phủ kín trên mặt bên trong cột. Cột mao dẫn thường
có  0,25 mm, dài khỏang từ 10 đến 100m.
Chiều dài cột phụ thuộc vào độ phân tách, càng dài tách càng tốt. Loại cột thứ 2 là cột mao dẫn
(capillary), có kích thước nhỏ cho phép tách tốt hơn và nhanh hơn. Cột sắc ký khí bằng thép không rỉ
vẫn còn được sử dụng, nhưng nó không phù hợp để phân tích các chất có độ mẫn cảm hoá học cao.
Nhiều sinh chất bị phân rã khi tiếp xúc với kim loại ở nhiệt độ cao. Thí dụ amino acid chỉ có thể phân
tích bằng GC sử dụng cột thuỷ tinh. GC thường sử dụng detector là tế bào đo độ dẫn nhiệt TC cell
(thermal conductivity cell) và detector ion-hoá ngọn lửa FID (flame ionization detector). TC cell đo độ
thay đổi điện trở của dây bạch kim bị đốt nóng, khi có dòng điện đi qua và nguội đi, khi dòng khí mang
đi qua. Mức độ thay đổi phụ thuộc vào bản chất của tốc độ dòng khí và độ dẫn nhiệt của nó. Do tốc
độ dòng khí là không đổi, nên chỉ phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt khác nhau của chất phân tích. Hơi chất
hữu cơ thường có độ dẫn nhiệt thấp hơn khí mang. Nên khi dòng khí mang chứa hơi hữu cơ đi qua
detector, sẽ làm thay đổi điện trở của dây bạch kim. Tín hiệu thay đổi trên được
khuyếch đại và ghi nhận. TC có độ nhạy không lớn (~ 5g), nhưng được sử dụng
rộng rãi, vì nó phù hợp cho phân tích hầu như tất cả các chất hữu cơ, đặc biệt là các chất bay hơi.
Hình 3.21: Sơ đồ hệ thống GC
Hình 3.22: Phương pháp tính nồng độ họat chất theo tính diện tích tam giác
Ngược lại FID có độ nhạy cao hơn nhiều, trong đó ngọn lửa được duy trì bởi khí H2 và không khí sẽ
đốt hơi hữu cơ ở đầu ra của cột, tạo dòng e- và các phân đoạn ion. Các ion này sẽ được thu lại để
phân tích định tính và định lượng. Detector FID rất nhạy đối với các chất oxy hoá. Do vậy không phù
hợp để phân tích hơi nước và khí CO2. Người ta xác định chất theo các peak thu được dựa vào thời gian
lưu giữ của chúng. Thời gian lưu giữ giống như giá trị Rf trong sắc ký lỏng.
GC là phương pháp phân tích và tách các chất hữu cơ rất tốt. Nó đơn giản, đa năng, nhanh, có
độ nhạy cao và không đắt. Hạn chế chủ yếu là yêu cầu điều kiện đốt nóng ổn định và sự bay hơi của
mẫu. Thường các sinh chất thường bị phân huỷ ở nhiệt độ cao dưới 250oC khó tiến hành GC.
Trong thực tế rất nhiều chất sinh học không bay hơi ở khoảng nhiệt độ này (200-250oC). Do vậy
người ta phải đưa chúng về dạng bay hơi nhờ cải biến hoá học. Thí dụ nhóm –OH của alcohol, đường,
sterol được chuyển thành dẫn xuất methyl- acetyl-hóa.
TÓM TẮT
Trong bài này, học viên làm quen với bản chất của phương pháp sắc ký, một công cụ thường được
sử dụng để thu nhận và tinh sạch chế phẩm CNSH. Giáo trình giới thiệu các phương pháp sắc ký từ
đơn giản như sắc ký giấy và sắc ký bản mỏng cho đến phương pháp sắc ký hiện đại hơn là sắc ký cột
và sắc ký khí.
Giáo trình đề cập chi tiết 4 phương pháp sắc ký cột thường hay được sử dụng nhất trong các thao
tác CNSH. Đó là sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực và sắc ký hiệu năng cao HPLC. Các
kỹ thuật này sử dụng trong thu nhận, và đặc biệt, trong tinh sạch họat chất sinh học. Trong đó nhấn
mạnh trong việc thu nhận và tinh sạch protein, là nhóm phân tử thường gặp nhất trong thao tác CNSH.
Một phần đáng kể nội dung bài đề cập đến các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp. Trình bầy
các giai đọan phát triển của phương pháp sắc ký ái lực trong thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp,
sản phẩm chủ lực của các ứng dụng CNSH hiện đại.
Cuối cùng là nội dung liên quan đến sắc ký khí, một công cụ phân tích các họat chất sinh học ở
dạng khí hay bay hơi. Trong đó có nhiều chất thứ cấp hiện đang được sử dụng rộng rãi.
Câu 1: Xác định xem amino acid nào trong các cặp amino acid sau đi ra khỏi cột sắc ký trao đổi ion
trước tiên: Asp và Lys; Arg và Met; Glu và Val; Gly và Leu và Ser và Ala?.
Câu 2: Trình bầy các bước chuẩn bị cột sắc ký ái lực sử dụng kháng thể đơn dòng trong thu nhận
và tinh sạch protein-đích?.
Câu 3: Giải thích tại sao người ta phải hòa tan tủa protein bằng ammonium sulfate và cho thẩm tích
qua đêm bằng một lượng đệm lớn. Tại sao người ta phải lọai ammonium sulfate ra khỏi tủa
protein và tại sao người ta không dùng nước để thẩm tích?.
Câu 4: Trình bầy các bước phát triển của phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái
lực?.
Câu 5: Trình bầy đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein trong quy trình thu nhận và tinh
sạch protein?.
65 BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG ĐIỆN DI 65
BÀI 4: PHÂN TÍCH PROTEIN
BẰNG ĐIỆN DI
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của phương pháp điện di;
- Nắm được phương pháp điện di SDS-PAGE và ứng dụng của nó;
- Nắm được phương pháp điện di theo điểm đẳng điện và điện di 2 chiều và ứng dụng của
chúng,
- Hiểu được phương pháp western blot và ứng dụng của nó.
4.1 KHÁI NIỆM VỀ ĐIỆN DI
Điện di là kỹ thuật phân tách các phân tử sinh chất thông qua sự chuyển động của chúng trong
trường điện từ. Sự chuyển động trên phụ thuộc vào kích thước, hình dáng, thành phần hoá học và
nhất là điện tích của phân tử sinh chất. Người ta đã lợi dụng các tính chất trên để phân tách các phân tử
sinh học, dùng cho cả mục đích định tính và định lượng. Kết quả phân tách phụ thuộc rất nhiều vào sự
ổn định của trường điện từ, để các phân tử sinh chất chuyển động ổn định về 2 điện cực. Một điểm quan
trọng nữa cần lưu ý là vật liệu nền cho điện di. Thường sử dụng 2 dạng vật liệu là cellulose và vật liệu
dạng gel. Vật liệu cellulose thường dùng để điện di các phân tử có MW nhỏ như amino acid,
carbohydrate... Còn vật liệu dạng gel để điện di các phân tử có MW lớn như protein, nucleic acid... Sau
đây sẽ xem xét một số phương pháp điện di phổ biến nhất. Sau khi kết thúc điện di, các vệt protein
được phát hiện nhờ xử lý chất chỉ thị nhuộm gắn với phân tử sinh chất.
4.2 ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE PAGE (POLYCRYLAMIDE GEL

ELECTROPHORESIS)
4.2.1 Giới thiệu phương pháp PAGE
Trong phương pháp PAGE, nền gel chạy điện di được tạo trong quá trình polymer hoá acrylamide.
Nền gel PAGE phân tách rất tốt đối với phân tử protein và nucleic acid có MW trung bình tới 106
Da. Sự tương tác giữa phân tử sinh chất với nền gel là nhỏ và nền gel khá bền. Khác với phương pháp
lọc gel, phương pháp điện di vừa có khả năng phân tách phân tử sinh chất theo kích thước nhờ lỗ xốp
của nền, vừa phân tách theo giá trị điện tích của chúng. Trong phương pháp lọc gel, phân tử kích thước
lớn di chuyển nhanh hơn phân tử nhỏ, còn trong điện di lại ngược lại.
Gel polyacrylamide tạo bởi quá trình polymer hoá acrylamide với chất tạo liên kết ngang N,N’-
methylene-bis-acrylamide. Quá trình trên được kiểm soát bởi hệ xúc tác khởi động gồm TEMED
(ammonium persulfate-N,N,N’,N’-tetramethylethylene diamine). Riboflavin cũng xúc tác polymer hoá
khi chiếu tia UV. Gel để tách protein thường chứa 7,5% polyacrylamide, cho phép tách protein có
MW từ 10.000 đến
1.000.000 Da. Tách tốt nhất trong khoảng MW từ 30.000 đến 300.000 Da. Nguyên tắc chung là
nồng độ acrylamide tạo gel càng thấp, thì gel tạo thành càng xốp, càng phù hợp để tách các phân tử có
kích thước lớn hơn.
Hình 4.1: Phản ứng polymer hóa giữa acrylamide và N,N’-methylene-bis-

acrylamide tạo nền gel PAGE
Gần đây các nhà sản xuất đã tạo được vật liệu tạo nền gel điện di ít độc hơn, không dùng
monomer có độc tính cao là acrylamide. Loại gel này tan trong nước gọi là Instacryl. Dịch ban đầu
chứa 20% theo trọng lượng chất tạo nền gel, tạo polymer rất nhanh với dithiothreitol. Do vậy tránh
không phải trộn acrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate và TEMED là các phản ứng độc
hại. Gel Instacryl L 8-15% rất
phù hợp để tách protein kích thước từ 14.000 đến 330.000 Da. Điện di polyacrylamide thường sử dụng
ở dạng bản gel hay ống gel.
Hình 4.2: Cột gel trong điện di polyacrylamide
Ống gel kích thước 10x0,6 cm được bơm đầy hoá chất cần thiết. Quá trình polymer hoá kéo dài
khỏang 30 - 40 phút. Sau đó ống gel được gắn nằm giữa 2 buồng đệm: buồng đệm cathode (thường nằm
phía trên) và buồng đệm anode nằm bên dưới.
Thường người ta phân tích điện di protein trong đệm có pH kiềm để đảm bảo phần lớn protein mang
điện âm, sẽ di chuyển xuống phía dưới. Khi mẫu được nạp vào phần phía trên của cột gel. Người ta
thường bổ sung chất chỉ thị màu đánh dấu đường chạy gọi là “tracking gel”, có tốc độ di chuyển nhanh
hơn các phân tử sinh chất. Khi chỉ thị màu chạy tới đáy cột gel, thì ngừng điện di và mang gel đi
nhuộm màu. Hiện trong thực hành phòng thí nghiệm, người ta thường dùng gel chạy điện di không
ở dạng ống, như mô tả ở trên, mà ở dạng bản gel.
Bản gel được tạo thành trong khoảng không gian nằm giữa 2 tấm thuỷ tinh được điều chỉnh rộng hẹp
bởi nẹp spacer. Điều chỉnh sao cho độ dày của bản gel nằm trong khoảng 0,5-2,0 mm. Bản gel thường
có kích thước 20x40 cm. Người ta đặt 1 “lược” nhựa vào phần trên của bản gel trong quá trình tạo gel.
Để tạo các lỗ (giếng) để nạp mẫu. Một lược có thể tạo được 20 giếng. Sau khi tạo gel, thận trọng lấy
lược và tấm kính ra khỏi buồng tạo bản gel. Rửa bản gel nhằm lọai bỏ muối và acrylamide không tham
gia tạo gel. Bản gel được kẹp nối nằm giữa 2 buồng đệm, nhỏ dịch mẫu chứa protein vào các giếng, bổ
sung thêm chất đánh dấu trước khi chạy điện di.
Hình 4.3: Buồng tạo bản gel và cách thức sắp xếp các tấm kính, nẹp điều chỉnh và lược tạo
giếng trên bản gel
4.2.2 Điện di không liên tục
Còn gọi là điện di đĩa (disc gel electrophoresis). Có 3 đặc điểm sau: Thứ nhất là nền gel gồm 2
lớp. Lớp trên còn gọi là stacking gel, lớp dưới gọi là resolving gel; Thứ
2 là hệ đệm sử dụng để chuẩn bị 2 lớp gel này có pH và lực ion khác nhau và thứ 3 là lớp stacking gel có
hàm lượng acrylamide thấp tạo lỗ gel lớn hơn. Ba điểm khác biệt trên cho phép tập trung mẫu protein
cần phân tích ở lớp stacking gel. Tạo điều kiện cho sự phân giải chúng xẩy ra ở lớp gel bên dưới.
Sở dĩ có hiện tương mẫu tập trung thành dải ở lớp gel bên trên vì nguyên nhân sau: Mẫu phân
tích thường hoà tan trong đệm glycine-chloride pH 8-9 trước khi đưa vào cột gel. Amino acid ở điều
kiện trên sẽ tồn tại ở hai dạng: trung hoà về điện (zwitterion) và mang điện âm ở pH 8,5 theo dạng cân
bằng:
H3N + CH2COO-  H2NCH2COO- + H+

Khi bắt đầu điện di, do ảnh hưởng của trường điện từ nên glycinate, chloride và protein sẽ di chuyển
vào stacking gel có pH ~ 6,9. Làm cân bằng của phương trình trên chuyển hướng lệch về bên trái, tạo
dạng trung hoà điện và không tiếp tục di chuyển trong trường điện từ. Để giữ dòng điện ổn định
trong hệ điện di, thì dòng điện âm anion phải ổn định. Vì đa số protein và nucleic acid ở dạng anion ở
pH 6,9. Nên chúng sẽ thay thế glycinate (muối của glycine), làm nhiệm vụ nói trên. Do vậy sẽ xuất
hiện sự phân bổ dịch chuyển trong điện trường như sau: chloride > protein hoặc nucleic acid >
glycinate. Điều này làm cho các phân tử protein trong mẫu tập trung thành dải mỏng nằm giữa chloride
và glycinate cùng lúc di chuyển qua lớp gel phía dưới (resolving gel). Vì nồng độ acrylamide trong lớp
stacking gel thấp (2-3%), nên không cản trở sự di chuyển của các phân tử protein hay nucleic acid trong
mẫu.
Khi đi vào lớp gel dưới có pH 8-9, tương quan trên sẽ thay đổi. Do hàm lượng glycinate tăng, nên
lúc này dòng điện chủ yếu lại do ion Cl- và glycinate quyết định. Do lớp gel dưới có độ pH cao hơn
và lỗ gel nhỏ hơn. Nên tương quan di chuyển ở lớp dưới như sau: Cl- > glycinate > protein hay nucleic
acid. Nhờ vậy quá trình phân tách protein và nucleic acid sẽ xẩy ra. Quá trình này phụ thuộc vào tương
quan điện tích/ trọng lượng, kích thước và hình dạng của phân tử cần điện di.
Hình 4.4: Quá trình điện di đĩa
(A) Trước khi điện di. (B) Sự di chuyển của chloride, glycinate và protein dọc
theo stacking gel. (C) Protein phân tách trên resolving gel
4.2.3 Điện di SDS-PAGE
Phương pháp điện di SDS-PAGE (sodium dodesulphate PAGE) thường được sử dụng để nghiên
cứu thành phần, cấu trúc protein và xác định MW phân tử protein. Khi phân tử protein bị xử lý bởi
SDS và mercaptoethanol, thì các cấu trúc bậc 2, bậc 3 và bậc 4 bị phá vỡ thành cấu trúc bậc 1 (dạng
sợi). Được bọc bởi các phân tử SDS mang
điện tích âm. Mercaptoethanol tham gia khử tất cả liên kết disulfide. Do vậy sự di chuyển của phức
SDS-protein mới tạo thành lúc này chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của phân tử protein: phân
tử lớn di chuyển chậm hơn phân tử nhỏ. Thực nghiệm cho thấy có tương quan tuyến tính giữa log
MW và tốc độ di chuyển của các vạch protein có MW khác nhau. Điều này được sử dụng trong xác định
MW protein, đã được trình bầy ở bài 2.
4.2.4 Điện di protein theo điểm đẳng điện IEF (Isoelectric

Focusing of Protein)
Khi xem xét khả năng di chuyển trong trường điện từ của các phân tử protein. Người ta thấy ở giá trị
pH nhỏ hơn giá trị pI (pH điểm đẳng điện), thì protein mang điện dương, và ngược lại. Còn nếu pH của
đệm bằng pI của protein, thì protein này sẽ không di chuyển trong trường điện từ, vì khi ấy tổng điện
tích của nó (điện tích + cộng với điện tích âm) sẽ bằng không. Điều này là cơ sở để xây dựng phương
pháp phân tách protein bằng điện di theo mức độ di chuyển phụ thuộc vào điểm đẳng điện (pI) của
chúng. Phương pháp được gọi là điện di theo điểm đẳng điện IEF. Có nghĩa là IEF phải được tiến hành
trong đệm có giá trị pH thay đổi từ từ (đệm có gradient pH tăng dần chẳng hạn). Gradient pH được tạo
nhờ các chất điện phân, là những phân tử polymer có MW thấp, có phạm vi thay đổi pI rộng nhờ
chứa số lượng nhóm NH2, COO- và SO3- khác nhau. Hỗn hợp các chất điện phân cho phép tạo
gradient pH khác nhau, trong các khỏang pH khác nhau, với các tên thương mại như ampholine,
pharmalyte, immobiline và Bio-Rad-Lyte …
Phương pháp IEF thường được sử dụng để đánh giá mức độ tinh sạch của protein. Trong thực tế, đối
với protein biết trước pI, thì người ta sử dụng dải gradient pH hẹp chênh nhau 2 đơn vị. Thí dụ
gradient trong khỏang pH 5-7, 6-8. Như vậy kết quả nhận được sẽ chính xác. Đối với protein chưa
biết trước giá trị pI, thì trước hết cho chạy IEF với dải gradient pH rộng (pH 3-10). Sau đó cho chạy
tiếp với dải gradient pH hẹp như đã đề cập ở trên.
Người ta tạo gradient pH như sau: Trộn ampholyte vào hỗn hợp trước khi polymer hoá tạo gel. Sau
khi gel tạo thành, pH trên toàn bộ ống gel hay bản gel giống nhau. Tuy nhiên khi đưa vào trường điện
từ để chạy điện di, thì các phân tử ampholyte lập
tức sẽ di chuyển ngay tới vị trí pI của chúng để tạo gradient pH mong muốn. Gel tách protein có MW <
100.000 Da thường là polyacrylamide 7,5%. Để tách các protein lớn hơn người ta sử dụng gel chứa
nồng độ acrylamide ít hơn là 2%, có bổ sung thêm
0,5-1% agarose để làm chắc bản gel.
Hình 4.6: Nguyên lý họat động của IEF
Có 2 cách đưa mẫu protein vào bản gel. Cách thứ nhất làm như bình thường. Cách thứ hai là đưa
trực tiếp hỗn hợp protein vào hỗn hợp tạo gel trước khi tạo gel. Sau khi gel hình thành. Dù protein có
phân bố đều trong toàn bộ ống gel hay bản gel, thì khi điện di, chúng cũng vẫn di chuyển về vị
trí pI của chúng. Vì các phân tử ampholyte có MW thấp, nên chúng sẽ di chuyển về điểm pI để tạo
gradient pH nhanh hơn nhiều, so với phân tử protein có MW lớn hơn nhiều.
Thường người ta sử dụng dòng 2 mA đối với 1 ống gel, thời gian chạy khỏang 30-
120 phút. Trong phương pháp này, thời gian chạy lâu cũng không đẩy protein ra khỏi bản gel. Gel IEF
không thể nhuộm trực tiếp vì các chất màu cũng bám vào ampholyte. Do vậy trước khi nhuộm gel
bằng thuốc nhuộm Coomassie Blue, phải rửa hết ampholyte ra khỏi bản gel bằng cách ngâm chúng
vào dịch trichloacetic acid 5%.
4.2.5 Điện di hai chiều (Two-dimensional Electrophoresis)
Là sự kết hợp của 2 phương pháp điện di: điện di IEF và SDS-PAGE. Trong điện di IEF, protein
được tách theo giá trị pI của chúng. Còn trong điện di SAS-PAGE protein lại tách theo kích thước và
khối lượng phân tử. Do vậy, nên sự kết hợp của cả 2 ưu
điểm trên sẽ cho khả năng tách tăng rất nhiều. Đó chính là bản chất của phương pháp điện di hai chiều.
Trong điện di 2 chiều, trước tiên mẫu protein được tách bằng IEF trong ống gel gọi là chiều thứ nhất.
Sau khi protein đã được tách thành các vệt theo pI của chúng, thì ống gel được chuyển sang bản gel
SDS-PAGE để phân tách tiếp theo chiều thứ 2 vuông góc với chiều thứ nhất, tách theo sự khác biệt
MW. Bằng cách này người ta có thể tách hỗn hợp protein trong dịch tế bào E. coli thành hàng trăm,
thậm chí hàng nghìn vết protein khác nhau. Trong thực tế đây là phương pháp tốt nhất để
đánh giá mức độ tinh khiết của protein.
Hình 4.7: Nguyên lý họat động của điện di 2 D
Hình 4.8: Vết protein dịch tế bào E. coli nhận được bằng điện di 2 chiều
4.2.6 Điện di mao dẫn CE (Capillary Electrophoresis)
Đây là kỹ thuật kết hợp khả năng phân tách cao của điện di với khả năng phân tách nhanh của
phương pháp HPLC. CE cho phép phân tích một lượng mẫu rất nhỏ chỉ khỏang 5-10 nl, với độ nhạy rất
cao, có thể đến attomole 10-18mole. Đây là phương pháp hết sức tốt để phân tích amino acid, peptide,
protein, các nucleotide, các chất hoạt tính sinh học trong tương lai. Thành phần chính của thiết bị CE
bao gồm nguồn điện, 2 nguồn đệm, vi ống điện di, detector và 2 điện cực bạch kim nằm trong 2
nguồn đệm. Detector được sử dụng rộng rãi là UV và diode-array detector. Vi ống
điện di là ống mao dẫn thủy tinh thạch anh đường kính 50-100 m, dài 25-100 cm.
Ưu điểm cơ bản của phương pháp CE là người ta có thể sử dụng nó giống như HPLC bằng cách chọn
chất mang thích hợp. Để tách những phân tử nhỏ mang điện, người ta hay sử dụng ống mao dẫn
nhồi hạt thuỷ tinh thạch anh, hay mao dẫn bọc polyimide. Để phân tách theo kiểu rây phân tử,
người ta nhồi cột bằng polyacrylamide hoặc SDS-polyacrylamide. Còn để chạy IEF, ống mao dẫn được
nhồi bằng chất điện phân electrolyte và tạo gradient pH bằng ampholyte.
4.2.7 Điện di miễn dịch IE (Immunoelectrophoresis)
Phương pháp IE được thực hiện theo 2

bước. Bước đầu điện di tách protein như
bình thường trên nền agarose. Bước tiếp
theo là cho tương tác với kháng thể đặc
hiệu để kiểm tra tính kháng nguyên của
các phân đọan protein mới tách được.
Thông thường bước đầu chạy điện di

trên bản agarose. Sau đó khóet tạo máng
trên bản điện di và bổ sung nguồn kháng
thể thường là huyết thanh (antiserum)
Hình 4.9: Sơ đồ vận hành điện di miễn dịch

vào máng. Từ máng, các phân tử kháng thể sẽ khuyếch tán vào gel và tiến đến các vết protein khác
nhau. Nếu phân tử kháng thể có sự gắn đặc hiệu với kháng nguyên của mình có trong vết protein nào
đó vừa được tách, thì sẽ tạo phức không tan ở dạng vành khăn. Kỹ thuật này chủ yếu để đánh giá độ
tinh sạch của protein (kháng nguyên) mới tách được.
Hình 4.10: Sơ đồ nguyên tắc họat động của phương pháp ELISA bánh kẹp
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) là phương pháp sàng lọc và định lượng nhanh sự có
mặt của kháng nguyên. Trong kiểu phân tích bánh kẹp “sandwich” như mô tả trong hình, thì trước tiên
phải gắn kháng thể thứ 1 bắt HGMB1 lên đáy giếng. Tiếp theo cho mẫu chứa kháng nguyên HGMB1 để
gắn bắt cặp lên kháng thể. Rửa và cho kháng thể thứ 2 có chứa enzyme, gắn lên HGMB1. Rửa và cho
cơ chất của enzyme vào, thì sẽ xẩy ra phản ứng do enzyme xúc tác. Tạo sản phẩm có mầu
chứng tỏ sự hiện diện của HGMB1 trong mẫu. Hiện phương pháp ELISA đang được sử dụng rất phổ
biến, vì nó rất tiện lợi, không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện. Kết quả phân tích nhanh,
có độ tin cậy cao.
Một trong ứng dụng quan trọng của phương pháp này là phương pháp thấm western
(Western blot). Dưới đây là hình mô tả 2 phương pháp thấm rất phổ biến trong nghiên cứu CNSH hiện
đại là phương pháp thấm southern (Southern blot), để xác định thứ tự DNA (gen) và phương pháp
thấm western, để xác định protein.
Hình 4.11: Các bước thực hiện trong phương pháp thấm
protein và nucleic acid
Western blotting có bản chất giống ELISA, có nghĩa là độ nhậy của phương pháp phân tích này dựa
vào khả năng gắn đặc hiệu kháng nguyên kháng thể. Các vệt điện di protein khác nhau thu nhận được
sau khi điện di sẽ được chuyển sang màng nitrocellulose. Màng này sau đó sẽ được xử lý lần lượt
với kháng thể thứ nhất và với kháng thể thứ hai kèm theo enzyme và cơ chất. Chỉ vệt chứa protein đích
mới hiện mầu. Phương pháp này cho phép xác định được những vệt protein rất nhỏ và đánh giá sơ bộ
MW của protein. Tương tự, các vệt điện di DNA (gen) cũng được xử lý cho lai bắt cặp với các đầu
dò để xác định thứ tự gen cần xác định nằm ở vệt điện di nào.
4.3 NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN
Nghiên cứu tính chất của protein tiến hành sau khi khi protein được tinh sạch là công đoạn sau
cùng trong quá trình chiết xuất và tinh sạch protein, bao gồm một số
vấn đề sau: Nghiên cứu chức năng protein, cung cấp bằng chứng về độ tinh sạch của mẫu protein, xác
định trọng lượng phân tử protein, xác định cấu trúc protein, xác định các dạng cải biến phân tử
protein...
Trong nghiên cứu protein ở giai đọan hậu genomics, nẩy sinh nhu cầu biết rõ hơn không những cấu
trúc và chức năng của từng phân tử protein riêng lẻ, mà còn cần phải biết vị trí của nó trong tổng
thể họat động chức năng của tế bào, mô hoặc cơ thể. Thông tin trên có thể nhận được từ nghiên cứu
proteomics, tin sinh học, tóan hệ thống ... với các nội dung như nhận dạng protein bằng MS
fingerfrinting (dấu vân tay MS), xác định trình tự amino acid bằng tandem MS/MS, MALDI-TOF
và cấu trúc không gian 3 chiều bằng phương pháp ghi nhiễu xạ tinh thể bằng tia X...
Bảng 4.1: Các phương pháp nghiên cứu tính chất của protein
Nghiên cứu tính chất Phương pháp

Nghiên cứu tính chất Phụ thuộc vào hoạt tính sinh học của từng protein cụ thể (xác
định hoạt tính đặc hiệu, ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, tương tác
Bằng chứng về độ tinh sạch với ligand...
Nghiên cứu cấu trúc Điện di SDS-PAGE , điện di 2 chiều, điểm đặng điện, phân tích
HPLC, nghiên cứu khối phổ, điện di mao quản.
● Xác định MW protein
Điện di SDS-PAGE, lọc gel, phân tích siêu ly tâm, khối
● Nghiên cứu cấu trúc
phổ.
Xác định thành phần amino acid, bản đồ peptide, xác định đầu N,
đầu C, Phân tích tia X tinh thể protein, phân tích siêu ly tâm.
Hình 4.12: Tổng quan về nghiên cứu proteomics

TÓM TẮT
Trong bài này, học viên làm quen với bản chất của phương pháp điện di, một công cụ phân tích đầu
tay và rất hiệu quả trong phòng thí nghiệm CNSH. Đặc biệt liên quan đến các nghiên cứu protein và
nucleic acid.
Tiếp theo giới thiệu chi tiết phương pháp điện di SDS PAGE rất hay được sử dụng trong phân tách
đơn vị thành phần của protein, dùng để xác định MW của biopolymer, giúp cho nghiên cứu cấu trúc
không gian của biopolymer.
Trên cơ sở của phương pháp điện di theo điểm đẳng điện được giới thiệu trong nội dung tiếp theo
và điện di theo MW của biopolymer hình thành phương pháp điện di 2 chiều, một phương pháp phân
tích đạt độ nhậy rất cao, làm cơ sở cho các nghiên cứu proteomics và genomics, hứa hẹn có nhiều ứng
dụng quan trọng trong tương lai.
Cuối cùng giới thiệu phương pháp western blot và southern blot là phương pháp phân tích dựa trên
tương tác kháng nguyên-kháng thể và lai phân tử, hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên
cứu cũng như phân tích, chẩn đóan bệnh, mà phương pháp ELISA là một trường hợp của phương pháp
này.
Câu 1: Phân biệt sự giống nhau và khác nhau giữa phương pháp sắc ký và điện di?.
Câu 2: Nêu nguyên tắc của phương pháp xác định MW protein bằng điện di SDS-
PAGE? Phương pháp xác định MW biopolymer nào gần giống phương pháp này?.
Câu 3: Nêu nguyên tắc họat động của phương pháp điện di 2 chiều?. Nêu ứng dụng của phương pháp
này trong nghiên cứu CNSH hiện đại?.
Câu 4: Trình bầy các bước phát triển của phương pháp thấm protein và DNA?. Nêu ứng dụng của
các phương pháp này?.
Câu 5: Trình bầy nội dung nghiên cứu tính chất của protein?.
81 BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME TYROSINASE 81
BÀI 5: PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC
ENZYME TYROSINASE
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của cơ chế xúc tác bởi enzyme
- Nắm bắt được cách thức thiết kế thí nghiệm phân tích động học enzyme
- Ý nghĩa của Km và Vmax và phương pháp xác định chúng
- Biết được đơn vị họat tính của enzyme
- Biết được cách thức đánh giá các bước tinh sạch enzyme.
5.1 ĐỘNG HỌC ENZYME
Động học enzyme thường được phân tích bằng một số phương pháp đồ thị. Đầu tiên là: Phương
trình Michaelis-Menten: vo = Vmax[S]/Km + [S], biểu thị bằng đường parabol.
Hình 5.1: Đồ thị phương trình Michaelis-Menten và Linerweaver-Burk

Hạn chế của việc xác định động học theo đường parabol là tính không tuyến tính của kết quả nhận
được. Vmax chỉ có thể xác định gần đúng. Do vậy Km tinh được cũng sẽ không chính xác. Tiếp
theo là biến đổi phương trình trên bằng cách lấy giá trị đảo ngược cả 2 vế của phương trình, sẽ
nhận được phương trình tuyến tính Linerweaver-Burk: 1/vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax. Biểu thị
bằng đường tuyến tính, cho kết quả xác định chính xác hơn so với xác định theo đường parabol.
Điểm yếu của phương trình Linerweaver-Burk là số liệu nhận được ở vùng nồng độ cơ chất gần nhau
dẫn đến có sai số. Kiểu phân tích đồ thị thứ 3 là theo phương trình Eisenthal-Cornish-
Bowden: Vmax = vo + vo/[S] . Km. Trong đó mỗi điểm đồ thị ứng với mỗi cặp vo và [S].
Ý nghĩa của Km và Vmax
Theo phương trình Michaelis-Menten, thì Km là nồng độ cơ chất [S] ở vị trí ứng với Vmax/2 trên
trục hòanh. Còn theo phương trình Linerweaver-Burk, thì Km có giá trị nồng độ cơ chất [S] ứng với
đường đồ thị cắt trục tung tại 1/Vmax và trục hòanh
1/[S] tại -1/Km.
Km có 2 ý nghĩa: Thứ nhất là Km = Vmax/2, có giá trị tính theo nồng độ [S], khi
½ tổng số tâm họat động của enzyme gắn với cơ chất. Km tương đương hệ số phân ly của phức ES. Km
lớn có nghĩa là giữa E và S tương tác yếu, enzyme kém họat động. Km nhỏ là có nghĩa là tương tác trên
chặt, enzyme họat động mạnh.
Vmax liên quan đến số vòng quay của enzyme (turnover number). Do ta có vo =
k3.[ES], k3 là hằng số phân ly của [ES], và vo có xu hướng  Vmax. Hay Vmax =
k3[Et] (Et là trạng thái khi tất cả tâm họat động của enzyme đều gắn cơ chất). Đối với enzyme có 1
tâm họat động, thì k3 là số phân tử S chuyển hóa thành sản phẩm bởi 1 phân tử enzyme trong 1 đơn vị
thời gian (thường là phút hay giây). Có nghĩa là turnover number biểu thị hiệu quả xúc tác của enzyme.
Ức chế enzyme
Có 2 kiểu ức chế họat động của enzyme: ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh.
Trong ức chế cạnh tranh Vmax không đổi khi có mặt chất ức chế. Để hạn chế chất ức chế cạnh
tranh, cần bổ sung thêm cơ chất.
Hình 5.3: Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị ức chế cạnh tranh (trái)
và không cạnh tranh (phải)
Theo phương trình Linerweaver-Burk thì đường đồ thị biểu thị ức chế cạnh tranh cắt trục hòanh
tại điểm – 1/Km(1 + [I]/Ki), có nghĩa là Km thay đổi. Còn ức chế không cạnh tranh gặp nhau trên
trục hòanh, có nghĩa là Km không thay đổi.
Có 3 đơn vị họat tính enzyme thường được sử dụng. Đó là đơn vị quốc tế IU (international units),
katal và họat tính riêng. IU được coi là đơn vị họat tính enzyme chuẩn biểu thị số lượng enzyme xúc tác
chuyển hóa 1 µmol cơ chất thành sản phẩm trong 1 phút. Katal là họat tính chuyển hóa 1 mole cơ chất
thành sản phẩm trong 1 giây. Như vậy 1IU = 1/60 katal. Do dơn vị tính katal quá lớn, nên thường sử
dụng milikatal, microkatal hay nanokatal. Đối với mẫu thử nghiệm enzyme không sạch, thì họat tính
nên biểu hiện theo unit/ml hoặc katal/ml. Họat tính riêng là tỷ số đơn vị họat tính enzyme /mg
protein, cũng là chỉ số độ tinh sạch của mẫu enzyme.
5.2 THIẾT KẾ THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘNG HỌC ENZYME
5.2.1 Khái niệm chung
Để phân tích động học enzyme cần biết một số thông tin sau:
- Tính lập thể của phản ứng
- Cơ chất và các yếu tố phụ trợ khác cho phản ứng xúc tác (ion kim lọai, cofactor...)
- Anh hưởng của pH, nhiệt độ và lực ion.

Để phân tích động học enzyme, phổ biến nhất là theo dõi sự thay đổi nồng độ cơ chất. Hoặc sản
phẩm tạo thành trong quá trình phản ứng xúc tác, bằng cách đo phổ, đo độ đục, chuẩn độ acid-base, đếm
phóng xạ ... Nếu theo dõi thay đổi liên tục nồng độ cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng, thì gọi là phân
tích động học enzyme. Còn nếu chỉ đo nồng độ cơ chất, hay sản phầm tạo thành, theo từng khỏang thời
gian cố định, thì gọi là phân tích họat tính enzyme theo thời gian cố định. Phân tích động học enzyme có
giá trị hơn, vì phản ánh sự thay đồi nồng độ cơ chất, hoặc sản phẩm một cách liên tục, ngay lập tức tại
thời điểm đo.
Trong phân tích động học enzyme theo thời gian cố định dưới đây, ta thấy tốc độ hình thành sản
phẩm giảm theo thời gian. Do giảm nồng độ cơ chất, do enzyme bị biến tính, cũng như do sự ức chế
bởi sản phẩm tạo thành...Đừơng gạch biểu thị động học xúc tác cho thấy, có khỏang 5 µmol sản phầm
tạo thành mỗi 1 phút. Trong khí đó, theo phân tích theo thời gian cố định, thì mỗi phút trong 5 phút
đầu chỉ tạo được khỏang 3 µmol sản phẩm. Tốc độ 5 µmol tất nhiên là gần tốc độ thật hơn. Có thể cải
thiện kết quả phân tích theo thời gian cố định, bằng cách đo tốc độ tạo sản phẩm sau mỗi 2 phút. Chứ
không phải đo sau mỗi 5 phút như mô tả trong hình.
Đồ thị này cũng cho thấy, chỉ những kết quả phân tích ban đầu mới cho kết quả gần đúng nhất,
tránh được những rắc rối liên quan đến biến tính enzyme, giảm cơ chất và ức chế bởi sản phẩm tạo
thành. Cần lưu ý là tốc độ phản ứng xúc tác trước tiên phụ thuộc vào nồng độ enzyme, vào cofactor,
pH, nhiệt độ và lực ion.
Hình 5.4: Diễn tiễn động học phản ứng xúc tác bởi enzyme
5.2.2 Xác định họat tính enzyme
Thông thường có 2 cách tiếp cận: Thứ nhất là xác định theo nồng độ enzyme trong mẫu phân tích.
Trong trường hợp này, tốc độ phản ứng sẽ tỷ lệ với nồng độ của enzyme. Theo trình bầy ở trên, quan hệ
tuyến tính chỉ xẩy ra giữa tốc độ ban đầu của phản ứng và nồng độ enzyme. Để tạo điều kiện trên, thì
nồng độ cơ chất, cofactor... phải dư thừa. Dung dịch phản ứng không được chứa chất ức chế. Giá trị pH,
nhiệt độ và lực ion là tối ưu. Ở điều kiện này đường biểu thị họat độ phản ứng xúc tác (µmol sản phẩm
tạo thành trong 1 phút), phụ thuộc vào nồng độ enzyme là đường thẳng và có thể sử dụng để xác định
nồng độ enzyme họat động trong dung dịch phân tích.
Thứ hai là phân tích động học enzyme thông qua xác định Km, Vmax và đặc điểm ức chế. Trong
trường hợp này, tùy theo yêu cầu cụ thể sẽ có những kịch bản khác nhau. Nếu cần xác định Km đối với
cơ chất, thì phải xác định tốc độ ban đầu của phản ứng. Lúc này phải cho một lượng enzyme không
đổi xúc tác (ủ) với các nồng độ cơ chất khác nhau và sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk. Hoặc xác định
trực tiếp Km và Vmax trên đồ thị parabol. Nếu phản ứng có sự tham gia của 2 hay nhiều hơn cơ chất, thì
mỗi cơ chất phải được đánh giá độc lập. Có nghĩa là chỉ thay đổi nồng độ của 1 cơ chất, trong khi các
yếu tố khác không đổi.
Tóm lại, nghiên cứu động học enzyme là việc xác định tốc độ ban đầu của phản ứng với điều
kiện chỉ 1 yếu tố (cơ chất, enzyme, factor) thay đổi trong khi tất cả các yếu tố còn lại không đổi.
5.3 ENZYME TYROSINASE
Tyrosinase có 2 họat tính: oxyhóa monophenol (tạo gốc – OH trên monophenol) và oxyhóa o-
diphenol (làm cho vết thương quả bị thâm). Ở động vật tyrosinase xúc tác chuyển Tyr thành Melanin,
làm da có mầu nâu-đen khi tia UV kích thích chiếu vào da.
Tyrosinase nấm sợi cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị, chứa 4 Cu+ , có MW 128.000 Da. Enzyme có 2
tâm gắn cơ chất phenolic và phân tử O2. Ion Cu+ gắn với tâm gắn O2. Do vậy, những chất tạo phức
với Cu (azide, cyanide, phenylthioyrea và cysyeine) đều ức chế tyrosinase.
5.3.1 Nội dung thí nghiệm
Có nhiều kịch bản khảo sát động học tyrosinase.

Nhưng thông dụng hơn cả là khảo sát tyrosinase oxyhóa
DOPA, tạo dopachrome có peak hấp thu ở 475 nm. 2 cơ chất
cần cho phản ứng là O2 và DOPA. Do O2 trong dung dịch
thí nghiệm luôn ở trạng thái bão hòa, nên tốc độ phản
ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ DOPA.
Thời gian cần để khảo sát nồng độ tyrosinase phù hợp

cho thí nghiệm kéo dài khỏang 15 phút, để khảo sát động
học kéo dài 1 giờ, để xác định Km kéo dài 2 giờ và khảo sát
ức chế cần 2 giờ.
5.3.2 Các bước tiến hành
A. Xác định nồng độ tyrosinase bằng cách đo OD dung

dịch tyrosinase ở 280 nm. Đối với tyrosinase hệ số hấp phụ
mol E = 24,9. Do A = Elc (A - độ hấp phụ, E – hệ số hấp
thu, c – nồng độ và l – chiều dài cuvette).
Do vậy, A = E lc , nếu l = 1cm (thường là như Hình 5.5: Enzyme tyrosinase oxyhóa
tyrosine và DOPA tạo dopachrome
vậy), và c = 1%, thì dựa vào c1/A1 = c2/A2 (c1 – nồng độ tyrosinase chuẩn, là 1%, A1 – là E = 24,9.
Còn c2 nồng độ tyrosinase chưa biết và A2 – độ hấp thu của dịch tyrosinase chưa biết).
Tương quan trên giúp chuyển nồng độ % về nồng độ tyrosinase mg/ml.
B. Tìm nồng độ tyrosinase để khảo sát động học: Điều này rất quan trọng vì nếu nồng độ thấp quá,
thì sự khác biệt sẽ quá nhỏ. Còn nếu nồng độ lớn quá, thì đường động học uốn cong quá sớm, vì cơ chất
hết nhanh. Nên quan trọng là chọn được nồng độ tối ưu. Đối với dopachrome, nên chọn nồng độ
tyrosinase cho độ hấp thu tuyến tính ở 475 nm trong 3 phút.
Ta làm như sau: Cho đệm phosphate và L-DOPA vào cuvette (theo bảng)
Trộn đều bằng cách dùng giấy bạc bịt đầu cuvette, lộn ngược cuvette, không được lắc, để tránh tạo
bọt làm biến tính tyrosinase. Nếu có máy tự ghi, thì điều chỉnh tòan bộ thang ghi về giá trị 1 đơn vị và
điều chỉnh kim ghi về 0 hay 0,1. Chọn tốc độ băng ghi 1-2 cm/phút. Để xác định đường nền, cho tự ghi
3 phút. Sau đó bổ sung tyrosinase, trộn đều như mô tả ở trên. Đánh dấu thời điểm bổ sung tyrosinase.
Bật máy tự ghi trong 3 phút. Dùng thước kẻ vạch đường thẳng trên giấy tự ghi, xem có tuyến tính trong
3 phút hay không?. Xác định khỏang thời gian dài nhất của độ tuyến
tính và tính giá trị trung bình của A/phút, trên tòan bộ khỏang tuyến tính. Nếu có
đọan nền blank xuất hiện (khi chưa cho tyrosinase vào), thì phải tính A/phút nếu có và trừ bớt đi tốc
độ xúc tác phản ứng.
Nếu không có máy tự ghi, thì cũng làm như trên. Nhưng phải đo OD mỗi 30 giây. Vào thời điểm bổ
sung tyrosinase, bấm đồng hồ giây và đo OD mỗi 30 giây trong 3 phút. Dựng đồ thị trên giấy họa đồ
gồm các điểm giá trị OD theo thời gian. Tính
A/phút trong khỏang tuyến tính. Tương tự cũng dựng đồ thị A/phút cho đọan blank.
Nếu lớn hơn 5%, thì phải trừ bớt ra khỏi giá trị A/phút của phản ứng.
Lặp lại thí nghiệm trên với các nồng độ khác của tyrosinase. Nếu giá trị nhận được
(A/phút của enzyme - A/phút của blank) mà nhỏ hơn 0,03, thì phải tăng gấp 2 lần nồng độ enzyme.
Nếu lớn hơn 0,3/min, thì giảm ½. Xác định 5 nồng độ enzyme khác
nhau. Nên chọn nồng độ enzyme ứng với mức A/phút trong khỏang 0,025/min đến
0,25/min.
Để tiện lợi, nên chuyển A/phút về µmol/phút (µmol sản phẩm tạo thành). Như vậy ta có c =
A/El (A – sự thay đổi OD trong 1 phút, l = 1, còn E – hệ số hấp thu mol
của dopachrome, trong trường hợp này là 3600/M-1 cm-1, c – nồng độ sản phẩm. Có nghĩa là sự thay
đổi độ hấp thu của 1 mol dopachrome trong 1 phút là 3600.
molar = A/3600M-1cm-1 . 1cm = 3600
Chuyển kết quả đo về mol sản phẩm trong 1 phút và trong 1 lít bằng cách lấy
A/phút chia cho 3600. Thí dụ A/phút là 0,1, ta sẽ tính được c = A/phút/El =
0,1/phút/3600M-1cm-1 = 2,78 . 10-5 M/phút . Chuyển về nồng độ mol ta có 2,78x10-5
M/phút x lít x 0,003 lít = 8,33 . 10-8 M/phút = 8,33 . 10-2 µmol/phút.
Thêm 1 cột điền các giá trị µmol/phút, để tính tốc độ phản ứng tương quan với từng nồng độ
enzyme. Dựng đồ thị với trục tung là µmol/phút, còn trục hòanh là nồng độ enzyme (mg) cho từng nồng
độ. Vẽ đường thẳng đi qua nhiều điểm nhất có thể. Đường đồ thị giúp định lượng nồng độ chưa biết
của enzyme, đồng thời giúp chọn nồng độ enzyme để nghiên cứu động học.
C. Xác định Km của L-DOPA và D-DOPA
Sau khi xác định được nồng độ enzyme phù hợp. Để xác định Km của L-DOPA làm như phần B,
chỉ thay đổi nồng độ L-DOPA (vì nồng đô L-DOPA trong phần B là bão hòa, tất cà tâm họat động
của enzyme đều gắn L-DOPA, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ tyrosinase). Trong
phương án C, nồng độ L-DOPA thay đổi từ thấp đến bão hòa.
Chọn nồng độ tyrosinase để thuận tiện tính tóan tốc độ phản ứng ở mức độ bão
hòa L-DOPA, sao cho đạt giá trị trong khỏang 0,10-0,15 A/phút. Lập bảng số liệu cho 5 thử
nghiệm. Tổng thể tích cho mỗi thí nghiệm vẫn không đổi là 3 ml. Do thể
tích enzyme trong cả 5 thí nghiệm không đổi, chỉ thay đổi thể tích của đệm và L-
DOPA. Khuyến cáo thể tích bổ sung của L-DOPA trong thí nghiệm này là: 0,10, 0,20,
0,40, 0,80, 1,0 và 1,5 ml (ở phương án B thể tích của L-DOPA luôn là 1,5 ml). Tiến hành như trong
phương án B. Bổ sung enzyme sau cùng, sau khi xác định được tốc độ đường nền “blank rate” cho mỗi
thử nghiệm (có 5 thử nghiệm tất cả). Nếu nồng độ L- DOPA khuyến cáo chưa tạo được độ bão hòa, thì
phải tăng nồng độ L-DOPA.
Dựng đồ thị phụ thuộc độ hấp thu A đối với thời gian thí nghiệm. Tính A/phút đối với từng nồng
độ L-DOPA, để xác định Km đối với L-DOPA. Lặp lại các bước tương tự
đối với D-DOPA. Tính A/phút đối với từng nồng độ D-DOPA.
Thực hiện như sau: Lập bảng nồng độ L-DOPA cho từng thử nghiệm đối với
A/phút. Chuyển tất cả A/phút thành µmol/phút giống như trên. Dựng đồ thị
Michaelis (µmol/phút đối với [S]) hoặc 1/ µmol/phút đối với 1/[S]) theo Lineweaver- Burk. Xác định
Km và Vmax. Thí dụ đường thẳng cắt trục tung ở 0,02, có nghĩa là Vmax = 1/0,02 = 50 µmol/phút. Cắt
trục tung ở -0,67 thì Km = 1/0,67 = 15 µmol.
Lưu ý: Một số enzyme xúc tác khác nhau đối với đồng phân D và L của cơ chất. Dạng tự nhiên của
DOPA là L. Do vậy trong trường hợp này, có thể enzyme xúc tác L- DOPA dễ hơn so với D-DOPA.
D. Khảo sát họat tính ức chế tyrosinase
Nên xác định họat tính ưc chế enzyme ngay sau khi xác định Km. Họat độ tyrosinase trong trường
hợp sử dụng hay không sử dụng chất ức chế, không được khác biệt nhiều. Nếu không tiến hành xác
định ngay, thì trước khi xác định họat tính ức chế, cần xác định lại Km.
Dựng bảng giống như trong phương án B. Chất ức chế phải bổ sung vào trước enzyme. Chọn nồng
độ tyrosinase sao cho tốc độ xúc tác A/phút khỏang 0,2. Thay
đổi nồng độ L-DOPA như ở mục C. Bổ sung 1 lượng ổn định chất ức chế (thiourea hoặc cinnamic
acid), mà nồng độ phù hợp của chúng trước đó được dò tìm bằng cách “thử và sửa”.
Bổ sung tyrosinase, trộn đều và đo A 475nm trong 3 phút. Dựng đồ thị A 475 phụ thuộc thời gian.
Tính A/phút cho từng thử nghiệm. Dựng đồ thị Lineweaver-Burk đối
với từng thử nghiệm ức chế. Mỗi đồ thị gồm 2 đồ thị tương ứng với có và không có
chất ức chế. Chuyển đổi tất cả số liệu A/phút thành µmol/phút và tính giá trị đảo ngược của nó đối với
1/mmol cơ chất.
5.3.3 Phân tích kết quả
A. Xác định nồng độ tyrorinase
Nếu dung dịch chứa tyrosinase đồng nhất, thì có thể xác định nồng độ tyrosinase bằng cách đo độ
hấp thu A ở 280 nm. Biết hệ số hấp thu mol của dung dịch tyrosinase 1% tinh khiết E = 24,9.
Theo định luật Beer’s A = Elc (A – độ hấp thu, E – hệ số hấp thu mol và l – bề rộng cuvette, thường là
1 cm) và theo tương quan c1/A1
= c2/A2 (c1 = 1%, A1 = 24,9, A2 = giá trị hấp thu đo được), ta tính được c2. Chuyển đổi giá
trị tính được ở dạng w/v% về mg tyrosinase/ml.
B. Xác định nồng độ tyrosinase phù hợp để phân tích động học
Lập bảng tương quan giữa tốc độ xúc tác (A/min) và nồng độ enzyme (mg/ml). Chuyển A/min về
đơn vị phù hợp hơn là µmol/min dựa vào công thức Beer’s: c = A/El (A – là sự thay đổi độ hấp
thu trong 1 phút, E – hệ số hấp thu của 1 mol sản
phẩm dopachrome – 3600/Mxcm, c- nồng độ sản phẩm tạo thành). Có nghĩa là sự thay đổi độ hấp
thu của 1 mol dopachrome trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm trên sẽ là 3600.
Chuyển đổi kết quả phân tích về mol sản phẩm tạo thành trong 1 phút/lít bằng cách lấy từng giá
trị A/min chia cho 3600. Thí dụ A/min = 0,1 chuyển về µmole sản
phẩm tạo thành sẽ là: c = A/min/3600 M-1cm-1 cm = 2,78x10-5 M/min. Chuyển đổi tiếp về
mol/min sẽ là 2,78x10-5 mole/lit. min x 0,003 lit = 8,33x10-8 mole/min. Đổi
về µmol/min ta nhận được c = 8,33 x 10-2 µmol/min. Lập thêm cột µmol sản phẩm/phút và
tính tốc độ xúc tác của từng nồng độ enzyme. Dựng đồ thị với trục
tung y là µmol/min và trục hòanh x là nồng độ enzyme trong từng thử nghiệm. Dựng parabol đi qua
điểm đầu và nhiều điểm sau nhất có thể.
C. Xác định Km của L-DOPA và D-DOPA
Các bước xác định Km đối với D-DOPA cũng tương tự như xác định đối với L-DOPA.
D. Ức chế họat tính tyrosinase
Dựng đồ thị Lineweaver-Burk đối với từng thí nghiệm ức chế theo 1/vo và 1/[S]. Bao gồm 2 đường
đồ thị tương ứng với trường hợp không có và có chất ức chế. Dựa vào đồ thị để xác định kiểu ức chế.
5.3.4 Đơn vị họat tính của enzyme
Các phương pháp xác định họat tính xúc tác của enzyme thường theo nguyên tắc chung sau: hoặc
xác định số lượng sản phẩm hình thành tăng theo thời gian hoặc xác định sự giảm số lượng cơ chất theo
thời gian phản ứng. Do vậy tùy thuộc vào cơ chất và điều kiện tiến hành phản ứng, người ta sẽ xây dựng
phương pháp cụ thể, phù hợp đối với từng enzyme riêng biệt. Ngòai ra, mỗi nhà sản xuất lại bổ sung
đặc thù riêng đối với sản phẩm enzyme của mình. Do vậy, rất khó so sánh họat tính enzyme kỹ thuật từ
các nguồn cung cấp khác nhau. Do vậy, đối với mỗi nhóm enzyme đều có một số cách thể hiện đơn
vị họat tính.
Protease
- AU: 1 đơn vị Anson (Anson unit) sử dụng cơ chất hemoglobin ở pH 4,7 (có thể ở
pH 5,0 và 7,5.
- BAPA: 1 đơn vị BAPA Na-benzoyl-L-arginine-p-nitranilide là số lượng protease cần để chuyển

hóa 1 µmol cơ chất trong 1 phút ở điều kiện chuẩn.
- NU: 1 đơn vị Northrop (NU) là số lượng protease cần thiết để thủy phân 40% của 1 lít dịch casein
trong 60 phút ở điều kiện chuẩn.
- PU: 1 đơn vị PU là số lượng protease cần thiết thủy phân giải phóng các phân đọan peptide từ
casein tương đương 1µg tyrosine trong 1 phút, ở 30oC, ở điều kiện chuẩn.
Carbohydrase
- DPo là đơn vị biểu hiện năng lực tạo đường (degrees of diastatic power) là số lượng enzyme
có trong 0,1 ml dịch 5% enzyme tạo ra lượng đường khử trong 100 ml dịch tinh bột 1% ở 20oC
trong 1 giờ, có khả năng khử 5 ml dịch Fehling.
- DU: 1 đơn vị tạo dextrin (dextrinogen unit) là số lượng enzyme xúc tác chuyển hóa
1 mg tinh bột thành dextrin ở điều kiện chuẩn : dịch chứa 1,2% tinh bột tan, đệm
acetate pH 5,7, thời gian 10 phút, ở 30oC.
- SKB-U: 1 đơn vị SKB biểu thị số lượng amylase thủy phân 1 g ß-limit dextrin đến điểm mất màu
iod trong 1 giờ ở điều kiện chuẩn. Có thể thay ß-limit dextrin bằng dịch tinh bột tan.
Pectinase
- PG-U: 1 đơn vị polygalacturonase biểu hiện họat độ enzyme cần thiết làm giảm độ nhớt của dịch
pectin chuẩn có giá trị 1/ = 0.000015, ở điều kiện chuẩn.
Cellulase
- 1 đơn vị cellulase CU, là số lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol glucose từ dịch 1,5%
carbomethylcellulose (CMC) ở 30oC, pH 4,5. Xác định đường khử bằng phương pháp so màu
sử dụng chỉ thị p-hydroxybenzoic acid.
- 1 đơn vị xylanase Xyl-U là số lượng enzyme cần thiết để giải phóng lượng đường khử tương đương
1 mmol xylose trong 1 phút, từ dịch xylan, ở 30oC, ở điều kiện chuẩn.
Oxidase
- 1 đơn vị glucose oxidase GO-U giải phóng 1 µmol H2O2 trong 1 phút ở 25oC, pH
7,0 (ICN Biomedicals, Inc., 1996)
- 1 đơn vị glucose oxidase GO-U là số lượng enzyme cần thiết để oxyhóa 1 µmol ß- D-glucose trong
1 phút, ở 25oC, pH 4,1 (Calbiochem-Novabiochem, 1996)
Catalase
- 1 đơn vị Baker BU là số lượng catalase (catalase từ nấm fungal) phân rã 264 mg

H2O2 ở điều kiện phản ứng.
- 1 đơn vị catalase CaU (Phương pháp của Nhật), là số lượng catalase phân rã 1 mmol
H2O2 trong 1 phút, ở 30oC chuần độ theo iodine thiosulfate theo Stellmach, 1988).
Lipase
- 1 đơn vị lipase là số lượng enzyme lipase cần thiết để tạo lượng acid xác định bằng
pH-stat.
Tuy có nhiều lọai đơn vị họat tính enzyme được sử dụng, có tính đặc thù cho từng trường hợp cụ
thể, người ta vẫn thường quy chúng về đơn vị họat tính quốc tế gọi là IU (international unit). 1 IU là
lượng enzyme xúc tác biến đổi 1 µmol cơ chất, trong 1 phút, ở 25oC, ở điều kiện tối ưu cơ chất và pH.
Vào năm 1972, Uy ban quốc tế về enzyme khuyến cáo sử dụng đơn vị họat tính mới catal (hay cat),
là lượng enzyme xúc tác biến đổi 1 M cơ chất trong 1 giây. Đây là đơn vị họat tính rất lớn, nên thực tế
người ta hay dùng µcat hay nanocat. Tương quan giữa đơn vị cũ và mới như sau: 1 cat = 6.107 IU.
Họat tính riêng của enzyme là tỷ lệ tổng số đơn vị họat tính trên 1 mg protein. Trong quá trình thu
nhận và tinh chế enzyme (hay protein nói chung), người ta phải xác định họat tính riêng của enzyme sau
từng bước thu nhận và tinh chế. Vì nó là thông số đánh giá mức độ tinh sạch enzyme. Họat tính riêng
của chế phẩm enzyme càng cao, thì enzyme càng tinh sạch.
5.3.5 Đánh giá các bước tinh chế enzyme
Quá trình thu nhận và tinh chế enzyme thường trải qua các bước, từ thu nhận dịch enzyme thô sau
khi phá tế bào, đến tủa phân đọan chứa enzyme đích và cuối cùng là việc tinh chế làm sạch enzyme
bằng các cách tiếp cận khác nhau, nhưng chủ yếu là
bằng phương pháp sắc ký. Cuối cùng kiểm tra độ tinh sạch enzyme và xác định MW của enzyme bằng
điện di hay lọc gel. Để đánh giá hiệu quả của quá trình trên, thông thường người ta dựa vào họat tính
riêng của enzyme.
Thí dụ minh họa:
Đánh giá các bước tinh sạch enzyme do E.coli sinh ra. Giải thích cơ sở khoa học và kết quả của các
bước tinh sạch theo thứ tự trình bầy trong bảng. Làm thế nào để khẳng định enzyme sau bước tinh sạch
thứ 6 là sạch hòan tòan?
Protein tổng Đơn vị họat tính

Các bước tinh sạch
(mg) (IU)
1. Dịch thô 20.000 4.000.000
2. Tủa muối 5.000 3.000.000
3. Thẩm tích 4.000 1.000.000
4. Sắc ký trao đổi ion 200 800.000
5. ắc ký ái lực 50 750.000
6. Sắc ký lọc gel 45 675.000
TÓM TẮT
Trong bài này, sinh viên viên làm quen và hiểu được bản chất của cơ chế xúc tác bởi enzyme: Bản
chất xúc tác là nhờ cấu trúc 3 D của một số mạch bên gốc amino acid tạo nên tâm họat động của
enzyme, cho phép giảm năng lượng họat hóa của phản ứng do nó xúc tác. Điều này đạt được nhờ
sự hình thành liên kết và tương tác yếu hình thành giữa enzyme và cơ chất.
Tiếp theo trình bầy cách thức thiết kế thí nghiệm phân tích động học enzyme. Trang bị cho
sinh viên kiến thức cơ bản về động học phản ứng do enzyme xúc tác, các giá trị động học cần phải biết
và cách thức tiến hành thí nghiệm xác định các giá trị này. Trong đó quan trọng hơn cả là Km và Vmax.
Có một số cách tiếp cận để xác định
2 giá trị trên. Nhưng phổ biến hơn cả là phương pháp đồ thị dựa vào đường parabol động học của
phản ứng enzyme xúc tác và đồ thị tuyến tính Linerweaver-Burk.
Quan trọng hơn cả là sinh viên phải nắm được các bước tíến hành nghiên cứu động học tyrosinase,
bao gồm từ xác định Km và Vmax, đến xác định động học ức chế phản ứng do tyrosinase xúc tác.
Các kiến thức này sẽ trang bị cho sinh viên cơ sở lý thuyết để nghiên cứu động học các enzyme khác.
Phần cuối giáo trình trình bầy khái niệm về đơn vị họat tính của enzyme và việc đánh giá các bước
tinh sạch enzyme thông qua xác định tỷ lệ giữa tổng họat tính của enzyme và số mg protein trong chế
phẩm enzyme.
Câu 1: Hạt ngô non mới hái có vị ngọt do hàm lượng đường cao. Tuy nhiên để vài ngày vị ngọt
giảm, vì khỏang 50% đường tự do trong hạt sẽ chuyển hóa thành tinh bột ngay trong ngày hái đầu
tiên. Để giữ bắp ngô còn ngọt, người ta ngâm bắp ngô non mới hái vào nước sôi vài phút. Sau đó làm
lạnh trở lại bằng cách ngâm vào nước. Xử lý như vậy làm bắp ngô giữ được ngọt. Giải thích cơ sở khoa
học của xử lý trên?.
Câu 2: Giả sử tế bào vi khuẩn chứa khỏang 1.000 enzyme khác nhau trong tế bào chất và mỗi
protein có MW khỏang 100.000. Coi tế bào vi khuẩn có hình trụ với đường kính 1,0 µm, cao 2,0
µm, tỷ trọng của dịch tế bào chất là 1,20 và protein tan trong dịch chiếm khỏang 20% trọng lượng.
Xác định nồng độ mol trung bình của từng enzyme?
Câu 3: Enzyme hexokinas bị mất họat tính khỏang 50% khi ủ ở 45oC trong 12 phút. Tuy nhiên khi ủ
với sự có mặt của một trong số cơ chất của nó, thì chỉ mất có 3% họat tính. Giải thích hiện tượng
trên, và đề xuất giải pháp ứng dụng?.
Câu 4: Định lượng enzyme lactatedehydrogenase bằng cách dựa vào phản ứng:
Pyruvate + NADH + H+  Lactate + NAD+
Dung dịch NADH (không phải NAD+), hấp phụ mạnh ở bước sóng 340 nm. Điều này cho phép
xác định được nồng độ NADH trong dung dịch bằng đo độ hấp phụ ánh sáng bước sóng 340 nm. Giải
thích làm cách nào dựa vào kết quả trên để xác định được nồng độ lactatedehydrogenase?.
Câu 5: Trong bảng là tốc độ ban đầu của phản ứng xúc tác bởi enzyme tương ứng với nồng độ cơ chất.
Sử dụng phương pháp đồ thị để xác định Km và Vmax?.
Vo (µmol/min) 130 116 87 63 30 10

[S] (mol/lít) 65x10-5 23x10-5 7,9x10-5 3,9x10-5 1,3x10-5 0,37x10-5
95 BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG PHỔ 95
BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
QUANG PHỔ
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của phương pháp phân tích quang phổ;
- Biết được nguyên lý họat động của các thiết bị quang phổ thông dụng;
- Nắm bắt được nguyên lý xác định nồng độ sinh chất bằng cách đo OD;
- Áp dụng được các phương pháp xác định protein trong dung dịch;
- Nắm được nguyên lý họat động và ứng dụng của quang phổ hùynh quang.
Thông thường việc phân tích các phân tử họat chất sinh học sử dụng các thiết bị đo tương tác của
chúng với trường phát xạ điện từ tự nhiên. Trong đó việc phân tích các phân tử sinh học dựa vào tính
tán xạ và hấp phụ ánh sáng là phổ biến nhất. Ở mức độ cao hơn, người ta phát triển tiếp kỹ thuật phân
tích khả năng phát quang của một số nhóm chất bằng đo quang phổ hùynh quang. Để nghiên cứu cấu
trúc phân tử sinh chất, người ta sử dụng các trường phát xạ điện từ mạnh hơn, đặc hiệu hơn, trong kỹ
thuật phân tích nhiễu xạ tia X hay trong phân tích công hưởng từ hạt nhân NMR.
6.1 NGUYÊN LÝ HỌAT ĐỘNG CỦA THIẾT BỊ

QUANG PHỔ
6.1.1 Khái niệm chung
Có nhiều phương pháp đo độ hấp phụ quang học, còn gọi là đo tỷ trọng quang OD (optical density)
của dịch chứa sinh chất. Trong đó các phương pháp đo OD vùng UV (180-350 nm), vùng ánh sáng khả
kiến (350-800 nm) và phương pháp đo huỳnh quang là được sử dụng rộng rãi hơn cả.
Phương pháp đo OD vùng ánh sáng khả kiến và tử ngoại, dựa theo theo nguyên tắc là khi hạt
photon ánh sáng tương tác với phân tử sinh chất sẽ kích họat chuyển phân tử sinh chất từ trạng thái cơ
bản, lên trạng thái kích động. Sự hấp phụ này có tính đặc hiệu đối với từng nhóm phân tử sinh chất theo
độ dài bước sóng. Dựa vào đó có thể tiến hành cả định tính và định lượng họat chất sinh học nói trên.
Việc xác định OD vùng khả kiến có thể thực hiện nhờ máy so mầu và máy quang phổ kế.
Hình 6.1: Sơ đồ máy đo quang phổ đơn sắc thông thường
Máy so mầu, là thiết bị đo độ hấp phụ (đo giá trị OD), của sinh chất không theo từng bước sóng (như
ở máy quang phổ), mà theo vùng phổ ánh sáng. Các vùng phổ này được tạo bởi bộ lọc ánh sáng (light
filter). Sắp xếp theo thứ tự giống như mầu sắc cầu vồng, khi ánh sáng trắng bị phân tách thành 7
vùng mầu cơ bản. Thường máy so mầu có độ nhậy không cao, chỉ nên sử dụng cho phân tích có tính
định tính. Xác định OD theo bước sóng có độ nhậy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với so mầu.
Máy quang phổ kế có chứa bộ tạo ánh sáng đơn sắc (monochromator) có nhiệm vụ chọn từ tập hợp
phổ liên tục các sóng ánh sáng có bước sóng khác nhau trong ánh sáng trắng, tia sáng có bước sóng đặc
thù dùng cho phân tích, gọi là tia sáng đơn sắc. Trong các thiết bị cũ, bộ monochromator là lăng kính
(prism) tạo từ khối tinh thể silica có độ tinh khiết rất cao. Anh sáng từ nguồn sáng sẽ bị lăng
kính phân tách thành nhiều tia sáng đơn sắc. Sau khi tia ánh sáng đơn sắc đi qua khe sàng lọc, thấu kính
và lọc sáng, sẽ được tập trung hơn, sạch hơn và hướng đến mẫu đích nằm trong cuvette. Các máy quang
phổ hiện đại trang bị cảm biến tia diode họat động theo nguyên lý khác: Anh sáng đa sắc từ nguồn sáng
trước tiên đi qua cuvette đựng mẫu cần đo OD. Sau cuvette ánh sáng sẽ được tập trung vào khe để
đi vào bộ cách tử
(grating), có nhiệm vụ tách ánh đa sắc thành ánh sáng đơn sắc (độ phân tách mạnh hơn nhiều so với
prism) và hướng vào diode tia. Do sự sắp xếp nguồn mẫu và bộ cách tử trong trường hợp này ngược với
cách truyền thống, nên thiết kế này đôi khi còn được gọi là quang ngược (reversed optics).
Để tạo nguồn UV (200-340 nm), người ta sử dụng đèn áp suất hydrogen hay đèn deuterium. Còn
nguồn sáng khả kiến (340-800 nm), thì dùng đèn tungsten-halogen bình thường. Thường máy quang phổ
sử dụng cả hai nguồn sáng này.
Hình 6.2: Sơ đồ quang học quang phổ kế diode tia
Dịch mẫu đo OD được đựng trong buồng đo gọi là cuvette. Có nhiều lọai cuvette đắt rẻ khác
nhau, sử dụng cho các mục đích khác nhau. Rẻ nhất là cuvette thủy tinh, không dùng được ở vùng ánh
sáng tử ngọai (UV), vì thủy tinh hấp thu tia UV. Chỉ dùng ở vùng ánh sáng khả kiến có bước sóng
lớn hơn 340 nm. Cuvette thạch anh (quartz) hoặc silica nóng chẩy (NIR) sử dụng tốt cả vùng UV và
khả kiến. Ngòai ra
còn có cuvette bằng nhựa, cuvette bằng polymethacrylate, dùng cho vùng phổ 280-
800 nm. Cuvette bằng polystyrene dùng cho phổ 350-800 nm.
6.2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ SINH CHẤT
Theo định luật Beer-Lambert thì sự hấp phụ ánh sáng của chất tan tỉ lệ thuận với nồng độ của nó
trong dung dịch. Do vậy người ta có thể xác định nồng độ chất tan nếu như biết được hệ số hấp phụ
ánh sáng của nó theo công thức A = lc
A = giá trị OD đo được của mẫu + dung môi - giá trị OD của dung môi. Trong đó
A = -log I/Io. Io là cường độ tia sáng đi vào cuvette, I là cường độ tia sáng đ ra khỏi
cuvette.  - là hệ số hấp phụ mol, giá trị này thường có trong sách tra cứu. l – là độ dài tia sáng đi
qua cuvete, thường là 1 cm và c – nồng độ chất tan
Người ta thường xác định nồng độ chất tan theo đường chuẩn và chỉ xác định nồng độ chất tan ở giá
trị OD, nằm trong khỏang tuyến tính với nồng độ trên đường chuẩn. Thường khỏang tuyến tính hình
thành ở nồng độ chất tan thấp. Để xác định hàm lượng protein trong dịch người ta rất hay sử dụng
globulin máu bò làm đường chuẩn.
Hình 6.3: (A) - Các bộ phận của cuvette do hãng VWR Scientific sản xuất; (B) – Cuvette
chuẩn 3 ml do hãng Beckman sản xuất và (C) – Đặc tính truyền quang của một số cuvette phổ
biến: A – thạch anh (silica); B – NIR silica; C
– polymethacrylate; D – polystyrene và E – thủy tinh
Phương pháp Bradford để xác định nồng độ protein trong dung dịch rất hay được sử dụng. Trong
đó dịch chứa protein ở nồng độ khác nhau sẽ tạo mầu với chất mầu Coomassie. Trong quá trình thực
hiện, người ta cho dịch protein chưa biết nồng độ phản ứng với chất tạo mầu Coomassie. Sau đó đo OD
ở 595 nm. So sánh kết quả OD đo được với OD đường chuẩn của dịch protein đã biết nồng độ, sẽ biết
nồng độ của dịch protein cần xác định.
Protein (µg) A595 nm

15 0,07
25 0,15
50 0,28
100 0,55
150 O,90
ml dịch protein chưa biết nồng độ ml 0,10
dịch protein chưa biết nồng độ 0,22
Hình 6.4: Đường hấp phụ sử dụng globulin máu bò trong

phương pháp Bradford
Ta thấy từ đồ thị đường chuẩn, giá trị A (hay OD) ở 595nm là 0,22 tương ứng 44
µg protein trong dịch 0,20 ml. Điều này cho biết nồng độ protein trong dịch protein ban đầu sẽ là
khỏang 200 µg/ml hay 0.20 mg/ml. Hiện đã có những phần mềm giúp tính tóan độ nghiêng của đường
chuẩn, điểm cắt đồ thị cũng như các hệ số điều chỉnh khác.
Hình 6.5: Phổ hấp phụ của NADH ở 350 nm và của NAD+ ở 270 nm
Ngòai việc sử dụng để xác định nồng độ sinh chất, phương pháp quang phổ còn được sử dụng để
định danh phân tử sinh chất chưa biết. Về nguyên tắc, nhiều sinh chất tự nhiên chứa các nhóm chức
năng tạo màu có phổ xác định. Dựa vào vị trí và độ lớn của các phổ này ta có thể định danh được tên
chất. Thí dụ điển hình là dựa vào phổ hấp phụ của NADH ở 350 nm và của NAD+ ở 270 nm để đánh
giá sự có mặt của chúng trong các phản ứng oxyhóa khử.
Những chú ý khi sử dụng máy đo quang phổ: Phương pháp quang phổ nhanh, dễ thao tác. Tuy
nhiên cần lưu ý:
- Anh hưởng của độ đục hoặc mẫu có mầu sữa rất thường gặp khi chiết tách mẫu sinh học. Độ
đục làm ánh sáng tán xạ. Do vậy đối với các mẫu không thể khắc phục được hiện tượng trên,
cần phải làm trong dịch bằng cách lọc hoặc ly tâm.
- Một số chất, hoặc dung dịch chất tan, ở nồng độ cao thường không tuân thủ định luật Beer –
Lambert. Do vậy chỉ tiến hành xác định OD của chúng trong dịch pha loãng, có nồng độ thấp.
- Cuvette phải sạch, đặc biệt 2 mặt cạnh nơi tia ánh sáng đi qua. Chỉ được cầm 2 mặt bên, tốt nhất
lót tay bằng giấy mềm.
6.3 QUANG PHỔ HÙYNH QUANG
Quang phổ hùynh quang họat động theo nguyên lý: Một số phân tử sinh chất sau khi hấp phụ ánh
sáng, sẽ chuyển từ trạng thái ổn định, sang trạng thái kích thích không bền. Sau một khỏang thời gian
rất ngắn (cỡ phần triệu giây), các phân tử này lại quay về trạng thái ban đầu, kèm theo sự phát ra ánh
sáng khá yếu, có bước sóng dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích. Ánh sáng này gọi là ánh sáng
huỳnh quang.
Hình 6.6: Biểu đồ mức năng lượng cuả quá trình phát huỳnh quang
Hai yếu tố ảnh hưởng đến cường độ phát hùynh quang. Yếu tố nội tại phụ thuộc vào mức độ
chuyển giữa trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích của từng phân tử sinh chất riêng biệt. Yếu tố bên
ngoài là do cấu hình phân tử, do tương tác giữa các phân tử nhỏ (ligand) và các đại phân tử như nucleic
acid, protein ….
Máy quang phổ hùynh quang gồm nguồn sáng, 2 bộ tạo ánh sáng đơn sắc, cuvette chứa mẫu đo và
detector. Thiết kế này cũng khá giống thiết kế máy quang phổ hấp phụ , chỉ khác hai điểm. Thứ nhất là
có 2 bộ tạo ánh sáng đơn sắc, một bộ để chọn bước sóng của ánh sáng kích thích, bộ kia là để phân
tích bước sóng hùynh quang phát ra. Thứ hai là bộ detector nằm lệch (thường là 90O) đối với tia sáng
kích họat.
Nguồn ánh sáng kích thích phải mạnh, thường dùng đèn hồ quang xenon phát ánh sáng tử ngoại, khả
kiến và gần hồng ngoại, trong khỏang 200-1.400 nm. Anh sáng được hướng tới bộ tạo ánh sáng đơn sắc
kích thích. Bộ này sau khi chọn, sẽ hướng tia sáng kích thích vào cuvette chứa dịch mẫu gọi là cuvette
huỳnh quang (fluorescence cuvette). Do ánh sáng không đi qua dung dịch mẫu mà đi vuông góc, nên
cuvette thạch anh 2 mặt không phù hợp để sử dụng trong trường hợp này.Trong thực tế người ta sử
dụng cuvette 4 mặt thạch anh, hoặc thuỷ tinh, hoặc ống thuỷ tinh trung tính hình tròn. Anh sáng kích
thích phân tử trong dung dịch phát ánh sáng huỳnh quang đi xuyên qua hệ ánh sáng đơn sắc phát
quang, đã được điều chỉnh về bước sóng được xác định từ trước (sao cho ở đó độ phát huỳnh quang là
maximum). Sau khi qua bộ ánh sáng đơn sắc, cường độ ánh sáng huỳnh quang sẽ được ghi nhận bởi bộ
nhân quang.
Hình 6.7: Sơ đồ thiết bị quang phổ hùynh quang
Hình 6.8: Phổ ánh sáng kích thích (đường liền) và phổ áng sáng hùynh quang
(đường chấm) của tryptophan
Ứng dụng: Hai ứng dụng quan trọng nhất của quang phổ hùynh quang là xác định cường độ phát
quang tương đối (relative fluorescence intensities) và xác định năng suất lượng tử (quantium yield).
Thường xác định độ phát quang tương đối là hay được sử dụng. Trong thực tế, một số phân tử sinh học
tự phát quang (intrinsic fluor), như amino acid chứa vòng phenyl phenylalanine, tyrosine,
tryptophan, Do vậy protein chứa chúng cũng tự phát huỳnh quang. Tương tự, gốc purine, pyrimidine
và một số coenzyme như NAD, FAD cũng có tính chất trên.
Hình 6.9: Một số chất phát mầu hùynh quang
Cũng có phân tử sinh chất không tự phát huỳnh quang, phải cần trợ giúp của chất màu bổ sung vào
dung dịch chứa chúng, gọi là nhóm mầu ngoại (extrinsic fluor). Trong số chất mầu bổ sung phổ biến
hơn cả là 1-anilino-8-naphthalene sufonate (ANS), dansyl chloride, fluorescein dùng cho nghiên cứu
protein. Trong khi ethidium, proflavin và acridine dùng cho nghiên cứu nucleic acid. Đặc biệt ethidium
bromide làm dịch DNA ở dạng xoắn đôi gia tăng độ phát quang, trong khi dịch DNA sợi đơn không
phát quang.
Chú ý, phép đo huỳnh quang nhạy hơn nhiều so với đo phổ hấp phụ, do vậy mẫu đo phải được
chuẩn bị cẩn thận, vì bất cứ sự nhiễm bẩn nào đều có thể làm sai lệch kết quả. Đèn xenon phát ánh
sáng không ổn định, do vậy phải lặp lại phép đo một số lần, đủ để lấy giá trị trung bình. Thiết bị quang
phổ hùynh quang hiện đại khắc phục hạn chế trên nhờ thiết bị tính tương quan giữa ánh sáng huỳnh
quang và ánh sáng kích thích. Dung dịch chuẩn bị phải đựng trong lọ thuỷ tinh nút nhám vách đen
(nâu), bảo quản trong tối, tránh ánh sáng, trước khi sử dụng phải được trộn đều. Ngoài ra, trong tiến
trình thao tác phải giữ nhiệt độ buồng đo không đổi.
Ngòai hai phương pháp đo phổ phổ biến vừa kể trên, còn có phương pháp đo phổ cộng hưởng từ
hạt nhân NMR (nuclear magnetic resonance) và phương pháp khối phổ. Trong phương pháp NMR,
ngưới ta đo năng lượng sóng điện từ phát ra từ hạt nhân phân tử sinh chất tan trong dung dịch, được
đặt trong từ trường. NMR thường được dùng để xác định cấu trúc phân tử. Bản chất của phương
pháp này như sau:
nhân nguyên tử của sinh chất mang điện tích dương (+) và xoay xung quanh trục của nó giống như một
nam châm nhỏ. Khi đặt phân tử sinh chất vào từ trường, thì hướng quay của nhân nguyên tử sẽ theo
hướng song song, hoặc ngược lại với từ trường bên ngòai. Năng lượng ở dạng sóng phát ra sẽ mạnh nhất
ở trạng thái chuyển (trạng thái cộng hưởng), sẽ được ghi nhận làm cơ sở giải thích cấu trúc hóa học của
sinh chất.
Khối phổ MS là phương pháp ghi nhận phổ khối lượng của các ion sinh chất theo gía trị khối
lượng/điện tích (m/z). Để tạo trạng thái ion của sinh chất người ta sử dụng phương pháp tạo ion trên chất
nền gọi là MALDI (matrix-assisted laser desorption) hoặc theo phương pháp phun điện tử (electrospray).
Các ion tạo thành sẽ được phân tích phổ khối lượng trong MS.
6.4 PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG DUNG DỊCH
Để theo dõi và đánh giá các bước tinh sạch protein, cũng như để xác định nồng độ protein trong
dung dịch, người ta sử dụng một số phương pháp xác định nồng độ protein tan trong dung dịch. Trong 5
phương pháp xác định nồng độ protein tan trong dung dịch phổ biến nhất, thì 4 phương pháp dựa vào
phản ứng hoá học, 1 phương pháp dựa vào phép đo quang phổ.
Phương pháp biuret: Peptide và đặc biệt protein chứa từ 2 liên kết peptide trở lên đều có khả năng
tạo phức cho màu mận chín với dịch kiềm chứa CuSO4 nhờ tạo liên kết coordinate còn gọi là liên kết
càng cua giữa nguyên tử N tham gia liên kết peptide với ion Cu+2. Nồng độ của peptide và protein trong
dung dịch tỷ lệ với độ đậm của màu.
Người ta thường sử dụng albumine máu bò BSA (bovine serum albumin) để xây
dựng đường chuẩn và đo giá trị OD ở bước sóng  540 nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc
nước. Một số tác nhân gây cản trở phản ứng là đệm chứa amino acid và
đệm Tris. Phương pháp biuret có ưu điểm, là cho kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau và
dễ dàng thực hiện. Nhược điểm chủ yếu, là độ nhạy của phương pháp thấp (tới khỏang 1 mg).
Phương pháp Lowry: Là phương pháp khá nhạy (đạt tới 5g), tương tự như phương
pháp biuret, nhưng có bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dịch. Dịch màu xanh
dương là do xuất hiện liên kết càng cua giữa nguyên tử N tạo liên kết peptide với Cu+2 và sự khử chất
Folin-ciocalten do amino acid tysosine và tryptophan có mặt trong phân tử protein.
Thứ tự thực hiện giống như khi tiến hành phương pháp biuret, độ nhạy của phương pháp này cao
hơn ~ 100 lần. Tuy nhiên nó cũng bị ảnh hưởng bởi đệm Tris, (NH4)2SO4 ở nồng độ >15%, glycine ở
nồng độ >0,5% và mercaptan. Ngoài ra, do protein có hàm lượng tysosine và tryptophan khác nhau, nên
kết quả sẽ khác nhau..
Hình 6.10: Chất mầu Coomassie
Phương pháp Braford khắc phục hạn chế của 2 phương pháp đầu nhờ sử dụng chất màu gắn
protein (Bradford, 1976, Biorad, 1984). Chất màu Coomassie gắn với protein trong dung dịch có
tính acid, sẽ làm thay đổi đỉnh hấp phụ từ 465 nm của Coomassie lên 595 nm.Thường sử dụng globulin
hoặc albumin máu bò làm protein chuẩn. Phép đo rất tiện vì chỉ sử dụng một loại chất. Màu xuất hiện
trong gần 2 phút
và ổn định trong gần 1 giờ. Độ nhạy của phương pháp cao (đạt tới 1-20 g), đôi khi
nhạy hơn cả phương pháp Lowry. Phương pháp Bradford cho kết quả khác biệt đối với các loại protein
khác nhau. Nó bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của Triton X-100, sodium dodecyl sulfate
Phương pháp BCA (1985) tương tự như phương pháp Biuret và Lowry. Phân tử protein tương tác với
ion Cu+2 tạo ra Cu+1, ion này sẽ tạo phức với bicinchoninic acid làm thay đổi màu táo xanh của BCA,
thành màu mận chín đỏ đo ở bước sóng  = 562
nm. Phương pháp này nhạy tương đương phương pháp Lowry và Bradford. Ưu điểm là nó đơn giản và
không bị Triton và sodium dodecyl sulphate cản trở.
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp đo phổ là dựa vào sự có mặt của các gốc amino
acid tyrosine và tryptophan trong protein hấp thu mạnh tia ánh ở bước sóng  =280 nm. Protein có
hàm lượng tyrosine và tryptophan khác nhau, sẽ cho kết
quả đo khác nhau. Đây là phương pháp đo nhanh và đơn giản. Dịch tế bào chứa nhiều chất cũng hấp thu
ở bước sóng này, sẽ là tác nhân cản trở, trong đó có nucleic acid. Để khắc phục người ta sử dụng tỷ lệ
hấp thu A280/ A260 để xác định hàm lượng protein. Công thức thực nghiệm cho phép xác định hàm
lượng protein trong dung dịch chứa 20% nucleic acid như sau: Hàm lượng protein (mg/ml) = 1,55
A280 – 0,76
A260
Bảng số liệu hấp thu UV của dung dịch chứa hỗn hợp nucleic acid và protein thường có
trong sách tra cứu, cho phép xác định cả hàm lượng protein và nucleic acid trong dung dịch. Phương
pháp này có ưu điểm là xác định nhanh, chỉ yêu cầu một lượng mẫu nhỏ. So với phương pháp đo phổ
màu, phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi dịch đệm và (NH4)2SO4. Phương pháp đo phổ
thường được sử dụng để phát hiện các peak protein trong phương pháp sắc ký cột.
TÓM TẮT
Trong bài này, trước tiên sinh viên phải làm quen và hiểu được bản chất của phương pháp
phân tích quang phổ: xác định độ hấp phụ ánh sáng (vùng phổ, từng phổ riêng biệt) của dịch sinh
chất. Đây là phương pháp phổ biến nhất trong phòng thí nghiệm CNSH.
Phần tiếp theo trình bầy nguyên lý họat động của các thiết bị quang phổ thông dụng: máy so mầu,
máy quang phổ. Phân biệt sự giống nhau và khác biệt trong nguyên lý họat động của 2 nhóm thiết bị
này. Sinh viên phải nắm được nguyên lý của sơ đồ cấu tạo máy đo quang phổ.
Một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp phân tích quang phổ là việc xác định nồng
độ sinh chất bằng cách đo tỷ trọng quang OD của dịch chứa sinh chất. Phương pháp này có nhiều ứng
dụng trong nghiên cứu sinh chất, đặc biệt là protein và nucleic acid.
Cuối cùng là nội dung giới thiệu nguyên lý họat động và ứng dụng của quang phổ hùynh quang,
thiết bị quang phổ sử dụng trong phân tích sinh chất có khả năng phát sáng, khi bị kích thích, hoặc nhờ
các chất phát quang gắn vào phân tử sinh chất.
Câu 1: Độ hấp thu A của dung dịch 5 x 10-4 M tyrosine ở bước sóng 280 nm là 0,75. chiều dài
cuvette là 1 cm. Xác định hệ số hấp thu mol  của dung dịch?.
Câu 2: Dung dịch chứa uracil trong cuvette 1 cm có độ hấp phụ ở bươ`c sóng 260 nm là 0,65. Trong
khi độ hấp phụ của dung dịch uracil tinh khiết của uracil ở điều kiện như trên có giá trị là 0,07. Xác
định nồng độ mol của uracil trong dịch nói trên. Biết rằng hệ số hấp phụ mol  của uracil là 8,2 x
103/M cm?.
Câu 3: hấp phụ của dung dịch 1% enzyme tyrosinase trong cuvette 1 cm ở bước sóng
280 nm là 24,9. Xác định nồng độ tyrosinase trong dung dịch có A280 là 0,25?.
Câu 4: Cho biết tại sao phần lớn protein trong dung dịch lại hấp thu ở bước sóng 280 nm?.
Câu 5: Cho biết biopolymer nào thường cản trở việc xác định hàm lượng protein trong dung dịch ở
bước sóng 280 nm và biện pháp khắc phục?.
109 BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH NUCLEIC ACID 109
BÀI 7: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH
NUCLEIC ACID
Yêu cầu:
- Nắm được các bước thu nhận nucleic acid từ sinh khối tế bào;
- Hiểu được phương pháp định lượng nucleic acid trong dung dịch;
- Biết các phương pháp tinh sạch nucleic acid;
- Hiểu được phương pháp tinh sạch nucleic acid;
- Nắm được 3 phương pháp tinh chế DNA từ vệt điện di.
Mọi nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học phân tử đều liên quan đến thu nhận, tinh sạch và làm
sao có đủ một lượng cần thiết nucleic acid, đặc biệt là DNA, cho các thí nghiệm có liên quan. Quá trình
thu nhận phải đảm bảo tính vẹn tòan của nucleic acid. Không bị gẫy do tác nhân cơ học hay bị thủy
giải bởi enzyme. Quá trình tách chiết thường tiến hành ở nhiệt độ thấp, để ức chế họat động của các
enzyme nội bào thủy phân cắt nucleic acid là desoxyribonuclease – Dnase và ribonuclease – Rnase.
7.1 PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN THU NHẬN NUCLEIC ACID
Quá trình thu nhận DNA và RNA về đại thể bao gồm các bước khá giống nhau.
7.1.1 Thu nhận DNA gồm 3 bước
- Phá tế bào bằng cách nghiền tế bào trong hỗn hợp chất tẩy rửa gồm SDS hoặc sarcosyl kết hợp
với proteinase K.
- Lọai bỏ thành phần khác, trong đó có protein, bằng cách lắc mạnh dịch phá tế bào trong hỗn hợp
phenol/chloroform làm biến tính protein, tạo lớp tủa, nhưng không ảnh hưởng đến nucleic acid. Ly
tâm thu phase nước chứa nucleic acid nằm trên lớp tủa protein biến tính và phenol/chloroform
- Tủa nucleic acid trong phase nước bằng 2 cách: Tủa bằng ethanol (2,5 lần thể tích ethanol/1 thể
tích nước), thực hiện ở nhiệt độ thấp với nồng độ muối cao. Tủa bằng isopropanol theo tỷ lệ thể
tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1, không cần bổ sung muối. Thu tủa chứa nucleic bằng ly tâm đối
với cả 2 trường hợp. Rửa cặn tủa bằng ethanol 70%, nhằm lọai bỏ muối hoặc isopropanol dạng vết
còn trong mẫu.
Hình 7.1: Sơ đồ tách DNA

7.1.2 Thu nhận RNA tòan phần và mRNA
Các phân tử RNA dễ bị phân hủy bởi RNase, mà các RNase lại có mặt ở khắp nơi, kể cả trên ngón
tay người thao tác. Rnase có họat tính rất cao và rất bền. Do vậy, việc tách chiết RNA đòi hỏi yêu
cầu độ sạch cao, tránh tạp nhiễm bởi Rnase. Nên thao tác trong điều kiện vô trùng, khử trùng dụng
cụ và hóa chất theo đúng quy định. Tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần
Thao tác tách chiết RNA theo các bước sau:
- Nghiền tế bào trong dịch chất tẩy rửa như SDS, sarcosyl nồng độ cao, bổ sung guanidium
thiocyanate làm biến tính protein và chất khử 2-mercaptoethanol vừa ức chế Rnase nội bào, vừa
giúp tách protein ra khỏi liên kết với RNA.
- Lọai bỏ protein bằng cách xử lý với hỗn hợp phenol/chloroform. Ly tâm tách tủa. Tủa RNA hòa tan
trong phase nước bằng ethanol. Ly tâm thu tủa và bảo quản tủa trong ethanol hay ở nhiệt độ lạnh sâu
-70oC trong nước chứa Rnasine (chất ức chế Rnase).
Thường rRNA chiếm khỏang 80-85%, tRNA – 15-20%, còn mRNA chỉ chiếm khỏang 1-
5%. Tuy nhiên, mRNA rất đa dạng, may là chúng đều chứa đuôi polyA, có khi dài đến vài trăm gốc.
Nên dễ dàng tách chúng bằng sắc ký ái lực trên nền cột chứa nhựa oligodT, lai bắt cặp với các gốc A
và giữ các mRNA lại trong cột. Sau đó mRNA sẽ được rửa thôi khỏi cột. Hiện các nhà sản xuất đã tạo
nhiều bộ Kit tách chiết DNA và RNA chuyên biệt cho từng lọai tế bào, hoặc cơ thể rất tiện lợi, đạt
độ tinh sạch cao.
7.2 THU NHẬN DNA TỪ VI KHUẨN
DNA cấu tạo từ các đơn vị thành phần nucleotide gồm các gốc chứa nitơ là G, A, T và C nối với
nhau bằng liên kết phosphodiester giữa C3 và C5 của các gốc nucleotide khác nhau. Dạng phổ biến
của DNA là dạng xoắn đôi. DNA trong tế bào prokaryote tồn tại ở dạng DNA vòng, còn gọi là
plasmid. Là DNA dạng xoắn đôi có MW tới 2x109. DNA trong tế bào eukaryote tồn tại ở dạng nhiễm
sắc thể gồm những phân tử DNA rất lớn. Để nghiên cứu hoặc thao tác trên DNA vi khuẩn, trước hết
phải tách và thu nhận DNA.
7.2.1 Sơ đồ tách chiết phân đọan DNA từ tế bào vi khuẩn
Gồm 6 bước tùy thuộc vào mục đích tách phân đọan chứa DNA từ tế bào. Đầu tiên là huyền phù
khỏang 2 – 3 g sinh khối ướt tế bào vi khuẩn (thường sử dụng là tế bào Bacillus subtilis, Escherichia
coli và Clostridium welchii vào dịch muối EDTA trong bình tam giác 125 ml nhằm lọai bỏ các ion
kim lọai hóa trị 2 như Cd+2, Mg+2, Mn+2, thường kèm theo DNA. Đồng thời EDTA cũng ức chế
enzyme deoxyribonuclease. Tiếp theo bổ sung 1,0 ml dịch lysozyme, tương ứng 10 mg, và ủ ở 37oC từ
30 – 40 phút để phân giải màng tế bào. Vì enzyme này xúc tác cắt liên kết glycoside giải phóng DNA.
Bước thứ 3 là bổ sung 2,0 ml dịch SDS 25% và đun nóng 60oC khỏang 10 phút. Chất tẩy rửa SDS sẽ
phá tương tác ion giữa protein histone mang điện (+) với khung DNA mang điện (-). SDS cũng ức chế
enzyme deoxyribonuclease và tách phức protein-DNA trong môi trường kiềm. Để tránh tạo bọt, không
khuấy mạnh. Ở bước thứ 4, sau khi để dịch nguội, bổ sung 9,0 ml Na perchlorate (5 M) để tạo nồng độ
muối 1 M. Khuấy đều nhẹ nhàng để phân ly hòan tòan phức protein-DNA và làm giảm tương tác ion
giữa DNA và các cation có mặt trong dung dịch. Tiếp theo bổ sung hỗn hợp chloroform -
isoamyl alcohol (24:1) bằng thể tích của dịch chiết (khỏang 40 – 45 ml). Lắc đều dịch trong phễu phân
chia, hay ống ly tâm, có nắp đậy chặt nhằm lọai bỏ nốt protein còn lại. Cuối cùng ly tâm 10.000 g
khỏang 5 phút. Sau ly tâm sẽ nhận được 3 phân đọan phân biệt được bằng mắt thường.
Phân đọan dưới đáy là phân đọan chứa chất hữu cơ, phân đọan giữa chủ yếu chứa protein bị biến
tính. Phân đọan trên cùng chứa nucleic acid. Cẩn thận chuyển dịch phân đọan trên sang cốc thủy
tinh 125 ml hay ống thủy tinh lớn. Bổ sung thêm khỏang gấp 2 lần thể tích ethanol 95%, để tủa
nucleic acid từ dung dịch. Khuấy nhẹ nhàng bằng que thủy tinh. Bông sợi nucleic acid sẽ xuất hiện
và bám vào que. Để đuổi ethanol người ta đè nhẹ bông sợi nucleic acid lên thành cốc thủy tinh.
Nếu nucleic acid không tạo dạng bông, người ta ly tâm hỗn hợp dịch trên khỏang 10 phút, ly tâm
khỏang 2.000 – 3.000 vòng/phút. Chuyển tủa vào 10 ml dịch muối EDTA, sau đó tủa thêm lần nữa bằng
ethanol 95%.
Hình 7.2: Sơ đồ tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn
Để xác định hàm lượng DNA, người ta pha lõang 0,5 ml dịch DNA thu được trong
4,5 ml muối citrate. Trộn đều và đo OD260 nm trong cuvette thạch anh. Nếu giá trị OD260nm > 1,0, thì
pha lõang dịch cho đến khi giá trị OD260 nm nằm trong khỏang giữa 0,5 – 1,0. Xác định tiếp OD260
nm của dịch DNA. Cuối cùng xác định hàm lượng DNA theo tỷ lệ OD260 nm/ OD280 nm.
7.2.2 Thu nhận DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn
DNA dạng vòng rất phổ biến ở vi khuẩn còn gọi là plasmid. Số copy plasmid trong tế bào vi khuẩn
thường khỏang 20-30. Tuy nhiên có dòng E.coli phát triển trên môi trường chứa chloramphenicol có số
plasmid lên tới 3.000. Plasmid là công cụ quan trọng trong thao tác dòng hóa DNA và công nghệ gen.
Tách plasmid để thao tác là việc làm rất phổ biến hiện nay trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử.
Có một số cách tách plasmid như sau:
Tách plasmid-DNA bằng cách đun sôi: Trước tiên tiến hành thu nhận DNA tổng số từ tế bào vi
khuẩn bằng cách bổ sung lysozyme cùng với chất ức chế nuclease. Sau đó tiến
hành tách DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid bằng cách đun sôi dịch trong khỏang thời gian ngắn và
ly tâm. Phần lớn DNA nhiễm sắc thể ở dạng sợi bị biến tính và rơi vào tủa. DNA plasmid ở dạng vòng
không bị biến tính, sẽ vẫn ở lại trong dịch. Ủ lạnh dịch sau khi tách. Đun sôi còn làm biến tính
deoxyribonuclease và các protein khác.
Tinh sạch DNA plasmid bằng siêu ly tâm hoặc bằng ribonuclease
DNA plasmid nhận được ở trên vẫn chưa sạch, còn kèm theo RNA và một ít DNA dạng sợi. RNA
có thể lọai bỏ bằng ribonuclease, nhưng tốt hơn cả là bằng siêu ly tâm, nếu có máy siêu ly tâm. Trong
phương pháp tách DNA plasmid bằng siêu ly tâm, người ta bổ sung chất mầu ethidium bromide chỉ
gắn xen vào DNA ở dạng xoắn đôi, không gắn vào DNA plasmid ở dạng vòng. Kết quả sau siêu ly tâm
theo gradient CsCl trong ống ly tâm sẽ có 4 vùng phân đọan: Phân đọan protein sẽ nằm ở lớp bề
mặt trên cùng, tiếp theo là 2 phân đọan DNA mầu vàng, phân đọan DNA dạng sợi nằm phía trên,
còn phân đọan DNA plasmid dạng vòng nằm dưới. Tủa là phân đọan RNA. Dùng kim tiêm lấy 2 phân
đọan này ra sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong trường hợp không có siêu ly tâm, người ta lọai
bỏ RNA bằng ribonuclease.
Hình 7.3: Sơ đồ tách và thu nhận DNA plasmid và DNA nhiễm sắc thể
7.3 TINH SẠCH NUCLEIC ACID
Sau tách, các nucleic acid sẽ được tinh sạch bằng một số kỹ thuật như ly tâm, sắc ký hay điện di.
7.3.1 Tinh sạch nucleic acid bằng siêu ly tâm
Dùng siêu ly tâm trên gradient CsCl liên tục để tinh sạch nucleic acid
Trong quá trình ly tâm, dung dịch CsCl trong ống ly tâm sẽ tự động tạo gradient tỷ trọng tăng dần từ
miệng ống xuống đáy ống. Các nucleic acid sẽ di chuyển trong ống ly tâm, cho đến vị trí dịch có tỷ
trọng bằng tỷ trọng của từng lọai nucleic acid. Độ phân giải của gradient tỷ trọng khỏang 1%, cho
phép tách triệt để các nucleic acid thành từng phân đọan riêng. Kỹ thuật này thường sử dụng để tinh
sạch plasmid và phage.
Tách và tinh sạch nucleic acid trên đệm CsCl không liên tục
Khác với trương hợp trên là trong kỹ thuật này, dung dịch CsCl không tăng dần tỷ trọng theo
gradient, mà tạo nhiều lớp tỷ trọng tăng dần. Khi ly tâm, chỉ những nucleic acid tỷ có trọng cao hơn tỷ
trọng lớp đệm chứa CsCl, thì mới đi qua được. Kết quả các nucleic acid tỷ trọng khác nhau, sẽ nằm ở
các giải CsCl có tỷ trọng khác nhau trong ống ly tâm. Kỹ thuật này thường được sử dụng để tinh sạch
một lượng lớn phage.
Tách và tinh sạch nucleic acid trên trên gradient saccharose
Dùng để phân tách hỗn hợp DNA kích thước lớn, chênh lệch nhau nhiều kb. Kỹ thuật này ứng
dụng để chọn lọc các DNA kích thước lớn dùng trong thiết lập ngân hàng gen.
7.3.2 Tinh sạch nucleic acid bằng sắc ký
Trong thực tế, tùy vào mục đích người ta sử dụng một trong 4 phương pháp sắc ký sau để tinh sạch
nucleic acid trong quá trình chiết tách nucleic acid mô tả ở trên.
Dùng sắc ký ái lực tinh sạch mRNA trên cột polyU-sepharose hay oligodT-cellulose. Sắc ký lọc gel
dùng để phân tách các nucleic acid và các nucleiotide tự do xuất hiện trong quá trình tạo mẫu dò hay
đánh dấu. Sắc ký trao đổi ion thao tác trên vi cột để thu những lượng rất nhỏ DNA. Còn HPLC có độ
phân giải cao nên thường được dùng để tinh sạch oligonucleotide tổng hợp hay plasmid.
7.4 ĐỊNH LƯỢNG NUCLEIC ACID
Thường người ta sử dụng phương pháp đo mật độ quang (OD), điện di, siêu ly tâm và sắc ký
để phân tích và định lượng.
7.4.1 Định lượng nucleic acid bằng quang phổ kế
Nucleic acid hấp thu rất mạnh ở bước sóng  = 260 nm do có mặt các nhân thơm trong gốc
nucleotide. Dựa vào tỷ lệ A280/ A260 có thể xác định hàm lượng nucleic
acid trong dịch chứa protein. Thực nghiệm cho thấy dung dịch chứa DNA sợi đôi có hàm lượng
50g/ml trong cuvette thạch anh cho giá trị A260 = 1,0. Thí dụ, dựa vào
thông số này có thể xác định hàm lượng dung dịch DNA sợi đôi (X) có A260 = 0,15 tìm thấy bằng
thực nghiệm sẽ bằng:
1,0/50 g/ml = 0,15/X g/ml, từ đây suy ra X = 7,5

Còn dung dịch DNA sợi đơn hoặc sợi RNA hàm lượng 40 g/ml có A260 = 1,0
trong cuvette nói trên. Đây là phương pháp xác định nucleic acid đơn giản, nhanh, không phá hủy
mẫu và nhạy. Hàm lượng tối thiểu nucleic acid có thể xác định bằng
phương pháp này vào khoảng 2,5-5,0 g/ml. Lưu ý, phương pháp này chỉ đúng với
dịch nucleic acid tinh sạch. Do vậy để kiểm tra độ tinh sạch, người ta xác định thêm
OD 280nm, là nơi protein có độ hấp phụ cao nhất. Tuy nhiên protein cũng hấp phụ ở
260 nm làm sai lệch giá trị nồng độ thật của nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được coi là sạch
khi tỷ lệ OD260nm/OD280nm nằm trong khỏang 1,8-2,0.
7.4.2 Định lượng nucleic acid bằng điện di
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính linh động của các đại phân tử nucleic acid tích
điện âm trong nền gel. Tính linh động trên phụ thuộc vào MW phân tử và gel điện di. Hai lọai gel
hay được dùng là polyacrylamide và agarose. Thông thường gel polyacrylamide được dùng để phân
tách nucleic acid có MW nhỏ. Hàm lượng gel polyacrylamide 8-11% để tách đọan dài 10-50 cặp
nucleotide, còn hàm lượng nhỏ hơn 4-5% - để tách những đọan lớn hơn 80-800 cặp nucleotide. Tương
tự hàm lượng agarose 0,6-0,8 % để tách các đọan kích thước 1-20 kb, trong khi 1,2-
1,5% - để tách những đọan kích thước 0,2-5 kb.
Gel polyacrylamide được dùng để tách các đọan nuleotide kích thước nhỏ. Thường kỹ thuật điện di
này được sử dụng để tinh sạch oligonucleotide tổng hợp hóa học, để xác định trình tự DNA, để tách các
đọan DNA ngắn hơn 500 bp.
Điện di trên gel agarose là thông dụng nhất, do thao tác đơn giản, phù hợp để tách những đọan
nucleic kích thước lớn nằm trong khỏang 0,5-20 kb. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được
hiện mầu nhờ ethidium bromide gắn lên DNA, phát hùynh quang mầu đỏ da cam khi chiếu tia UV bước
sóng khỏang 300 nm. Để ước lượng các trình tự nucleic acid trong gel agarose, người ta so sánh các vệt
điện di nhận được với
các vệt điện di marker có MW đã biết. Thường là thang Kit DNA của phage  thủy giải
bằng Hind III.
7.4.3 Tinh chế DNA từ gel điện di
Khi cần có những đọan DNA tinh sạch, để thực hiện gắn nối, hay làm mẫu để lai Southern, thì nhất
định phải tinh chế phân đọan DNA-đích nhờ điện di agarose. Sau khi xác định được đọan cần tinh chế
thì tiến hành thu chúng theo 3 cách sau:
Dùng dao cạo cắt phần gel chứa vệt DNA sau đó cho DNA khuyếch tán từ gel vào đệm phù hợp.
Dùng agarose nóng chẩy ở nhiệt độ thấp (low melting agarose): Dùng dao cạo cắt phần gel phía
trước các phân đọan DNA cần tinh chế tạo thành một cái máng. Đổ vào máng dung dịch agarose 0,5%
có độ nóng chẩy ở nhiệt độ thấp. Để gel kết lại và cho chạy điện di tới khi phân đọan DNA cần tinh
chế chạy lọt vào hố thạch lõang. Dùng ống hút miệng rộng hút tòan bộ thạch chứa DNA cần tinh chế
chuyển vào ống Eppendorf sạch. Lọai agarose bằng GencleanKit (hãng BIO 101 co.) sẽ thu được phân
đọan DNA tinh sạch.
Dùng phương pháp ly tâm qua phễu giấy lọc:. Chạy điện di cho đến khi phân đọan DNA cần tinh
chế tách khỏi những phân đọan khác. Đặt bản gel lên hộp đèn cực tím, dùng dao cạo cắt phần gel mang
đọan DNA cần tinh chế. Làm phễu bằng giấy lọc đường kính 6-8 mm đặt lên miệng ống Eppendorf
cắt bỏ nắp, châm kim 1 lỗ ở đáy ống. Sau đó đặt tòan bộ ống Eppendorf thủng đáy và phễu lọc chồng
lên một ống Eppendorf cắt bỏ nắp khác. Tất cả phải được khử trùng trước đó. Cho mẫu gel mang phân
đọan DNA cần tinh chế vào phễu lọc. Sau đó đặt tòan bộ vào ống ly tâm và cho quay 5 phút 10.000
v/phút. Dịch trong thu được ở ống Eppendorf bên dưới chứa tới
90% lượng DNA có trong mẫu gel cắt ra. Dùng 1/10 thể tích NaOAc và 2 thể tích
ethanol để tủa DNA từ dịch ly tâm sẽ thu được phân đọan DNA cần tinh sạch.
TÓM TẮT
Trong bài này, sinh viên phải nắm được các bước thu nhận nucleic acid từ sinh khối tế bào bao gồm
việc phá tế bào, giải phóng nucleic acid ra khỏi phức protein/nucleic acid bằng hóa chất và enzyme.
Sau đó tách và tinh sạch DNA bằng cách tủa, ly tâm trong gradient CsCl hoặc đường saccharose.
Tiếp theo là nội dung liên quan đến phương pháp định lượng nucleic acid trong dung dịch
bằng phản ứng mầu hay bằng cách đo phổ trực tiếp ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
Phần tiếp theo trình bầy các phương pháp tinh sạch nucleic acid và cách thức thực hiện việc tinh
sạch nucleic acid. Kể cả tách chiết và tinh sạch plasmid, một nội dung cần thiết phục vụ cho các nghiên
cứu cơ bản trong CNSH liên quan đến ứng dụng của công nghệ gen, công nghệ lõi của CNSH hiện đại.
Cuối cùng là nội dung giới thiệu 3 phương pháp tinh chế DNA từ bản chạy điện di giúp sinh viên
nắm được những phương pháp cơ bản trong thu nhận và tinh sạch nucleic acid.
Câu 1: Trình bầy sơ đồ chiết tách DNA. Giải thích nội dung của các bước thực hiện?.
Câu 2: Trình bầy các phương pháp tinh sạch nucleic acid trong dung dịch và giải thích nội dung các
bước thực hiện?.
Câu 3: Nêu các phương pháp định tính và định lượng nucleic acid?.
Câu 4: Trình bầy các phương pháp tinh chế DNA từ bản gel?.
Câu 5: Trình bầy phương pháp chiết tách và thu nhận RNA tổng và mRNA. Phương pháp định tính
và định lượng RNA?.
119 BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ
BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 119
BÀI 8: KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
SINH HỌC PHÂN TỬ
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của phương pháp phân tích phân tử;
- Nắm được phương pháp điện di nucleic acid trên PA và agarose;
- Hiểu được các kiểu lai phân tử và ứng dụng của chúng;
- Biết được cách tạo mẫu dò và mồi và ứng dụng của chúng;
- Nắm được bản chất của phương pháp PCR;
- Biết phương pháp xác định trình tự nucleic acid;
- Hiểu được bản chất của phương pháp microarray.
Các thao tác trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học hiện đại liên quan đến các enzyme sử
dụng, các phương pháp lai phân tử, các lọai mẫu dò và phương pháp đánh dấu, các vector và sự tạo
dòng, phương pháp nhân gen PCR, phương pháp xác định trình tự nucleotide và phương pháp biến đổi
vật liệu di truyền.
8.1 CÁC ENZYME DÙNG TRONG KỸ THUẬT DI TRUYỀN
Cụ thể người ta phân làm 2 nhóm enzyme: enzyme cắt giới hạn RE (restrictase) và nhóm enzyme
thông dụng khác.
8.1.1 Các enzyme cắt giới hạn RE (restrictase)
Nhờ biết một số lòai vi khuẩn có khả năng “giới hạn” sự xâm nhiễm của phage, nên người ta
phát hiện khả năng của RE ở vi khuẩn, cắt DNA của phage ở những vị trí xác định, tạo ra các trình
tự xác định, có tính đặc hiệu. Bằng cách này vi khuẩn đã
giới hạn sự xâm nhiễm của phage. Bản thân DNA của vi khuẩn bị methyl hóa ở một số gốc trong
thành phần của nucleotide, nên không bị RE của chính vi khuẩn cắt. Trong thực tế, một số phage
không bị RE cắt vì đã trở nên thích nghi do trong một lần xâm nhiễm nào đó, DNA của phage được
methyl hóa trước khi bị RE phát hiện, và do vậy, phage tồn tại được trong vi khuẩn chủ.
Quy định tên gọi RE như sau: Chữ đầu viết hoa (tên giống) + 2 chữ viết thường (tên lòai vi khuẩn) +
chữ số (tên chủng). Ngòai ra, có thể có chữ viết hoa biểu thị chủng vi khuẩn sử dụng. Các lọai RE bao
gồm lọai I cắt cách vị trí nhận biết khỏang
1000-5000 bp. Lọai II cắt ngay vị trí nhận biết, là RE duy nhất được sử dụng. Lọai III
cắt ở cách vị trí nhận biết khỏang 20bp. Có nhiều lọai RE II, phân biệt theo đặc điểm nhận biết các trình
tự cắt khác nhau (cắt tạo đầu dính, đầu bằng...). Lưu ý một số điểm sau: Tùy lọai RE mà sử dụng
nồng độ NaCl cho phù hợp. Bảo quản RE trong đệm chứa 50% glycerol, ở -20oC. Nên tiến hành
phản ứng cắt trong thể tích càng nhỏ càng tốt. RE có nhiều ứng dụng trong thao tác di truyền, cũng như
trong nghiên cứu sinh học phân tử như : tạo dòng, lập bản đồ giới hạn, phân tích so sánh bộ gen theo
sự đa dạng độ dài đọan cắt RFLP.
Hình 8.1: Phổ điện di các phân đọan DNA cắt bởi restrictase
8.1.2 Các enzyme thông dụng khác
Polymerase: DNA polymerase xúc tác tổng hợp sợi DNA theo chiều 5’-3’ trên khuôn DNA.
Phổ biến nhất là DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase. Có DNA polymerase
phiên mã ngược revertase dùng khuôn RNA. Một lọai
DNA polymerase khác là terminal transferase xúc tác gắn thêm gốc nucleotide vào đầu của một
phân tử DNA. Lưu ý các DNA polymerase họat động cần có mặt một đọan DNA hay RNA ngắn
làm mồi khởi động.
DNA polymerase I đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế sửa sai khi sao chép, vì ngòai họat tính tổng
hợp theo chiều 5’-3’, nó còn có họat tính exonuclease theo chiều 5’-3’ (tạo nick translation) và chiều 3’-
5’ (proofreading). Rất phù hợp để copy đọan DNA ngắn.
Trong thực tế hay sử dụng đọan Klenow có nguồn gốc từ DNA polymerase I có họat tính
polymerase và exonuclease chiều 3’-5’, không chứa họat tính exonuclease chiều 5’-3’. T4 DNA
polymerase từ phage T4 có họat tính giống đọan Klenow, nhưng họat tính exonuclease 3’-5’ mạnh
hơn, nên hay được dùng. Taq polymerase dùng trong PCR, vì chịu được nhiệt độ cao.
Revertase từ retrovirus, thường là revertase từ MMLV. Dùng trong tổng hợp sợi cDNA sử dụng
mRNA làm khuôn.
Terminal transferase từ tuyến ức của bê con, xúc tác gắn deoxynucleotide vào đầu
3’OH tự do. Dùng để thêm đuôi tạo đầu so le dùng trong tạo dòng, trong xác định trình tự
nuccleotide theo phương pháp của Macxam và Gilbert.
RNA polymerase xúc tác tổng hợp RNA. Có 3 lọai phổ biến nhất là SP6, RNA polymerase từ phage
xâm nhiễm Salmonella, T3 và T7 RNA polymerase từ phage xâm nhiễm E. coli.
Ligase T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, dùng để nối DNA và RNA.
T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm -phosphate của ATP gắn lên đầu 5’
của DNA hay RNA, dùng trong đánh dấu phóng xạ.
Alkaline phosphatase từ E. coli và ruột bê con xúc tác lọai bỏ nhóm 5’-phosphate
của DNA, RNA và nucleotide tự do.
Nuclease cắt DNA gọi là DNase, cắt RNA gọi là RNase. DNase từ tụy bò cắt liên kết nằm sau gốc
pyrimidine trong chuỗi DNA cả mạch đôi và mạch đơn. Dùng để lọai DNA tạp nhiễm, tạo chỗ đứt
(nick), tạo đầu dò dùng để phát hiện gen trên nhiễm sắc chất. Nuclease S1 từ Asp. oryzae phân hủy
DNA, RNA mạch đơn, không cắt phức lai
DNA/RNA. Từ cây Mung bean có một lọai nuclease tương tự. Exonuclease III từ E.coli xúc tác cắt
tuần tự từng nucleotide từ đầu 3’ tự do của DNA theo chiều 3’-5’ được dùng để tạo mạch đơn trên
DNA làm cơ chất để đọan Klenow của DNA polymerase tạo mẫu dò đặc trưng cho từng mạch DNA.
RNase A có họat tính cao, bền nhiệt (90oC), thu nhận từ tụy bò, cắt liên kết ngay sau gốc
pyrimidine của RNA mạch đơn.
RNase H xúc tác lọai bỏ RNA trong phân tử lai RNA/DNA dùng trong tạo thư viện
cDNA.
8.2 ĐIỆN DI NUCLEIC ACID
Tùy vào mục đích, điện di nucleic acid thường được điện di trên gel PA và agarose. Các phương
pháp điện di trên gel polyacrylamide mô tả ở phần trên, chỉ thích hợp để tách protein hoặc các phân
đoạn nucleic acid có MW nhỏ hơn 350.000 Da, vì các lỗ gel nhỏ không thích hợp để tách các đoạn
nucleic acid lớn. Do vậy, để tách RNA và DNA kích thước từ 200 đến 50.000 bp, người ta dùng điện di
trên agarose. Agarose là polymer chứa dẫn xuất galactopyranose từ tảo biển. Bản điện di agarose được
chuẩn bị bằng cách hoà agarose trong đệm được hâm nóng. Sau khi gel nguội xuống 500C, người ta rót
dung dịch agarose lên khuôn để tạo bản điện di. Gel có hàm lượng <
0,5% rất dễ vỡ do vậy phải chạy điện di ngang. Hãng Kodak đã thay thế agarose bằng Instacryl,
cho phép tạo gel 10% bền vững hơn. Gel Instacryl nồng độ 3,6% được sử dụng để tách DNA sợi
đôi kích thước 10 - 35.000 bp. Vệt nucleic acid được nhuộm bằng ethydium bromide, cho vệt mầu đỏ da
cam khi chiếu UV.
Tốc độ di chuyển của nucleic acid trong gel agarose phụ thuộc vào nồng độ gel ( tốt nhất là 0,3-
2,0%) và phụ thuộc vào cấu hình của DNA: dạng I (siêu xoắn) di chuyển nhanh nhất, dạng II (dạng xoắn
doãng) di chuyển chậm nhất.
Điện di trên agarose ứng dụng để phân tích phân đoạn DNA, sau khi bị phân giải bởi enzyme
restrictase. Hiện đã biết hơn 500 loại restrictase cắt đặc hiệu theo thứ tự gốc nucleotide khác nhau trên
DNA. DNA nhỏ của virus hay phage, thường bị cắt thành khoảng 50 phân đoạn oligonucleotide.
Trong khi DNA vi khuẩn hoặc của động vật, bị cắt thành hàng trăm, thậm chí hàng ngàn phân đoạn
khác nhau. Do các phân
đoạn này có tính đặc hiệu rất cao, nên điện di phân đoạn DNA còn được gọi là “lấy dấu vân tay”
của DNA.
Hình 8.2: Bộ điện di ngang
Bảng 8.1 : Ngưỡng tách hiệu quả các phân đọan DNA trên agarose
8.3 LAI PHÂN TỬ
8.3.1 Cơ sở khoa học của sự lai phân tử
Khi phân tử DNA xoắn đôi gặp nhiệt độ cao hay bị biến tính bởi chất hóa học, thì các liên kết
hydro sẽ bị gãy, làm biến tính DNA, tách thành 2 mạch sợi đơn. Quá trình trên gọi là quá trình biến tính
DNA, còn gọi là quá trình tan chẩy DNA. Nếu các yếu tố
gây biến tính không còn, 2 mạch đơn của DNA lại bắt cặp với nhau theo nguyên tắc bổ sung, thì
DNA lại phục hồi lại như cũ. Quá trình này gọi là hòan tính DNA. Mạch DNA ở dạng đơn tự do
trong dung dịch có khả năng bắt cặp với mạch sợi đơn DNA khác chứa các gốc nucleotide bổ trợ,
tương ứng với các gốc trên mạch của mình. Kết quả nhận được phân tử lai giữa 2 mạch đơn DNA, giữa
mạch đơn DNA và RNA và giữa
2 mạch RNA với nhau. Trong các biều hiện biến tính DNA, nhiệt độ tan chẩy Tm có ý
nghĩa quan trọng.
Tan chẩy DNA xẩy ra ở điểm nhiệt độ Tm, đặc thù cho từng lọai DNA. Ở nhiệt độ này liên kết hydro
bị đứt dẫn đến tách sợi, làm giá trị OD ở 260nm tăng, vì DNA sợi đơn hấp thu ở bước sóng 260nm
mạnh hơn sợi đôi. Yếu tố ảnh hưởng lên Tm của DNA bao gồm thành phần gốc base. DNA có nhiều cặp
base GC có Tm cao hơn: Tm = 69,3
+ 0,41(%G+C). DNA càng dài , thì Tm càng cao. Điểm bắt cặp sai lệch càng nhiều càng làm giảm Tm.
Nồng độ muối trong môi trường phản ứng giảm, sẽ làm Tm giảm, Nồng độ formamide tăng cũng làm
giảm Tm.
Yếu tố ảnh hưởng lên sự lai phân tử
DNA và RNA bắt cặp với nhau, hoặc bắt cặp lẫn nhau theo nguyên tắc các gốc base bổ sung
bắt cặp với nhau. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng càng cao, thì sự lai bắt cặp càng mạnh. Nhiệt
độ thấp hơn Tm khỏang 25% cho sự lai đạt cực đại. Tốc độ lai tỷ lệ với căn bình phương độ dài và lực
ion của môi trường. NaCl 1 M làm tăng sự bắt cặp lai khỏang 5-10 lần.
Hình 8.3: Tm làm thay đổi độ phát hùynh quang và OD của dịch DNA
8.3.2 Các kiểu lai phân tử
Gồm 3 kiểu: lai trong dung dịch, lai trong phase rắn và lai tại chỗ.
Lai trong dung dịch thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm khỏang 15%, bổ sung formamide làm giảm
nhiệt độ lai. Thông thường 42oC là nhiệt độ phù hợp. Định lượng phân tử lai bằng 3 cách: dùng quang
phổ kế để đo sự giảm OD ở 260 nm, sử dụng nuclease S1 chỉ phá mạch đơn DNA, thu tủa mạch lai ở
dạng sợi đôi và định lượng. Dùng sắc ký hydroxyapatite gắn mạch sợi đôi DNA, phần nucleic acid
không gắn sẽ được thu nhận. Sau đó dùng nồng độ muối cao hơn để rửa thôi nucleic acid gắn ra
khỏi cột. Số lượng nucleic acid gắn và không gắn lên cột sẽ được xác định bằng đo quang phổ.
Lai trong dung dịch cho phép xác định tỷ lệ % các trình tự giống nhau giữa 2 lòai gần nhau. Để phân
tích trình tự lặp lại. Trình tự lặp lại càng nhiều, sự bắt cặp càng cao. Dùng để so sánh kích thước các bộ
gen không chứa các trình tự lặp lại.
Lai trên phase rắn giống như lai trong dung dịch, nhưng 1 trong 2 trình tự được cố định trên giá
thể, cho phép dễ dàng tạo cặp. Hạn chế là khó định lượng phân tử lai hơn, vận tốc lai thấp hơn so
với lai trong dung dịch khỏang 10 lần. Màng nitrocellulose ít được sử dụng làm màng lai, do độ
bền cơ học thấp, khó thao tác, không tách được phân tử lai trên màng để tiếp tục với mẫu dò khác.
Thường dùng màng nylon, do có độ bền cao, cho phép lai nhiều lần với các mẫu dò khác nhau. Lai trên
phase rắn được sử dụng trong phương pháp thẩm tách Southern blot (1975) để lập bản đồ giới hạn của
gen, giúp phát hiện đa dạng trình tự và phát hiện đột biến mất đọan.
Phương pháp Southern blot gồm các bước sau:
DNA bộ gen được cắt thành các đọan to nhỏ khác nhau bằng một hay nhiều RE. Tách chúng bằng
điện di trên agarose.
Làm biến tính DNA ngay trên gel, thường là bằng cách ngâm bản gel vào dung
dịch kiềm. Rồi chuyển lên màng lai theo đúng vị trí của chúng trên bản gel.
Sợi đơn DNA cố định trên màng lai được lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ (32P,
35S, 14C và 3H) hoặc liên kết với chất steroid digoxigenin, được phát hiện bằng kháng
thể đặc hiệu tạo sản phẩm mầu dễ nhận biết. Gần đây nhiều mẫu dò được đánh dấu huỳnh quang và
được quan sát dưới kính hiển vi hùynh quang.
Hình 8.4: Cố định và phát hiện DNA trên màng nylon

Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để lọai bỏ các mẫu dò không bắt cặp với các đọan DNA
trên màng lai.
Cuối cùng để định vị các phân tử lai, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hoặc bằng các kỹ
thuật phù hợp khác đã mô tả ở trên.
Hình 8.5: Phương pháp lai thấm Southern để phân tích DNA
Ví dụ cụ thể là phương pháp lai thấm Southern sử dụng trong RFLP để phát hiện gen globulin bị đột
biến. Trong tế bào khỏe mạnh, thứ tự amino acid từ vị trí 5 tới vị trí 7 của peptide-globin tương ứng
thứ tự CCTGAGGAG được nhận biết bởi enzyme MstII. Trong tế bào bệnh, gốc A thay bằng gốc T làm
cho MstII không nhận biết được thứ tự trên. Do vậy với tế bào khỏe mạnh MstII tạo đọan 0,2 và 1,2 kb,
còn tế bào bệnh tạo 1,4 kb.
Hình 8.6: Phát hiện gen đột biến bằng RFLP
Trung bình cứ khỏang 1/1.000 thứ tự là có một thay đổi thứ tự nucleotide, có thể được phát hiện và
bị cắt bởi restrictase, tạo ra một sự đa dạng chiều dài đoạn cắt DNA vô cùng lớn. Phương pháp phân
tích RFLP dựa trên sự lai bắt cặp theo Southern blotting. Thứ tự DNA dùng trong phân tích RFLP
thường nằm trong những vùng, gọi là tandem, chứa những thứ tự ngắn DNA lặp lại, có thể tới hàng
nghìn lần trong 1 tandem. Những thứ tự lặp lại này phân biệt khác nhau ở từng cá thể người (trừ
trường hợp sinh đôi cùng trứng).
Xác định các phân tử trên màng thấm được tiến hành thông qua đánh dấu: Nhiều năm kỹ thuật đánh
dấu bằng đồng vị phóng xạ đã được ứng dụng một cách rộng rãi, phổ biến nhất là các nucleotide gắn
đồng vị phóng xạ dạng 32P-dNTP. Phương pháp này có độ nhậy rất cao, có thể phát hiện vết DNA ở
nồng độ nano gram và thấp hơn. Tuy nhiên nó lại đòi hỏi kỹ thuật cao và đặc biệt là an tòan phóng xạ.
Những năm gần
đây, người ta thường sử dụng kỹ thuật phi phóng xạ (non-radioactive) hay kỹ thuật đánh dấu lạnh. Nổi
bật là kỹ thuật dạ quang hóa học kích họat ECL (enhancing chemical luminecsence) và đánh dấu
bằng digoxigenin (DIG).
Hình 8.7: Sơ đồ kỹ thuật đánh dấu bằng digoxigenin
dUTP gắn digoxigenin dùng để tổng hợp đọan DNA mẫu dò. Sau khi lai, mẫu dò được phát hiện
bằng phản ứng miễn dịch với anti-DIG gắn sẵn với phosphatase kiềm xúc tác cơ chất CSPD (Lumis-
Phos), giải phóng ánh sáng làm hiện vết trên phim. Phương pháp RFLP hiện dùng phổ biến trong xác
định danh tính người, xác định thân nhân liệt sĩ, đặc biệt trong công tác điều tra tội phạm. Điển hình là
trường hợp “Nghi án áo ngủ mầu xanh dương”.
Trong nghi án này, người ta tiến hành tách DNA từ các vết trên áo ngủ của cô thực tập sinh
Nhà trắng là Monica, cắt phân đọan DNA bằng restrictase, khuyếch đại bằng PCR và tách bằng điện di
trên gel thành các vệt. Các vệt này được chuyển sang màng bám DNA và cho lai bắt cặp với một số
mẫu DNA máu người khác nhau, trong
đó có máu của người tình nghi được đánh dấu. Trong trường hợp này thấy có sự trùng khớp với DNA từ
mẫu máu của Tổng thống Mỹ lúc đó là Clinton. Hiện người ta có thể lấy mẫu DNA từ vết tay để lại trên
hiện vật.
Phương pháp thẩm tách Northern blot gần giống Southern blot, nhưng để phân tích RNA.
Phương pháp này cho biết được mức độ họat động của các gen ở các mô khác nhau, thông qua mRNA
tương ứng của chúng. Khác biệt ở chỗ là trong Northern blot, người ta sử dụng tập hơp của RNA tách,
chiết từ một lọai tế bào, mô xác định. Sau đó tách chúng trên gel agarose. Cho thẩm tách gắn lên màng
lai và cho lai với mẫu dò. Vị trí vạch điện di có thể cho biết kích thước của RNA. Mức độ đậm nhạt của
vạch cho biết hàm lượng của chúng. Có nghĩa là gián tiếp cho biết mức độ biểu hiện của gen tương ứng.
Phương pháp dot và slot blot để định lượng một RNA đặc trưng trong hỗn hợp RNA, mà không phải
tách riêng chúng ra. Trong phương pháp này người ta không chuyển nucleic acid lên màng, mà gắn trực
tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai ở dạng 1 điểm, nên gọi là dot, hoặc khe hay slot. Sau đó cho lai và
phát hiện như bình thường.
Hình 8.8: Sơ đồ phương pháp Northern blot

Lai tại chỗ
Cho phép phát hiện trình tự nucleic acid cần tìm nằm ngay trong tế bào hay mô tế bào, mà không
phải tách ra. Dùng để định vị gen trên nhiễm sắc thể, để phát hiện vi khuẩn tái tổ hợp... Bao gồm các
thao lai trên khuẩn lạc, trong đó người ta dùng dấu ấn chuyển khuẩn lạc lên màng lai. Sau đó dùng
NaOH phá tế bào và làm biến tính DNA. Cho lai để phát hiện dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp ban
đầu. Tiếp theo là lai trên nhiễm sắc thể bằng mẫu dò chuyên biệt thực hiện trên lame. Kết quả cho phép
xác định vị trí và trình tự DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể. Tiến hành lọai bỏ RNA và protein bằng
Rnase và proteinase K. Cố định DNA trên lam và cho lai với mẫu dò chứa phóng xạ. Ủ và phủ lên lam
lớp huyền phù nhậy với tia phóng xạ. Sau đó quan sát dưới kính hiển vi để biết kết quả. Kiểu lai tại
chỗ tiếp theo là lai trên mô tế bào cho biết phân bố không gian của mRNA, cung cấp thêm thông tin về
chức năng, sự điều hòa và tương tác của mRNA với các thành phần khác của tế bào. Mà bằng cách chiết
tách và tinh sạch không thể biết được. Tiến hành xử lý mô bằng phương pháp mô học. Sau đó tẩm
paraffin, cắt thành lát mỏng trải trên lam. Phát hiện phân tử lai bằng phương pháp lai trên nhiễm sắc thể.
Cuối cùng soi dưới kính hiển vi để biết kết quả.
8.4 MẪU DÒ VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU MẪU DÒ
8.4.1 Mẫu dò
Mẫu dò là đọan trình tự bản sao của một đọan gen, nên nó chỉ lai với gen đó, có độ nhậy cao, dễ
dàng đánh dấu. Các mẫu dò trước hết phải được tinh sạch, không lẫn với các nucleic acid có trình tự
khác. Mẫu dò phổ biến là trình tự DNA được tách dòng hoặc khuếch đại nhờ PCR, đọan oligonucleotide
tổng hợp hóa học, hay phân tử RNA thu được từ quá trình phiên mã. Mẫu dò thường dùng để phát hiện
thứ tự nucleotide-đích (gen). Việc phát hiện thứ tự nucleotide có thể thực hiện bằng 2 cách: Lai các gốc
bổ sung với nhau, theo biểu hiện miễn dịch của phản ứng lai giữa mẫu dò và tế bào cố định trên màng bị
phân rã và phát hiện theo họat tính protein là sản phẩm của tế bào chuyển gen bằng ELISA bắt cặp
với tế bào cố định trên màng bị phân rã. Mẫu dò được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Một trong
số đó là dùng để phân lập gen.
Gen thông thường được phân lập từ ngân hàng gen. Trong đó người ta xác định đồng thời rất nhiều
dòng tế bào từ ngân hàng gen, bằng cách nuôi chúng trên đĩa
thạch và chuyển khuẩn lạc lên màng để thực hiện việc tìm kiếm gen. Dòng tế bào chứa gen-đích
cần tìm được phát hiện bằng cách lai mẫu dò với thứ tự nucleotide của gen cần tìm. Mẫu dò được tạo
bằng cách tách gen (hay một phần của gen) từ chính tế bào chủ, hay tế bào gần tế bào chủ, hoặc dùng
oligonucleotide tổng hợp hóa học dựa vào các nguồn thông tin khác (đặc biệt là thành phần và thứ tự
amino acid protein mà gen-đích mã hóa). Trong quá trình này việc quan trọng là phải đánh dấu mồi.
8.4.2 Tác nhân đánh dấu
Đồng vị phóng xạ 32P, 35S 3H là hay được dùng. Trong đó 32P hay dùng hơn cả. Đồng vị 32P
phát tia  năng lượng rất cao, nên cho độ nhậy cao. Tuy nhiên nó lại có
chu kỳ bán phân rã ngắn (15 ngày). 35S có chu kỳ sống dài hơn (2-3 tháng), nhưng tia phát có năng
lượng thấp hơn. Còn 3H nói chung là đồng vị yếu, có thời gian tồn tại dài.
Đánh dấu hóa học bằng avidin (hay streptavidine) kết hợp với biotin có độ ái lực cực cao cỡ
khỏang 10-14. Cho biotin gắn vào DNA, cho lai và phát hiện sự lai khi cho avidine gắn hùynh quang
vào. Có một cách khác là đánh dấu bằng phát quang sinh học: Đánh dấu DNA bằng peroxidase, cho
lai, rồi cho cơ chất peroxidase vào. Phát hiện đọan lai nhờ xác định các đọan phát sáng.
8.4.3 Phương pháp đánh dấu
Đánh dấu DNA

Tạo nick translation (Rigby et al, 1977): Dùng Dnase I cắt DNA ở nhiều vị trí tạo các lỗ hổng
(nick). Dùng DNA polymerase gặm dần nhờ họat tính exonuclease 5’-3’ đồng thời với việc tổng hợp bù
lại đọan thiếu bằng các gốc nucleotide được đánh dấu, thường dùng gốc dATP đáng dấu. Kết quả đọan
mới tổng hợp được đánh dấu ở một số chỗ. Cách làm như sau: ủ mẫu dò DNA với Dnase I, DNA
polymerase I và dATP đánh dấu. Tiến hành lọai bỏ các nucleotide tự do. Cho biến tính ở 100oC, rồi làm
lạnh đột ngột.
Tạo mồi ngẫu nhiên (random priming) (Feinberg, 1984): Biến tính mẫu dò bằng nhiệt và làm lạnh
đột ngột sẽ tách sợi DNA mồi. Thêm vào các hexanucleotide tương ứng với mọi trình tự tổ hợp. Xuất
hiện đọan lai ngẫu nhiên. Dùng các đọan lai này làm
mồi để DNA polymerase xúc tác tạo mạch bổ sung chứa gốc nucleotide đánh dấu. Thừơng sử dụng
đọan Klenow hay DNA T7 polymerase để xúc tác.
Hình 8.9: Sơ đồ tạo mồi ngẫu nhiên và dùng phóng xạ phát hiện thứ tự đích
Đánh dấu các oligonucleotide: Các oligonucleotide được tổng hợp ở dạng mạch đơn, rồi được
đánh dấu bằng nucleotide đánh dấu gắn vào đầu 5’ nhờ T4 polynucleotide kinase. Sau đó lọai bỏ các
nucleotide tự do bằng sắc ký.
Tạo mẫu dò RNA (ribpprobe) (Erlich, Cohen và McDevitt, 1978).
Là việc chuyển trình tự DNA làm khuôn sản xuất mẫu dò RNA vào vector có promoter dạng SP6,
T3, hay T7. Cắt vector thành dạng thẳng và bổ sung RNA polymerase phù hợp tạo một lượng lớn RNA
đánh dấu. Dùng DNase I phân hủy DNA của vector. Sau đó tinh sạch RNA bằng lọc gel. Tuy có vẻ khó
thực hiện, nhưng ưu điểm là phân tử lai DNA/RNA có hiệu quả lai cao hơn so với lai DNA/DNA.
Hiện các kỹ thuật này đã được công cụ tin học hỗ trợ rất nhiều thể hiện trong tìm và so sánh với các
trình tự tương đồng từ những dòng tế bào gần tế bào đích.
Hình 8.10: Sơ đồ tạo mồi RNA
8.5 TÁCH DÒNG DNA (CLONING DNA)
Tách dòng DNA là việc khuếch đại một số lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định, để sử
dụng trong thao tác di truyền, hay cho mục đích phân tích. Một trong những ứng dụng quan trọng của kỹ
thuật này là phân lập gen mới để nghiên cứu hoặc phân tích. Tất cả thí nghiệm tách dòng đều dựa trên
việc tạo DNA tái tổ hợp. Phân tử DNA được tách dòng thường là đọan DNA được quan tâm sẽ được
gắn vào phân tử DNA mang gọi là vector, thường là DNA vòng gọi là plasmid, để tạo vector tái tổ hợp.
Sau khi được tạo thành, vector tái tổ hợp sẽ được đưa vào tế bào chủ, thường là E.coli, nhân bản
lên nhiều lần. Nhờ vậy, sẽ thu và tinh sạch được một số lượng lớn vector chứa gen quan tâm.
Để thao tác tách dòng, người ta sử dụng cùng một lọai enzyme RE cắt giới hạn (đã trình bầy ở trên),
cắt DNA mang gen quan tâm và DNA vector, tạo đầu dính bổ trợ nhau, cho phép chúng dễ dàng gắn với
nhau, tạo DNA tái tổ hợp.
Công cụ thứ hai là các vecto dòng hóa. Ngòai plasmid pBR322 ban đầu, là một phân tử DNA
vòng có kích thước vài kb, mang gen đánh dấu, thường là các gen có tính kháng kháng sinh
ampicillin và tetracyclin. Trong quá trình tách dòng đọan gen quan tâm được gắn vào vị trí của gen
kháng tetracyclin. Sau này người ta đã phát
triển nhiều lọai plasmid khác trong đó có vector họ pUC cho phép xác định khuẩn lạc mang plasmid tái
tổ hợp, bằng phương pháp chọn lọc xanh/trắng, dựa vào sự có mặt của gen lac Z mã hóa cho β-
galactosidase, xúc tác phân giải cơ chất X-gal không mầu thành sản phẩm mầu xanh. Gen quan tâm sẽ
gắn vào vùng gen lac Z, làm đứt gen này. Do vậy khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp sẽ có mầu trắng.
Một đặc tính hữu ích khác của vector pUC là việc cải tiến trình tự gen lac Z thành vùng chứa vị trí
đa tách dòng sử dụng cho một số RE và để gắn các đọan DNA khác nhau. Một ưu điểm tiếp theo là sự
có mặt của trình tự khởi động phiên mã có nguồn gốc từ các phage (bacteriophage) gắn vào một trong
hai phía của vị trí đa tách dòng, giúp phiên mã đọan DNA cần tách dòng nhờ RNA polymerase.
Phương pháp này thừơng dùng cho việc tạo mẫu dò RNA từ các trình tự DNA được tách dòng.
Người ta còn cải tiến các vector-plasmid có khả năng sinh tổng hợp protein được gen tách dòng mã
hóa. Các vector này gọi là vector biểu hiện. Ngòai plasmid pUC, còn có nhóm plasmid pSP và
Gemini giống pUC, nhưng không mang gen lacZ. Bù lại chúng mang promoter rất mạnh đặc trưng cho
RNA polymerase của virus là SP6 và T7 nằm 2 bên vùng polylinker cho phép phiên mã đọan DNA,
gắn trong vector tạo protein hay RNA làm mẫu dò. Cuối cùng là nhóm plasmid Bluescript tập hợp ưu
điểm của 2 nhóm plasmid trên, và có tiềm năng nhất.
Hình 8.11: Sơ đồ cấu tạo của vector pUC19

Ngòai plasmid, trong thực tiễn người ta còn sử dụng các lọai vector khác cho mục
đích tách dòng DNA. Phage  được cải tiến làm vector tách dòng bằng cách cắt bỏ
DNA của phage và thay vào đó là DNA cần tách dòng, tạo DNA tái tổ hợp. Sau đó DNA phage tái
tổ hợp sẽ được lắp vào vỏ của phage và đóng gói. Hạt phage tái tổ hợp sẽ lây nhiễm E.coli. Cấy chúng
thành lớp trên mặt agar. E.coli tái tổ hợp sẽ tạo vết tan trong suốt. Các vết này sẽ được phân lập và
tạo ra một số lượng lớn DNA tách dòng, bằng việc lây nhiễm vào các tế bào E.coli mới. Ưu điểm của
vector tách dòng
phage , là có thể tách dòng các đọan DNA lớn tới 25 kb so với plasmid chỉ khỏang 10
kb.
Người ta sử dụng vector  cho mục đích chính là xây dựng thư viện DNA là tập hợp của
các phage tái tổ hợp, chứa tòan bộ các đọan DNA từ hệ gen của sinh vật chủ.
Trong đó các đọan DNA từ hệ gen của sinh vật chủ sẽ bị bẻ gãy bằng RE, hoặc dùng sóng siêu âm, có
MW khỏang 20 kb, được gắn vào các vai của vector phage. Sau đó được giữ trong E.coli. Khi cần phân
lập gen cần thiết, người ta chỉ việc nuôi các phage tái tổ hợp lên lớp E.coli. Cho các vết tan bám lên
màng nylon, xử lý bằng kiềm gây
biến tính DNA và cho lai với mẫu dò để phát hiện gen cần tách.
Hình 8.12: Các bước xây dựng ngân hàng gen người và sàng lọc gen đích bằng cách lai trên
đĩa cấy sau khi phân giải tế bào
Người ta cũng tạo thư viện gen cDNA xuất phát từ mRNA của một lọai tế bào mang tính biệt hóa
cao, bằng cách sử dụng enzyme phiên mã ngược để chuyển trình tự mRNA thành cDNA. Các phân tử
cDNA sau đó sẽ được tách dòng như mô tả ở trên, để
tạo thư viện cDNA. Thư viện cDNA có ưu điểm là không chứa trình tự intron. Lọai
vector khác là cosmid, được coi là kết hợp của vector plasmid và vector phage .
Hình 8.13: Sơ đồ các bước xây dựng ngân hàng cDNA và tạo vector cosmid
Cosmid có đặc điểm của plasmid là chứa vùng đa tách dòng, chứa gen kháng kháng sinh.
Đồng thời nó cũng chứa các trình tự cos có trong vector phage , có mặt
ở 2 đầu DNA của phage  giúp gắn DNA vào vỏ của phage . Bình thường vector cos được
chuyển vào E.coli. Tuy nhiên do cosmid không chứa gen nào của phage, nên nó
không tạo được vết tan trên lớp E.coli. Thay vào đó người ta nuôi E.coli chứa vector cosmid trên môi
trường chứa kháng sinh để phân lập. Cosmid có ưu điểm là có thể mang những đọan DNA kích thước
lớn có thể tới 44 kb.
Các phương pháp phát hiện dòng cần tìm (screening)
Hình 8.14: Sơ đồ sử dụng đầu dò oligonucleotide

A – Lai với mẫu dò; B – Gắn với tyramide tạo tín hiệu khi gắn với peroxidase từ cây cải ngựa
horseradish peroxidase (HRP)
Sử dụng oligonucleotide tổng hợp là thông dụng nhất hiện nay. Protein nghiên cứu được tách và
tinh sạch. Xác định vài trình tự ngắn (15-20 amino acid), đối chiếu với mã di truyền. Dùng máy tính
xác định những trình tự nucleotide phù hợp nhất. Tổng hợp hóa học một số lượng lớn oligonucleotide,
kết hợp với đánh dấu đồng vị hay hóa chất đầu 5’ nhờ polynucleotide kinase. Sau đó cho lai với thư
viện gen để xác định dòng tái tổ hợp.
Sử dụng kháng thể khi có kháng thể đặc hiệu và vector sử dụng phải là vector cho phép dịch mã.
Thực hiện như sau: Khi các đĩa phân giải do các phage tái tổ hợp tạo trên mặt lớp vi khuẩn đạt 1-2 mm,
đặt lên trên màng nitrocellulose tẩm IPTG để cảm ứng tạo protein lai. Ủ màng với kháng thể đặc hiệu sẽ
xuất hiện phức kháng thể- protein lai đánh dấu 125I. Phát hiện tín hiệu phóng xạ.
Hình 8.15: Sơ đồ phát hiện dòng cần tìm nhờ kháng thể
Hình 8.16: Sơ đồ chọn dòng gen

Lọai vector mới phát triển sau này là nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo YAC đại diện cho một
hướng tách dòng mới. Trong đó vector tách dòng được sao chép trong tế bào nhân chuẩn. YAC có tất cả
các đặc điểm của nhiễm sắc thể cần cho tự sao chép trong tế bào nấm men. YAC được dùng để tách
dòng các đọan DNA rất lớn, tới vài trăm kb, dùng để xây dựng thư viện hệ gen người. Ngòai YAC còn
có nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn BAC và nhiễm sắc thể nhân tạo P1. Các vector tách dòng gen thưc
vật dựa trên cấu trúc của Ti plasmid, có ưu điểm là dễ dàng kết hợp với thứ tự DNA cần chuyển, thí dụ
các gen kháng bệnh, kháng thuốc trừ cỏ... vào hệ gen thực vật.
8.6 PHẢN ỨNG CHUỖI NHÂN SỢI DNA PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION)
Khi lượng DNA quá ít, thì cần phải nhân bản tăng số lượng bằng phản ứng nhân sợi lai PCR sử
dụng mồi (primer) là đoạn oligonucleotide cần cho việc bắt đầu tổng hợp thứ tự DNA, nhờ lặp lại
nhiều lần chu trình đun nóng và làm lạnh. Bổ sung DNA polymerase và dNTP vào để tổng hợp DNA.
Thực hiện trong một số chu kỳ. Ưu điểm cơ bản của PCR là do khả năng bền nhiệt của DNA
polymerase (Tag polymerase), nên tất cả thành phần tham gia phản ứng có thể trộn lẫn, rồi cho vào máy
tự động.
8.6.1 Các bước thực hiện PCR
Phương pháp PCR được sử dụng rất rộng rãi như là kỹ thuật đầu tay cho các nghiên cứu có
liên quan đến gen. Sản phẩm PCR sử dụng làm mẫu dò trong các phương pháp thẩm tách, để giải trình
tự DNA, để tạo các dòng gen mới... Một số lĩnh vực sử dụng rộng rãi PCR là nghiên cứu bệnh di truyền,
nghiên cứu ung thư, nghiên cứu pháp y, dùng trong công nghệ sinh học sản xuất protein tái tổ hợp, phát
triển các lọai vacine tái tổ hợp như vacine viêm gan B, viêm gan C...
Hình 8.17. Phương pháp nhân sợi DNA PCR là chu kỳ gồm 3 bước lặp lại. (1) Gia nhiệt làm biến
tính tách sợi DNA và gắn mồi khi nhiệt độ giảm. (2) Kéo dài mồi sử dụng revertase nếu khuôn là
RNA và DNA polymerase nếu khuôn là DNA. (3) tạo sợi đôi DNA và bắt đầu chu kỳ mới bằng
cách lặp lại bước (1). Sau chừng 25-35 chu kỳ phản ứng, lượng DNA tăng hàng triệu lần.
8.6.2 Ứng dụng của PCR
Sản xuất mẫu dò bằng PCR thay thế phương pháp tạo dòng truyền thống, kỹ thuật
nick translation, random priming.
Khuếch đại số lượng mRNA bằng cách phối hợp RT PCR: Do Taq polymerase không họat động trên
RNA, nên trước hết thu mRNA bằng sắc ký trên cột nhựa polydT, hay dùng hexanucleotide bắt cặp ngẫu
nhiên với trình tự trên RNA. Tiếp theo tạo cDNA và khuếch đại cDNA bằng Taq polymerase. Cũng có
thể sử dụng Tth polymerase. RT-PCR cho phép nghiên cứu một lượng mRNA rất nhỏ, không thể phát
hiện bằng Nothern blot. Lưu ý không nhầm lẫn RT-PCR với Real-Time PCR.
Real-Time PCR giúp xác định sự gia tăng số lượng DNA theo thời gian. Có một số kỹ thuật Real-
Time PCR, nhưng phổ biến là TaqMan real-time PCR, molecular becon và SYBR Green. TaqMan
real-time PCR sử dụng TaqMan probe. Mầu Q (ở đầu 3’) sẽ ngăn mầu tín hiệu xanh lá cây (ở đầu 5’)
xuất hiện khi chúng nằm gần nhau.
Hình 8.18: Cấu trúc TaqMan probe. Vòng mầu đỏ Q – quenching dye. Vòng
mầu xanh – mầu tin hiệu xuất hiện hki có sự gắn thêm các gốc nucleotide kéo dài trình tự
đích
Một khi TaqMan probe gắn lên DNA (thông qua thứ tự gốc bổ sung), thì Taq polymerase sẽ gắn các
nucleotide mới vào và đẩy vòng mầu tín hiệu xa dần khỏi vòng mầu đỏ. Và cho phép nó phát tín hiệu
mầu xanh lá cây, sau khi đạt độ dài nhất định. Tín hiệu được định lượng nhờ máy tính. Tín hiệu tăng
tỷ lệ với thời gian. Được thể hiện ở dạng đồ thị, trong đó trên trục hòanh là là số chu kỳ PCR, còn trên
trục tung là giá trị logarit cường độ mầu tỷ lệ với số lượng DNA.
Hình 8.19: Đồ thị biểu hiện sự gia tăng số lượng DNA trong real time PCR
Định lượng bằng PCR thường để nghiên cứu trình tự DNA (hay RNA) có số lượng copy rất nhỏ.
Thí dụ để so sánh mức độ biểu hiện gen thyroid hormone receptor, biểu hiện rất yếu ở các mô khác
nhau. Trong thực nghiệm, người ta khuếch đại đồng thời trình tự đích và trình tự chứng có nồng độ đã
biết trong cùng một ống nghiệm, tốt nhất là cùng cặp mồi. Có nghĩa là phần đầu nơi bắt cặp của chúng
giống nhau, chỉ khác nhau phần trung tâm. Sau phản ứng có thể phân biệt hai trình tự này bằng điện di.
Dựa vào khuếch đại của trình tự chứng, suy ra nồng độ của trình tự đích.
8.6.3 Hạn chế của PCR
Hạn chế về kích thước trình tự cần khuếch đại không > 3 kb, tốt nhất là < 1,5 kb.
Hạn chế sự ngọai nhiễm thường là do những sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước bay
lơ lửng trong phòng thí nghiệm và bám vào dụng cụ thí nghiệm gây ra.
Sai sót do Taq polymerase với tỷ lệ sao chép sai khỏang 10-4. Hạn chế bằng cách đảm bảo các gốc
nuc tham gia phản ứng phải luôn cân bằng.
8.7 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA
Có 2 nguyên lý giải mã trình tự DNA là phương pháp enzyme dựa vào kết thúc chuỗi dideoxy
ddNTP của Sanger và phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert. Trong đó phương pháp enzyme
được sử dụng phổ biến.
Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert dựa vào sự thủy giải đặc hiệu phân tử DNA cần xác định trình
tự : Đánh dấu đầu sợi DNA bằng 32P. Sau đó tiến hành 5 phản ứng cắt đặc hiệu gốc G, (G+A), C,
(T+C), A. Thí dụ gốc G, biến đổi các gốc G bằng dimethyl sulfate. Lọai bỏ các gốc G đã bị biến đổi.
Thủy giải liên kết bằng piperidine và chạy điện di tách các phân đọan DNA. Dựa vào đầu đánh dấu
sẽ xác định được trình tự của đọan DNA.
Hình 8.20: Xác định thứ tự nucleotide theo Maxam-Gilbert
Phương pháp enzyme sử dụng dideoxy của Sanger dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme xúc tác mạch
bổ sung cho trình tự mạch đơn cần xác định. Sử dụng 4 lọai dideoxynucleotide trong tổng hợp mạch bổ
sung. Tiến hành như sau: Trình tự cần xác định được tạo dòng trong vector mạch đơn của phage M13.
Có thể dùng đọan Klenow, taq polymerase hay sequensase xúc tác. Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ
mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt trên mạch đơn của phage M13. Có nghĩa là các đọan
oligonucleotide có chung đầu, nhưng có độ dài khác nhau do quá trình tổng hợp chúng trên sợi
đơn DNA làm khuôn kết thúc ở các vị trí khác nhau nhờ sự hiện diện của các gốc dideoxynucleoside
triphosphate.
Thực hiện 4 phản ứng riêng biệt. Điện di trên PA cả 4 phân đọan sẽ nhận được lần lượt các vệt cách
nhau 1 gốc nucleotide cho phép biết được trình tự của đọan DNA đích. Để xác định phân đọan
oligonucleotide người ta dùng đồng vị 32P hoặc chất

hùynh quang để đánh dấu. Các thông tin nhận được được lưu giữ trong ngân hàng dữ
liệu DNA, là nguồn thông tin rất bổ ích cho các nghiên cứu genomics và proteomics.
Hình 8.21: Xác định thứ tự nucleotide theo Sanger
Người ta cải biến phương pháp Sanger do thao tác trên phage M13 là phức tạp, mất nhiều thời
gian. Thay vì sử dụng M13, người ta sử dụng vector thế hệ thứ 3 gọi là Gemini, chứa 2 trình tự đặc hiệu
ở 2 bên đọan DNA được tạo dòng, mỗi trình tự nằm trên 1 mạch. Phải tách 2 mạch bằng NaOH, rồi sử
dụng mồi bắt cặp đặc hiệu trình tự trên mạch đó. Phản ứng tổng hợp thực hiện như bình thường.
Hình 8.22: Phương pháp Sanger cải tiến sử dụng

dideoxynucleotide mầu khác nhau
Xác định tự động trình tự nucleotide bằng cách thay vì đánh dấu phóng xạ, mỗi lọai
dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluorochrome có mầu khác nhau. Điện di tách chúng trên PA và
đọc trình tự trên máy tính. Một trong những cải tiến là phương pháp pyrosequencing thực hiện như sau:
Cho các hạt gắn các thứ tự nucleotide cùng trình tự, được tạo bằng PCR, vào trong từng giếng. Cho
DNA polymerase và dNTP chẩy qua các giếng. Khi gốc nucleotide mới gắn vào đuôi các sợi
nucleotide gắn trên hạt, thì sẽ giải phóng pyrophosphate, do vậy phương pháp có tên gọi là phương pháp
pyro-, kèm theo chớp lóe sáng, nhờ luciferase xúc tác. Cường độ lóe sáng phụ thuộc vào số lượng các
nucleotide được ghép vào. Thí dụ 1,2 và 3 đơn vị lóe sáng tương ứng với gắn thêm gốc A, AA và AAA.
Cho cả 4 NTP chạy qua các giếng nhiều vòng và dựa vào phần mềm chuyên dụng, có thể biết được
thứ tự nucleotide. Phương pháp này
nhanh và rẻ hơn nhiều so với phương pháp Sanger. Khỏang 100 triệu thứ tự bp có thể xác định được
trong 7 giờ.
Dùng PCR xác định trình tự DNA cho phép xác định trực tiếp trình tự sợi DNA được khuếch đại
bằng PCR, không cần tạo dòng. Chỉ sử dụng khi vùng trình tự xác định đã được biết trước, chủ yếu là để
phát hiện nhanh đột biến điểm: Trước hết khuếch đại DNA cần xác định bằng PCR. Tách 2 mạch, cho
bắt cặp với mồi và thực hiện phản ứng như trong phương pháp Sanger.
8.8 MICROARRAY
Gần đây, thiết bị lai nucleotide cố định trên cảm biến sinh học (còn gọi là chip sinh học) gọi chung
là microarray tỏ ra rất hữu hiệu trong nghiên cứu biểu hiện gen. Thiết bị gồm mặt phẳng chứa các chấm
DNA được gắn theo hàng, nên gọi là array.
Hình 8.23: Sơ đồ tạo đầu dò DNA bằng tổng hợp hóa học và DNA array
Chấm DNA ở đây có thể là các đọan cDNA (nhận trên khuôn mRNA). Tuy nhiên hiện mồi
oligonucleotide tổng hợp hóa học, dựa trên cơ sở dữ liệu của gen nghiên cứu được sử dụng nhiều hơn
cả. Các chấm oligonucleotide này sẽ lai bắt cặp với đọan DNA, cDNA hay mRNA, có mặt trong
các mẫu phân tích và so sánh chúng với nhau nhờ 2 mầu hùynh quang gắn với mồi. So sánh sự thể
hiện mầu sẽ biết thông tin định lượng liên quan tới biểu hiện gen.
Hình 8.24: Microarray
Phương pháp kết hợp tủa miễn dịch sợi nhiễm sắc thể với microarray (ChiP-on-
chip) là một cách tiếp cận mới cho phép lập bản đồ vị trí trên sợi nhiễm sắc thể.
Hình 8.25: Phân tích ChiP-on-chip là sự kết hợp kỹ thuật tủa miễn dịch chromatin (ChiP) với
microarray cho phép phát hiện vị trí protein lai với DNA (nhờ ái lực) . Sau đó dùng siêu âm đánh
gẫy chromatin tạo các đọan DNA. Xác định các đọan DNA đích nhờ PCR (dùng mồi đặc hiệu) và
cho lai trên array cho biết bức tranh tổng thể biểu hiện của gen-đích.
TÓM TẮT
Trong bài này, sinh v iên làm quen với các phương pháp sử dụng trong phân tích phân tử. Chủ yếu
liên quan đến các phương pháp phân tích và thao tác DNA và RNA thường sử dụng trong nghiên cứu
sinh học phân tử. Đó là việc sử dụng nhóm enzyme cắt giới hạn đóng vai trò chủ yếu trong cắt đặc hiệu
thứ tự DNA. Sử dụng các enzyme polymer hóa tạo DNA, RNA, enzyme nối thứ tự nucleotide...
Tiếp theo giới thiệu phương pháp điện di nucleic acid trên PA và agarose, một công cụ chủ yếu
trong phân tích nucleic acid đang được sử dụng ngày càng tăng do những ưu điểm của nó. Sinh viên
phải nắm bắt được nguyên tắc tiến hành điện di nucleic acid. Phân biệt điện di nucleic acid và protein.
Phần quan trọng giới thiệu nguyên tắc của các phương pháp phân tích phân tử là lai phân tử.
Giơi thiệu bản chất của sự lai phân tử. Các kiểu lai phân tử: lai trong dung dịch, lai trên phase rắn và
lai tại chỗ. Các phương pháp tạo mẫu dò và mồi. Ứng dụng của lai phân tử trong phân tích nucleic
acid, trong chẩn đóan bệnh, trong công tác tư pháp, trong định danh phân tử.
Phần cuối giới thiệu phương pháp nhân bản thứ tự nucleotide, một phương pháp quan trọng bậc
nhất sử dụng trong sinh học phân tử có rất nhiều ứng dụng quan trọng. Phương pháp xác định thứ
tự nucleotide và microarray là các phương pháp có nhiều ứng dụng trong tương lai.
Câu 1: Trình bầy cách thức xác định nhiệt độ tan chẩy Tm của DNA?.
Câu 2: Nêu cơ sở khoa học của lai phân tử?.
Câu 3: Trình bầy ý nghĩa của các phương pháp lai phân tử?.
Câu 4: Trình bầy cách thức tạo mẫu dò và mồi?.
Câu 5: Bản chất của việc tách dòng. Nêu các bước phát triển của việc tách dòng nucleic acid và
ứng dụng của chúng?.
Câu 6: Trình bẩy các phương pháp xác định trình tự DNA?.
149 BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ 149
BÀI 9: PHÂN LỌAI HỌC PHÂN TỬ
Yêu cầu:
- Hiểu được bản chất của phương pháp phân lọai học phân tử;
- Nắm được các bước thực hiện trong phân lọai phân tử vi khuẩn (phân lọai
prokaryote);
- Nắm được các bước thực hiện trong phân lọai phân tử thực vật (phân lọai
eukaryote).
9.1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LỌAI KINH ĐIỂN
Có thể nói phân lọai học là bộ môn sinh học sớm nhất với sự đóng góp của nhiều nhà khoa học-
triết học nổi tiếng như Linnaeus, Lamark, Darwin...Cho tới đầu thế kỷ
20, những thành công trong phân lọai học chủ yếu dựa vào phương pháp so sánh hình thái, phương
pháp giải phẫu so sánh, phương pháp cổ sinh vật học, phương pháp cá thể phát triển, phương pháp
sinh thái...Từ những năm 1980, xuất hiện phương pháp nghiên cứu phân lọai mới, phương pháp
phân lọai phân tử. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng
sinh học ở mức độ phân tử giữa các lòai và trong phạm vi lòai. Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa và xây
dựng cây chủng lọai phát sinh.
9.2 PHÂN LỌAI PHÂN TỬ
9.2.1 Các phương pháp dùng trong phân lọai phân tử
Phân lọai học phân tử dựa trên nghiên cứu các gen trong hệ gen ở nhân, hệ gen bào quan (ty thể
và lục lạp thể), hoặc các sản phẩm của gen (enzyme, protein). Do đó việc chọn lựa gen nào, protein
nào, sẽ có ý nghĩa quyết định cho sự thành công của mỗi cách phân lọai. Cho đến nay đã có khá nhiều
kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong phân lọai.
Điện di isozyme cho biết sự khác biệt trọng lượng, kích thước và điện tích của các enzyme có cùng
chức năng, được mã hóa bởi gen cùng locus, hoặc các locus khác nhau; So sánh mẫu protein nhờ các
kháng thể, thí dụ dùng huyết thanh để xác định các nhóm máu A, B, O, Rhezus, M, MN, N...; Phân tích
tính đa dạng độ dài của đọan cắt giới hạn RFLP (restriction fragment length polymorphism) dựa vào
enzyme cắt đặc hiệu DNA bộ gene, tạo hàng lọat các phân đọan dài ngắn khác nhau mang biểu tượng
đặc trưng lòai.
Một số kỹ thuật dựa trên PCR như phân tích DNA vệ tinh hoặc các trình tự lặp lại đơn giản
(microsatellite, simple sequence repeat) cho phép phát hiện tính đa hình độ dài các trình tự nucleotide
đơn giản, khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại và số đơn vị lặp lại được phát
hiện nhờ PCR và điện di; Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên RAPD (randomly amplified
polymorphism DNA) nhờ các mồi dài 10 nucleotide với hàm lượng G + C lớn hơn 60% tạo các đọan
kích thước > 100bp và <
2kb. Sự khác nhau của các đọan là do đột biến ở vị trí gắn mồi cản trở việc bắt cặp. Kết quả sẽ phát hiện
được sự có mặt hay vắng mặt của các đọan; Sự khác biệt độ dài được nhân lên ở các cơ thể khác nhau
cùng lòai hay thuộc các lòai khác nhau được xem là yếu tố trội.
Đa hình chiều dài các đọan nhân chọn lọc AFLP (amplified fragment length polymorphism) giống
RAPD, chỉ khác mồi là đọan dài hơn (khỏang 15bp) chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một
phần thay đổi nhỏ (2-4bp). Phần cố định dài tạo sự ổn định của sản phẩm được nhân lên, còn phần
thay đổi ngắn sẽ tạo nhiều locus. AFLP phát hiện sự khác nhau của các đọan DNA bởi sự nhân lên
có chọn lọc trình tự của DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn. Sự đa hình được xác định bởi sự
có mặt hoặc không có mặt của băng điện di có liên quan. Phương pháp AFLP chủ yếu dùng để thiết lập
bản đồ di truyền các tính trạng số lượng.
Lai phân tử DNA để xác định mức độ tương đồng của trình tự nucleotide của DNA thuộc các lòai
khác nhau. Ta có thể đo mức độ bắt cặp của các sợi DNA thuộc hai lòai khác nhau bằng cách xác định
nhiệt độ mà tại đó phân tử DNA lai bị biến tính. Sự tương đồng về trình tự nucleotide giữa các lòai càng
cao, thì phân tử lai càng mau chóng được hình thành và nhiệt độ cần thiết để phân tử DNA lai này bị
biến tính càng cao.
Phân tích trình tự DNA nhờ tạo một số lượng lớn các đọan sắp xếp hơn kém nhau
1 đơn vị nucleotide, được đánh dấu hùynh quang và được tách bằng điện di. Với sự trợ giúp của
những phần mềm xử lý kết quả nhận được ta có thể nhận được kết quả phân lọai. Trong bảng 9.1 trình
bầy tổng quan các phương pháp phân lọai.
Bảng 9.1. Các phương phương pháp phân lọai sinh học phân tử
Phân tích vị Phân tích Phân tích

Vấn đề Isozyme Lai DNA
trí cắt RE đọan DNA trình tự
Tiến hóa gen M - M -,M,- +
Phân lọai phụ của
+ - + M,+,- +
quần thể
Biến đổi địa lý + - + M,+,M +
Ranh giới các lòai + - +,M,- +
Phát sinh (0-5
+ M + -,M,- +
triệu năm)
Phát sinh (5-50
+ + + -,-,- +
triệu năm)
Phát sinh (50-500
M M M -,-,- +
triệu năm)
Phát sinh (500-
- - - -,-,- +
3.500 triệu năm)
Chú thích: - phương pháp không phù hợp; + phương pháp phù hợp; M phương pháp phù hợp
một phần
9.2.2 Các gen thường dùng trong phân lọai học phân tử
Ribosome là bộ máy sinh tổng protein. Cấu trúc của ribosome được bảo tồn gần như không thay
đổi trong suốt quá trình tiến hóa. Trong mỗi thế hệ tế bào, có khỏang
10 tỷ ribosome được tạo ra. Ribosome của tế bào nhân chuẩn có hằng số lắng 80S
gồm 2 tiểu phần lớn và nhỏ, với hằng số lắng tương ứng là 60S và 40S, lớn và phức tạp hơn ribosome
của tế bào nhân sơ có hệ số lắng là 70S, tương ứng với 2 tiểu phần là 50S và 30S. Trong môi trường có
nồng độ cation Mg+2, Ca+2, Co+2, Mn+2 thấp, các tiểu phần sẽ tách ra, và ngược lại. Các tiểu phần
được tạo thành do liên kết hydro và ion Mg+2 của các rRNA với nhiều phân tử protein.
Các phân tử rRNA đều được tạo từ một tiền phân tử RNA (pre-rRNA). Ở sinh vật nhân chuẩn, phân
tử tiền rRNA 45S sẽ trải qua quá trình biến đổi để tạo những rRNA nhỏ hơn. Phân tử rRNA 45S sẽ
được methyl hóa tại hơn 100 nucleotide trong tổng số
14.000 nucleotide của cả phân tử. Hầu hết ở nhóm 2’OH của đường ribose. Các vị trí
này sẽ giữ nguyên trạng thái methyl hóa cho đến sản phẩm cuối cùng, là các phân tử rRNA 28S, 18S,
5,8S. Riêng rRNA 5S được tổng hợp riêng, được xúc tác bởi RNA polymerase III, thay vì RNA
polymerase I. Phản ứng cắt rRNA 45S cần sự tham gia của một số phân tử snRNA (small nuclear
RNAs) nằm trong phức spliceosome.
Bảng 9.2. Thành phần cấu tạo của ribosome
Sinh vật Ribosome Thành phần

50S rRNA 5S (120 nucleotide và
Prokaryote 70S (2,7.103 kDa) (1,8.103 kDa) rRNA 23 S (3200 nuc.)
36 phân tử protein
30S rRNA 16S (1540 nucleotide
(0,9.103 kDa) 21 phân tử protein
60S rRNA 5S (120 nucleotide,rRNA
Eukaryote 80S (4,2.103 kDa) (2,8.103 kDa) 28 S (4700 nuc.) và rRNA 5,8S (160
nuc.)
49phân tử protein
40S rRNA 18S (1900 nucleotide)
(1,4.103 kDa) 33 phân tử protein
Gen 16S rRNA được sử dụng trong nghiên cứu cây phả hệ của prokaryote vì vừa có vùng rất bảo thủ
và vùng siêu biến động. Có thuận lợi nữa là gen rRNA của ty thể và lục lạp thể cũng gần giống như vậy.
Vùng ổn định thường nằm cạnh vùng siêu biến động. Các mồi sử dụng được thiết kế gắn vào vùng ổn
định để khuếch đại thứ tự ở vùng biến động. 5S rRNA và 23S ở prokaryote chứa tương ứng là 120 và
2900 nucleotide nằm trong tiểu đơn vị lớn của ribosome. Còn 16S rRNA chứa 1500 nucleotide, nằm
trong tiểu đơn vị nhỏ của ribosome.
Hình 9.1: Cấu trúc của 16S rRNA

với mũi tên chỉ vùng siêu biến động và bảo thủ
Cơ sở khoa học của việc phân lọai prokaryote theo gen 16S rRNA, là ribosome có mặt ở tất cả tế
bào sống. Gen 16S rRNA có tính bảo thủ rất cao và không cần phải nuôi cấy vi sinh vật cần định
danh, nên tốn ít thời gian. Vùng siêu biến động trên gen
16S rRNA cho phép định danh lòai vi sinh vật. Phương pháp định danh nhờ nuôi cấy vi sinh vật, chẩn
đóan hóa sinh hoặc các phương pháp có liên quan khác thường mất khỏang 8-20 giờ.
9.2.3 Giám định theo 16 S ribosome RNA ở prokaryote
Để giám định 16S rDNA của vi khuẩn người ta dựa vào một số mồi (primer), được chọn từ ngân
hàng dữ liệu gen 16S rRNA, thứ tự theo 5’ tới 3’.
fDl ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG Đa số eubacteria
fD2 ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCATGGCTCAG Nhóm enterics
fD3 ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTTAG Nhóm Borrelia spirochetes
fD4 ccgaattcgtcgacaacAGAATTTGATCTTGGTTCAG Nhóm Chlamydiae
rDl cccgggatccaagcttAAGGAGGTGATCCAGCC Nhiều lọai eubacteria
rPl cccgggatccaagcttACGGTTACCTTGTTACGACTT Nhóm enterics và

eubacteria
rP2 cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT Đa số eubacteria
rP3 cccgggatccaagcttACGGATACCTTGTTACGACTT Nhóm fusobacteria và

eubacteria
Chú thích: f - mồi xuôi; r - mồi ngược; D – vùng ngọai biên, P - ở vùng giữa theo chiều 5’ tới 3’.
Thứ tự nối chứa vị trí cắt cho RE biểu thị chữ nhỏ. Trong đó thứ tự nối nhóm “f” chứa vị trí cắt của
EcoRI và Sall. Còn thứ tự nhóm “r” chứa vi trí cắt của HindIJI, BamHI và Xmal. Mồi rPI, rP2 và rP3
chỉ khác nhau thứ tự thứ 17 từ đầu 3’. Mồi rP2 chứa thứ tự tương ứng với rất nhiều vi khuẩn.
Cách thức thực hiện xác định thứ tự gen 16S rRNA mô tả trong sơ đồ.
Hình 9.2: Sơ đồ xác định thứ tự gen 16S rRNA

Trước tiên phải thu nhận và tinh sạch DNA từ vi khuẩn. Sau đó khuếch đại gen 16S rRNA, sử dụng
mồi khuếch đại vùng siêu biến động của gen này. Điện di sản phẩm PCR trên gel biến tính DGGE.
Trong đó gel PA chứa chất gây biến tính DNA, thường là urea hay formamide. DGGE cho phép xác
định sai biệt thứ tự đến từng gốc nucleotide. Trong hình làn điện di A,B và C là của vi khuẩn đã
biết. Làn 1 và 2 là của vi khuẩn cần xác định. Mẫu trong làn 1 chứa cả vi khuẩn A và C. Làn 2 chứa
A,B và đối tượng chưa biết (mũi tên). Cắt vệt điện di này mang đi xác định thư tự và so sánh với
ngân hàng dữ liệu gen 16S rRNA.
9.2.4 Giám định theo 18 S ribosome RNA lan hài (Paphiopedium)
Gen mã hóa rRNA 18S
Gen mã hóa rRNA 45 S là một cụm gen gồm 1 đơn vị gen nhỏ (từ 16S tới 18S), 1 đơn vị gen lớn (từ
26S tới 28S) và gen 5,8S. Giữa các đơn vị gen này có các đọan sao chép nội ITS-1 và ITS-2 (internal
transcribed spacer). Ở đầu 5’ phiên mã của rRNA có một đọan sao chép ngọai biên ETS (external
transcribed spacer). Sáu thành phần này tạo nên nhóm gen cơ bản. Các nhóm gen này được lặp lại liên
tục hàng nghìn bản sao trong hệ gen. Chúng được ngăn cách bởi vùng không phiên mã NTS
(nontranscribed spacer).
Hình 9.3: Sơ đồ nhóm gen mã hóa rRNA ở sinh vật nhân chuẩn
Nói chung, các đọan thứ tự gen thì bảo thủ hơn các đọan ITS-1 và ITS-2. Các đọan này lại bảo thủ
hơn đọan EST. Thậm chí trong gen bảo thủ, cũng có những vùng có mức độ bảo thủ cao thấp khác
khau. Do đó mỗi gen có thể coi như là tập hợp của các vùng có tốc độ tiến hóa khác nhau. Trong phân
lọai học, gen mã hóa rRNA 18S và
16S hay được sử dụng để đánh giá quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật, do mức độ
bảo thủ cao của nó. Ngòai ra những đọan ITS-1 và ITS-2 cũng được sử dụng cho mục đích trên. Gen
5,8 rRNA tuy ngắn, nhưng mồi thiết kế cho gen này lại được sử dụng để nhân vùng ITS kề bên.
Đặc điểm cấu tạo của DNA ty thể
Ty thể là bào quan có mặt ở tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí. Nó có DNA riêng, có tính di truyền
độc lập với hệ di truyền ở nhân bào. Trong ty thể có ribosome và các lọai rRNA cần thiết, để tổng
hợp một số protein đặc trưng của ty thể. DNA ty thể là sợi xoắn kép, cấu trúc vòng, dài khỏang 5 µm,
chiếm khỏang 1-5% DNA của tế bào. DNA ty thể tự tái bản. Khác với DNA của nhân, DNA ty thể
không gắn histone. Về tổng thể, DNA ty thể tương tự DNA vi khuẩn và là một trong những nhân
tố quyết định tính di truyền tế bào chất.
DNA ty thể mã hóa tạo nhiều thành phần của ty thể. Phần lớn protein của ty thể do gen trong
nhân quy định. Còn DNA ty thể mã hóa cho 22-23 lọai tRNA và 10-12 lọai protein có trong màng ty
thể. Mã di truyền của ty thể có tính linh họat hơn. Nhiều tRNA có thể đọc được cả 4 cụm mã trong một
khung. Chính vì vậy, chỉ cần 22 lọai tRNA trong ty thể là đủ nhận biết 61 bộ ba mã hóa. Trong khi ở
nhân cần tới 32 lọai tRNA. Ở phần lớn động vật có xương sống, DNA ty thể dài khỏang 16,8 kb. Trên
DNA ty thể, ngòai các gen cấu trúc, còn có vùng điều khiển gọi là vùng D-loop mang promoter cho quá
trình sao chép và phiên mã RNA ty thể. DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5 lần, so với gen ở
nhân. DNA ty thể là phân tử đơn bội, không tái tổ hợp. Như vậy, các kiểu đơn bội khác nhau của DNA
ty thể, cũng có thể sử dụng làm các dấu hiệu chỉ thị để phát hiện khác biệt di truyền theo dòng mẹ, ở
các quần thể nuôi nhốt và sống hoang dại.
Vùng điều khiển là vùng tiến hóa nhanh nhất của DNA ty thể. Trung bình nó tích lũy các dạng
đột biến với tỷ lệ cao gấp 5-10 lần, so với các gen khác của ty thể. Vì vậy việc xác định trình tự
nucleotide ở vùng điều khiển của DNA ty thể là công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và
sự phân nhánh tiến hóa bên trong, và giữa các quần thể trong cùng một lòai.
Giám định gen mã hóa rRNA 18S từ cây lan hài (Paphiopedilum)
Lan hài là một trong những chi lan được nuôi trồng khá sớm và phổ biến ở Việt Nam. Do đó nó là
nguồn tài nguyên quí cần phải được phân lọai, phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen, cũng như triển
khai ứng dụng trong thực tiễn.
Hình 9.4: Lan hài Paph. helenae (trái) và Paph. delenatii (phải)
Để xác định quan hệ chủng lọai trong họ Lan, người ta so sánh sự khác biệt trình tự nucleotide
của một số gen, trong đó gen rRNA 18S. Trong thí dụ này các tác giả sử dụng 2 mẫu lan hài Paph.
helenae và Paph. delenatii. Cụ thể gồm các bước dưới đây.
Tách chiết DNA tổng số từ thực vật: Phá vỡ thành tế bào thực vật bằng phương pháp cơ học, kết hợp
sử dụng các chất tẩy rửa mạnh. DNA giải phóng được làm sạch nhờ proteinase K, dung dịch
CHCl3/Isoamyl alcol (24/1). Tủa DNA trong cồn tuyệt đối ở -20oC, thu tủa bằng ly tâm. Các bước cụ
thể được thực hiện như sau:
Bước 1: Nghiền 2 g lá bằng cối chày sứ vô trùng, giữ ở -70oC trong nitơ lỏng cho đến khi thành bột
mịn.
Bước 2: Hòa tan mẫu trong 5 ml dung dịch đệm chiết chứa 1M NaCl, 1M Tris-HCl pH 8,0, 10 ml
mM EDTA pH 8,0, SDS 10%.
Bước 3: Thêm 10 µl proteinase K (10 mg/ml), ủ mẫu ở 56oC trong 2 giờ.
Bước 4: Thêm 1 ml NaCl 6M, để 45 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 14.000 v/phút ở
4oC, thu dịch phía trên, chuyển sang ống mới.
Bước 5: Lọai protein và tạp chất bằng CHCl3/Isoamyl alcol (24/1). Ly tâm 14.000 v/phút trong 20
phút ở 4oC, thu dịch phase phía trên.
Bước 6: Tủa DNA bằng cồn 100% trong 3 giờ ở 20oC.
Bước 7: Ly tâm 14.000 v/phút trong 15 phút ở 4oC. Thu tủa và lọai bỏ dịch.
Bước 8: Rửa tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 14.000 v/phút trong 15
phút ở 4oC, thu tủa.
Bước 9: Làm khô mẫu và hòa tan DNA trong nước khử ion vô
trùng.
Bước 10: Lọai RNA bằng cách bổ sung RNA ase vào mẫu
DNA thu được đạt nồng độ cuối là 100 µg/ml, ủ mẫu ở 37oC trong
1 giờ.
Các bước tiếp theo lặp lại các bước 5, 6, 7, 8, 9.
Kết quả tách được DNA từ 2 lòai lan Paph. helenae

và Paph. Delenatii
Mẫu DNA từ lá 2 lòai lan Paph. helenae và Paph. delenatii
được tách theo quy trình trên, được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8%. Trên điện di đồ ở giếng 1 và 2 đều xuất hiện 1 băng
DNA đậm nét . Kết quả cho thấy DNA tổng số không bị phân hủy,
Hình 9.5: Phổ điện di DNA
RNA bị hủy hòan tòan. Như vậy mẫu DNA đảm bảo yêu cầu chất
tổng số của Paph. helenae
lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
(1) và Paph. delenatii (2)
Nhân đọan gen mã hóa rRNA 18S. Nhân gen mã hóa
18S rRNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi xuôi là: 5’-GCG ATC CGA ACA CTT CAC CGG-3’ và
mồi ngược là: 5’-GCT TGT TCT CAA GAT TAA GCC-3’. Cặp mồi được thiết kế dựa trên một số
trình tự ở 2 đầu đọan thứ tự bảo thủ cao của gen rRNA 18S, của một số lòai thực vật bậc cao đã được
công bố. Dự đóan vùng bảo thủ này cũng có mặt trong trình tự gen rRNA 18S của các lòai thuộc chi
Lan hài. Theo lý thuyết sử dụng cặp mồi này sẽ nhân được đọan gen rRNA 18S kích thước khỏang 1,7
kb.
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu kỳ 3 bước. Bước 1: biến tính DNA khuôn ở
95oC trong 1 phút. Bước 2 gồm 30 chu kỳ nhiệt 95oC-30 giây, 50oC – 1 phút, 72oC –
1phút 20 giây. Bước 3 kết thúc tổng hợp ở 72oC trong 8 phút và bảo quản ở 4oC. Kiểm tra sản
phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy ở cả 2 lòai lan đều thu được sản phẩm
PCR đặc hiệu với kích thước 1,7 kb tương ứng kích thước tính tóan theo lý thuyết.
Hình 9.6. Phổ điện di sản phẩm PCR của thang DNA chuẩn
(1), Paph. helenae (2) và Paph. delenatii (3)
Phân tích đọan gen rRNA nhận được bằng enzyme giới hạn
Dùng một số enzyme giới hạn để phát hiện các vị trí cắt khác nhau trên vùng gen rRNA 18S của 2
lòai lan trên. Mặc dù sản phẩm PCR gen rRNA 18S của chúng có kích thước giống nhau, nhưng có thể
có một số thứ tự nucleotide khác nhau. Thứ tự tạo khác biệt này có thể rơi vào vị trí cắt của một
enzyme giới hạn nào đó, trong số các enzyme thử nghiệm. Ngòai ra, các phân đọan tạo này còn được
dùng làm nguyên liệu để tạo dòng phụ (subclone). Là bước cần thiết để xác định tòan bộ trình tự đọan
gen rRNA 18S. Phân tích trình tự đọan gen rRNA 18S bằng phần mềm PC GENE, có tham khảo thêm
kết quả giám định gen rRNA 18S của một số tác giả khác, đã nhận được các kết quả liên quan đến vị
trí cắt trên trình tự gen rRNA 18S ở lan hài Paph. helenae và Paph. micranthum.
Bảng 9.3: Vị trí nhận biết của một số RE trên trình tự 18S rRNA ở lan hài
Paph. helenae Paph. micranthum

Enzyme Số điểm Số điểm
Vị trí cắt Vị trí cắt
cắt cắt
AccI 192 1
ApaLI 142 1
ApolI 276, 882, 1506, 1557 3 275, 881, 1505, 1556 4
BamHI 515 1 515 1
BsaAI 142 1 141 1
BspHI 225 1
EcoRI 1557 1 1566 1
HaeII 719, 1446 2 718 1
HindII 1296, 1590 2
HindIII 1352 1 1352 1
HpaI 1279 1 1296 1
NaeI 1049 1 1048 1
NcoI 319 1 318 1
PvuI 629 1 628 1
SacI 1224 1 1223 1
SacII 551 1 550 1
XbaI 129 1 128 1
XhoI 515 1 514 1
Chọn enzyme Hind III và Bam HI để phân tích đọan gen rRNA 18S. Theo kết quả trong bảng, Hind
III có 1 điểm cắt trên gen rRNA 18S tại vị trí nucleotide thứ 1352 của Paph. helenae và Paph.
micranthum . Như vậy enzyme này cắt đọan gen rRNA
18S thành 2 đọan có kích thước xấp xỉ là 298 bp và 1331 bp. Đồng thời enzyme Bam HI cũng có 1
điểm cắt tại vị trí thứ 515 trên gen rRNA 18S ở cả 2 lòai lan này. Kết quả phản ứng cắt của enzyme
được thể hiện trên điện di đồ.
Hình 9.7: Phổ điện di sản phẩm PCR xử lý bằng enzyme giới hạn
Giếng 1: Marker (thang DNA chuẩn)
Giếng 2: Sản phẩm PCR của lòai Paph. helenae

Giếng 3: Sản phẩm PCR của lòai Paph. helenae cắt bằng Bam HI Giếng 4:
Sản phẩm PCR của lòai Paph. helenae cắt bằng Hind III Giếng 5: Sản phẩm
PCR của lòai Paph. delenatii
Giếng 6: Sản phẩm PCR của lòai Paph. delenatii cắt bằng Bam HI
Giếng 7: Sản phẩm PCR của lòai Paph. delenatii cắt bằng Hind III.
Trên hình phổ điện di cắt gen rRNA 18 S bằng enzyme giới hạn, thấy có sự khác biệt giữa 2 lòai
Paph. helenae và Paph. delenatii. Bam HI cắt gen rRNA 18 S thành 2 phân đọan 0,5 kb và 1,2 kb.
Hind III cắt thành 0,3 kb và 1,4 kb. Điều này có nghĩa là Hind III và Bam HI chỉ có 1 điểm cắt trên gen
rRNA 18S của cả 2 lòai. Tuy nhiên nếu chỉ dựa vào kết quả phân tích của enzyme giới hạn, thì chưa thể
khẳng định được sự khác biệt giữa 2 lòai Paph. helenae và Paph. delenatii. Để có kết luận chính xác,
cần phải tiếp tục tách dòng gen rRNA 18S của Paph. delenatii, tiến hành đọc trình tự đọan gen này và
so sánh với gen rRNA 18S của Paph. helenae.
Sản phẩm tách dòng DNA plasmid được làm khô và hòa tan trong nước khử ion vô trùng. Cho chạy
điện di. Quan sát phổ điện di thấy mẫu DNA số 3 nằm ở vị trí cao hơn (do kích thước lớn hơn), so với
DNA plasmid đối chứng. Như vậy, có thể plasmid này có chứa đọan DNA ngọai lai gắn vào. Để khẳng
định đó là gen rRNA 18S gắn vào plasmid, đã tiến hành kiểm tra sản phẩm plasmid trên bằng cắt
enzyme giới hạn.
Hình 9.8. Phổ điện di sản phẩm tách DNA plasmid Giếng 1:
Vector pBluescript dùng làm chuẩn Giếng 2-12: Các dòng
khuẩn lạc đem tách
Trên vector Bluescript KS (-) có 1 điểm cắt của enzyme Bam HI và Hind III trong
vùng gắn đa vị trí. Ngòai ra theo kết quả phân tích ở trên, trên gen rRNA 18S cũng có
1 vị trí cắt của Bam HI tại thứ tự 515 và Hind III tại 1352. Do vậy theo lý thuyết, nếu plasmid mang
đọan gen rRNA 18S, thì khi cắt bằng Bam HI sẽ cho băng kích thước khỏang 1,3 kb. Cắt bằng Hind III
- cho băng khỏang 1,4 kb. Còn nếu cắt bằng cả 2 sẽ cho 3 băng kích thước khỏang 0,3 kb, 0,5 kb và
0,9 kb. Kết quả cắt bằng cả 2 enzyme trên nhận được phổ điện di sau.
Hình 9.10: Phổ điện di sản phẩm DNA plasmid xử lý bằng enzyme giới hạn
Giếng 1: Marker (thang DNA chuẩn) Giếng
2: DNA xử lý bằng Bam HI Giếng 3: DNA
xử lý bằng Hind III
Giếng 4: DNA xử lý bằng Bam HI và Hind III
Trên điện di đồ thấy DNA plasmid sau khi cắt bằng Bam HI cho băng kích thước khỏang 1,2 kb. Cắt
bằng Hind III cho băng khỏang 1,4 kb. Khi cắt bằng cả 2 cho 3 băng: 0,3kb, 0,5 kb và 0,9 kb. Kết quả
hòan tòan khớp với tính tóan theo lý thuyết, chứng tỏ dòng plasmid đã chọn có chứa đọan gen rRNA
18S. Các tế bào này được nhân lên, tách DNA plasmid lượng lớn để đọc trình tự đọan gen rRNA 18S.
TÓM TẮT
Trong bài này, sinh viên làm quen và nắm được bản chất của phương pháp phân lọai học phân tử.
Sự khác biệt của phương pháp phân lọai học phân tử so với các phương pháp phân lọai học truyền
thống. Các phương pháp thường sử dụng trong phân lọai học phân tử. Nắm được lý do thường sử
dụng trong phân lọai học phân tử gen 16S và 18S ribosome RNA.
Nắm được sơ đồ giám định gen prokaryote theo 16S ribosome RNA gồm các bước thu nhận và tinh
sạch DNA, tiến hành PCR thứ tự gen 16S RNA. Xác định thứ tự nucleotide sản phẩm PCR và so sánh
với database để có kết luận định danh phân lọai.
Nắm được sơ đồ giám định gen eukaryote theo 18S ribosome RNA (từ lan hài
Paphiopedium) gồm các bước thu nhận và tinh sạch DNA, tiến hành PCR thứ tự gen
18S RNA. Xác định thứ tự nucleotide sản phẩm PCR và so sánh đặc điểm vị trí cắt đối với các enzyme
cắt giới hạn. Cuối cùng so sánh với database để có kết luận định danh phân lọai.
Câu 1: So sánh phương pháp phân lọai học truyền thống và phương pháp phân lọai học phân tử?.
Câu 2: Trình bầy cơ sở khoa học của phương pháp phân lọai học phân tử trong phân lọai cơ thể
prokaryote và eukaryote?.
Câu 3: Trình bầy các phương pháp phân lọai học phân tử?.
Câu 4: Nêu lý do sử dụng các gen 16S, 18S ribosome RNA và gen ty thể trong phân lọai học phân
tử?.
Câu 5: Nêu sơ đồ các bước thực hiện trong phân lọai học phân tử?.
164 TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, “Giáo trình sinh hóa hiện đại”, NXB Giáo dục, 1998.
2. Hồ Hùynh Thùy Dương, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục, 1998.
3. R. Boyer, Modern Experimental Biochemistry, 2000.
4. 4.Lê Trần Bình và cộng sự, Ap dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật
Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, 2003.
5. Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình “Hóa sinh đai cương”, 2011
6. Nguyễn Tiến Thắng, Giáo trình “Phương pháp phân tích trong CNSH”, 2011

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC HIỆN ĐẠI

MỤC LỤC .................................................................................................................. I

NỘI DUNG MÔN HỌC

KIẾN THỨC TIỀN ĐỀ

YÊU CẦU MÔN HỌC

CÁCH TIẾP NHẬN NỘI DUNG MÔN HỌC

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC

Môn học được đánh giá gồm:

BÀI 1: QUY ĐỊNH AN TOÀN VÀ

1. Phải luôn đeo kính phòng hộ khi làm thí nghiệm.

2. Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm.

4. Nghiêm cấm ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.

5. Nghiêm cấm thực hành thí nghiệm chưa được dạy.

1.2 RỬA DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

Hình 1.3: Thao tác lấy dịch bằng pipet tự động

1.3 CHUẨN BỊ VÀ BẢO QUẢN HÓA CHẤT

Hình 1.5. Hệ thống thu nhận nước thẩm thấu ngược

Chuẩn bị dịch và bảo quản hóa chất:

CÂU HỎI ÔN TẬP

BÀI 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN

TRONG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- Biết khái niệm về đầu dò sinh học

- Nắm được kỹ thuật đông khô, sấy phun

- Hiểu được cách xác định trọng lượng đại phân tử

2.1 ĐO PH, DUNG DỊCH ĐỆM VÀ ĐIỆN CỰC

Bảng 1.2: Điện cực ion đặc hiệu

Hình 2.4: Sơ đồ họat động của đầu dò sinh học

2.3 CÁCH THỨC THỂ HIỆN NỒNG ĐỘ

- Nồng độ % tính theo thể tích, là số g trong 100 ml

- Nồng độ mol (M), là số gram mol/1 lít.

2.4 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ

(NH4)2SO4 + NaOH  NH4OH + Na2 SO4

HOOC-CH(R)-NH2 + HCHO  HOOC-CH(R)-N=CH2 + H2O R-

2.5 ĐỊNH LƯỢNG CARBOHYDRATE

Phân tích thành phần đường trong dung dịch

Hình 2.6: Sơ đồ họat động của phân cực kế

2.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPID

Hình 2.8: Hệ soxhlet cổ điển và máy chiết lipid hiện đại

Phân tích thành phần lipid

Hình 2.10: Thiết bị cô quay chân không

Rf = Khỏang di chuyển của cholesterol ester/Khỏang di chuyển của dung môi =

Hình 2.13: Sơ đồ phân tích acid béo

2.7 THẨM TÍCH VÀ SIÊU LỌC

Hình 2.14: Hệ thống thẩm thấu

Opaque, Rigid, Opaque, Flexible,

Molecular Weight Cut Off (MWCO)

Hình 2.15: Thiết bị lọc và phụ kiện

Hình 2.17: Hệ thống lọc màng phòng thí nghiệm

Hình 2.18: Sơ đồ cấu tạo máy ly tâm liên tục

2.8 ĐÔNG KHÔ VÀ SẤY PHUN

khỏang 5-25 mm Hg. Kết quả nhận được sinh khối

Hình 2.30: Máy đông khô do hãng Savant sản xuất

2.10 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG BIOPOLYMER

MW protein bằng phương pháp hóa học Xác định MW protein

theo thành phần hóa học

protein = W nguyên tố/hàm lượng % x 100

MW min. = (14/19,17) x 100 = 73. Do lysine chứa 2 N, nên MW cùa Lysine sẽ là

Dựa vào áp suất thẩm thấu

Xác định MW protein bằng siêu ly tâm

khỏang từ 1S – 200S. Thí dụ rRNA của E.coli có MW 5S, có hệ số lắng là 5 x 10-13 s.