ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KỸ THUẬT LÊN MEN

CÔNG NGHIỆP
(Bản thảo)

TS. HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2016

 MỤC LỤC
1. Khái niệm lên men ............................................................................................3
2. Ứng dụng của các quá trình lên men ................................................................4
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật ........................................................................4
2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật ..........................................................................4
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật ............................................................4
2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp ..................................................................5
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp .......................................................................8
3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men .................................................8
CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG
QUÁ TRÌNH LÊN MEN 10
1. Phân loại phương pháp lên men ........................................................................ 10
2. Phương pháp lên men mẻ .................................................................................. 10
3. Phương pháp lên men liên tục ........................................................................... 14
4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)................................................. 16
5. Lên men mật độ cao ........................................................................................... 19
CHƯƠNG 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ...................... 20
1. Giới thiệu ............................................................................................................ 20
2. Các công đoạn của qui trình lên men ................................................................. 21
3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men ............................................ 29
CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ....... 34
1. Giới thiệu ............................................................................................................ 34
2. Thiết kế môi trường lên men ............................................................................. 35
3. Các thành phần của môi trường lên men........................................................... 38
4. Đánh giá môi trường .......................................................................................... 52
5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột ............................. 52
6. Xử lý mật rỉ mía đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men ................. 54
CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP ........................... 56
1. Mục đích khử trùng trong lên men .................................................................... 56
2. Yêu cầu khi khử trùng ........................................................................................ 57
3. Phương pháp khử trùng..................................................................................... 57
4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt ........................................................ 59
5. Khử trùng môi trường........................................................................................ 62
5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục .......................................................... 63
5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ ................................................................. 66
6. Khử trùng nồi lên men ....................................................................................... 66
7. Lọc không khí ..................................................................................................... 68
CHƯƠNG 6. KIỂM SOÁT NUÔI CẤY ................................................................... 70
1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào ............................................................................ 70
2. Kiểm soát pH ...................................................................................................... 74
3. Kiểm soát nhiệt độ ............................................................................................. 75
4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men .................... 78
5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men .... 82
6. Phá bọt trong quá trình lên men ........................................................................ 85
6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt.............................................................. 85
6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt ................................................................... 86
6.3. Kiểm soát bọt ................................................................................................ 86
7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men .............................................................. 89

1
 1. Nồng độ sản phẩm........................................................................................... 89
2. Sản lượng ........................................................................................................ 89
3. Hiệu suất ......................................................................................................... 90
CHƯƠNG 7. TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN ............................................... 95
1. Cải tiến giống ...................................................................................................... 95
2. Cải tiến thiết bị ................................................................................................... 96
3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy ......................... 96
4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho lên men
.............................................................................................................................. 102
CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG CHỐNG TẠP
NHIỄM TRONG LÊN MEN .................................................................................. 103
1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn .................................................................... 103
2. Phát hiện tạp nhiễm ......................................................................................... 103
3. Nguyên nhân tạp nhiễm ................................................................................... 104
4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men ............................................... 105
5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm .............................................. 106
6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm ........................ 108
CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN ........................... 109
1. Giới thiệu ....................................................................................................... 109
2. Các phương pháp tách tế bào........................................................................... 113
2.1. Phương pháp lắng tủa ............................................................................... 113
2.2. Phương pháp ly tâm .................................................................................. 113
2.3. Phương pháp lọc........................................................................................ 114
2.4. Phương pháp tạo bọt ................................................................................. 118
3. Phương pháp phá màng tế bào ........................................................................ 119
3.1. Phương pháp vật lý ................................................................................... 119
3.2. Phương pháp hóa học................................................................................ 123
- Dùng dung môi........................................................................................... 126
3.3. Phương pháp sinh học-Enzyme ................................................................ 126
4. Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm .................................................. 127
4.1. Phương pháp chiết lỏng - lỏng .................................................................. 127
4.2. Phương pháp thẩm tích ............................................................................. 128
4.3. Phương pháp kết tủa ................................................................................. 130
5. Phương pháp sắc ký tinh sạch sản phẩm lên men ........................................... 134
5.1. Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion
Chromatography)............................................................................................. 135
5.2. Sắc kí ái lực (Affinity Chromatography) ................................................... 137
5.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion .............................................................. 138
CHƯƠNG 10. XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN ...................... 141
1. Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý................................... 141
1.1. Giới thiệu ................................................................................................... 141
1.2. Các phương pháp xử lý chất thải............................................................... 143
2. Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp............................ 147
3. Triết lý “không phát thải”................................................................................. 148
CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG ................................................................... 149
1. Bài tập............................................................................................................... 149
2. Bài giải .............................................................................................................. 151
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 157
PHẦN PHỤC LỤC ................................................................................................ 158

2
 CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG

1. Khái niệm lên men

Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có
nghĩa là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men
trong dịch chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch. Hiện tượng sôi bọt này là do
CO2 sinh ra bởi sự phân giải hiếu khí của các loại đường có trong dịch chiết. Tuy
nhiên, đối với các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn
có ý nghĩa khác. Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự
sinh năng lượng bởi quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về
phương diện vi sinh vật học trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn.
Sự phân giải đường là một quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các
phân tử pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị
oxy hoá cho các quá trình tiếp theo. Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa các phân
tử pyridine nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống
cytochrome mà trong đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy
nhiên, trong điều kiện kỵ khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn
ra cùng với sự khử của một hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian
của một quá trình phân giải. Đối với trường hợp về sự hoạt động của nấm men
trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự
khử của acid pyruvic thành ethanol. Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng
khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau và rất đa dạng. Do vậy, thuật ngữ lên
men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là một quá trình sinh năng lượng
trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho vừa là chất nhận điện tử.
Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết
đại mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và
đã trở thành chất trao đổi của vi sinh vật được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Do
vậy, các nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả
bất kỳ qui trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật.
Việc sản xuất bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men
theo cả nghĩa về sinh hoá học và vi sinh vật học. Trong tài liệu này, thuật ngữ lên
men được sử dụng theo nghĩa rộng bao hàm cả hai.
Cần phân biệt các khái niệm:

Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùng

Lên men (sinh hoá) Chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ
Hô hấp hiếu khí Chất hữu cơ Oxygen
Hô hấp kỵ khí Chất hữu cơ Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate)
Thuật ngữ lên men mở rộng bao gồm cả ba khái niệm trên.

3
2. Ứng dụng của các quá trình lên men
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật
Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình
chính. (1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào
vi sinh vật dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn
bào). Nấm men bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm
1900 và nấm men được sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong
Đại thế chiến thứ I. Tuy nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi
sinh vật mới được khai thác mạnh mẽ. Và do vậy từ những năm 1970, các qui
trình sản xuất liên tục theo qui mô lớn đã được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh
khối vi sinh vật phục vụ cho chăn nuôi và thực phẩm cho con người.

2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật

Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy
nhiên, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội hơn do có thể sản xuất với
lượng rất lớn bằng kỹ thuật lên men. Bên cạnh đó, nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật
DNA tái tổ hợp nên có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động vật bằng các
chủng vi sinh vật. Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp thực
phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1. 1). Quá trình nuôi cấy
vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ. Ngày nay, người ta
sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của
các chủng như tăng cường chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp
gene.

2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật

Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một
chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong
các phase khác nhau của đường cong tăng trưởng. Ở log phase, sản phẩm được
sinh ra chủ yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids,
nucleotides, lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm
sơ cấp của sự biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase.

Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất
bằng phương pháp lên men (Bảng 1. 2).

Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ
đủ cho nhu cầu trong tế bào của chúng. Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật
học công nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện
nuôi cấy cần thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này.

Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng
không tổng hợp được trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối

4
với quá trình biến dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp,
và phase này gọi là idiophase. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên
ở tốc độ thấp, điều này khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase
chiếm ưu thế hơn trophophase. Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng
thứ cấp, ví dụ như đối với trường hợp của vi khuẩn Enterobacteriaceae thì không
tìm thấy có sản phẩm thứ cấp. Đôi khi rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ
cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp của những hợp chất nhất định có thể
thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.

Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được
tranh luận nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các chất
trao đổi trung gian nhiều hơn. Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính
kháng khuẩn, là các enzyme ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều
chất có dược tính. Do vậy, sản phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ
sở của nhiều qui trình lên men khác nhau. Cũng giống như trường hợp đối với các
chất trao đổi sơ cấp, các chủng vi sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp
các chất trao đổi thứ cấp với nồng độ thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi
sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và hệ thống phản hồi.

2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứng dụng
của công nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc
sống của con người. Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế
bào vi sinh vật và các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại. Có
nhiều chủng vi sinh vật khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống
biểu hiện bao gồm E.coli, Sac. cerevisiae và các nấm sợi. Các sản phẩm được sinh
ra từ các chủng được biến đổi di truyền gồm: interferon, insulin, albumin của
huyết thanh người, các nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và
somatostatin của bò. Khi thiết kế các hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp
cần chú ý đến một số vấn đề: sự tiết của sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản
phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp trong toàn bộ tiến trình lên men, cũng như
tối ưu hóa biểu hiện của gene ngoại.

5
Bảng 1. 1. Các ứng dụng của enzyme trong thương mại.
Công nghiệp Ứng dụng Enzyme Nguồn gốc
Công nghiệp bánh mì Giảm độ nhớt trong quá trình nhào bột, tăng cường độ mềm Amylase Nấm
và xay bột mại, và duy trì độ tươi của bột
Cải thiện cấu trúc, giảm thời gian trộn, tăng thể tích của ổ Protease Nấm/vi khuẩn
Công nghiệp bia bánh mì Amylase Nấm/vi khuẩn
Tăng cường độ nghiền nhừ Protease Nấm/vi khuẩn
Chống lại ảnh hưởng của khí lạnh b-glucanase Nấm/vi khuẩn
Công nghiệp ngũ cốc Cải thiện độ lọc tinh Amylase Nấm
Trong chế biến socola Xử lý các thực phẩm ăn nhanh Pectinase Nấm/vi khuẩn
Coffee Sản xuất các dịch si-rô Pectinase Nấm
Trong xay café Lên men hạt cà-fé Pectinase, hemicellulase Nấm
Làm chế phẩm cà-fé cô đặc Invertase, pectinase Nấm/vi khuẩn
Sản xuất các lọai bánh kẹo
Siro bắp Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao Amylase Nấm
Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp Amylase Vi khuẩn
Sản xuất glucose từ siro bắp Amyloglycosidase Nấm
Sản xuất siro fructose Glucoseisomerase Vi khuẩn
Chế biến sữa Sản xuất dịch thủy phân protein Protease Nấm/vi khuẩn
On định sửa bay hơi Protease Nấm
Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng Lactase Nấm men
động lạnh
Sản xuất sữa thô Protease Nấm/vi khuẩn
Trong chiên-xào Tách lọai glucose Glucose oxidase Nấm
Nước ép trái cây Làm trong các loại dịch Pectinase Nấm
Loại oxygen Glucose oxidase Nấm
Giặt ủi Sử dụng làm chất tẩy Protease, lipase Vi khuẩn
Thuộc da Chống mọc lông Protease Nấm/vi khuẩn
Thịt Làm mềm mại Protease Nấm

6
Trong y dược Hổ trợ tiêu hóa Amylase, protease Nấm
Chống đông máu Steptokinase Vi khuẩn
Trong các thử nghiệm lâm sàng Numerous Nấm/vi khuẩn
Tráng ảnh Thu hồi bạc từ film đã sử dụng Protease Vi khuẩn
Dịch thủy phân protein Trong sản xuất dịch thủy phân Proteases Nấm/vi khuẩn
Chế biến thức uống Tạo sự ổn định Glucose oxidase, catalase Nấm
Công nghiệp dệt Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi Amylase Vi khuẩn
Rau quả Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ Pectinase, amylase, Nấm
cellulase

Bảng 1. 2. Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại
Chất trao đổi sơ cấp Ý nghĩa thương mại
Ethanol Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu.
Citric acid Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Glutamic acid Chất tăng vị
Lysine Chất hổ trợ thực phẩm
Nucleotides Chất tăng vị
Phenylalanine Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt
Polysaccharides Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo
Vitamins Chất hổ trợ thực phẩm

7
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp
Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một
cấu trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính
đặc trưng vị trí và lập thể cao. Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình
hóa học và cho phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở
những vị trí đặc trưng nhất định trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến
các hoá chất. Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử
hydrogen, phản ứng oxy hoá, phản ứng hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng
khử carboxyl, amin hoá, khử amin, phản ứng chuyển vị. Các quá trình chuyển hóa
nhờ vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa là thực hiện ở nhiệt độ và áp suất
phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như các kim loại nặng.

3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men

Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô
tả trong Bảng 1. 3. Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn
1900 được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới
hạn ở dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn.
Bảng 1. 3. Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men.

8
 Kiểm soát Các thiết
Giai đoạn Sản phẩm chính Loại bồn Kiểm soát quá trình Phương pháp nuôi cấy Chọn lọc giống
chất lượng bị pilot
- Bằng gỗ, đạt đến 1500 Sử dụng thiết bị đo Nấm men thuần
Hầu như không
Alcohol barrels nhiệt độ, báo mực, Dạng mẻ Không có nhất sử dụng ở
kiểm soát
- Bằng đồng thau trao đổi nhiệt Carlberg (1886)
1. Trước 1900
Bằng các thùng phuy, khay
Hầu như không Chọn lọc chủng
Dấm hay trong các lớp lọc chảy Dạng mẻ Không có
kiểm soát lên men dấm tốt
dòng
Bồn bằng kim loại 200m3 cho
sản xuất acetone/butanol
Nấm men bánh mì, Sử dụng đầu dò pH, Hầu như
Sử dụng hệ thống phân phối Dạng mẻ và hệ thống Hầu như không Sử dụng giống
2. 1900-1940 glycerol, citric acid, lactic đầu dò kiểm soát không
Khuấy trộn được sử dụng fed- batch kiểm soát thuần nhất
acid, acetone/butanol nhiệt độ có
trong trường hợp bồn lên men
có kích thước nhỏ.
Pennicillin, Streptomicin Sử dụng đầu dò pH,
các kháng sinh khác DO có thể thanh - Thông thường là dạng mẻ
Các bồn lên men có trang bị hệ Sử dụng các
gibberelin, trùng được. Sử dụng và fed-batch. Trở nên
thống sục khí, vận hành trong chương trìnhđột
3. 1940 đến nay amino acid, các thiết bị kiểm - Phát triển nuôi cấy liên Rất quan trọng thông
điều kiện vô trùng- đúng nghĩa biến và chọn lọc
nucleotides, soát mà sau này có tục cho lên men bia và một dụng
bồn lên men cơ bản
các chất chuyển hoá, thể kiểm soát trên vài chất trao đổi sơ cấp
enzyme máy tính
Sử dụng máy tính
Sinh khối đơn bào, Các bồn lên men chịu áp lực, Nuôi cấy liên tục với việc
kiểm Rất quan Sử dụng kỹ
4. 1964- nay protein, hydrocarbon, các được thiết kế để giải quyết vấn hồi lưu môi trường nuôi Rất quan trọng
soát các thông số trọng thuật di truyền
chất phục vụ chăn nuôi đề trao đổi khí, nhiệt độ cấy
vận hành
Sản xuất các protein khác Sử dụng nồi lên men được phát Phát triển các điều Dạng mẻ, fed-batch, hoặc Rất quan trọng Rất quan Sử dụng kỹ
dòng (heterologous) bởi vi triển trong giai đoạn 3, 4. Và kiện kiểm soát và liên tục. trọng thuật tái tổ hợp
sinh vật và tế bào động vật, phát triển thêm nồi nuôi cấy tế đầu dò như trong Phát triển nuôi cấy liên tục
5. 1979- nay
Sản xuất kháng thể đơn bào động vật giai đoạn 3, 4 dạng chảy tràn để nuôi cấy
dòng bởi tế bào động vật tế bào động vật

9
CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
1. Phân loại phương pháp lên men

Tuỳ theo đặc điểm mà việc phân loại lên men có khác nhau
1. Theo tính chất môi trường: lỏng; rắn; bán rắn
2. Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí; lên
men kỵ khí
3. Theo trạng thái: trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); trạng thái
động (có khuấy trộn/sục khí)
4. Theo mức độ kiểm soát của qui trình: có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất,
pH,…); không kiểm soát (tự nhiên)
5. Theo qui trình lên men: lên men theo mẻ (batch); lên men theo dạng liên
tục (continuous); lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ
sung)
Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên
men theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh
giá đối với các phương pháp lên men còn lại.

2. Phương pháp lên men mẻ

Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ
chất dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn
phase khác nhau.
Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có
sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong
môi trường mới. Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn thời gian của phase này
càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng
trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm quan tâm. Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích
nghi, tăng trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b).
Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình toán
học sau:
dx/dt = µx (2.1)
Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc
độ tăng trưởng đặc trưng (hr-1), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong
chu kỳ tăng trưởng.

10
 Xo, So
Moâi tröôøng

X, Sr

Hình 2. 1. Hệ thống lên men theo phương pháp mẻ.

Từ phương trình trên ta có:
dx/x = µdt
t t
 ∫ dx / x = µ ∫ dt
to to

 (ln xt - ln x0) = µ (t - t0) (2.2)

x0: lượng sinh khối ban đầu, xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ).

0.8
Ln(noàng ñoä teá baøo)

0.6
(a) (b) (c) (d)

0.4

0.2

Thôøi gian nuoâi caáy (giôø)

0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

Hình 1. 1. Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi nuôi cấy dạng mẻ. (a) lag-
phase, (b) log- phase, (c) phase ổn định, (d) phase suy vong.
Trong log- phase, giàu dinh dưỡng, µ sẽ đạt µmax. Mỗi chủng vi sinh vật trong
những điều kiện tối thích nhất định sẽ có µmax khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ
thuộc rất lớn vào nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy và thành phần các sản
phẩm do chính hoạt động của vi sinh vật tạo ra trong môi trường. Nếu duy trì việc bổ

11
sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy thì tăng trưởng sẽ vẫn đạt được ở tốc độ
cao.

Bảng 2. 1. Một số giá trị µmax của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy đặc
trưng.

Chủng vi sinh vật µmax (giờ-1) Nguồn tham khảo

Vibrio natriegents 4,24 Eagon (1961)
Methylomonas methanolytica 0,53 Dostalek et al (1972)
Aspergillus nidulans 0,36 Trinci (1969)
Penicilium chrysogenum 0,12 Trinci (1969)
Fusarium graminearum Schwabe 0,28 Trinci (1992)
Nuôi cấy tế bào thực vật 0,01-0,046 Petersen & Alfermann (1993)
Nuôi cấy tế bào động vật 0,01-0,05 Lavery (1990)

Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2
theo phương trình:
N = N0 × 2n (2.3)
trong đó, N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ.
 lg(N/N0) = n.lg2
 n = 3,32 × lg(N/N0) (2.4)
Thời gian thế hệ tg
tg = t/n (2.5)
với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ.
Đối với vi khuẩn tg thường khoảng 20-60 phút, đối với nấm men tg thường
khoảng 1-3 giờ.
Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy
k = 1/g = n/t (2.6)
Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có
thể mô tả bằng phương trình:
x = Y×(si - sr) (2.7)
trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng
cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại. Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng
lại khi sr = 0 hoặc khi mà trong môi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại
cho chủng. Giá trị Y nhằm giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một cơ chất thành sinh

12
khối vi sinh vật. Do vậy có thể dùng Y để tính toán lượng cần thiết của một cơ chất
khi muốn tổng hợp một lượng sinh khối nhất định. Hiệu suất Y không phải là một
hằng số ổn định mà thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH,
hàm lượng oxygen hoà tan, sự giới hạn của các cơ chất,... Sự suy giảm tăng trưởng
phụ thuộc vào cơ chất giới hạn khi cạn kiệt trong môi trường có thể được mô tả theo
phương trình (theo Monod, 1942):
µ = µmax× sr/(Ks + sr) (2.8)
Trong đó Ks là hằng số sử dụng cơ chất, Hình 2. 2. Đối với một cơ chất nhất
định thì mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau (Bảng 2. 2).
Khi sr = Ks thì µ = 1/2µmax. Khi µ = 0, bước vào giai đoạn phase ổn định. Đây là
giai đoạn chính của việc sản xuất các chất trao đổi.

Bảng 2. 2. Một số giá trị Ks của một số chủng vi sinh vật thông thường.

Chủng vi sinh vật Cơ chất Ks (mg/dm3) Tham khảo

E.coli Glucose 6,8.10 -2 Shehata and Marr (1971)
Sac. cerevisiae Glucose 25,0 Pirt and Kurowski (1970)
Pseudomonas sp. Methanol 0,7 Harison (1973)
Noàng ñoä cô chaát giôùi haïn

si

Ks

sr

Thôøi gian nuoâi caáy

Hình 2. 2. Sơ đồ biểu thị trị số Ks.

Sự thay đổi hàm lượng các chất trao đổi có thể biểu diễn:
dp/dt = ρx (2.9)
trong đó, p là nồng độ sản phẩm, ρ là tốc độ sinh tổng hợp đặc trưng. Mặt khác, sự
tạo thành sản phẩm tùy thuộc vào hoạt tính của chủng (hiệu suất trên một đơn vị tế
bào):
dp/dx = Yp/x (2.10)
với Yp/x là hiệu suất tạo sản phẩm trên một đơn vị sinh khối (năng suất sản xuất).

13
 Từ hai phương trình trên ta có:
dx/dt = ρx/Yp/x
mà dx/dt = µx
Do vậy ta có: ρ = µ × Yp/x (2.11)
Như vậy tốc độ sản xuất đặc trưng phụ thuộc vào µ, và đạt giá trị cao nhất khi µ =
µmax.

3. Phương pháp lên men liên tục

Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase,
log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase
được duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được
lặp đi lặp lại cho đến khi nồi lên men đầy. Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt
thêm hệ thống thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở
mức độ ổn định cao nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân
bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu.
Ta có:
D = F/V (2.12)
Trong đó, F: tốc độ nạp liệu (KL/hr), V là thể tích dịch lên men trong nồi (KL), D là độ
pha loãng (giờ-1).
Sự thay đổi mật độ tế bào trong dịch lên men có thể biểu diễn:
dx/dt = growth – output
dx/dt = µx – Dx (2.13)
Trong điều kiện ổn định, nồng độ tế bào trong dịch không đổi, dx/dt = 0.
Lúc đó: µ = D (2.14)
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng và như vậy trong
nuôi cấy liên tục thì µ ≤ µmax.
Trong một số trường hợp, người ta dùng D để kiểm soát µ. Tăng trưởng của vi
sinh vật trong nuôi cấy liên tục được điều khiển bởi các chất trong thành phần của
môi trường nuôi cấy. Lên men theo cách này còn được gọi là chemostat. Theo Monod
ta có:
µ = µmax. s /(Ks + s ) (2.15)
Ở trạng thái cân bằng, D = µ, nên D = µmax. s r/(Ks + s r), s r: nồng độ cơ chất ở
trạng thái cân bằng.
 s = Ks × D/(µmax - D) (2.16)
Như vậy, nồng độ cơ chất còn lại phụ thuộc vào độ pha loãng. Trong thực tế,
điều này xảy ra do sự tăng trưởng của tế bào làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng khi mà

14
nguồn cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha loãng. Nếu tốc độ sử dụng
cơ chất của vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng trưởng tế bào thì một số
đặc điểm sau sẽ xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha loãng, và
do vậy tế bào sẽ bị chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng
được sinh ra. Điều này gây nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men. Nồng độ
cơ chất trong nồi lên men sẽ tăng dần vì trong nồi lên men còn ít tế bào hơn để sử
dụng. Khi nồng độ cơ chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao
hơn tốc độ pha loãng và khi đó, sinh khối tăng dần lên và trong trường hợp này thì
trạng thái ổn định mới được thiết lập.

x, So, F x, So, F

Moâi tröôøng Moâi tröôøng

x, Sr, F x, Sr, F
Theå tích
dòch, V

(A) (B)

S, F
x, So, F

Moâi tröôøng

x, Sr, F

Theå tích
dòch, V

(C)

Hình 2. 3: Sơ đồ hệ thống lên men liên tục.

(A): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, không hồi lưu sinh khối;

15
 (B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối;
(C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng.

Do vậy, người ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới
hạn dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng
đặc trưng phụ (sub- µmax).
Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng ( x ) có thể được
biểu diễn:
x = Y × (si + sf - sr) (2.17)
Phương trình tạo sản phẩm:
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);
 dp/dt = ρ.x – D.p (2.18)
Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0. Khi đó:
 p = ρ × x /D (2.19)
trong đó p là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định. Trong nuôi cấy liên tục, người
ta còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:
1. Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa
ngay vào một hệ thống lên men khác. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay
đổi được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men.
2. Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: Dịch chiết ra
trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn.
Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng
cường được sản lượng của hệ thống. Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế
bào rồi cho hồi lưu vào hệ thống. Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế
bào theo dịch chiết và vấn đề chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là
một trở ngại lớn.

4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)

Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung
vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá
trình nuôi cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên
men. Các cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống
như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn. Đối với cơ
chất giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban
đầu, hoặc (3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc. Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2)

16
gọi là mẻ-bổ sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ-bổ sung cố
định thể tích.

4.1. Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích

Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem như
hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất. Sinh khối tại
bất kỳ thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình:
xt = xo + Y(si - sr) (2.20)
trong đó xo là nồng độ giống nạp vào hệ thống.
Khi sr = 0 và xt = xmax; do x0 << xmax
 xmax = Y × si (2.21)
Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường được bổ sung vào với D < µmax thì toàn bộ
môi trường vừa mới được bổ sung sẽ được sử dụng ngay (ds/dt = 0), và ta có:
F.si = µ × (X/Y) (2.22) với X = x × V.

F F

xt, Sr
Vfeed

Vo, xo, So

(A) (B)

Hình 2. 4. Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung.

(A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích
(B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích

Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu
như không tăng (dx/dt = 0), do vậy µ = D. Đây được xem như là trạng thái cân bằng.
Khi thể tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy:
D = F/(V0 + F × t) (2.23)

17
 Theo phương trình Monod, Khi sr giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên. Tuy
nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si >> Ks
nên trong thực tế sr thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng
ổn định thì D < µmax và Ks << si.
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm trong hệ thống này tương tự như trong nuôi
cấy liên tục được biểu diễn theo cân bằng:
dp/dt = ρx – D.p (2.24)
Ở trạng thái cân bằng tức là lượng sản phẩm sinh ra cân bằng với độ pha
loãng do nạp dịch bổ sung vào thì nồng độ sản phẩm trong hệ thống sẽ không thay
đổi, dp/dt = 0, khi đó:
p = ρ.x/D (2.25)

4.2. Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích
Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp
nuôi cấy mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất
giới hạn đạt đến một mức nhất định. Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ
cao, không làm thay đổi đến thể tích dịch lên men. Động học trong hệ thống này
được mô tả như sau:
dx/dt = G.Y (2.26)
trong đó G là tốc độ nạp cơ chất.
Do dx/dt = µx, nên:
G.Y = µx
 µ = G.Y/x (2.27)
Nếu GY/x < µmax thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc
đó ds/dt = 0. Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên:
xt = x0 + G.Y.t (2.28)
Trong đó x0, xt là nồng độ tế bào khi bắt đầu và sau khi vận hành hệ thống mẻ-bổ
sung được t giờ nuôi cấy.
Khi x tăng lên, µ giảm dần. Nồng độ của cơ chất giới hạn hầu như không thay
đổi, sinh khối tăng dần và nồng độ các chất không giới hạn trong môi trường giảm
dần.
Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau:
dp/dt = ρ.xt (2.29)
dp/dt = ρ.(x0 + G.Y.t) (2.30)

18
5. Lên men mật độ cao
Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra
trong quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn
bị ban đầu. Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ
tăng trưởng là tốt nhất. Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng
trong quá trình nuôi cấy và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong
trường hợp nuôi cấy mẻ-bổ sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để
thể tích dịch lên men hoặc không thay đổi hoặc thay đổi ít.
Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay
ngoại bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ
sản xuất đặc trưng (ρ) nhất định:
ρ = (P/X)/t (2.31)
 P = ρ.X.t (2.32)
trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng
sinh khối tham gia sản xuất. Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần
phải tăng X.
X = x.V (2.32)
với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men. Do thể tích
dịch lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng
nồng độ tế bào x trong quá trình lên men.
Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có
thể tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề
sau.

19
CHƯƠNG 3. QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

1. Giới thiệu
Trong phần này, chúng ta tập trung phân tích qui trình lên men công nghiệp
theo phương pháp chìm, hiếu khí, có kiểm soát vì đây là qui trình bao gồm đầy đủ
các thành tố của một qui trình lên men tiêu chuẩn. Qui trình này thường bao gồm các
công đoạn sau:
- Giữ giống
- Hoạt hóa giống
- Nhân giống (sơ cấp, thứ cấp)
- Lên men sản xuất
- Thu hồi sản phẩm lên men
- Xử lý các chất thải sinh ra trong quá trình sản xuất sản phẩm lên men
Tùy theo chủng vi sinh vật, yêu cầu của sản phẩm mục tiêu và hệ thống công
nghệ thiết bị mà điều kiện của từng bước trong qui trình lên men có thể khác nhau.
Tuy nhiên, để đảm bảo được hiệu quả sản xuất tốt và ổn định nhất thì toàn bộ các
hoạt động có liên quan đến lên men có một đặc điểm chung là cần được thực hiện
trong điều kiện có kiểm soát vô trùng.
Nếu không đề cập đến các yếu tố về kiểu nồi lên men, về cơ bản một hệ thống
lên men bao gồm sáu thành phần sau:
1. Công thức môi trường sử dụng trong qui trình nuôi cấy vi sinh vật từ giai
đoạn nhân giống cho đến giai đoạn lên men sản xuất.
2. Điều kiện vô trùng của môi trường nuôi cấy, nồi lên men và các thiết bị liên
quan trong hệ thống.
3. Bảo đảm nhân giống đủ số lượng với độ thuần nhất và chất lượng cao
trước khi nạp vào nồi lên men chính.
4. Sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật trong sản xuất dưới điều kiện tối ưu
để tạo thành các sản phẩm mong muốn.
5. Chiết tách, tinh sạch và kết tinh sản phẩm.
6. Xử lý chất thải của quá trình sản xuất.

Các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau theo một qui trình được mô tả
trong Hình 3. 2. Từng yếu tố độc lập có thể được nghiên cứu cải tiến phù hợp để cuối
cùng nâng cao hiệu quả sản xuất của toàn hệ thống.
Trước khi tiến hành xây dựng hệ thống lên men cần phải chọn lọc chủng giống
vi sinh vật bảo đảm sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn với hàm lượng cao.

20
Việc chọn lọc chủng giống thường được thực hiện bởi các phòng nghiên cứu có năng
lực và kinh nghiệm trong lĩnh vực phát triển chủng giống. Ngoài ra, cần phải thực
hiện đánh giá hiệu quả và tính ổn định của chủng trước khi đưa vào ứng dụng cho
sản xuất. Việc tuyển chọn chủng giống phục vụ sản xuất công nghiệp dựa trên một số
tiêu chí sau:
- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ tiền)
- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi
phí hệ thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)
- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng
- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao
Dựa vào loại sản phẩm lên men và các yêu cầu về độ tinh sạch của sản phẩm,
hệ thống thu hồi chiết tách và tinh sạch sản phẩm được thiết kế để bảo đảm hiệu
suất cao, đạt tiêu chuẩn như mong muốn. Trong quá trình vận hành sản xuất, cả ba
yếu tố chính: chủng giống, qui trình lên men, qui trình thu hồi cần phải được nghiên
cứu cải tiến liên tục nhằm thu nhận được nhiều sản phẩm với chất lượng cao.
Chủng giống vi sinh vật được thu thập (phân lập, tuyển chọn) và phân phối từ
các trung tâm lưu trữ giống danh tiếng trên thế giới (Xem phụ lục 4).

2. Các công đoạn của qui trình lên men

2.1. Giữ giống
Việc giữ giống có vai trò rất quan trọng đối với một qui trình lên men nhằm
bảo đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho nghiên cứu và sản xuất.
Quá trình giữ giống cần phải bảo đảm một số yêu cầu sau:
- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài, không xảy ra hiện tượng thoái
hóa giống, giảm khả năng tăng trưởng hoặc/và giảm năng lực sản xuất của giống.
- Không bị tạp nhiễm
Các phương pháp giữ giống khác nhau trong công nghiệp bao gồm:

a. Giữ giống ở nhiệt độ thấp

a1. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Giống vi sinh vật có thể được giữ
trên bề mặt môi trường thạch nghiêng (đối với các chủng hiếu khí) với nhiệt độ giữ
giống từ –20 ~ 50C. Trong quá trình giữ giống, phải cấy chuyền theo chu kỳ khoảng 6
tháng một lần. Phương pháp cấy chuyền tuy đơn giản nhưng lại có những nhược điểm
sau:
+ Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc.
+ Tốn nhiều công sức cấy chuyền.

21
 + Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy chuyền không thích
hợp.
+ Chủng vi sinh vật có thể bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến phát
sinh qua nhiều lần cấy chuyền.
+ Phải nghiên cứu, theo dõi môi trường và thời gian cấy chuyền thích hợp đối
với các chủng bảo quản.
+ Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản.
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền, giúp giữ giống trong
thời gian dài người ta thường giữ giống trên bề mặt môi trường thạch nghiêng có
phủ một lớp dầu bảo vệ, thời gian giữ giống có thể kéo dài đến 1 năm.
a2. Giữ giống trong nitơ lỏng (đông sâu). Khi giữ giống ở nhiệt độ thấp (-150 ~
-196oC), hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật giảm hẳn, hầu hết các phản ứng sinh
hoá đều không xảy ra, các phân tử nước tồn tại ở dạng liên kết hoặc tinh thể. Đây là
phương pháp giữ giống khá an toàn cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm mốc, nấm men, virus, tảo và cả tế bào động vật, thực vật. Tuy nhiên khi
giữ giống bằng phương pháp này thì tế bào có thể bị phá vỡ và làm tan mẫu trong
quá trình bảo quản lạnh do tích luỹ các chất điện giải và hình thành các tinh thể
nước trong tế bào. Thông thường người ta cho chủng vi sinh vật cần giữ phát triển
đến phase ổn định, bổ sung chất bảo vệ (thường là glycerol 10%; DMSO: dimethyl
sulfoxide), sau đó làm lạnh và giữ. Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp này khá tốn
kém cho thiết bị, nguồn nitơ lỏng và một số rủi ro về vấn đề an toàn như cháy nổ.

Hình 3. 1. Hệ thống bình nitơ lỏng dùng để giữ giống.

22
 b. Giữ trong điều kiện khử nước
b1. Nuôi cấy khô. Phương pháp này thường được áp dụng đối với bào tử nấm
sợi. Các bước tiến hành bao gồm ủ đất vô trùng với bào tử nấm khoảng vài ngày cho
phát triển, làm khô ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tuần, sau đó cất giữ ở điều kiện
không khí khô hoặc tủ lạnh.
b2. Giữ ở điều kiện khử nước trong giá thể
+ Giữ giống trong cát
Phương pháp này thường dùng để giữ các vi sinh vật có bào tử. Các bước tiến
hành như sau:
- Cát sông được đem rửa sạch bằng nước nhiều lần, sấy khô, rây để bỏ các hạt
lớn; xử lý ngâm trong HCl đậm đặc sau đó đem đun sôi 1-2 giờ, rửa nhiều lần cho
đến khi pH đạt trung tính, có thể trung hòa bằng NaOH hoặc NaHCO3 nếu pH còn
thấp; sấy khô 100oC từ 3 - 4 giờ; chia cát khô vào các ống nghiệm và khử trùng trong
tủ sấy 160 - 180oC từ 2-3 giờ hoặc khử trùng trong autoclave 130oC trong 90 phút.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra độ vô trùng bằng cách cho môi trường LB vào cát
đã vô trùng, nếu môi trường vẫn trong sau 48 giờ nuôi trong tủ ấm nghĩa là cát
không chứa các vi sinh vật lạ nên có thể dùng; nếu môi trường bị đục thì phải đem
cát khử trùng lại.
- Chuẩn bị bào tử: các chủng vi sinh vật được nuôi trên môi trường agar thích
hợp để tạo nhiều bào tử, thời gian thường đối với một số loài như sau: vi khuẩn 7
ngày, nấm mốc 7-8 ngày, xạ khuẩn 14 ngày.
- Trộn bào tử vào cát: cho 1-2g cát đã vô trùng vào ống giống vi sinh vật đã
hình thành bào tử dùng que cấy trộn đều bào tử với cát, tránh làm cát bị ướt quá vón
cục, cho cát đã có bào tử vào ống nghiệm vô trùng, đậy nút bông và cho vào tủ sấy,
giữ ở 40oC hoặc tủ sấy chân không có chất hút ẩm như CaCl2 trong thời gia 2-3 ngày
cho đến khi cát thật khô, dùng paraffin đặc đun nóng chảy phết lên nút bông để
tránh trường hợp hút ẩm trở lại, bảo quản trong phòng mát, hoặc trong tủ lạnh 4oC,
thời gian bảo quản từ 1 đến nhiều năm, giống trước khi dùng được cấy ria trên môi
trường thạch và chọn các khuẩn lạc điển hình.
+ Giữ giống trong đất
Một số vi sinh vật có bào tử Clostridium pastetianum thường được bảo quản
tốt trong đất. Các bước tiến hành: đất vườn đem nghiền nhỏ, rây lấy những hạt nhỏ
bằng nhau cỡ 1 mm. Nếu đất chua thì cần bổ sung 1-2% CaCO3 và thêm cát hoặc than
hoạt tính khoảng 2% để làm cho đất được tơi xốp. Cho vào mỗi ống nghiệm vô trùng
khoảng 1-2 g đất, đậy nút bông, khử trùng 121oC trong 1 giờ với 2 lần liên tiếp mỗi
lần cách nhau 24 giờ. Cần phải kiểm tra vô trùng trước khi đem trộn với bào tử vi

23
sinh vật, sấy khô, bảo quản như phương pháp bảo quản trong cát. Thời gian bảo
quản có thể đến 10 năm.
+ Giữ giống trên silicagel
Cách làm: Silicagel nghiền mịn cỡ 1 mm, phương pháp tương tự như giữ giống
trên cát.
+ Giữ giống trên hạt ngũ cốc
Các hạt như lúa, ngô, kê… đều có thể được sử dụng để giữ giống vi sinh vật.
Cách làm: chọn loại hạt tốt, loại bỏ tạp chất, rửa sạch cho vào nước sôi theo tỷ lệ
100g hạt / 30 ml nước sôi, khuấy đều, ngâm 30 phút, lọc bỏ nước, rải hạt lên khay
sạch để ráo nước, cho vào bình tam giác khoảng 15-16g/ bình 250ml, đậy nút bông,
khử trùng 121oC trong 40 phút, 3 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ. Bào tử của vi sinh
vật đem hòa vào nước vô trùng, dùng pipet cấy vào mỗi bình 3 ml, lắc đều nuôi ở
nhiệt độ thích hợp cho từng loại chủng trong thời gian 8-10 ngày, hằng ngày lắc nhẹ
để phá vỡ các khối hạt bết lại, làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm
còn khoảng 8%. Kiểm tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi dán
paraffin trên nút bông và bảo quản trong phòng mát.

b3. Phương pháp đông khô. Làm đông một dung dịch tế bào trong điều kiện
chân không, kéo theo sự thăng hoa của các phân tử nước. Huyền phù dịch nuôi cấy
được trong các môi trường bảo vệ như sữa, serum, hoặc glutamate natri, sau đó làm
đông khô và giữ trong tủ lạnh. Thời gian bảo quản có thể đến hơn 10 năm. Ưu điểm
của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyền
của vi sinh vật không bị biến đổi và thời gian giữ giống được kéo dài khá lâu, ít tốn
công sức để cấy chuyền nhiều lần.
Cách làm: nuôi vi sinh vật trên các môi trường thích hợp cho đến phase log, thu tế
bào và trộn với các chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2 ml huyền phù vi
sinh vật vào các ống đông khô chuyên dùng, cho các ống giống vi sinh vật đã chuẩn
bị vào làm lạnh trong băng khô cacbonic + cồn etylic ở nhiệt độ -70oC đến -80oC,
trong khoảng 1-5 phút. Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị đông khô
ở áp suất thấp, thời gian làm khô tùy thuộc vào thiết bị và số lượng giống cần làm
khô, trung bình 8-14 giờ, độ ẩm sau khi làm khô còn lại 1-4% . Để xác định độ ẩm
còn lại người ta dùng chất chỉ thị là CoCl2 tẩm trên các miếng giấy lọc, sấy khô và bỏ
các miếng giấy có tẩm CoCl2 vào các ống nghiệm kiểm tra, nếu giống đã được làm
khô thì giấy có màu xanh còn nếu độ ẩm còn thì miếng giấy sẽ có màu hồng. Các ống
giống khi đã khô được hàn kín để tránh bị ẩm trở lại và có thể bảo quản ở nhiệt độ
phòng hoặc trong tủ lạnh. Một số chất bảo vệ được trộn vào giống vi sinh vật để khi
đông khô tế bào không bị chết do sự hình thành các tinh thể nước cũng như chống

24
các quá trình oxy hóa… Ví dụ trong trường hợp giữ giống vi khuẩn Lactobacillus
bằng phương pháp đông khô, các dung dịch bảo vệ thường được dùng:
Glutamate 3%
Lactose 8% + pepton 1,2%
Vitamin C 0,5 % + thiourea 0,5% + NH4Cl 0,05%
Saccharose 8% + sữa 5% + getalin 1,5%

25
 Nuoâi caáy
gioáng goác
(5-10mL)

Nuoâi caáy laéc Nguyeân lieäu

(200-1000mL)

Moâi tröôøng

Thanh truøng

Noài nuoâi
caáy maàm
(10-100L)

Ly taâm/loïc

Sinh khoái Dòch noãi

M
Khí vaøo
Dòch sau nuoâi caáy

Xöû lyù nöôùc thaûi

Chieát xuaát saûn phaåm

Tinh cheá saûn phaåm

Ñoùng goùi
Noài leân
saûn xuaát
(> 1000L) Thaønh phaåm

Hình 3. 2. Sơ đồ lưu trình hệ thống lên men trong công nghiệp.

26
2. 2. Hoạt hóa giống
Hoạt hoá giống là bước rất quan trọng nhằm mục đích khôi phục lại hoạt tính
sau thời gian giữ giống. Phương pháp cấy chuyền thường được sử dụng để hoạt hoá
giống bằng cách cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm hoặc
trên đĩa thạch, ủ ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi sinh vật phát triển thành một lớp
trên mặt thạch. Môi trường sử dụng phải bảo đảm giàu dinh dưỡng, độ pH tối ưu;
điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ thoáng khí phải thích hợp cho sự tăng trưởng
của chủng. Các điểm cần lưu ý trong công đoạn này bao gồm:
- Bề mặt thạch cần phải đảm bảo độ ẩm nhất định, không được quá khô vì như
thế sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng sau khi được cấy ria lên mặt
thạch.
- Trong quá trình cấy ria, cần phải bảo đảm ria đều (theo đường zic-zăc) trên
mặt thạch, không ria quá gần mép thạch nghiêng vì ở đây lớp thạch mỏng, khô
không thích hợp cho sinh khối tế bào khi khuẩn lạc phát triển lớn.
- Cần phải kiểm soát tốt thời gian ủ để đạt được lượng sinh khối với hoạt tính
tối ưu và ổn định. Tránh trường hợp ủ thời gian quá dài, sinh khối tế bào phát triển
quá nhiều (over growth), lớp tế bào trên cùng của khuẩn lạc không được tiếp xúc
trực tiếp với dinh dưỡng của môi trường thạch trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến
chất lượng của giống sau này.

2.3. Nhân giống

Mục đích của nhân giống là tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui
trình sản xuất. Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase,
khi đó hoạt tính của giống là tốt nhất. Quá trình nhân giống thường chia thành hai
giai đoạn:
a. Nhân giống sơ cấp
Công đoạn nhân giống sơ cấp thường được thực hiện trong phòng nhân giống
(phòng clean room) ở qui mô 100-500ml với thiết bị sử dụng có thể là:
1. Máy lắc với bình tam giác có thể tích phải gấp tối thiểu 4 lần thể tích dịch
nuôi cấy để bảo đảm đủ không gian để lắc trộn dịch nuôi cấy và cung cấp đủ lượng
oxy cần thiết. Tốc độ lắc là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng trưởng của
chủng trong quá trình nhân giống. Nếu lắc ở tốc độ thấp sẽ không bảo đảm cung cấp
đủ độ hòa tan oxy tốt trong dịch nuôi cấy, chủng sẽ phát triển chậm. Nếu lắc ở tốc độ
quá nhanh, dịch nuôi cấy sẽ tiếp xúc với phần nút bông (cotton plug) làm ẩm ướt nút
bông dễ gây ra hiện tượng tạp nhiễm và sẽ cản trở việc trao đổi không khí giữa bên
trong và bên ngoài của bình tam giác. Mặt khác, khi lắc ở tốc độ quá cao, tế bào vi
sinh vật sẽ bị ảnh hưởng bởi những tác động cơ học.

27
 2. Nồi lên men nhân giống với kích thước nhỏ. Hệ thống này có đầy đủ các yếu
tố bảo đảm cho chủng phát triển tốt nhất như độ khuấy trộn, hệ thống cung cấp
không khí, hệ thống hiệu chỉnh pH, nhiệt độ…. Tuy nhiên do có nhiều hệ thống liên
quan phức tạp tác động vào trong quá trình nuôi cấy nên nguy cơ xảy ra tạp nhiễm
trong trường hợp này là rất cao.
Khi quá trình nhân giống kết thúc cần phải tiến hành kiểm tra, đánh giá các
thông số quan trọng trước khi đưa vào sản xuất như mật độ tế bào thông qua giá trị
OD hoặc DCW (dried cell weight), hiệu suất sinh khối, độ pH, … so với tiêu chuẩn.
Một trong những vấn đề quan trọng của công đoạn nhân giống sơ cấp là phải bảo
đảm giống mầm không bị tạp nhiễm. Để đạt được điều này, cần phải bảo đảm môi
trường và thiết bị sử dụng được khử trùng triệt để, quá trình thao tác vận hành phải
được chuẩn hóa, đáp ứng được các tiêu chí vô trùng. Để kiểm tra tạp nhiễm của
giống mầm thông thường sử dụng phương pháp nuôi cấy trải trên đĩa pettri. Trong
một số trường hợp do mật độ tạp nhiễm quá nhỏ, không thể phát hiện được, người
ta thường nuôi cấy tăng cường (enrichment culture) nhằm tăng số lượng tế bào tạp
nhiễm (nếu có) trong mẫu thử để kiểm tra. Phương pháp thực hiện như sau: dùng
khoảng 10-50 ml dịch nhân giống sau khi kết thúc nuôi cấy nạp vào bình tam giác
chứa môi trường tương tự như môi trường nhân giống và tiếp tục nuôi cấy cùng
điều kiện trong thời gian 24 giờ. Sau đó lấy mẫu dịch trải lên đĩa pettri để kiểm tra
độ tạp nhiễm. Nếu tạp nhiễm xảy ra thì khả năng giống mầm ban đầu bị tạp nhiễm
rất lớn. Để bảo đảm kết quả đánh giá chính xác, quá trình nuôi cấy tăng cường cần
phải được thực hiện trong điều kiện tuyệt đối vô trùng.
b. Nhân giống thứ cấp
Tùy theo qui trình mà hệ thống nhân giống thứ cấp được thực hiện qua một
hoặc nhiều bậc. Quá trình nhân giống thức cấp được thực hiện trong nồi nuôi cấy
mầm với thể tích nạp giống tăng dần, khoảng 5-10% cho mỗi bậc. Cần phải bảo đảm
các điều kiện như thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ…
tối ưu để chủng tăng trưởng tốt nhất. Mục đích của nhân giống thứ cấp là tạo được
lượng sinh khối lớn, hoạt tính tốt phục vụ cho lên men sản xuất.

2.4. Lên men sản xuất

Đây là công đoạn chính của qui trình, do vậy cần phải kiểm soát chặt chẽ các
điều kiện nuôi cấy như lượng tế bào cần thiết cho sản xuất, nhiệt độ, pH, hàm lượng
oxy hòa tan, nồng độ các cơ chất giới hạn nhằm đạt được hiệu quả lên men cao nhất.
Trong quá trình nuôi cấy cần phải rút ngắn lag phase, tăng cường tốc độ tăng trưởng
đặc trựng  đ ể đạt
giá trị tối đa, max và trong pha ổn định phải được duy trì tốt. Một
số thành phần dinh dưỡng sẽ bị cạn kiệt theo thời gian do vậy cần phải bổ sung để

28
bảo đảm duy trì được hoạt tính sản xuất của chủng (mẻ- bổ sung). Trong quá trình
lên men cần phải phân tích, đánh giá hiệu quả lên men để xác định thời gian nuôi cấy
thích hợp, mang lại hiệu quả sản xuất cao nhất.
3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men
Một hệ thống lên men hiếu khí có kiểm soát bao gồm các thiết bị liên quan
như sau (Hình 3.3):

Heä thoáng
nöôùc laøm
Khí thoaùt ra

maùt
Cyclone

Bôm

Chieát dòch leân men

Chaát phaù boït

V-14
V-12

TIC
FI
V-13

V-11
I-9
Motor
OÁng naïp moâi tröôøng boå sung

DO2
pH
PI

FI
FI

FI
OÁng nhaäp gioáng

-
Moâi tröôøng

H /OH
+

V-16

V-15
Heä thoáng loïc khoâng khí
Heä thoáng thanh
truøng lieân tuïc
Bôm
Boàn chuaån
bò moâi
tröôøng

29
 Hình 3. 3. Mô hình hệ thống lên men kiểm soát tự động.

(2)

(5)

(3)

(1)
(4)

Hình 3. 4. Hệ thống thiết bị lên men qui mô pilot được thiết kế và gia công bởi
công ty Khoa học và Kỹ thuật Vĩnh An (Việt Nam).
(1) Bồn lên men thể tích 50 L (2 bồn)
(2) Tủ điều khiển: Kiểm soát các thông số: tốc độ khuấy trộn, độ pH, nhiệt độ,
oxy hoà tan
(3) Máy làm lạnh nước để giải nhiệt sinh học trong quá trình lên men
(4) Máy nén khí cung cấp không khí cho quá trình lên men
(5) Lò hơi điện nhằm cung cấp hơi nước nóng phục vụ cho khử trùng nồi lên
men và khử trùng môi trường trước khi nuôi cấy.

3.1. Nồi lên men

- Thân nồi: Tùy theo qui mô sản xuất mà thể tích bồn lên men sẽ khác nhau từ
1KL - 1.000 KL.
- Hệ thống khuấy trộn: Nhằm mục đích tạo sự đồng nhất của dịch lên men
trong nồi và tăng cường độ hòa tan của oxygen vào dịch lên men.
- Thiết bị giải nhiệt: Do quá trình lên men sinh ra năng lượng sinh học dưới
dạng nhiệt làm cho nhiệt độ của dịch lên men tăng lên. Để kiểm soát nhiệt độ thích
hợp cho nuôi cấy thì cần phải giải nhiệt cho nồi lên men. Tác nhân giải nhiệt thường
là nước có nhiệt độ thấp 5-25oC, được cung cấp bởi hệ thống máy làm mát nước
(chiller, cooling tower). Có 3 dạng thiết bị giải nhiệt thường được sử dụng cho nồi
lên men: (1) dạng áo (jacket) bao bên ngoài nồi lên men; dạng ống vòng xoắn (coil)
và dạng bó ống (tube set) gắn bên trong nồi lên men.

30
 Hình 3. 5. Thiết bị trao đổi nhiệt thường dùng trong nồi lên men.

- Hệ thống phân phối khí (air sparger): Nhằm phân chia không khí sục vào
bồn qua những lỗ có kích thước nhỏ, tạo điều kiện cho không khí tiếp xúc tốt với
dịch lên men, tăng diện tích tiếp xúc của bọt không khí với dịch lên men. Hệ thống
phân phối khí thường được lắp đặt ở gần đáy bồn lên men, bảo đảm hành trình của
bọt khí trong nồi lên men khi đi từ đáy bồn đến mặt dịch là dài nhất để tăng tính
hiệu quả hòa tan của oxy trong dịch nuôi cấy.
- Hệ thống thoát khí và hồi lưu dịch bọt tan (cyclone): Đối với trường hợp lên
men hiếu khí, không khí được sục vào từ đáy nồi lên men, sau đó sẽ thoát ra ngoài
qua hệ thống cyclone được gắn ở đỉnh bồn. Trong quá trình lên men do có rất nhiều
bọt khí được hình thành và vì tỷ trọng của bọt nhỏ nên toàn bộ bọt sẽ nổi lên ở bề
mặt dịch trong nồi lên men. Phần lớn bọt khí này sẽ thoát ra khỏi nồi lên men cùng
với không khí sau khi qua dịch lên men, đi vào hệ thống thu hồi dịch (cyclone). Ở
trong cyclone, bọt sẽ bị vỡ ra do tác động cơ học, phần khí trong bọt sẽ thoát ra
ngoài và phần dịch (màng bọt) sẽ được đưa trở lại nồi lên men qua đường ống hồi
lưu gắn ở đáy cyclone.
- Hệ thống các đầu dò cảm biến (sensor) để điều khiển pH, nhiệt độ, độ oxygen
hoà tan (DO2), phá bọt tự động …. Trong quá trình lên men, do hoạt động của vi sinh
vật làm thay đổi các đặc điểm lý-hóa của dịch lên men. Để bảo đảm các yếu tố này
thường xuyên được duy trì ở giá trị phù hợp với nhu cầu của vi sinh vật, cần phải có
hệ thống cảm biến ghi nhận và hiệu chỉnh kịp thời. Một hệ thống điều kiện tự động
bao gồm: đầu dò cảm biến gắn trực tiếp vào nồi lên men, thiết bị ghi nhận và xử lý
tín hiệu, van tự động đóng mở để kiểm soát lượng tác nhân hiệu chỉnh cung cấp vào
nồi lên men trong quá trình nuôi cấy. Ví dụ trong trường hợp kiểm soát pH tự động.
Giá trị pH vận hành trong nồi lên men được cài đặt là 7,5. Khi pH giảm xuống dưới
7,5 đầu dò cảm biến sẽ ghi nhận và gởi giá trị này về thiết bị điều khiển trung tâm. Ở

31
đây sẽ phân tích và so sánh với giá trị cài đạt và sau đó sẽ gởi tín hiệu đến van tự
động. Van tự động sẽ mở ra và tác nhân hiệu chỉnh pH OH- sẽ được cung cấp vào nồi
lên men. Khi OH- vào nồi lên men sẽ làm cho pH tăng dần lên và khi vượt qua khỏi
ngưỡng cài đặt 7,5 thì đầu dò cảm biến sẽ nhận diện và thông tin sẽ được xử lý, van
tự động sẽ đóng lại, ngưng cung cấp nguồn OH-. Cứ như vậy, pH nuôi cấy của dịch lên
men được kiểm soát tự động trong suốt quá trình lên men.
- Các đường ống: nạp liệu, nạp giống, lấy mẫu, đường xả dịch …Tất cả các
đường ống này đều có gắn van nhằm cô lập các hệ thống hỗ trợ với nồi lên men và
để điều tiết dịch nạp vào hoặc chiết ra khi cần thiết.

3.2. Hệ thống cung cấp oxygen (không khí nén hoặc nguồn oxygen lỏng)
- Máy nén khí: hút không khí và nén lại ở áp suất 1-3 kgf/cm2 để cung cấp cho
nồi lên men. Lưu ý là nhiệt phát ra trong quá trình nén không khí do vậy cần phải
giải nhiệt cho hệ thống thiết bị nén và không khí nén trước khi cung cấp vào nồi lên
men. Tác nhân giải nhiệt thường dùng là nước đã làm mát (chilled water/ cooling
tower water).

Hình 3. 6. Máy nén không khí sử dụng trong công nghiệp.

- Hệ thống tách nước ngưng trong khí nén, bao gồm các thiết bị hạ nhiệt, thiết
bị tách nước ngưng (cyclone). Do không khí sau khi được nén lại nhiệt độ sẽ tăng cao
và trong không khí có độ ẩm lớn nên trước khi sử dụng cho lên men cần phải tách
loại nước ngưng và hạ nhiệt độ. Hàm lượng ẩm cao trong khí nén sẽ làm tăng thể
tích dịch lên men, giảm lưu lượng khí qua các lọc khi và có thể gây tạp nhiễm.
- Thiết bị lọc khí. Kích thước lỗ lọc có thể thay đổi từ 0,01 - 0,5 mm tùy theo
mục đích sử dụng.

32
 - Các thiết bị điều khiển áp suất, lưu lượng.

3.3. Hệ thống nước giải nhiệt

- Tháp giải nhiệt, máy làm lạnh (chiller)
- Bơm cấp nguồn nước nhiệt độ thấp cho nồi lên men

Hình 3. 7. Sơ đồ hệ thống máy làm lạnh nước cung cấp cho hệ thống lên men.

3.4. Hệ thống chuẩn bị và khử trùng môi trường liên tục

- Bồn chứa các thành phần nguyên liệu, bơm, thiết bị phụ trợ…
- Hệ thống thiết bị trao đổi nhiệt liên tục
- Tháp lưu
3.5. Lò hơi
Cung cấp hơi nước nóng với áp suất >1,5 kgf/cm2 phục vụ cho việc khử trùng
nồi lên men, môi trường nuôi cấy…. Có thể dùng các nhiên liệu như dầu DO, FO, khí
hóa lỏng (LPG), khí nén thiên nhiên (CNG) để đốt lò hoặc dùng điện trở đốt nóng
(electrical boiler).

33
Hình 3. 8. Sơ đồ lò hơi cung cấp hơi nước nóng để tiệt trùng cho hệ thống lên men.

CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG

NGHIỆP

1. Giới thiệu
Môi trường nuôi cấy được thiết kế tùy theo yêu cầu của chủng vi sinh vật,
phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu. Trước khi thiết kế môi trường lên men
cần khảo sát chi tiết về nhu cầu dinh dưỡng của chủng, nguồn cơ chất trực tiếp tạo ra
sản phẩm và hệ thống thiết bị-công nghệ lên men. Tuy nhiên các môi trường lên men
đều có chung một số yêu cầu căn bản. Toàn bộ các chủng vi sinh vật trong quá trình
sinh trưởng, phát triển và tạo sản phẩm trao đổi chất đều cần nước, nguồn năng
lượng, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vitamin và oxygen
(đối với trường hợp hiếu khí). Đối với qui mô phòng thí nghiệm thì việc chuẩn bị
môi trường tương đối đơn giản vì thường dùng các hợp chất tinh khiết. Tuy nhiên
với qui mô sản xuất công nghiệp thì công đoạn này khá phức tạp.

Trong công nghiệp người ta dùng các nguồn dinh dưỡng khác nhau để chuẩn
bị môi trường với yêu cầu là càng thỏa mãn các điều kiện sau đây càng tốt.
- Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối hoặc/và sản phẩm
- Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối hoặc sản phẩm
- Cho phép tạo được tốc độ sản xuất tối đa
- Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp các sản phẩm không mong
muốn.
- Ổn định chất lượng và sẵn sàng cho sử dụng quanh năm
- Hạn chế đến mức tối thiểu việc xảy ra các vấn đề trong quá trình chuẩn bị và
khử trùng môi trường.

34
 - Hạn chế đến mức tối thiểu các vấn đề nảy sinh như gây trở nảy cho việc
khuấy trộn, chiết tách, tinh sạch và xử lý chất thải.
Cần lưu ý là việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến việc thiết kế nồi
lên men, ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm và quá trình xử lý chất thải sau
lên men và các yếu tố liên quan đến pháp luật, văn hóa, tôn giáo, …

2. Thiết kế môi trường lên men

Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công
trong nuôi cấy vi sinh. Thành phần môi trường nuôi cấy phải bảo đảm đủ lượng để
phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho
việc duy trì mật độ tế bào và sự sinh tổng hợp. Phương trình cân bằng vật chất trong
quá trình lên men được mô tả như sau:

[C và E] + [N] + O 2 + Các yếu tố khác  Sinh khối + Sản phẩm + CO2 + H2O + Nhiệt

Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng, trung lượng và vi
lượng.

- Yếu tố đa lượng bao gồm: Nguồn nước, nguồn carbon, nguồn nitơ.
- Yếu tố vi lượng bao gồm: Nguồn muối khoáng, nguồn vitamin, các chất hỗ
trợ tăng trưởng, chất kiểm soát …

Dựa vào thành phần và hàm lượng của các chất trong tế bào vi sinh vật để
thiết kế đủ thành phần và lượng cần thiết nhằm thu nhận được sinh khối theo yêu
cầu, bảo đảm sản xuất. Bảng 4.1 mô tả một số thành phần căn bản của sinh khối các
loài vi sinh vật khác nhau, cho thấy carbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô tế
bào, và các nguyên tố C, O, N, H chiếm tổng cộng khoảng 92%.

Bảng 4. 1. Thành phần và hàm lượng các nguyên tố trong tế bào vi sinh vật

35
 Các nguyên tố E.coli Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc
C 50 50-53 45-50 40-63
O 20
H 8 7 7
N 14 12-15 7,5-11 7-10
P 3 2-3 0,8-2,6 0,4-4,5
S 1 0,2-1,0 0,01-0,24 0,1-0,5
K 1 1-4,5 1,0-4,0 0,2-2,5
Na 1 0,5-1,0 0,01-0,1 0,02-2,5
Ca 0,5 0,01-1,1 0,1-0,3 0,1-1,4
Mg 0,5 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5
Cl 0,5 0,5 - -
Fe 0,2 0,02-0,2 0,01-0,5 0,1-0,2
Khác 0,3

Đơn vị: % theo trọng lượng khô của tế bào.

Bảng 4. 2. Phân tích thành phần của một số chủng vi sinh vật.
Trọng
Tốc độ Thành phần
Chủng vi sinh Nguồn Công thức ước lượng
tăng
vật carbon định phân
trưởng
C H N O tử
Klibsiella
Glycerol 0,1 50,6 7,3 13,0 29,0 CH1,74O0,43N0,22 23,7
aerogenes
Aerobacter
Complex 48,7 7,3 13,9 21,1 CH1,78O0,33N0,24 22,5
aerogenes
Aerobacter
Complex 0,9 50,1 7,3 14,0 28,7 CH1,73O0,24N0,43 24,0
aerogenes
Sacchromyces
47,0 6,5 7,5 31,0 CH1,66O0,49N0,13 23,5
cerevisiae
Sacchromyces
50,3 7,4 8,8 33,5 CH1,75O0,15N0,50 23,9
cerevisiae
Candida utilis Glucose 0,45 46,9 7,2 10,9 35,0 CH1,84O0,56N0,20 25,6
Candida utilis Ethanol 0,43 47,2 7,3 11,0 34,6 CH1,84O0,55N0,20 25,5

Từ các kết quả phân tích thành phần tế bào ở Bảng 4.2 trên đây cho thấy, hàm
lượng carbon thay đổi từ 46-50%, H từ 6-7%, N từ 8-14% và O từ 29-35%. Sự thay
đổi này tùy thuộc vào cơ chất và điều kiện tăng trưởng. Trong tính toán kỹ thuật,

36
người ta sử dụng công thức chung của vi sinh vật là: CH1,8O0,5N0,2. Dựa trên công
thức này, trọng lượng phân tử tế bào được xác định là 24,6.

Ví dụ: Muốn sản xuất thu 10 g tế bào khi sử dụng glucose làm nguồn carbon
thì lượng glucose tối thiểu cần thiết trong môi trường phải là bao nhiêu?

Công thức ước định của tế bào: CH1,8O0,5N0,2

Glucose: C6H12O6: MW 180.
Số phân tử mol tế bào cần là: 10/24,6

Số mole glucose cần 1/6×10/24,6

Lượng glucose cần: 1/6×10/24,6×180 = 12,2 g.

Một số môi trường thông dụng:
1. Môi trường sinh tổng hợp Amylase (Underkofler, 1966)
Dịch thủy phân đậu nành 1,85%
Dịch chiết nấm men thủy phân 1,5%
Dịch thủy phân casein 0,65%
Lactose 4,75%
MgSO4.7H2O 0,04%
Chất phá bọt 0,05%
2. Môi trường sản xuất glutamic acid (Gore et al., 1968)
Dextrose 270g/L
NH4H2PO4 2g/L
(NH4)2HPO4 2g/L
K2SO4 2g/L
MgSO4.7H2O 0,5g/L
MnSO4.H2O 0,04g/L
FeSO4.7H2O 0,02g/L
Polyglycol 2000 0,3g/L
Biotin 12mg/L
Penicillin 11mg/L
3. Môi trường sản xuất Pennicillin (Perlan, 1970)
Glucose hoặc rỉ đường (feed liên tục) 10%
Dịch chiết bắp 4-5%
Phenylacetic acid 0,5- 0,8 %

37
 Lard oil (hoặc dầu thực vật) dùng làm chất phá bọt 0,5%
pH 6.5-7.5 (acid hoặc kiềm)
4. Môi trường sản xuất Endotoxin từ Baccillus thuringiensis (Holmberg et al., 1980)
Rỉ đường 0-4%
Bột đậu nành 2-6%
KH2PO4 0,5%
K2HPO4 0,5%
MgSO4 0,0005%
MnSO4 0,003%
FeSO4 0,001%
CaCl2 0,005%
Na(NH4)2PO4.4H2O 0,15%

3. Các thành phần của môi trường lên men

3.1. Nước
Tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước, do vậy nước là yếu tố quan trọng trong
tất cả các môi trường lên men. Ngoài ra nước rất cần thiết cho các hoạt động khác
trong công nghệ lên men như là tác nhân gia nhiệt, giải nhiệt hoặc phục vụ cho việc
vệ sinh thiết bị. Nguồn nước cung cấp phải ổn định, sạch bảo đảm các yếu tố như độ
pH, các muối khoáng hòa tan và mức độ tạp khuẩn trong nước.
Hàm lượng khoáng trong nước rất quan trọng đối với công nghiệp lên men
sản xuất bia. Ví dụ nước cứng có hàm lượng CaSO4 cao rất tốt cho bia đắng Bourton
của Anh. Nước có hàm lượng carbonate cao thì tốt cho các loại bia có màu sậm hơn
như bia nâu. Ngày nay, trước khi dùng cho qui trình lên men nước thường được xử
lý bằng phương pháp khử ion, hay các kỹ thuật khác như bổ sung muối khoáng, hiệu
chỉnh pH, lọc bỏ tạp khuẩn, …

Trong thực tế, để tiết kiệm, góp phần giảm thiểu giá thành sản xuất, người ta
thường nghiên cứu tái sử dụng nguồn nước thu hồi từ các qui trình khác. Trong một
số qui trình sau lên men, ở giai đoạn thu hồi hoặc kết tinh, một lượng lớn nước thoát
ra từ qui trình này do hoạt động cô đặc. Lượng nước này khi thoát ra trong quá trình
bay hơi kéo theo một số hợp chất khác trong dịch như NH3 (còn lại trong dịch lên
men của mẻ trước), các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, … sau đó được đưa vào tái sử
dụng cho lên men, góp phần làm giảm tải cho qui trình xử lý nước thải của hệ thống.

3.2. Nguồn năng lượng

38
 Năng lượng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bắt nguồn hoặc là từ sự oxy
hóa các thành phần dinh dưỡng trong môi trường hoặc là từ ánh sáng. Hầu hết trong
công nghiệp vi sinh, các chủng thường dùng là hóa dưỡng. Do vậy, nguồn năng lượng
thông dụng nhất được dùng là từ nguồn carbon như các carbohydrate, lipid và
protein. Một vài chủng còn dùng được cả hydrocarbon hay methanol làm nguồn C và
năng lượng cho quá trình tăng trưởng và trao đổi chất. Chu trình TCA vừa cung cấp
các acid hữu cơ làm khung C để hình thành các chất quan trọng khác cung cấp cho tế
bào mặt khác còn cung cấp các chất mang năng lượng lớn như NADH, FADH, các chất
này sau đó di vào chuỗi chuyển điện tử để tổng hợp ATP cung cấp nguồn năng lượng
lớn cho hoạt động của tế bào.

39
 Pyruvate-(C3)

NADH CO2

Acetyl-CoA

CoA

Oxaloacetate 2-
Citrate3-

Malate 2- Aconitate3-

NADH
Isocitrate3-
NADP+
NAD+
Fumarate 2-
CO2
FADH

NAD(P)H
FAD Succinate 2- α-Ketoglutarate 2-

Succinyl- CoA+NAD+
CoA CoA
GTP GDP+Pi CO2
NADH

Overall reaction: Pyruvate-+4NAD++FAD 3CO2+4NADH+FADH

(1)Substrate level: GDP+Pi GTP
phosphorylation GTP+ADP GDP+ATP

(2)Electron transport 4NADH = 12ATP 15 ATP

phosphorylation FAD = 2ATP

(3)Sum: CAC plus Glycolysis 38 ATP per glucose

Hình 4. 1. Chu trình TCA và cân bằng năng lượng.

40
3.3. Nguồn carbon
Nguồn carbon được sử dụng thường có ảnh hưởng đến sự tổng hợp sinh khối
hay các sản phẩm trao đổi sơ cấp và thứ cấp. Khi chọn lựa nguồn carbon cho qui
trình lên men cần dựa trên các yếu tố sau:
- Sản phẩm chính của quá trình
- Giá thành sản phẩm
- Độ tinh khiết của nguyên liệu (các ion kim loại)
Các nguồn C thường dùng là carbohydate: bột ngô, bột ngũ cốc, khoai tây, bột
mì…. Ngoài ra, mật rỉ mía đường hoặc mật rỉ củ cải đường cũng được dùng làm
nguồn C. Nguồn carbon từ dầu (dầu olive, dầu bắp, dầu cotton, dầu đậu phộng …) mỡ
(các acid béo, oleic, linoleic, linolenic,…), có thể cung cấp năng lượng cao hơn nhiều
so với từ glucose. Nguồn hydocarbon và các dẫn xuất: n-alkane, methane, methanol.
Ngoài ra, đối với một số qui trình lên men người ta còn dùng cellulose làm nguồn
cung cấp C.
Khi khử trùng môi trường lên men, nên tách riêng nguồn đường khử với
nguồn nitơ hữu cơ vì chúng dễ dàng phản ứng với NH2- trong cấu trúc của amino
acid (phản ứng Maillards, caramen hóa) tạo nên hợp chất chứa nitrogen có màu đen
gây ức chế cho tăng trưởng của tế bào. Phản ứng Maillards xảy ra theo 3 giai đoạn:
- Phân tử glucose kết hợp với amino acid để hình thành N glucoside
- Sau đó hình thành immonium ion và diễn ra quá trình isomer hóa để hình
thành ketosamine
- Ketosamine bị dehydrate hóa và kết hợp với redutones để hình thành các
hợp chất có màu, gây ức chế tăng trưởng của vi sinh vật.

41
3.4. Nguồn nitrogen
Hầu hết các chủng vi sinh vật sử dụng trong công nghiệp có thể dùng được cả
hai nguồn nitrogen là vô cơ (ammonia, nitrate, nitrite,) và hữu cơ (amino acid, urea,
cao nấm men, dịch chiết thịt, dịch chiết cao bắp, dịch thủy phân đậu nành, peptone,
dịch thủy phân cá–nước mắm, …). NH3 được dùng vừa để hiệu chỉnh pH vừa là
nguồn cung cấp N trong môi trường nuôi cấy Sac. cerivisiae sản xuất công nghiệp
dịch albumin người (Collins, 1990). Các muối của ammonium như ammonium
sulphate, thường gây nên tính acid khi vi sinh vật sử dụng NH4+ và giải phóng gốc
acid tự do. Mặt khác, khi gốc nitrate được sử dụng thì gây nên sự thay đổi dần sang
điều kiện kiềm. Ban đầu, ammonium nitrate tạo nên pH acid khi NH4+ được sử dụng
và sẽ gây ức chế quá trình đồng hóa nitrate. Sau đó khi nguồn NH4+ bị cạn kiệt, có sự
chuyển dần sang điều kiện kiềm khi nitrate được dùng làm nguồn N. Tuy nhiên có
một ngoại lệ cho kiểu trao đổi chất nguồn N này là đối với chủng Gibberella fujikuroi
(Borrow et al., 1961, 1964). Ở pH 2,8 -3,0, nitrate ức chế sự đồng hoá NH4+ của vi
sinh vật. Khi pH tăng dần đến giá trị thích hợp, sự đồng hoá nitrate của vi sinh vật
chuyển dần qua NH4+. Nguồn N hữu cơ được sử dụng có thể từ các nguồn amino
acids, protein, urea. Trong nhiều trường hợp, sự tăng trưởng của chủng sẽ nhanh
hơn nếu chúng ta cung cấp nguồn N là hữu cơ, và một số chủng vi sinh vật đòi hỏi
một số amino acid nhất định cho tăng trưởng. Trong lên men amino acid công
nghiệp, cần bổ sung một lượng nhất định amino acid đối với các chủng đột biến
khuyết dưỡng các amino acid này. Tuy nhiên, các amino acid dùng để bổ sung vào
môi trường nuôi cấy là nguồn N hữu cơ phức tạp, thường không đồng nhất, rẻ tiền,
ổn định. Trong công nghiệp lên men sản xuất lysine, người ta sử dụng methionine và
threonine thu nhận từ dịch thủy phân đậu nành để bổ sung vào môi trường nuôi cấy
thay thế cho loại tinh khiết, đắt tiền.

42
 Các hợp chất N dùng làm nguồn cung cấp amino acid là dịch chiết cao bắp,
dịch đậu nành, đậu xanh, từ hạt coton, cao nấm men. Ngoài ra các dịch này còn bổ
sung các yếu tố khác như vitamin, khoáng. Trong quá trình cất giữ các sản phẩm này,
chất lượng của chúng có thể bị ảnh hưởng bởi tác động của yếu tố môi trường như
độ ẩm, nhiệt độ và thời gian lưu giữ.

Hình 4. 2. Các con đường chuyển hóa Nitơ.

Trong sản xuất vaccines cho người, cần phải sử dụng nguồn amino acid tinh
khiết để chuẩn bị môi trường, không nên dùng amino acid từ protein. Khi chọn lựa
nguồn nitơ cần quan tâm đến các yếu tố sau:
- Cơ chế kiểm soát việc sử dụng nguồn nitrogen tồn tại bởi enzyme khử
nitrate, một enzyme liên quan đến việc chuyển hoá nitrate thành ion NH4+, bị ức chế
khi có sự hiện diện của ammonia. Nguyên nhân của quá trình này là do ammonia

43
hoặc ion NH4+ là nguồn N được sử dụng thích hợp hơn. Người ta đã có các thí
nghiệm khảo sát trên nấm cho thấy rằng NH4+ ức chế sự hấp thụ các amino acids nói
chung và các amino acids màng nói riêng. Đối với Aspergillus nidulans, ammonia điều
hoà sự sản xuất các protease kiềm tính và trung tính. Vì thế, trong một hỗn hợp
nguồn N, từng thành phần của N có ảnh hưởng đến sự điều hòa trao đổi chất và do
vậy có sự chọn lựa nguồn N thích hợp để sử dụng trước cho đến khi nguồn này cạn
kiệt.
- Người ta đã chứng minh rằng việc sản xuất kháng sinh bởi nhiều chủng vi
sinh vật khác nhau chịu ảnh hưởng bởi loại và nồng độ nitrogen trong môi trường
nuôi cấy. Nguồn N dễ đồng hóa như NH4+, NO3-, các amino acid có thể ức chế sự sinh
tổng hợp các chất kháng sinh. Sự sản xuất kháng sinh chỉ bắt đầu tăng trong môi
trường nuôi cấy sau khi toàn bộ nguồn N đã được sử dụng hết.
Trong thí nghiệm nuôi cấy lắc trong bình tam giác, muối của các acid yếu
(ammonium succinate) được bổ sung vào làm nguồn N và để hạn chế sự thay đổi pH,
có thể dùng muối ammonium của các acid mạnh như Cl- hoặc SO42-. Theo cách này,
người ta có thể dùng muối phosphate có nồng độ thấp hơn trong môi trường để làm
hệ đệm pH, nhưng nếu nồng độ muối phosphate cao có thể gây ức chế việc sản xuất
nhiều chất trao đổi thứ cấp.
- Trong lên men sản xuất gibberellin, nguồn N ảnh hưởng lên việc định hướng
sản xuất các loại gibberellin và tỷ lệ tương quan giữa các loại này (Jefferys, 1970).
Năm 1963, Rhodes đã chứng minh rằng nồng độ tối thích của nguồn N cho sản
xuất griseofulvin có sự biến thiên tùy thuộc vào kiểu cấy giống và loại nồi lên men
đang sử dụng. Như vậy, các yếu tố này cần phải được đề cập khi giải thích các kết
quả các chương trình nghiên cứu phát triển các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Một số nguyên liệu có chứa nguồn N phức tạp, vi sinh vật không thể sử dụng được và
gây trở ngại với các qui trình thu hồi và qui trình xử lý chất thải.

3.5. Các nguyên tố khoáng trung - vi lượng

Hầu hết các chủng vi sinh vật đòi hỏi một số nguyên tố trung-vi lượng nhất
định cho sự tăng trưởng và trao đổi chất. Trong nhiều môi trường nuôi cấy, Mg, P, K,
S, Ca, Chlorine là các thành tố rất cần thiết. Tùy từng loại môi trường mà nồng độ yêu
cầu cũng khác nhau và do vậy chúng thường được bổ sung vào môi trường từ các
thành phần riêng biệt. Các nguyên tố khác như Co, Cu, Mn, Mb và Zn cũng là những
nguyên tố đóng vai trò quan trọng thường có sẵn trong các thành phần nguyên liệu
nhưng chỉ với hàm lượng rất nhỏ nên cần phải phân tích môi trường nuôi cấy để nếu
cần thiết thì phải bổ sung thêm nhằm luôn bảo đảm rằng các nguyên tố vi lượng đạt
hàm lượng theo nhu cầu của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Trong thực tế,

44
chất lượng của nguồn nguyên liệu không ổn định (vì nguồn gốc tự nhiên) nên hàm
lượng của các nguyên tố này cũng thay đổi. Bảng 4. 3 cho thấy thành phần các chất
trong dịch thủy phân cao bắp.

Bảng 4. 3: Thành phần dịch thuỷ phân cao bắp

Tổng hàm lượng chất rắn 51%w/v Potassium 20%
Hàm lượng acid qui về lactic acid 15%w/v Phosphorus 1-5%
Tổng lượng đường khử tự do 5.6%w/v Sodium 0,3-1%
Tổng lượng đường khử tự do sau thủy 6.8%w/v Magnesium 0,003-0,3%
phân Iron 0,01-0,3%
Tổng lượng nitrogen:
Alanine
4%w/v
25
Copper
Calcium
} 0,01-0,03%

Arginine 8 Zinc 0,003-0,08%

}
Glutamic acid 8 Lead
Leucine 6 Silver 0,001-0,003%
Proline 5 Chromium
Isoleucine 3.5 Vitamine 41-49 mg/g
Threonine 3.5 Aneurine 0,34-0,38 mg/g
Valine 3.5 Biotin 14,5-21,5 mg/g
Phenylalanine 2.0 Ca-pantothenate 0,26-0,6 mg/g
Methionine 1.0 Folic acid 30-40 mg/g
Cystine 1.0 Nicotinamide 3,9-4,7 mg/g
Hàm lượng tro 1.25%w/v Riboflavine

Các nguyên tố vi lượng này đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của
enzyme.

45
 Hình 4. 3. Mô hình enzyme hydrolase với nguyên tố Zn ở tâm hoạt động.

Bảng 4. 4. Vai trò của các nguyên tố vi lượng.

Nguyên tố kim Vai trò
loại
Coban (Co) Cần để tạo Vitamin B12, transcarboxylase của vi khuẩn lên men
propionic.
Molypden (Mo) Có trong cấu trúc của molybdoflayvoprotein tham gia khử
nitrate và trong nitrogenase khử N2.
Đồng (Cu) Có trong một số enzyme tham gia hô hấp như cytochrome C; có
trong enzyme tham gia quang hợp như plastocyanin và một số
superoxide dismutase.

Mangan (Mn) Làm hoạt hóa nhiều enzyme, có trong một số superoxide
dismutase, là những enzyme rất quan trọng để khử độc dạng
độc O2.
Niken (Ni) Có trong các enzyme hydrogenase có chức năng nhận hoặc
phóng thích H2.
Tungsten và Selen Có vai trò trong định dạng cấu trúc enzyme dehydrogenase
Sắt (Fe) Có trong nhiều enzyme trong tế bào đặc biệt là các enzyme hô
hấp.

46
Kẽm (Zn) Đóng vai trò trong cấu trúc nhiều enzyme: carbonic anhydrase,
alcohol dehydrogenase, DNA polymerase, RNA polymerase.
Thường đóng vai trò nối các tiểu đơn vị protein trong sự sắp
xếp cấu hình đặc biệt cho hoạt động của enzyme.

Khi dùng môi trường tổng hợp để nuôi cấy vi sinh vật, cần phải bổ sung một
lượng chính xác các nguyên tố vi lượng. Các loại muối và nồng độ thường dùng trong
chuẩn bị môi trường nuôi cấy được tóm tắt theo Bảng 4.5.

Bảng 4. 5. Khoảng nồng độ thích hợp của một số thành phần khoáng

Thành phần Khoảng nồng độ thích hợp (g/L)

KH2PO4 1,0-4,0
MgSO4.7H2O 0,25-3,0
KCL 0,5-12,0
CaCO3 5,0-17,0
FeSO4.4H2O 0,01-0,1
ZnSO4.8H2O 0,1-1,0
MnSO4.H2O 0,01-0,1
CuSO4.5H2O 0,003-0,01
NaMoO4.2H2O 0,01-0,1
Nồng độ phosphate ở các môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm thường cao
hơn nồng độ các khoáng khác. Một phần của phosphate này được dùng để đóng vai
trò là chất đệm, giảm thiểu sự thay đổi pH khi không sử dụng hệ thống hiệu chỉnh pH
từ bên ngoài trong quá trình nuôi cấy.

Trong một số qui trình đặc trưng, nồng độ của một số chất khoáng nhất định
rất quan trọng. Các quá trình sinh tổng hợp chất trao đổi thứ cấp có giới hạn chấp
nhận đối với phosphate vô cơ thấp hơn so với quá trình tăng trưởng. Nguồn
phosphate này đủ thấp cho việc đồng hoá trước khi kết thúc trophosphase. Garner
và cộng sự (1950) cho rằng chức năng quan trọng của muối calcium trong môi
trường lên men là để lắng tụ các phospate vô cơ dư thừa và tăng cường hiệu suất của
streptomycine. Nồng độ phosphate vô cơ trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự
sản xuất của bacitracins, citric acid (trong nuôi cấy bề mặt), ergot, monomycin,
novobiocin, oxytetraclin, polyenes, ristomycin, rifamycin Y, streptomycin,
vancomycin và viomycin. Tuy nhiên, trong môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp
pyrronitrin, thiopeptin và methylenomycin thì cần phosphate với nồng độ cao. Hai

47
kháng sinh monomycin được sản xuất chọn lọc bởi chủng Streptomyces jamaicensis
khi nồng độ phosphate là 0,1 mM hoặc 0,4 mM. Sự điều hòa phosphate cũng đã được
thảo luận bởi Weinberg (1974), Aharonowitz và Demain (1977), và nhiều tác giả
khác.
Trong báo cáo tổng kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh, Liras và cộng sự
(1990) đã nhận diện được enzyme đích bị (a) ức chế bởi phosphate, (b) ngăn chặn
bởi phosphate, (c) ức chế sinh tổng hợp một enzyme nhưng không rõ ràng. Thứ tự
các bước kiểm soát của phosphate cũng đã được xác lập và xác định các đặc tính từ
promotor điều hoà phosphate kiểm soát sự sinh tổng hợp candicidin.
Weiberg (1970) đã tổng kết 9 nguyên tố vi lượng có ảnh hưởng sinh học.
Trong số 9 nguyên tố này, nồng độ của Mn và Zn là nhạy cảm quan trọng nhất trong
cơ chế trao đổi chất thứ cấp. Trong tất cả các hệ thống trao đổi chất bậc 2 mà trong
đó, người ta đã thu thập đầy đủ dữ kiện cho thấy rằng hiệu suất sản phẩm biến thiên
tuyến tính với nồng nồng độ (theo hàm logarit) của một kim loại quan trọng (chìa
khoá). Mối tương quan tuyến tính này không được xác lập khi nồng độ của kim loại
vi lượng này không đủ hoặc có độc tính đối với tăng trưởng của tế bào. Hiệu suất
sinh tổng hợp một số sản phẩm sinh học bậc một và bậc hai chịu sự ảnh hưởng bởi
nồng độ của các kim loại vi lượng hơn nồng độ đòi hỏi cho tăng trưởng tối đa. Theo
Foster (1949), Chlorine không đóng vai trò như là một thành phần dinh dưỡng trong
quá trình trao đổi chất của nấm mốc.

3.6. Chelator (Chất kìm)

Đối với nhiều loại môi trường lên men thường có tình trạng là ngay sau khi
pha chế hoặc sau khi khử trùng có sự hình thành chất lắng cặn ở dạng phức hợp của
phosphate kim loại không tan. Gaunt và cộng sự (1984) đã chứng minh rằng khi khử
môi trường Mandels và Weber (1969), một chất lắng cặn màu trắng được hình
thành có chứa toàn bộ Fe và hầu hết các kim loại như Ca, Mn, Zn hiện diện trong môi
trường. Hiện tượng hình thành lắng cặn này vừa làm giảm nồng độ các chất cần thiết
cho sự phát triển và biến dưỡng của vi sinh vật vừa gây cản trở cho quá trình thu hồi
sản phẩm và vệ sinh thiết bị.
Để giải quyết vấn đề về sự hình thành các phosphate kim loại không tan trong
môi trường lên men, người ta bổ sung các chất chelator nồng độ thấp như ethylene
diamine tetraacetic acid (EDTA), citric acid, polyphosphates … vào môi trường nuôi
cấy. Các chất này tạo các phức với kim loại trong môi trường và được sử dụng dần
trong quá trình nuôi cấy. Người ta nhận thấy rằng khi thêm vào môi trường Mandels
và Weber lượng EDTA có nồng độ 25 mg/dm3 thì không thấy có sự xuất hiện của
chất lắng cặn sau khử trùng. Lưu ý việc chọn lựa các chelator để không gây ức chế

48
các chủng vi sinh vật trước khi đưa vào sử dụng. Đối với môi trường dùng ở qui mô
công nghiệp, không cần phải bổ sung chelator, do các thành phần phức như dịch
chiết nấm men, pepton, sẽ tạo phức với kim loại và bảo đảm rằng kim loại được giải
phóng dần trong quá trình tăng trưởng.

3.7. Nhân tố tăng trưởng

Một số chủng vi sinh vật không thể tổng hợp toàn bộ các thành tố cấu tạo nên
tế bào, do vậy chúng đòi hỏi cần có một số tiền chất như các vitamin, một số amino
acid đặc trưng, acid béo hoặc sterol…, những chất này gọi là nhân tố tăng trưởng.
Các nhân tố tăng trưởng này thường có trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên cung
cấp nguồn C và N dùng trong các công thức môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một số trường hợp thì các nhân tố tăng trưởng này trong môi trường không đủ để
đáp ứng nhu cầu của vi sinh vật nên cần thiết phải bổ sung vào. Ví dụ người ta bổ
sung calcium pentothenate trong công thức môi trường để sản xuất dấm, hay trong
qui trình lên men sản xuất glutamic acid, PABA cũng được bổ sung với một nồng độ
nhất định.

3.8. Các chất đệm pH

Muốn thu nhận được sinh khối với năng suất tối đa, độ pH môi trường phải
được kiểm soát ở giá trị tối ưu. Một số hợp chất khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy
ngoài vai trò là thành phần dinh dưỡng, còn đóng vai trò đặc trưng là chất đệm
nhằm điều chỉnh pH ở một giá trị ổn định. Nhiều môi trường được kiểm soát pH 7.0
nhờ sự kết hợp của đệm CaCO3. Khi pH giảm, carbonate bị phân hủy để hiệu chỉnh
pH ổn định. Ngoài vai trò quan trọng đối với dinh dưỡng tế bào phosphate còn đóng
vai trò là chất đệm pH. Tuy nhiên, nếu nồng độ phosphate cao sẽ gây ức chế sinh
tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp.
Sự cân bằng về tỷ lệ nguồn C và N trong môi trường cũng hình thành nên một
cơ sở cho việc kiểm soát pH như vai trò của một hệ đệm. Nguồn C và N này thường
được cung cấp bởi protein, peptides, amino acids như trong dịch chiết bắp. Độ pH
của môi trường nuôi cấy có thể được điều chỉnh bằng các chất như NH3, NaOH,
H2SO4 tùy theo yêu cầu.

3.9. Chất tiền thân (precusor)

Một số hóa chất khi được bổ sung vào một số loại môi trường lên men sẽ hổ
trợ trực tiếp cho việc tổng hợp một sản phẩm mong muốn. Ví dụ khi bổ sung cao bắp
(corn-steep) vào môi trường lên men sản xuất penicilin làm tăng sự tích luỹ sản

49
phẩm từ 20 đơn vị/cm3 lên 100 đơn vị/cm3 dịch môi trường. Trong cao bắp có chứa
phenylalanine làm tăng cường sản xuất benzyl penicillin.

3.10. Chất kìm hãm

Khi bổ sung các chất kìm hãm vào môi trường lên men, một sản phẩm đặc
trưng nhất định sẽ được tổng hợp nhiều hơn, hoặc một chất trao đổi trung gian theo
con đường thông thường sẽ được tích lũy dần. Sự sinh tổng hợp glycerol bằng vi
sinh vật là một ví dụ tiêu biểu. Sự sản xuất glycerol phụ thuộc vào biến đổi của
ethanol khi loại bỏ acetaldehyde. Khi thêm sodium bisulphite vào môi trường sẽ dẫn
đến sự hình thành acetaldehyde bisulphite. Do vậy không còn acetaldehide để tái
oxy hoá NADH2, đóng vai trò là chất nhận hydrogen của nó bị mất đi bởi
dihydroacetone phosphate, sinh ra trong quá trình glycolysis. Sản phẩm của phản
ứng này là glyceral 3-phosphate, sau đó chuyển thành glycerol. Ứng dụng của các
chất kìm hãm đặc trưng trong lên men được ghi nhận trong Bảng 4. 6.
Bảng 4. 6. Các chất kìm hãm dùng trong lên men.
Sản phẩm Chất kìm hãm Ảnh hưởng chính Chủng vi sinh vật

-Glycerol Sodium bisulphite Ức chế sản xuất acetaldehyde Sac. cerevisiae

-Tetracycline Bromide Ức chế sự hình thành Strep.aureofaciens
Chlortetracycline
-Glutamic acid Penicilline Tính thấm của màng tế bào Mic. glutamicus
-Citric acid Chất kiềm metal/ Ức chế Oxalic acid Asp. niger
phosphate,
pH<2.0
-Valine Nhiều chất ức chế Nhiều ảnh hưởng với các chất Bre. roseum
khác nhau ức chế khác nhau
-Rifamycine -B Di-ethyl Kìm hãm các Rifamycine khác Nocardia
barbiturate mediterranei

-7-chloro-6 Ethione Ảnh hưởng lên các phản ứng Strep.aureofaciens

demethyl- chuyển 1 carbon
tetracycline

3.11. Chất cảm ứng

Đa số các enzyme được sản xuất trong công nghiệp đều là enzyme cảm ứng.
Các enzyme này chỉ được sinh tổng hợp khi có sự đáp ứng với sự hiện diện của chất
cảm ứng trong môi trường nuôi cấy. Các chất cảm ứng thường là các cơ chất bột
hoặc đường đối với amylase; maltose đối với pullunase và pectin đối với pectinase.

50
Một số chất ức chế có ảnh hưởng rất mạnh như isovaleronitrile cảm ứng sinh tổng
hợp nitralase. Các cơ chất tương đồng không bị phân hủy bởi các enzyme cũng có
thể đóng vai trò là chất cảm ứng. Hầu hết các chất cảm ứng là các cơ chất tương đồng
nhưng cũng có khi là chất trao đổi trung gian hoặc sản phẩm làm chất cảm ứng. Ví dụ
maltodextrine cảm ứng sinh amylase, acid béo cảm ứng sinh lipase. Tuy nhiên, do
giá thành cao nên trong công nghiệp người ta không dùng chúng để làm chất cảm
ứng. Một ứng dụng lấy nấm men làm chất cảm ứng trong sản xuất streptomycin.
Trong quá trình lên men, streptomycin và mannosidostreptomycin được sinh tổng
hợp. Bởi vì mannosidostreptomycin chỉ có hoạt tính khoảng 20% so với
streptomycin, do vậy nó là sản phẩm không mong muốn. Chủng Strep.griseus có thể
được cảm ứng bởi nấm men mannan để sinh  -mannosidase, enzyme này sẽ chuyển
mannosidostreptomycin thành streptomycin.
Hiện nay người ta có thể sản xuất một lượng lớn protein có nguồn gốc khác
nhau (từ virus, người, động vật, thực vật và vi sinh vật) trong nấm men, nấm sợi và
vi khuẩn. Tuy nhiên các protein này đôi khi lại có độc tính đối với tế bào chủ và có
ảnh hưởng lớn lên tính ổn định của sự biểu hiện protein. Cũng giống như sự ức chế
lên tăng trưởng của chủng, tính độc của các protein này sẽ gây ảnh hưởng đến các
điều kiện chọn lọc cho các tế bào phân ly mà không thể tổng hợp protein với hàm
lượng cao. Do vậy, điều kiện để chủng tăng trưởng tối thích thì sẽ không phù hợp để
đồng thời sinh tổng hợp protein ngoại được, và điều này chỉ thực hiện được khi gây
cảm ứng sau khi đã tạo đủ lượng sinh khối trong bồn lên men. Ví dụ trường hợp của
Sac. cerevisiae có promoter Gal1 là một phần của hệ thống biểu hiện, sự hình thành
sản phẩm chỉ thực hiện được khi bổ sung galactose vào môi trường nuôi cấy có chứa
glycerol hoặc glucose ở nồng độ thấp.

3.12. Yêu cầu về oxygen

Mặc dù oxygen không được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật như
là một thành phần tuy nhiên oxygen đóng vai trò rất quan trọng đối với sự tăng
trưởng và sự sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Tính chất của
môi trường ảnh hưởng lên hàm lượng oxygen theo các cách như sau:
- Cơ chế biến dưỡng nhanh: Nếu nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy ở
mức phù hợp cho tăng trưởng, hàm lượng oxygen nhanh chóng giảm xuống do nhu
cầu sử dụng oxygen xảy ra đồng thời khi đồng hóa đường.

- Tính lưu biến của môi trường: Các thành phần của môi trường sẽ góp phần
tạo nên độ nhớt của môi trường. Khi độ nhớt của môi trường cao, tính lưu biến của
môi trường thấp và do vậy sẽ ảnh hưởng trực tiếp lên sự sục khí khả năng khuấy

51
trộn, hạn chế sự khuếch tán của oxygen không khí trong môi trường trong quá trình
lên men.
- Chất phá bọt: Chất phá bọt đóng vai trò là chất hoạt động bề mặt và làm giảm
tốc độ khuếch tán của oxygen. Khi nồng độ chất phá bọt cao, độ hòa tan của oxygen
trong môi trường sẽ giảm đáng kể, gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và trao đổi
chất của vi sinh vật.

4. Đánh giá môi trường

Mục đích của đánh giá môi trường
Bảo đảm về mặt kỹ thuật: phù hợp, hiệu quả cao
Yếu tố kinh tế: giá thành sản xuất thấp, tính ổn định
Yếu tố an toàn cho sản phẩm
Đánh giá môi trường dựa trên các tiêu chí:
1. Thành phần các chất môi trường
2. Hàm lượng nguyên liệu
3. Chất lượng nguyên liệu
4. Giá cả của nguyên liệu
5. Tính ổn định của nguồn nguyên liệu

5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột
Tinh bột (starch) là nguồn nguyên liệu có nguồn gốc nông nghiệp rất phổ
biến, được sử dụng để sản xuất đường glucose, phục vụ cho nhiều mục đích khác
nhau trong lĩnh vực thực phẩm, lên men….

Hình 4. 4. Cấu tạo của amylose và amylopectin.

Phương trình phản ứng thủy phân tinh bột thành đường glucose:

52
 (C6H10O5)nH2O + (n-1)H2O  nC6H12O6

MW: (162×n+18) 180×n

(n ≥ 1)

Hiệu suất đường hóa = 180×n/(162×n+18) với n là số đơn phân glucose trong
tinh bột. Tùy theo loại tinh bột mà n có khoảng giá trị khác nhau. Do vậy, đối với mỗi
loại tinh bột thì hiệu suất đường hóa cực đại khác nhau. Hiệu suất đường hóa lớn
nhất khi toàn bộ các đơn phân glucose trong phân tử tinh bột được cắt rời hoàn
toàn, khi đó số lượng đơn phân trong dung dịch đạt cực đại.
180× 𝑛
Hiệu suất đường hóa tối đa = lim nà∞ [ ] ×100 =111,11%
(162× 𝑛+18)

Tác nhân thủy phân tinh bột thành đường glucose có thể là H2SO4 hoặc
enzyme. Việc sử dụng H2SO4 để thủy phân tinh bột trong công nghiệp gặp phải nhiều
nhược điểm như hiệu suất thủy phân không cao, kém ổn định, thiết bị sử dụng đắt
tiền, kém an toàn cho công nhân vận hành, dung dịch glucose có độ màu cao, chứa
nhiều dư lượng của SO42- gây ảnh hưởng xấu khi sử dụng cho môi trường lên men.
Do vậy trong sản xuất công nghiệp sản xuất đường glucose từ tinh bột hiện nay
người ta thường dùng các enzyme như amyloase, glucose amylase để thủy phân.
Sử dụng phương pháp enzyme để thủy phân tinh bột thành đường cần thông
qua hai bước:
- Quá trình dịch hóa (liquefaction):
Sử dụng enzyme  -amylase để thủy phân tinh bột thành các đoạn
oligosaccharide mạch ngắn. Phản ứng được thực hiện ở pH 5-6,5, nhiệt độ 70-105oC
trong thời gian khoảng 90-120 phút với tỷ lệ enzyme sử dụng là 0,8-1,3 L/t DS. Nồng
độ tinh bột trong dịch bột thích hợp cho phản ứng là 30-35%. Sản phẩm của quá
trình dịch hóa là dung dịch chứa các oligosacchride với DE (dextrose equivelent)
khoảng 12-20%. Với thành phần này thì sẽ rất thuận lợi cho giai đoạn phân cắt tiếp
theo.
- Quá trình đường hóa (saccharification):
Phản ứng thủy phân được thực hiện bởi enzyme glucose amylase, có đặc điểm
là thủy phân các oligosaccharide thành các đơn phân glucose.
Phản ứng diễn ra ở pH 4,0-4,5, nhiệt độ tối ưu khoảng 60-62oC. Với tỷ lệ enzyme sử
dụng 0,35-0,5 L/t DBS (dried base starch) thì sau khoảng thời gian 60-80 giờ sẽ thu
được dung dịch đường glucose với hiệu suất đường hóa đạt khoảng 110%.

53
6. Xử lý mật rỉ mía đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men
1. Thành phần của mật rỉ đường mía ở Việt Nam

Thành phần các chất có trong mật rỉ đường mía (cane molasses) ở Việt nam thay đổi
tuỳ theo vùng, tuỳ theo vụ mùa và tuỳ vào công nghệ của nhà máy đường.

Bảng 4. 7. Thành phần của mật rỉ đường

Thành phần %
Hàm lượng đường tổng số 46-60
Hàm lượng Ca2+ 0,3-1,2
Hàm lượng K+ 1,8-5,0
Hàm lượng Mg2+ -
Màu 4 00nm (*250) 0,2-1,3
Tỷ trọng 1,4-1,7

2. Phương pháp xử lý mật rỉ đường trước khi dùng cho qui trình lên men

Một số chủng vi sinh vật có thể sử dụng đường sucrose trực tiếp cho qui trình
lên men, nhất là những chủng có hệ enzyme SPT….Tuy nhiên, một số chủng chỉ sử
dụng đường đơn glucose hoặc fructose. Do vậy, việc thuỷ phân sucrose thành đường
đơn trong một số trường hợp là rất cần thiết. Có nhiều phương pháp để thuỷ phân
sucrose: (1) Phương pháp dùng phản ứng enzyme invertase, (2) phương pháp thuỷ
phân bằng acid (H2SO4).
Thông thường H2SO4 được sử dụng để thủy phân đường sucrose thành đường
glucose và fructose trong công nghệ sử lý mật rỉ đường. Mặt khác, trong thành phần
của mật rỉ đường có chứa làm lượng Ca2+ rất cao, gây ức chế cho sự tăng trưởng của
vi sinh vật cũng như ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men cũng như thu hồi
sản phẩm sau lên men. Do vậy cần phải loại bỏ Ca2+ trong mật rỉ trước khi đưa vào
giai đoạn lên men. Việc sử dụng H2SO4 đồng thời có tác dụng là gốc SO42- sẽ phản ứng
với Ca2+ để tạo muối CaSO4 dạng ít tan và có thể loại khỏi dung dịch đường bằng cách
ly tâm.
Sucrose + H+  Glucose + Fructose

Ca2+ + SO42-  CaSO4 (ít tan)

Qui trình xử lý được thực hiện như sau: Pha loãng mật rỉ đường về nồng độ
thích hợp cho qui trình lên men, thường từ khoảng 35-40%. Bổ sung H2SO4 đến khi
pH đạt từ 2.5-3.0. Giữ ở nhiệt độ 50-60oC trong vòng 48-60 giờ sau đó ly tâm ở

54
2000-3000g để tách loại tinh thể CaSO4. Hiệu suất thuỷ phân đường glucose lúc này
có thể đạt trên 98%. Lưu ý là trong trường hợp hàm lượng K+ trong mật rỉ đường
quá cao, quá trình phản ứng sẽ tạo tinh thể K2Ca(SO4)2, tinh thể muối này có kích
thước hạt nhỏ hơn so với tinh thể CaSO4 nên cần phải tăng lực ly tâm để tách loại
triệt để.

55
CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

Phân biệt các khái niệm

- Khử trùng (sterilization)
- Tiệt trùng
- Thanh trùng (pasteurization)
- Sát trùng
- Tẩy trùng (disinfection)
- Vô trùng (sterile)
Khử trùng (sterilization): là quá trình loại bỏ hoặc giết toàn bộ vi sinh vật
trong thực phẩm bởi nhiệt độ, chiếu xạ… Đây là phương pháp mà toàn bộ các yếu tố
tạp nhiễm vi sinh bị huỷ diệt triệt để.
Tẩy trùng (disinfection): Là quá trình ức chế hoặc làm suy giảm số lượng vi
sinh vật, phương pháp này chỉ được áp dụng đối với các dụng cụ, thiết bị (non-living
objects). Đây cũng là phương pháp làm huỷ diệt các nhân tố gây bệnh bởi vi sinh.
Thanh trùng (pasteurization): là quá trình khử trùng của các dịch lỏng (sữa)
để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh.

1. Mục đích khử trùng trong lên men

Một sản phẩm lên men được tạo ra bằng một chủng hoặc một nhóm chủng vi
sinh vật nhất định trong môi trường dinh dưỡng. Nếu quá trình lên men bị xâm
nhiễm bởi vi sinh vật ngoại thì thường xảy ra các hậu quả sau đây:
- Môi trường nuôi cấy thường giàu dinh dưỡng giúp cho sự tăng trưởng tốt
không chỉ cho chủng vi sinh vật sản xuất mà còn cho cả chủng tạp nhiễm, do vậy
thường dẫn đến việc thất thoát sản lượng.
- Trong trường hợp lên men liên tục, chủng tạp nhiễm có thể tăng trưởng
vượt quá chủng sản xuất và thay thế chủng sản xuất trong trong quá trình lên men.
- Chủng tạp nhiễm có thể gây nhiễm lên sản phẩm cuối. Ví dụ trong trường
hợp sản xuất protein đơn bào thì tế bào chủng tạp nhiễm sẽ lẫn trong sản phẩm cuối.
- Chủng tạp nhiễm có thể sinh tổng hợp các hợp chất ảnh hưởng khó khăn
cho qui trình chiết tách sản phẩm cuối.
- Chủng tạp nhiễm có thể phân huỷ sản phẩm mong muốn. Đây là trường hợp
thường xảy ra đối với lên men sản xuất kháng sinh khi mà các chủng tạp nhiễm
kháng lại những ảnh hưởng ức chế của chất kháng sinh và việc phân huỷ chất kháng
sinh là một trong những cơ chế kháng thông thường. Ví dụ trong trường hợp phân
hu -ỷlactam
kháng b
sinh ởi ch
- lactamase. ủng
 s ản xu ất

56
 - Sự tạp nhiễm của phage đối với chủng lên men sản xuất thường dẫn đến
việc phân huỷ tế bào trong dịch nuôi cấy.
Một trong những vấn đề quan trọng của lên men có kiểm soát là phải khử
trùng nhằm loại bỏ các yếu tố gây tạp nhiễm sinh học (như nấm mốc, nấm men, vi
khuẩn, phage). Tùy theo vào loại sản phẩm và qui trình lên men mà mức độ kiểm
soát vô trùng trong quá trình lên men có khác nhau. Trong trường hợp lên men sản
xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thuốc trị bệnh thì cần phải kiểm soát tạp
nhiễm chặt chẽ, do vậy mức độ khử trùng là rất nghiêm ngặt. Đối với trường hợp lên
men sản xuất các sản phẩm dùng trong thực phẩm thì mức độ kiểm soát tạp nhiễm
kém nghiêm ngặt hơn. Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy có kiểm soát đạt được khi:
- Sử dụng giống không bị tạp nhiễm
- Khử trùng môi trường trước khi sử dụng
- Khử trùng nồi lên men
- Khử trùng toàn bộ các nguyên liệu bổ sung vào nồi lên men trong quá trình
nuôi cấy
- Duy trì điều kiện vô trùng trong quá trình lên men

2. Yêu cầu khi khử trùng

- Loại bỏ một phần hoặc toàn bộ tác nhân gây nhiễm sinh học ảnh hưởng lên
quá trình lên men. Tác nhân gây nhiễm sinh học có thể bao gồm cả tế bào sinh
dưỡng và bào tử.
- Quá trình khử trùng không gây nên những biến đổi đáng kể về chất –lượng
của môi trường. Không tạo ra các chất độc hại có thể gây kìm hãm hay ức chế sự
phát triển, hoặc làm suy giảm hoạt tính sinh tổng hợp của chủng nuôi cấy sau này.
- Tác nhân khử trùng không độc hại đối với người vận hành, môi trường, thao
tác đơn giản, rẻ tiền, dễ áp dụng cho qui mô sản xuất lớn, dễ tự động hóa.

3. Phương pháp khử trùng

3.1. Sử dụng tác nhân vật lý
a) Phương pháp lọc
Phương pháp lọc được sử dụng để lọc không khí hoặc môi trường. Trong
trường hợp thành phần môi trường có các chất kém bền với các tác nhân như nhiệt
độ hoặc chiếu xạ, hoặc môi trường có chứa các thành phần dễ bay hơi… thì sử dụng
phương pháp lọc là một giải pháp rất hữu hiệu. Các dạng lọc thông dụng bao gồm lọc
màng, lọc túi, lọc cartridge
b) Dùng tác nhân là không khí nóng (hot air)
Sử dụng không khí nóng để làm khô các thiết bị lên men.

57
 c) Sử dụng tác nhân là hơi nước nóng (steam)
Hơi nước nóng là tác nhân khử trùng hiệu quả, dễ áp dụng cho qui mô sản
xuất công nghiệp và được sử dụng rộng rãi để khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh
vật và khử trùng thiết bị lên men.
- Phóng xạ (tia UV, tia X, tia g), siêu âm

3.2. Tác nhân hóa học

Các hóa chất thường dùng là phenol, alcohol, formol, hologen, H2O2… hoặc các
dung dịch hóa chất chuyên dụng như Germicide, Stabilon BP, Triquart…
a) Phenol. Được dùng ở dạng dung dịch để sát trùng các dụng cụ, thiết bị. Tuỳ
theo nồng độ mà dung dịch phenol có tác dụng diệt khuẩn hay ức chế vi khuẩn. Hoạt
tính của phenol bị giảm trong môi trường kiềm và trong môi trường có mặt chất hữu
cơ. Ngược lại trong môi trường có muối thì hoạt tính này tăng lên. Phenol và các dẫn
xuất của nó tác động chủ yếu lên các lớp màng của tế bào, phá hoại tính bán thấm
của màng tế bào chất và làm biến tính protein. Chúng thường được dùng kết hợp với
xà phòng để làm dung dịch sát trùng da.
b) Các alcohol như ethanol, methanol có tác dụng sát khuẩn rất mạnh, thường
gây nên sự động tụ protein màng. Khi ở nồng độ cao, các alcohol có tính khử nước
mạnh do đó rút nước khỏi tế bào, cản trở sự xâm nhập của alcohol vào nội bào nên
chỉ có tác dụng ức chế vi khuẩn. Ethanol 70% có tính sát khuẩn tốt hơn loại 90%.
c) Các halogen có tính độc với vi sinh vật. Tác dụng diệt khuẩn của cá hologen
là do việc hình thành acid pecloric. Acid này bị phân huỷ tiếp để hình thành acid
clohydric và oxy. Oxy ở trạng thái này là một chất oxy hoá mạnh có tác dụng phá huỷ
các thành phần của tế bào.
- Cl2 và các hợp chất của clo như NH2Cl (cloramin), NHCl2(cloran) đều có tác
dụng diệt khuẩn tốt. Cấu trúc của tế bào có thể bị phá huỷ do tác dụng trực tiếp của
Cl2. Cơ chế tác dụng của clo được mô tả như sau:
+ Clo có thể thay thế hydro trong nhóm amin của protein để tạo thành
cloramin làm cho cấu trúc của protein bị thay đổi, do đó cấu trúc của tế bào cũng bị
phá huỷ.
R-CO-NH-R- + Cl2 → R-CO-NCl-R + HCl
+ Clo còn tác dụng với nước để tạo thành oxi nguyên tử
Cl2 + HOH → HOCl + HCl
HClO → HCl + O
+ Clo trong hợp chất với Ca2+ tạo thành clorua vôi Ca(OCl)2 cũng có khả
năng diệt khuẩn tốt.

58
 Ca(OCl) + 2H2O → Ca(OH)2 + HClO
HClO → HCl + O
+ Clo tác dụng với NaOH tạo thành natrihypoclorit cũng là một chất diệt
khuẩn rất tốt.
Cl2 + 2NaOH → NaOCl + NaCl + H2O

- Iod là một chất diệt khuẩn khác thuộc nhóm halogen. Iod dễ hoà tan trong
alcohol và trong dung dịch và trong các dung dịch kiềm Na, K. Iod chỉ có tác dụng
diệt khuẩn trên bề mặt nên thường chỉ được dùng để khử trùng bề mặt, không khí.

4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt

Động học về sự hủy diệt tế bào vi sinh vật do hơi nước nóng được mô tả theo
phương trình sau:
-dN/dt = k.N (5.1)
Trong đó, N là số tế bào sống hiện diện, t là thời gian khử trùng, k là tốc độ
chết đặc trưng của tế bào vi sinh vật (phút-1). Cần lưu ý rằng k chỉ đạt hằng số dưới
điều kiện nhiệt độ khử trùng không thay đổi.
Từ phương trình (5.1) trên ta có:
-dN/N = k.dt
⇒ ∫ (−dN / N ) = ∫ k.dt
⇒ Ln(Nt/No) = -kt (5.2)
⇒ Nt/No = e-kt (5.3)

No và Nt là số tế bào vi sinh vật tại thời điểm bắt đầu xử lý khử trùng và sau
khi khử trùng được thời gian t. Giá trị k không chỉ phụ thuộc vào chủng vi sinh vật
mà còn phụ thuộc vào dạng trạng thái sinh lý: ví dụ khi ở dạng bào tử thì khả năng
chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với dạng tế bào sinh dưỡng. Do vậy khi khử trùng
phải chọn lựa điều kiện thích hợp để có thể khử trùng hết toàn bộ các nhân tố gây
nhiễm.
Ở điều kiện (100 oC, 40 phút), hầu hết các chủng vi sinh vật (kể cả bào tử) đều
bị diệt ngoại trừ bào tử của Streptomyces sp ngay cả với điều kiện nhiệt độ như trên
trong vòng 3 giờ. Ở các điều kiện (115 oC, 60 phút), (120 oC, 30 phút), (130 oC, 5
phút) thì hầu như toàn bộ vi sinh vật bị chết, ngay cả đối với trường hợp của bào tử
các chủng chịu nhiệt (thermophile). Trong điều kiện (160 oC, 30 phút) bào tử khô
của các chủng chịu nhiệt cũng bị diệt.
Từ phương trình (5.3) và đồ thị trên Hình 5.1 cho thấy:
1. Thời gian khử trùng để khả năng không còn tế bào vi sinh vật tồn tại là vô
cùng (Nt = 0)

59
 2. Sau một thời gian khử trùng nhất định thì luôn luôn tồn tại khả năng có
dưới một tế bào đang sống. Trong thực tế, người ta quan niệm rằng với 0 < Nt < 1 thì
luôn tồn tại một tế bào sống sau khi xử lý khử trùng nhiệt.
Điều này có nghĩa là cho dù khử trùng ở nhiệt độ nào, trong thời gian bao lâu
thì nguy cơ bị tạp nhiễm cũng vẫn còn! Do vậy, vấn đề là cần phải hạn chế số lượng
vi sinh vật tạp nhiễm trước khi khử trùng như vệ sinh thiết bị, sử dụng nguyên liệu
có độ tinh sạch cao, ổn định … chứ không nhất thiết là phải tăng cường các điều kiện
khử trùng.
Giả sử D là thời gian khử trùng để giảm số lượng tế bào vi sinh vật sống xuống
10 lần ta có: Nt = 1/10.No
Ln(1/10) = - kD
Hay D = 2,303/k

Bảng 5. 1: Mối quan hệ giữa giữa thời gian khử trùng số lượng tế bào vi sinh vật sống
sót khi khử trùng bằng nhiệt.
-kt
t kt e Nt
0 - 1.000000 1,000,000.0
10 1.50 0.223130 223,130.2
20 3.00 0.049787 49,787.1
30 4.50 0.011109 11,109.0
40 6.00 0.002479 2,478.8
50 7.50 0.000553 553.1
60 9.00 0.000123 123.4
70 10.50 0.000028 27.5
80 12.00 0.000006 6.1
90 13.50 0.000001 1.4
100 15.00 0.000000 0.3

No = 1,000,000 tế bào
k = 0.15 /min

60
 Hình 5. 1. Mô hình mối quan hệ giữa thời gian khử trùng số lượng tế bào vi sinh vật
sống sót khi khử trùng bằng nhiệt.

Thôøi gian teá baøo suy

giaûm 10 laàn (D)
Tyû leä teá baøo soáng soùt

100
(theo tyû xích log)

50oC
70oC 60oC
10

1,0

0,1
10 20 30 40 50
Thôøi gian (phuùt)

Hình 5. 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự biến dị của các chủng vi khuẩn ưa nhiệt
trung bình. Thời gian suy giảm tế bào 10 lần (D) có được của cùng một chủng vi sinh
vật ở các nhiệt độ khác nhau. D là thời gian mà chỉ 10% số tế bào vi sinh vật còn lại ở
một nhiệt độ nhất định. Đối với nhiệt độ 70oC, D = 3 phút; 60oC, D = 12 phút; 50oC, D=
41 phút.

61
 100

(b)
10

Thôøi gian teá baøo suy

giaûm 10 laàn (phuùt)
(a)
1,0

0,1

105 110 115 120 125 130

Nhieät ñoä (oC)

Hình 5. 3: Mối quan hệ giữa nhiệt độ và tốc độ chết được biểu thị bởi thời gian tế bào
suy giảm 10 lần của hai chủng vi sinh vật khác nhau. Đối với chủng (a), ở nhiệt độ
110oC, D< 20 giây. Trong khi đó đối với chủng (b)(chịu nhiệt cao) D = 10 phút.

5. Khử trùng môi trường

Khử trùng môi trường trong nuôi cấy vi sinh vật có thể được thực hiện bằng
phương pháp dùng hơi nước hay phương pháp lọc. Yêu cầu của phương pháp lọc là
môi trường lỏng, đồng nhất, cặn bã thô trong môi trường ít. Đối với cách khử trùng
dùng hơi nước thì có nhiều thuận lợi, dễ áp dụng. Dùng hơi nước nóng để khử trùng
có hai cách: (1) gia nhiệt gián tiếp: như trong trường hợp của autoclave, của khử
trùng liên tục, (2) gia nhiệt trực tiếp như trong trường hợp của khử trùng theo mẽ.
Khi tăng độ nghiêm ngặt khử trùng thì sẽ gây biến đổi thành phần môi trường
do sự phản ứng giữa các thành phần này hoặc làm phân hủy các chất không bền
nhiệt, dễ bay hơi … Từ đó làm cho kết quả lên men giảm đáng kể (theo bảng sau).
Cần lưu ý rằng khi pH của môi trường thấp, hiệu quả khử trùng tăng lên, và
nếu nồng độ các chất trong môi trường (đường, protein, chất béo) cao sẽ làm giảm
hiệu quả khử trùng của môi trường.

Bảng 5. 2: Ảnh hưởng thời gian khử trùng lên nồng độ glucose và tốc độ tích lũy sản
phẩm trong lên men tạo kháng sinh (Corbett, 1985)

62
 Thời gian khử trùng ở Nồng độ Tốc độ tích lũy
1210C (phút) glucose còn lại (%) sản phẩm tương đối
60 35 90
40 46 92
30 64 100

Có hai dạng khử trùng thường được sử dụng để khử trùng môi trường trong
thực tế sản xuất công nghiệp: khử trùng liên tục và khử trùng mẻ. So với khử trùng
mẻ thì khử trùng liên tục có nhiều ưu điểm và do vậy thường được dùng nhiều hơn.

5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục

Một số ưu điểm chính của hệ thống khử trùng liên tục:
1. Duy trì tốt chất lượng môi trường sau khử trùng
2. Dễ dàng nâng cấp qui mô sản xuất
3. Dễ dàng kiểm soát tự động
4. Giảm sự tăng thể tích môi trường do hơi nước ngưng tụ
5. Lượng tiêu thụ của hơi nước nóng ổn định trong suốt quá trình
6. Giảm thiểu sự ăn mòn nồi lên men
tục

120
S
Nhiệt độ (oC)

g liên

S1 S2
100
h trùn

Th
anh
Than

trù
ng
the
o
mẻ

30

10 16 20 30 36 40

Thời gian thanh trùng (phút)

Hình 5. 4: Mô hình thay đổi nhiệt độ trong khử trùng theo phương pháp liên tục và
theo phương pháp mẻ. Trong trường hợp khử trùng liên tục (a), thời gian để đạt nhiệt
độ khử trùng là rất ngắn (~10 phút) và được làm nguội nhanh; tổng tác động nhiệt
(trên 100oC) của môi trường trong trường hợp này là vùng S. Trường hợp khử trùng
theo mẻ (b) thì ngược lại, mức độ tăng lên để đạt nhiệt độ khử trùng diễn ra chậm, và

63
quá trình hạ nhiệt sau khử trùng cũng chậm, do vậy, tổng tác động nhiệt của môi
trường (S+S1+S2), lớn hơn trong trường hợp khử trùng liên tục.

Boàn chuaån bò Hôi nöôùc noùng

moâi tröôøng

V-3

TI

F
V-2
Thieát bò ño
Löu löôïng

Nöôùc noùng Bôm

Thieát bò gia Thieát bò Boàn leân men
nhieät sô caáp gia nhieät Thaùp löu

Hình 5. 5: Mô hình hệ thống khử trùng môi trường liên tục trong lên men công nghiệp.
Hệ thống khử trùng liên tục bao gồm:
(1) Bồn chuẩn bị môi trường;
(2) Bơm;
(3) Thiết bị hiệu chỉnh lưu tốc truyền dịch
(4) Thiết bị gia nhiệt sơ cấp
(5) Thiết bị gia nhiệt
(6) Tháp lưu
(7) Thiết bị kiểm soát nhiệt độ khử trùng.

Nguyên lý hoạt động của hệ thống bao gồm hai giai đoạn là (1) Khử trùng
thiết bị của hệ thống và (2) Khử trùng môi trường.
1. Khử trùng thiết bị của hệ thống
Hệ thống trước khi sử dụng cho khử trùng môi trường thì bản thân nó cần
phải được khử trùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm. Tác nhân khử trùng là nước
nóng từ bồn chứa được bơm (2) vào hệ thống qua thiết bị gia nhiệt (5). Ở đây, nhiệt
độ của nước được nâng lên 120oC bằng hơi nước nóng được cung cấp trực tiếp vào
thiết bị gia nhiệt. Nước nóng sau đó đi vào tháp lưu và được hồi lưu về bồn chứa sau
khi đi qua thiết bị gia nhiệt sơ cấp. Thời gian tuần hoàn nước khử trùng trong hệ
thống khoảng từ 1- 2 giờ thì bảo đảm được tính vô trùng.

64
 2. Khử trùng môi trường
Hệ thống thiết bị sau khi được khử trùng xong, chuyển van 3 chiều từ hướng
bồn chứa nước nóng sang hướng bồn chuẩn bị môi trường. Khi đó môi trường trong
bồn (1) này được bơm đưa vào hệ thống khử trùng qua thiết bị gia nhiệt sơ cấp (4)
và sau đó đi vào thiết bị gia nhiệt (5).
Nhiệt độ khử trùng được cài đặt ở giá trị thích hợp (ví dụ 120oC) và tự kiểm
soát bằng hệ thống tự động gồm đầu cảm biết nhiệt gắn trên đường ống dẫn dịch
môi trường sau khi qua thiết bị gia nhiệt và một van tự động kiểm soát lượng hơi
nước nóng cung cấp vào thiết bị gia nhiệt. Khi nhiệt độ khử trùng chưa đạt theo giá
trị cài đặt, thiết bị cảm biến nhiệt sẽ nhận diện và truyền tín hiệu đến bộ điều van tự
động mở ra để cung cấp thêm hơi nước nóng cho hệ thống. Ngươc lại, khi nhiệt độ
vượt quá giá trị cài đạt thì van tự động này sẽ đóng lại, hạn chế hơi nước nóng đi vào
thiết bị gia nhiệt.
Thiết bị gia nhiệt có thể là dạng các “tấm trao đổi nhiệt” (heat exchange plates,
Hình 5. 5 a) được lắp ghép liên kế nhau tạo nên các khoang hở bên trong cho phép
hai pha dịch trao đổi nhiệt cho nhau hoặc dạng xoắn ốc (spiral, coil) (Hình 5. 5 b, c).

(a) (b) (c)

Hình 5. 6. Thiết bị trao đổi nhiệt sử dụng trong hệ thống khử trùng môi trường. (a)
Dạng tấm; (b) dạng xoắn ốc, spiral; (c) Dạng cuộn lò xo, coil.

Thời gian khử trùng được kiểm soát bằng lưu lượng dịch môi trường nạp vào
hệ thống khử trùng. Tháp lưu được thiết kế nhằm lưu giữ dịch môi trường sau khi
gia nhiệt một thời gian nhất định tùy thuộc vào lưu tốc truyền dịch.
Thời gian khử trùng được kiểm soát thông qua lưu lượng dịch bơm vào hệ
thống theo công thức:
t = V/F (5.5)

65
 trong đó, t là thời gian khử trùng, V là thể tích tháp lưu, F là lưu lượng dịch
môi trường nạp vào hệ thống.
Ví dụ: Với thể tích tháp lưu V = 10 KL, để thời gian khử trùng t đạt 15 phút thì
tốc độ bơm dịch môi trường vào hệ thống khử trùng F = 10/15×60 = 40 KL/hr.
Lưu tốc dịch nạp vào hệ thống được kiểm soát tự động bằng một thiết bị đo
lưu lượng (3) trên đường ống và van tự động. Khi lưu lượng dịch khác biệt với giá trị
cài đặt thì van tự động sẽ tự đóng/mở để điều chỉnh lưu lượng đúng theo giá trị đã
cài đặt.

5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ

Toàn bộ các thành phần môi trường được chuẩn bị trong nồi lên men, sau đó
gia nhiệt trực tiếp vào bồn đến khi đạt nhiệt độ nhất định cần cho khử trùng (thông
thường 121-125oC). Tính thời gian khử trùng kể từ khi nhiệt độ môi trường đạt giá
trị cài đặt. Môi trường sau khử trùng được hạ nhiệt độ bằng cách cấp nước lạnh vào
hệ thống giải nhiệt của nồi (thường là dạng ống xoắn vòng, coil hoặc dạng tháp ống,
tube). Trong quá trình khử trùng cần lưu ý là phải khuấy trộn dịch môi trường nhằm
bảo đảm gia nhiệt đồng nhất cho toàn bộ môi trường. Ưu điểm của phương pháp này
là thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ kiểm soát quá trình khử trùng và hiệu quả khử
trùng tốt. Tuy nhiên, phương pháp này tồn tại một số nhược điểm như thời gian gia
nhiệt dài, làm nguội môi trường chậm do vậy tổng thời gian chịu nhiệt của môi
trường cao, gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng của môi trường sau khi khử trùng. Do
phải gia nhiệt trực tiếp nên một lượng lớn nước ngưng từ hơi nước nóng làm cho
thể tích môi trường sau khử trùng tăng lên rất đáng kể, làm giảm nồng độ các chất
trong môi trường. Để khắc phục tình trạng này, người ta thường giảm thể tích nước
pha loãng khi chuẩn bị môi trường. Một nhược điểm nữa của phương pháp này là
tính tự động hóa kém.

Để xác định điều kiện khử trùng cho một loại môi trường nào đó chúng ta cần
thực hiện hai loạt thí nghiệm thay đổi nhiệt độ và thời gian khử trùng, sau đó đánh
giá sự tồn tại của vi sinh vật tạp nhiễm (bằng cách trải các môi trường sau khử trùng
lên đĩa pettri rồi ủ hoặc thực hiện nuôi cấy lắc…) và kết quả lên men khi nuôi cấy
chủng sản xuất.

6. Khử trùng nồi lên men

Tùy mức độ nghiêm ngặt trong kiểm soát tạp nhiễm của qui trình lên men mà
phương pháp và điều kiện khử trùng nồi có khác nhau. Ví dụ đối với các trường hợp
mức độ kiểm soát không cao như trong lên men rượu, lên men dấm thì không cần
phải dùng hơi nước để khử trùng mà có thể dùng alkohol để tiệt trùng trước khi sử

66
dụng. Trong trường lên men amino acids, lên men kháng sinh thì cần phải dùng hơi
nước nóng để khử trùng với áp suất cao (thường ≥ 1,5 kgf/cm2 để đạt nhiệt độ khử
trùng ~125oC) trong thời gian dài (≥ 2 giờ). Trong quá trình khử trùng cần phải bảo
đảm là hơi nước nóng phải được luân chuyển trong bất kỳ không gian nào của thiết
bị, nước ngưng tụ lại ở đáy nồi phải được liên tục xả ra nhằm tránh một số vị trí của
nồi không bảo đảm nhiệt độ khử trùng. Điều cần lưu ý là sau khi khử trùng xong
phải luôn luôn giữ nồi lên men ở áp suất dương bằng không khí đã được lọc sạch,
tránh không khí từ bên ngoài xâm nhập vào nồi một khi áp âm. Qui trình thao tác
khử trùng nồi lên men (Hình 5. 7) như sau:

1. Các van xả, van thoát khí phải ở trạng thái mở trước khi bắt đầu khử trùng
(V1, V2, V4, V9, V12).
2. Đóng van khí nén (V5), van cấp môi trường (V7), van nạp giống (V11) và
mở các van V3, V8, V10.
3. Cấp hơi nước nóng vào nồi, mở V6.
4. Khi nhiệt độ đạt 100oC, mở nhỏ các van xả (V1, V2, V4, V9, V12).
5. Khi nhiệt độ đạt yêu cầu (125oC) bắt đầu tính thời gian khử trùng
6. Khi thời gian khử trùng đạt yêu cầu, dừng quá trình khử trùng bằng cách
đóng van cấp hơi nước nóng (V6) và ngay lập tức mở van cấp không khí
nén (V5).
7. Khi toàn bộ nước ngưng (condensate) trong nồi lên men, trong đường ống
đều được thoát ra ngoài, đóng các van xả (V1, V2, V9, V12).
8. Duy trì áp suất không khí trong bồn và sẵn sàng để nhận môi trường chuẩn
bị cho nuôi cấy.

67
 V10 Naïp gioáng
V11
Moâi tröôøng V12
V8
V7 V9
M
V4

Khoâng khí Ghi chuù:

V5 V3 V1: Van xaû ñaùy
Hôi nöôùc V2: Van thu maãu
V6 V3: Van kieåm soaùt löu löôïng khí
V4: Van thoaùt khí, kieåm soaùt aùp suaát boàn
V5: Van caáp khoâng khí
V6: Van caáp hôi nöôùc noùng
V7, V8: van caáp moâi tröôøng
V9, V12: Van xaû dòch moâi tröôøng/ nöôùc ngöng
V10, V11: Van naïp gioáng

V2

V1

Hình 5. 7. Sơ đồ bồn lên men và các đường ống liên quan.

7. Lọc không khí

Không khí trước khi sục vào nồi lên men cần phải được lọc bỏ các tác nhân
gây tạp nhiễm. Phương pháp vô trùng không khí thường là sử dụng thiết bị lọc. Thiết
bị của hệ thống lọc bao gồm:
+ Lọc thô: nhằm loại bỏ các hạt tử có kích thước lớn. Kích thước lọc 5-30 m ,
thường là dạng màng lọc làm bằng sợi thủy tinh.
+ Lọc tinh: nhằm lọc bỏ các tế bào vi sinh vật (và cả bào tử). Kích thước màng
lọc thường 0,1-0,3 idge), th
m làm bằng các lớp sợi PE ường là
(polyethylene).

Thieát bò giaûi nhieät Thieát bò gia nhieät

Noài leân men

Thieát bò loïc thoâ Thieát bò loïc tinh

Maùy neùn khí
Cyclone taùch nöôùc

Hình 5. 8. Mô hình hệ thống các thiết bị cung cấp và xử lý không khí nén cung cấp cho
hệ thống lên men. Hệ thống bao gồm:

68
 (1) Máy nén khí
(2) Thiết bị giải nhiệt
(3) Thiết bị ly tâm (cyclone) tách nước
(4) Thiết bị gia nhiệt
(5) Thiết bị lọc thô
(6) Thiết bị lọc tinh

Không khí được nén lại với áp suất từ 1-3kgf/cm2 bằng máy nén khí công
nghiệp. Tuỳ theo nhu cầu sử dụng của hệ thống lên men mà công suất của máy nén
khí được lựa chọn khác nhau. Không khí sau khi được nén nhanh ở áp suất cao
thường sinh nhiệt. Thiết bị giải nhiệt giúp hạ nhiệt độ (thường từ 15- 20oC) của khí
nén đột ngột làm cho hơi ẩm trong khí nén ngưng tụ lại và được loại bỏ qua thiết bị
tách ẩm (cyclone). Sau đó, không nén này được sấy gia nhiệt trở lại (thường là
khoảng 38-40oC) để làm cho phần nước ngưng (nếu còn) trong khí nén khuyếch tán
đồng nhất trở lại, tránh tình trạng các “giọt” nước ngưng này (nếu còn) gây ẩm trên
màng lọc và làm giảm tính hiệu quả của thiết bị lọc. Phần khí nén này sau đó đi qua
thiết bị lọc thô nhằm loại bỏ những phần tử bụi có kích thước lớn sau đó qua thiết bị
lọc tinh, loại bỏ các tách nhân gây nhiễm sinh học. Tuỳ theo mức độ nghiêm ngặt của
hệ thống mà kích thước lọc của thiết bị lọc tinh khác nhau.

69
CHƯƠNG 6. KIỂM SOÁT NUÔI CẤY
1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào
Kiểm soát tăng trưởng là hoạt động nhằm hạn chế sự tăng trưởng của chủng
trong những giai đoạn cần thiết của quá trình lên men. Để kiểm soát được sự tăng
trưởng của chủng trong quá trình lên men cần phải định lượng (trực tiếp hoặc gián
tiếp) được lượng sinh khối hiện diện trong từng thời điểm của quá trình nuôi cấy.
Các phương pháp thường được sử dụng để theo dõi tăng trưởng bao gồm:

1. Phương pháp đếm trực tiếp

- Thường áp dụng đối với các vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn như nấm
men, tảo …
- Đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (sử dụng buồng đếm hồng cầu hoặc buồng
đếm Breed). Mẫu dịch lên men được pha loãng và được đếm trực tiếp bằng phòng
đếm dưới kính hiển vi. Phương pháp này có ưu điểm là có thể xác định nhanh được
số lượng tế bào ở từng thời điểm nhưng có nhược điểm lớn độ chính xác không cao
và không phân biệt được tế bào sống/chết.
- Có thể đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang. Nhuộm mẫu chứa vi
khuẩn bằng các chất nhuộm có khả năng phát huỳnh quang như acridin cam (AODC),
4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC). Theo
phương pháp này, số lượng vi sinh vật trong mẫu được xác định tương đối chính
xác, tương ứng tỷ lệ với lượng sinh khối và do vậy thường được dùng để ước lượng
sinh khối vi sinh vật có trong mẫu.

2. Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp này được thực hiện thông qua việc nuôi cấy mẫu trên môi
trường đặc trưng. Mẫu dịch lên men được pha loãng (theo dãy thập phân) đạt tỷ lệ
thích hợp và trải trên môi trường thạch đặc trưng sau đó được ủ ở nhiệt độ tối tích
để chủng phát triển. Đếm số khuẩn lạc hiện diện trên mặt thạch sau thời gian nuôi
cấy thích hợp, số khuẩn lạc tương ứng với số tế bào vi sinh vật sống tại thời điểm lấy
mẫu (cfu-colony forming unit). Ưu điểm của phương pháp này là xác định được
chính xác số lượng tế bào sống trong môi trường lên men đồng thời có độ nhạy cao
và thường được dùng để xác định số lượng tế bào sống ngay cả khi ở trường hợp
mật độ thấp. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là thời gian đánh giá rất
lâu. Ưu điểm của phương pháp này là có thể xác định tương đối chính xác số lượng
tế bào sống trong mẫu dịch.

70
 3. Thông qua máy đo mật độ quang (OD, optical density).
Đây là phương pháp gián tiếp rất thông dụng để đánh giá nhanh sự biến động
nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy.
Nguyên tắc của phương pháp này là khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử
không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù tạo độ đục do các phần tử này cản ánh
sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới qua dịch. Tế bào vi sinh vật được xem như là
một thực thể có thể cản ánh sáng tạo độ đục khi hiện diện trong dịch huyền phù. Độ
đục của dịch huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào vi sinh vật trong dịch. Do vậy có thể
sử dụng máy đo độ đục với bước sóng ánh sáng thích hợp (thường là từ 550 – 610
nm) để xác định gián tiếp mật độ tế bào hiện diện trong mẫu.
Nhược điểm của phương pháp này là kết quả đo thường bị ảnh hưởng bởi các
phân tử tạo màu của môi trường do vậy độ chính xác không cao. Để khắc phục tình
trạng này thông thường này ta sử dụng chính môi trường lên men làm dịch huyền
phù để hiệu chỉnh máy so màu về vị trí “0” trước khi tiến hành đo mẫu.
Nguyên lý xác định mật độ quang dựa trên cơ sở của định luật Lambert- Beer
về sự hấp thu ánh sáng của một dung dịch có chứa các chất có khả năng hấp thu ánh
ở một bướ sóng nhất định. Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io qua
một dung dịch có nồng độ c, I là cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch. Mật độ
quang (độ đục- nồng độ dung dịch) A và độ truyền suốt T được biểu diễn theo
phương trình:

A = -log T = - log (I / Io) Dung dịch hấp

thu ánh sáng

Io I

Độ đục tỷ lệ tuyến tính với mật độ tế bào trong chỉ một trong khoảng giới hạn
nhất định. Nếu độ đục của mẫu vượt quá ngưỡng giới hạn của máy thì phải pha
loãng dung dịch. Khi theo dõi tăng trưởng thì cần phải pha loãng mẫu để độ đục nằm
trong giới hạn của khoảng tuyến tính thì sự biến thiên của giá trị OD phản ánh được
mật độ tế bào vi sinh vật trong nồi lên men. Kết quả khảo sát thực nghiệm khi đo
một dung dịch tế bào vi sinh vật ở các độ pha loãng khác nhau ở bước sóng 562nm
theo Hình 5.8 cho thấy khi không pha loãng thì ODo = 1,128, khi pha loãng 4 lần, OD4
= 0,402. Rõ ràng ODo < 4 × OD4.

71
 Hình 6. 1. Giá trị OD ghi nhận được từ thực nghiệm khi đo một dịch mẫu tế bào
vi sinh Corynebacterium ở bước sóng 562nm ở các nồng độ pha loãng
khác nhau.(Source: Chuong Hoang VQ., 2013)

Tương quan giữa nồng độ tế bào và OD

0.50
0.40
0.30
OD

y = 0.0131x + 0.0249
0.20
R² = 0.9986
0.10
0.00
0 10 20 30 40
Nồng độ tế bào, %

Hình 6. 2. Tương quan tuyến tính giữa nồng độ tế bào và OD của

Corynebacterium ở bước sóng 562nm ở khoảng giới hạn tuyến tính (Source: Chuong
Hoang VQ., 2013).

72
 4. Phân tích trọng lượng tế bào khô (DCW, Dried Cell Weight).
Thu một thể tích mẫu dịch lên men nhất định (V, ml), ly tâm thu sinh khối và
sấy chân không khoảng 60oC đến khi trọng lượng không đổi (m, g). Tỷ số m/V
(g/ml) chính là nồng độ tế bào khô trong dịch lên men tại thời điểm thu mẫu. Cần
chú ý là trong trường hợp môi trường lên men có chứa nhiều phần tử không tan, khi
ly tâm, các phần tử này cùng lắng với sinh khối nên kết quả sẽ không chính xác. Để
khắc phục tình trạng này thông thường người ta sử dụng lọc có kích thước thích hợp
để loại bỏ và rửa lại sinh khối nhiều lần với acid/base.

5. Thông qua các thông số chỉ cường độ trao đổi chất.

Bằng cách xác định lượng O2 hấp thụ hoặc lượng CO2 sinh ra trong quá trình
lên men, người ta có thể gián tiếp biết được lượng sinh khối tham gia lên men trong
từng thời điểm nhất định. Nhược điểm của phương pháp này là đôi khi lượng sinh
khối nhiều nhưng do điều kiện lên men không bảo đảm làm cho quá trình trao đổi
chất diễn ra chậm.
Tại sao phải kiểm soát tăng trưởng?
Bất kỳ một hệ thống lên men nào thì cũng có sự giới hạn về công suất thiết kế.
Trong qui trình thiết bị lên men, sự giới hạn đó là ở thể tích nồi lên men, hệ thống
sục khí, hệ thống nước giải nhiệt… Do vậy, để luôn bảo đảm cung cấp đủ nguồn dinh
dưỡng, nguồn oxygen… cho vi sinh vật trong quá trình sản xuất, người ta phải giới
hạn lượng tế bào tham gia sản xuất ở một mức nhất định, phù hợp với công suất
thiết kế. Nếu lượng sinh khối tế bào tham gia sản xuất nhỏ hơn công suất thiết kế thì
sản lượng thu được không đạt yêu cầu làm tăng chi phí cố định (định phí) của sản
phẩm. Ngược lại nếu số lượng tế bào phát triển quá lớn, vượt qua giới hạn thiết kế
thì khả năng đáp ứng của qui trình liên quan không đủ làm cho hiệu quả lên men
kém, tăng chi phí biến động (biến phí) và như vậy sẽ làm tăng chi phí sản xuất. Do
vậy cần phải kiểm soát sự tăng trưởng tế bào ở một mức nhất định, phù hợp với
công suất của các hệ thống thiết bị liên quan. Cũng cần lưu ý thêm rằng, trong quá
trình nuôi cấy, việc theo dõi mật độ tế bào theo thời gian còn có ý nghĩa để nhận diện
tình trạng bình thường hay bất thường của quá trình lên men. Bên cạnh đó việc theo
dõi tăng trưởng còn giúp để nhận diện nếu có hiện tượng tạp nhiễm xảy ra. Ví dụ khi
nhiễm phage, mật độ tế bào đột ngột giảm do một lượng lớn tế bào vi sinh vật bị vỡ
ra khi bị phage tấn công, còn nếu bị nhiễm tạp khuẩn thì mật độ tế bào tăng lên bất
thường.

73
 1.4

1.2

1.0

0.8
-(1)
OD

0.6 -(2)
0.4 -(3)

0.2
Thời gian nuôi cấy (giờ)
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Hình 6. 3. Sự thay đổi OD trong quá trình nuôi cấy. (1): Trường hợp bình thường, kiểm
soát được, (2): Trường hợp OD tăng liên tục, không kiểm soát được, có thể do bị tạp
nhiễm hoặc các yếu tố kiểm soát không phù hợp. (3): OD giảm đột ngột có thể là do
nhiễm phage.

Kiểm soát tăng trưởng của chủng nuôi cấy bằng cách nào?
- Bổ sung các chất ức chế tăng trưởng (Tween 40, 60, penicilin)
- Thay đổi yếu tố sinh lý (nhiệt độ, độ pH của môi trường lên men)
- Giới hạn hàm lượng cơ chất giới hạn

2. Kiểm soát pH
Kiểm soát pH nhằm bảo đảm pH sinh lý của tế bào trong quá trình phát triển
và sinh tổng hợp các chất. Vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi
trường. Cần lưu ý là pH tối thích của môi trường là pH tối thích cho hệ enzyme của
chủng nuôi cấy. Tác nhân dùng để điều chỉnh pH trong quá trình lên men là acid
(H2SO4, HCl …) hoặc kiềm (NaOH, KOH, NH3, urea …). Yêu cầu chung của tác nhân
hiệu chỉnh pH trong qui trình lên men sản xuất qui mô công nghiệp là rẻ tiền, dễ hấp
thụ, không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men, không làm tăng đáng kể áp
suất thẩm thấu trong môi trường, dễ tự động hóa. Trong lên men fed-batch để sản
xuất amino acid ngoài việc bổ sung nguồn carbon, người ta còn phải bổ sung thêm
nguồn N để bảo đảm cung cấp đủ N cho sự tăng trưởng của vi sinh vật và cho việc
tổng hợp amino acid. Urea hoặc NH3 thường được chọn làm nguồn cung cấp N vì có
thể làm tác nhân hiệu chỉnh pH trong trường hợp pH môi trường giảm xuống do sự

74
tích lũy sản phẩm amino acid. Trong qui trình lên men công nghiệp, người ta thường
dùng hệ thống kiểm soát pH tự động. Hệ thống này bao gồm (Hình 6. 4):

Acid
Valve töï ñoäng

Base

Thieát bò
khueách ñaïi
tín hieäu
Thieát bò ñieàu
khieån trung taâm
Ñieän cöïc
pH

Noài leân men

Hình 6. 4. Sơ đồ hệ thống kiểm soát pH tự động của nồi lên men.

1. Điện cực đo pH (electrode) gắn trực tiếp vào bồn lên men trong quá trình
nuôi cấy.
2. Hệ thống trung chuyển và khuyếch đại tín hiệu (transmiter)
3. Hệ thống điều khiển (controller): cho phép cài đặt giá trị pH cần kiểm soát,
hiển thị giá trị pH hiện tại ở trong bồn lên men, so sánh sự chênh lệch này
và đưa tín hiệu điều khiển để mở hay đóng van nạp tác nhân (H+, OH-) hiệu
chỉnh pH vào.
4. Van tự động (control valve): cho phép nạp hay ngắt tác nhân chỉnh pH
(acid hay base) vào bồn lên men.
3. Kiểm soát nhiệt độ
Vi sinh vật có thể được phân loại dựa vào nhiệt độ thấp nhất mà ở đó bắt đầu
diễn ra sự tăng trưởng. Mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng nhiệt độ thích hợp cho tăng
trưởng khác nhau. Đối với nhóm ưa nhiệt độ thấp (psychrophiles) thì nhiệt độ tối
thích cho tăng trưởng dưới 20oC. Đối với nhóm chịu nhiệt trung bình (mesophiles)
thì nhiệt độ tối thích cho tăng trưởng là từ 20-45oC. Trong khi đó, nhiệt độ tối thích
cho nhóm chịu nhiệt (thermophiles) là 45-60oC.

75
 Hình 6. 5. Nhiệt độ tối thích của các nhóm vi sinh vật khác nhau.

Hình 6. 6. Nhiệt độ tối thích của vi khuẩn sinh lactic acid và của nấm men.

Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến tăng trưởng như thế nào?
Tốc độ của phản ứng thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ theo phương trình của
Arrheunius:
Logv = − ∆H 2,303RT + constant (6.1)
Trong đó, v: tốc độ phản ứng,
∆H : năng lượng hoạt hóa,
R: hằng số khí,
T: nhiệt độ tuyệt đối.
Như vậy Logv phụ thuộc vào 1/T.

76
 Trong nuôi cấy vi sinh vật, cần bảo đảm đúng nhiệt độ tối thích của chủng.
Trong từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy, nhiệt độ có thể thay đổi. Nhiệt trong lên
men (đối với qui trình có khuấy trộn) sinh ra là do:
1. Hoạt động của vi sinh vật. Đây là nhiệt lượng có nguồn gốc sinh học, đóng
vai trò chủ yếu trong quá trình lên men.
[C] + O2 + [N]  [P] + CO2 + E (6.2)

Một số ví dụ:
C6H12O6 + … → C3H6O3 (lactate) + 32,4 Kcal (6.3)
C6H12O6 + … → C2H5OH (ethanol) + 41,9 Kcal (6.4)
C6H12O6 + … → C5H9NO4 (glutamate) + 193,4 Kcal (6.5)

2. Nguồn gốc vật lý. Nhiệt lượng sinh ra do các tác động lý học như do khuấy
trộn, do nhiệt từ không khí sục vào,… tuy nhiên nhiệt lượng này thường không lớn.
Tuỳ từng giai đoạn cụ thể của quá trình lên men và tuỳ vào nhiệt độ môi
trường mà hoạt động kiểm soát nhiệt độ nuôi cấy có khác nhau. Trong giai đoạn đầu,
nhiệt lên men nhỏ, nếu nhiệt độ môi trường thấp, cần gia nhiệt (dùng hơi nước
nóng). Trong giai đoạn tăng trưởng mạnh, nhiệt lên men nhiều, cần giải nhiệt (dùng
nước nhiệt độ thấp). Trong thực tế, người ta thường dùng nước nhiệt độ thấp (5~27
oC) để giải nhiệt. Thiết bị trao đổi nhiệt có thể là dạng ống (coil, package) đặt trong

nồi lên men hoặc dạng áo (jacket) đặt bên ngoài nồi lên men. Khả năng giải nhiệt
phụ thuộc vào lưu lượng, nhiệt độ của nước giải nhiệt và diện tích tiếp xúc giữa hai
loại dịch. Một hệ thống điều khiển nhiệt độ bao gồm:
- Thiết bị trao đổi nhiệt (heat exchanger), làm bằng vật liệu có hệ số truyền
nhiệt cao.
- Hệ thống làm lạnh nước giải nhiệt (cooling system) hoặc hệ thống gia nhiệt
(thường dùng là điện trở đốt nóng-heater hoặc hơi nước nóng-steam)
- Bơm cung cấp nước giải nhiệt
- Bộ cảm biến nhiệt tự động (thermo sensor), điều khiển hệ thống van nhằm
cho phép các van này đóng hay mở để kiểm soát nhiệt độ nuôi cấy theo giá trị đã cài
đặt.

Cách tính sự giải nhiệt của hệ thống lên men

Giả sử có hệ thống giải nhiệt cho nồi lên men dạng jacket (Hình 6.1)

T1: Nhiệt độ đầu vào của nước giải nhiệt

77
 T2: Nhiệt độ đầu ra của nước sau khi giải nhiệt
T3: Nhiệt độ của dịch lên men
F: Lưu tốc nước giải nhiệt (KL/hr)
A: Diện tích trao đổi nhiệt (m2)
(T 3 − T 1) − (T 3 − T 2)
Tm = (6.6)
(T 3 − T 1)
Ln
(T 3 − T 2)
Nhiệt lượng trao đổi Q, Mcal/hr, Q = (T 2 − T 1) × F (6.7)
Hiệu suất trao đổi nhiệt U của thiết bị, Mcal/hr.m2.0C,
U = Q A × ∆Tm (6.8)

Motor

T2

T3
T1
F

Ño löu toác, F

Hình 6. 7. Sơ đồ hệ thống giải nhiệt nồi lên men dạng áo (jacket).

Ví dụ:
Trong trường hợp giải nhiệt nồi lên men với nhiệt độ lên men theo yêu cầu là
T3, diện tích trao đổi nhiệt A, bằng hệ thống giải nhiệt với nhiệt độ cung cấp là T1,
lưu lượng dòng cấp là F. Nhiệt độ nước sau khi qua nồi lên men là T2. Hãy tính nhiệt
lượng sinh ra từ nồi lên men và hiệu suất trao đổi nhiệt của thiết bị.

T1 = 16oC, T2 = 22oC, T3 = 32oC, F = 75 KL/giờ, A=25,6 m2.

Ta có: ∆Tm = 12,5oC;
Q = 450 Mcal;
U=1,41 Mcal/hr.m2.oC.

4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men
Tùy theo chủng vi sinh vật và giai đoạn phát triển mà nhu cầu sử dụng oxygen
cũng khác nhau. Đối với các chủng kỵ khí thì không cần cung cấp oxygen trong quá

78
trình lên men. Đối với các chủng hiếu khí không bắt buộc thì trong từng giai đoạn cụ
thể của quá trình, nhu cầu sử dụng oxygen có khác nhau. Đối với các chủng hiếu khí
bắt buộc, cần cung cấp oxygen trong suốt quá trình nuôi cấy. Ví dụ đối với trường
hợp của nấm men, trong điều kiện hiếu khí thì nấm men sinh sản tăng số lượng,
nhưng trong điều kỵ khí thì chúng sẽ chuyển hoá glucose thành rượu ethanol. Đặc
tính này được khai thác trong qui trình công nghệ sản xuất bia rượu và nước giải
khát từ qui trình lên men.
Oxygen từ không khí đi vào tế bào vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy thông
qua 3 giai đoạn:
- Từ không khí vào dịch lên men
- Từ dịch lên men vào tế bào
- Sự sử dụng oxygen bởi tế bào vi sinh vật
Trong môi trường nước, hàm lượng oxygen hoà tan tối đa là 8,4 mg/L ở 25oC.
Nhu cầu sử dụng oxygen của vi sinh vật hiếu khí trong quá trình nuôi cấy diễn ra liên
tục do vậy cần phải cung cấp oxygen liên tục.
Vai trò của oxygen được xác định là tạo ATP và tái tạo NAD(P) từ NAD(P)H2
Ví dụ trong lên men sản xuất glutamic acid, vi sinh vật sử dụng một phân tử
glucose cần 2,33 phân tử oxygen. Khi thiếu oxygen, các sản phẩm phụ (như lactic
acid) được hình thành nhanh chóng, do vậy một phần nguồn C tiêu tốn cho các sản
phẩm phụ này dẫn đến hiệu suất lên men thấp. Trong một số trường hợp, chính các
sản phẩm phụ này có tác động ngược lại gây ức chế quá trình tăng trưởng và sinh
tổng hợp các sản phẩm mong muốn.
Hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men phụ thuộc:
- Khả năng cung cấp không khí hoặc oxygen dạng khí
- Độ khuấy trộn dịch men
- Áp suất khí trong trong nồi lên men
Tốc độ hòa tan oxygen từ không khí vào dịch lên men có thể mô tả qua
phương trình sau:
dCL/dt = KLa.(C* - CL) (6.9)
CL: nồng độ oxygen hòa tan trong dịch lên men tại thời điểm đánh giá
(mmoles/dm3), C*: nồng độ oxygen hòa tan bảo hòa, KL hệ số dịch chuyển hòa tan
(cm/hr), a là diện tích bề mặt tiếp xúc giữa phase khí và phase lỏng. Trong thực tế,
người ta thường đánh giá khả năng hòa tan oxygen trong nồi lên men thông qua chỉ
số KLa. Hàm lượng oxygen hòa tan trong nồi lên men phản ánh sự cân bằng giữa
lượng cung cấp và lượng sử dụng oxygen bởi vi sinh vật.

79
 OTR (oxygen transfering rate) và OAR (oxygen absorption rate) là hai chỉ số
được dùng trong việc đánh giá khả năng cung cấp oxygen cho nồi lên men và lượng
oxygen được sử dụng bởi vi sinh vật.
OTR(Oxygen transfering rate): Khả năng cung cấp oxygen tối đa của hệ thống,
bị giới hạn bởi công suất thiết kế của hệ thống. OAR(Oxygen absorption rate)(R-ab):
tốc độ sử dụng oxygen của chủng nuôi cấy, thường gọi là B-rab. Trong trường hợp
nuôi cấy không nén áp, cách tính B-rab như sau:

Q 273 100 − ( xo + yo)  1 1 1

B-rab = . . .( xi − xo). . . (mmol/min/ml) (6.10)
V (273 + T )  100 − ( xi + yi)  100 22,4 1000

Trong đó, Q: lưu lượng không khí sục vào nồi lên men
V: thể tích dịch môi trường lên men
T: nhiệt độ nuôi cấy
xo và xi: nồng độ oxygen của không khí (%) trước khi sục vào và sau khi
thoát ra từ nồi lên men
yo và yi: nồng độ CO2 của không khí (%) trước khi sục vào và sau khi
thoát ra từ nồi lên men.

Sự ảnh hưởng của oxygen lên tăng trưởng của vi khuẩn

Đối với lên men thu nhận amino acid, cần phải tăng cường tối đa tỷ lệ số
lượng tế bào /lượng glucose (hiệu suất sinh khối) sử dụng trong phase tăng trưởng
và tỷ lệ giữa lượng amino acid /lượng glucose (hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành
sản phẩm) sử dụng trong phase sản xuất. Trong điều kiện thiếu oxygen (pL < pLcrit)
diễn ra trong phase tăng trưởng, các sản phẩm phụ là các acid hữu cơ như lactic acid
sẽ tích lũy dần, gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men. Do vậy cần phải sục khí -
khuấy trộn trong giai đoạn này để bảo đảm cung cung đủ oxygen theo yêu cầu cho
sự hô hấp của vi khuẩn.
Bảng 6.1. Sự phụ thuộc của hàm lượng Arg sản xuất vào áp suất riêng phần của
Oxygen trong dịch lên men ở các pha khác nhau.
Áp suất O2 trong Áp suất O2 trong Nồng độ Arg,
phase tăng trưởng, atm phase sản xuất, atm mg/ml
0,01-0,05 0,01-0,05 30,3
0,01-0,05 0,32-0,42 28,4
0,32-0,42 0,01-0,05 19,5
0,32-0,42 0,32-0,42 22,8

80
 Tuy vậy, người ta cũng nhận thấy rằng trong điều kiện nguồn oxygen cung cấp
quá cao thì việc tổng hợp các amino acid của vi khuẩn cũng không hiệu quả. Hiện
tượng này liên quan chặt chẽ với áp suất vận hành bên trong nồi lên men trong quá
trình nuôi cấy. Trong trường hợp lên men dưới áp suất không khí, nuôi cấy bắt đầu
với áp suất là 0,21 atm của pL. Trong khi đó nếu áp suất nuôi cấy là 1,5 kg/cm2 thì
khi bắt đầu nuôi cấy áp suất riêng phần là 0,315 atm pL và với điều kiện áp suất 2,0
kg/cm2 thì áp suất riêng phần sẽ là 0,42 atm pL trong. Quá trình lên men sản xuất
Arg bị đình trệ khi áp suất nuôi cấy cao. Do vậy trong thực tế sản xuất, áp suất vận
hành càng gần áp suất khí quyển thì càng tốt. Nếu vi sinh vật tăng trưởng với pL từ
0,01-0,05 atm, nên dùng khí với hàm lượng oxygen 5% trong điều áp suất không khí.
Như đã đề cập trên đây, điều kiện cung cấp oxygen tối ưu đã được khảo sát
thông qua sự thay đổi mức độ pL trong phase tăng trưởng và phase sản xuất các
amino acids, với kết quả ghi nhận được tùy thuộc vào điều kiện tối ưu của oxygen.
- Amino acids của nhóm Glu như là Gln, Glu, Pro và Arg được sinh ra tối đa
trong điều kiện hô hấp thích hợp cho vi khuẩn và giảm mạnh trong điều kiện sản
xuất thiếu oxygen.
- Nhóm Leu, Phe, và Val được tổng hợp tối đa trong điều kiện thiếu oxygen.
- Các amino acids của nhóm Asp như là Lys, Ile và Thr được tổng hợp tối đa
trong điều kiện hô hấp thích hợp cho vi khuẩn và giảm không đáng kể trong điều
kiện thiếu oxygen.
Sự cần thiết của oxygen trong lên men amino acid
Trong lên men các amino acids đòi hỏi phải cung cấp nguồn oxygen do hai
nguyên nhân chính sau:

1) Vi khuẩn cần có nguồn ATP cho tăng trưởng của chúng và sự sinh tổng hợp
amino acids bằng cơ chế biến dưỡng năng lượng hiếu khí.
2) NAD được tái tạo bởi oxygen từ NADH2, mà NADH2 đuợc sinh ra từ quá
trình sinh tổng hợp các amino acids.
Do vậy, hiệu quả của sự khuấy trộn rất có ý nghĩa trong lên men sản xuất
amino acids. Trên cơ sở của số lượng mol ATP được yêu cầu cho sự sinh tổng hợp
của nhiều loại amino acids khác nhau và số lượng mols NAD(P)H2 tạo ra trong quá
trình được gọi là quá trình sinh tổng hợp. Bảng 6.2 tổng hợp tỷ lệ cân bằng của ATP
và NAD(P)H2 trong phản ứng lên men các amino acid từ cơ chất là glucose.

Bảng 6.2. Bảng tính toán lượng NADH2 và ATP sinh ra trong quá trình tổng hợp các
amino acid thông qua chu trình Glyoxylate và con đường PEP carboxylation.

81
 Theo con đường Theo con đường
Amino acid Glyoxylate cố định CO2
NADH2 ATP NADH2 ATP
Glu +5 1/3 +2 +3 +1
Gln +5 1/3 +1 1/3 +3 0
Pro +4 2/3 +1 1/3 +2 0
Arg +4 -2/3 +1 -3
Leu +2 +2
Phe 0 -1 2/5
Val 0 +2
Lys +2 2/3 +2/3 -2 -1
Ile +2 +2/3 -3 -4
Thr +4 0 -4 -4

Các amino acids như Leu, Phe và Val được sinh tổng hợp không thông qua chu
trình TCA với hiệu suất tối đa khi hô hấp bị cản trở bởi điều kiện thiếu oxygen; Điều
này được cho là do các nguyên nhân sau:

- Khi sự quay vòng của chu trình TCA bị ngăn trở do thiếu oxygen, nguồn PEP
hoặc pyruvic ngoại bào mà có chứa các amino acids được gia tăng.

-Nhiều oxygen là không cần thiết cho sự tái oxy hóa NAD(P)H2 bởi vì không
có NAD(P)H2 sinh ra do sự sản xuất của các amino acid (Phe và Val) hoặc bởi vì nó
được sinh ra ít hơn so với trong trường hợp của các amino acid thuộc nhóm Glu và
Asp.

5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men
Như chúng ta đã biết, đối với nuôi cấy vi sinh vật, một trong những vấn đề
quan trọng cần kiểm soát là phải duy trì hàm lượng dinh dưỡng của các chất trong
môi trường lên men không quá thừa hoặc quá thiếu, đặc biệt là đối với một số cơ
chất giới hạn. Ví dụ trong lên men sản xuất glutamic acid công nghiệp, nếu tốc độ
nạp đường glucose vào môi trường nuôi cấy quá cao, làm nồng độ đường glucose
tích lũy trong môi trường nhiều, lúc này vi khuẩn sinh glutamic acid sẽ đồng hóa
glucose với tốc độ cao cùng với việc sử dụng nhiều oxygen. Tuy nhiên do tốc độ sục
khí và khuấy trộn không thay đổi nên nồng độ oxygen hòa tan trong dịch lên men
giảm xuống, lúc này trong môi trường lên men xảy ra tình trạng thiếu hụt oxygen
dẫn đến việc hình thành các sản phẩm phụ mà nỗi bật nhất là lactic acid. Việc hình
thành các sản phẩm này làm giảm hiệu suất lên men và chính các sản phẩm phụ là

82
yếu tố ức chế gây ảnh hưởng đến hoạt tính của chủng trong quá trình lên men. Tùy
theo đặc điểm của từng loại lên men mà phương pháp nạp bổ sung nguyên liệu và
kiểm soát sự nạp liệu khác nhau. Tuy nhiên phải luôn bảo đảm một số yêu cầu căn
bản sau:
- Chỉ nạp bổ sung đủ theo nhu cầu sử dụng của chủng, không nạp lượng quá
dư thừa dẫn đến việc thiếu oxygen cung cấp.
-Không nạp bổ sung thiếu làm hạn chế tốc độ tăng trưởng và tốc độ sản xuất
của chủng.

Mục đích của việc bổ sung dung dịch trong quá trình lên men bao gồm:
- Tăng lượng sinh khối tham gia vào quá trình sinh tổng hợp sản phẩm (nuôi
cấy mật độ tế bào cao) và để kéo dài thời gian nuôi cấy và tăng nồng độ sản phẩm.
- Để hạn chế sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên vi sinh vật, trong môi
trường nuôi cấy ban đầu nồng độ cơ chất giới hạn thông thường chỉ ở mức phù hợp,
không quá cao.
- Môi trường bổ sung thường có chứa cơ chất giới hạn (thường là nguồn C)
nên cần phải duy trì nồng độ ở nồng độ thích hợp trong quá trình nuôi cấy nhằm
kiểm soát sự tăng trưởng và sự sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn để tăng cường
hiệu suất sản xuất và giới hạn sự hình thành các sản phẩm phụ.
Bảng 6.3. Nồng độ gây ức chế của một số thành phần trong môi trường nuôi cấy
Thành phần Hàm lượng gây ức chế tăng trưởng

Glucose > 50 g/L

NH3 > 3 g/L
Fe > 1,15 g/L
Mg > 8,7 g/L
P > 10 g/L
Zn > 0,038 g/L

Các thành phần môi trường thường phải nạp bổ sung vào trong quá trình nuôi
cấy:
- Nguồn C: glucose, fructose, sucrose …
- Nguồn N: NH3, Urea …

Các phương pháp nạp bổ sung (thực hiện trong điều kiện vô trùng):

83
 - Bổ sung liên tục: Dịch môi trường bổ sung được nạp vào với tốc độ thích hợp
theo nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật. Tốc độ bổ sung có thể cố định, tăng dần
theo từng bước hoặc tăng dần theo hàm số mũ. Có thể dùng dấu hiệu gián tiếp như
dựa trên cơ sở của hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường đang nuôi cấy để
điều chỉnh tốc độ bổ sung dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu sử dụng của vi sinh vật và
duy trì tốt sự cân bằng hàm lượng cơ chất trong suốt quá trình lên men. Phương
pháp bổ sung liên tục khó thực hiện, đòi hỏi hệ thống thiết bị hiện đại, nhân viên kỹ
thuật phải có trình độ tay nghề cao.

Noàng ñoä teá baøo

Noàng ñoä teá baøo
Noàng ñoä teá baøo
Toác ñoä boå sung
dinh döôõng Toác ñoä boå sung Toác ñoä boå sung
dinh döôõng dinh döôõng
Thôøi gian Thôøi gian Thôøi gian
(a) (b) (c)

Hình 6. 8. Động học tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy mẻ- bổ sung với tốc độ bổ
sung chất dinh dưỡng khác nhau. (a) Tốc độ cố định; (b) Tốc độ tăng dần từng
bước; (c) Tốc độ tăng theo hàm mũ.

- Bổ sung gián đoạn: Phương pháp này đơn giản giản hơn so với phương pháp
bổ sung liên tục. Việc nạp bổ sung chỉ thực hiện một số lần nhất định trong quá trình
nuôi cấy. Lượng bổ sung lần sau thường cao hơn lần trước và cao hơn nhu cầu sử
dụng của vi sinh vật, do vậy nồng độ cơ chất thay đổi đột ngột sau mỗi lần nạp liệu,
gây sốc cho tế bào.

(a) (b)
1.2 12 OD 1.2 12
Glu.
pH
1.0 10 1.0 10
% Glucose

0.8 8
% Glucose

0.8 8
OD
OD

0.6 6 0.6 6

0.4 4 0.4 4

0.2 2 0.2 2

0.0 0 0.0 0
4 8 12 16 20 24 28 32 36 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Thôøi gian nuoâi caáy (giôø) Thôøi gian nuoâi caáy (giôø)

84
Hình 6. 9. Sự biến động nồng độ glucose và pH trong quá trình lên men theo phương
pháp nạp môi trường bổ sung. (a) Bổ sung dinh dưỡng liện tục; (b) Bổ sung dinh
dưỡng gián đoạn.
6. Phá bọt trong quá trình lên men
Hiện tượng tạo bọt thường xảy ra trong nuôi cấy vi sinh vật ngay cả qui mô
phòng thí nghiệm. Đối với các nhà máy lên men sản xuất công nghiệp, đặc biệt trong
điều kiện nuôi cấy có sục khí - khuấy trộn như trong lên men sản xuất kháng sinh,
sản xuất các amino acid hoặc trong trường hợp lên men sử dụng các cơ chất có
khuynh hướng tạo bọt mạnh như mật rỉ đường, hiện tượng tạo bọt xảy ra rất mạnh.
Thông thường nguyên nhân gây bọt là do các phân tử protein có nguồn gốc từ
nguyên liệu thô dùng để pha chế môi trường như mật rỉ đường, cao ngô, cao đậu,
dịch chiết nấm men…. Các protein này bị biến tính và hiện diện trên bề mặt tiếp xúc
giữa hai phase khí - lỏng, hình thành nên một lớp áo khó vỡ. Bọt khí bền sẽ duy trì
trong suốt quá trình lên men, ban đầu là do môi trường nuôi cấy, sau đó do hoạt tính
của vi sinh vật gây nên.

6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt

Bọt bóng không khí do sục vào nồi lên men từ hệ thống phân phối khí hoặc khí
CO2 sinh ra trong quá trình nổi dần lên bề mặt dịch lên men gây nên một lớp màng
mỏng. Bình thường, lớp màng mỏng này dễ dàng bị bể ra và khuếch tán thành hơi
ẩm thoát ra khỏi nồi lên men qua đường ống thoát khí. Trong trường hợp môi
trường nuôi cấy có một số thành phần làm cho màng bóng khí này bền vững, không
vỡ được thì sẽ tạo nên bọt. Theo thời gian, lượng bọt trong nồi lên men tăng dần lên
và đến khi vượt thể tích bồn thì sẽ thoát ra ngoài theo dòng khí qua đường ống thoát
khí của nồi lên men. Khi nghiên cứu hiện tượng tạo bọt cần phải lưu ý cả hai vấn đề
là sự tạo bọt và tính bền vững của bọt. Sức căng bề mặt, độ nhớt và độ cứng của dịch
lên men là các yếu tố quan trọng gây nên hiện tượng tạo bọt. Những loại dịch lỏng
chứa những phân tử dễ bị hấp phụ trên bề mặt có khuynh hướng tạo bọt mạnh. Chất
tạo bọt thường là các hợp chất hữu cơ như chất tẩy rửa, protein, … Các chất này đều
có các đầu phân cực ái nước như SO42-, COO-, NH4+, amide, ester, OH-, -CO, hoặc kỵ
nước có chứa các chuỗi carbohydrate. Bọt sẽ được hình thành nhiều một khi có sự
cân bằng giữa các đầu ái nước và kỵ nước.

85
6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt
- Làm tách tế bào vi khuẩn ra khỏi bề mặt dịch lỏng lên men, dẫn đến hiện
tượng tự phân xảy ra mạnh, mất sinh khối tham gia sản xuất đồng thời càng tạo nên
sự bền vững cho bọt.
- Một lượng lớn tế bào trong phase bọt không được bảo đảm các yếu tố thích
hợp cho sản xuất như nhiệt độ, pH, dinh dưỡng … gây suy giảm hoạt tính giống.
- Giảm thể tích sử dụng của nồi lên men.
- Bọt trào ra ngoài gây thất thoát một lượng lớn tế bào, giảm hiệu suất và sản
lượng lên men; gây ô nhiễm môi trường làm việc.

6.3. Kiểm soát bọt

Có hai quan điểm căn bản trong việc kiểm soát bọt:
- Kiểm soát trước quá trình: Xử lý nguyên liệu, làm giảm khả năng tạo bọt
trước khi đưa vào qui trình. (như bentonite mật rỉ trong sản xuất nấm men, lọc
sellaite dịch thủy phân đậu nành, thay đổi thời gian khử trùng…)
- Ngăn chặn sự tạo bọt bằng cách loại trừ các yếu tố gây nên như thay đổi pH,
nhiệt độ, thành phần môi trường…. Và điều quan trọng là phải nổ lực kiểm soát bọt
vì sự tạo bọt là không thể tránh khỏi trong quá trình lên men, đặc biệt là qui trình có
sục khí và khuấy trộn.
Để bảo đảm việc phá bọt đạt hiệu quả cao, người ta thường kết hợp sử dụng
cả hai quan điểm để kiểm soát bọt.
Một số phương pháp chống bọt đã được áp dụng, dựa trên nguyên tắc kỹ
thuật, có thể chia thành ba loại như sau:
- Chống bọt theo phương pháp hóa học
- Chống bọt theo phương pháp nhiệt
- Chống bọt theo phương pháp cơ học

a. Phương pháp hóa học

Sử dụng các hóa chất phá bọt vào môi trường nuôi cấy. Yêu cầu căn bản của
các chất phá bọt:
- Độ hòa tan thấp trong môi trường có bọt
- Sức căng bề mặt kém
- Khả năng khuyếch tán trong môi trường lỏng cao.
Trong công nghiệp lên men, các chất phá bọt cần phải có thêm một số tính chất sau:
- Không độc hại đối với vi sinh vật
- Không được sử dụng bởi vi sinh vật
- Không gây ảnh hưởng ngược đến nguồn cung cấp oxygen

86
 - Bền đối với nhiệt
- Không gây trở ngại đối với các qui trình sau đó
- Không gây ảnh hưởng xấu đối với sản phẩm
- Hoạt động tốt ở nồng độ thấp
- Duy trì hoạt tính tốt trong thời gian dài
Chất phá bọt dùng trong công nghệ lên men công nghiệp được phân loại như
sau:
- Chất béo tự nhiên
- Cồn có mạch C cao (8C- khả năng phá bọt tương đối thấp)
- Các dẫn xuất của sorbitan (sorbitane monolaurate, tri-oleate, tri-stearate)
- Polyether (trọng lượng phân tử cao hơn 2000)
-Dầu silicon (polydimethyl siloxane) [(CH3)3SiO(CH3)2O]Si(CH3)3. Silicon oil
không hòa tan trong nước, hơi độc, và không thể đồng hóa bởi vi sinh vật.
Cơ chế phá bọt:
Chất phá bọt có chứa các tác nhân gây vỡ bọt cục bộ và ức chế sự tạo bọt bằng
cách gây suy giảm tính ổn định của bọt. Đối với các chất gây bể bọt, một lượng nhỏ bị
hấp phụ và hòa tan trên bề mặt, do vậy làm giảm đáng kể sức căng bề mặt ở vị trí
được hấp phụ. Do chất phá bọt thường không tan trong nước nên vùng hấp phụ chất
phá bọt bị hấp dẫn bởi khu vực lân cận rất mạnh và được khuếch rộng một khi màng
của khu vực đó mang theo những lớp dịch ở tầng thấp hơn. Màng của lớp chất lỏng
mỏng di chuyển rất nhanh và khi đạt đến một mức nhất định, chúng lập tức bị vỡ ra
do sự thay đổi đột ngột cơ học, nhiệt hoặc do rung động phân tử khi khuếch tán.
Chất ức chế tạo bọt như dầu silicone và span-20 được hấp dẫn chọn lọc rất mạnh
vào giao diện của hai phase và kéo theo màng bề mặt gây nên sự không phù hợp cho
điều kiện điện-cơ cần thiết như độ cứng, độ nhớt … do vậy rất khó để tạo bọt bền.

(a) (b)
Hình 6. 10. Sơ đồ quá trình phá bọt. (a), hiện tượng làm vở bọt khi bổ sung chất
phá bọt; (b), cơ chế phá bọt.
Phương pháp bổ sung chất phá bọt:

87
 Trong sản xuất công nghiệp, người ta thường bổ sung chất phá bọt vào nồi lên
men nhờ hệ thống tự động. Có thể sử dụng các nguyên tắc căn bản sau:
- Nạp theo thời gian (timer). Theo cách này, yêu cầu phải biết trước được tiến
trình và mức độ tạo bọt trong một hệ thống lên men nhất định. Trên cơ sở đó, có thể
cài đặt thời gian và lưu lượng chất phá bọt nạp vào cho thích hợp.
- Nạp theo tín hiệu chỉ thị của ampere kế. Khi bọt được hình thành trong nồi
lên men đến mộc mức nhất định, lớp bọt trên cùng sẽ va đập vào cánh khuấy phá bọt
làm tải (load) của khuấy tăng lên kéo theo sự gia tăng dòng điện của khuấy. Đây là
dấu hiệu tốt để nạp chất phá bọt.
- Dựa vào thiết bị cảm biến bọt (differential temparature sensor). Khi bọt
dâng lên ở một mức được xác định trong nồi lên men sẽ chạm vào đầu cảm biến và
như vậy có thể nhận biết để nạp chất phá bọt.
Lưu ý là khi dùng chất phá bọt, bên cạnh ưu điểm là hoạt động phá bọt, cần
lưu ý một số nhược điểm sau:
- Hạn chế OTR
- Ức chế tăng trưởng
- Ức chế sinh tổng hợp
- Độc tính

b. Phương pháp phá bọt cơ học

Có nhiều thiết bị cơ khí dùng làm phương tiện phá bọt trong lên men. Thông
thường người ta kết hợp với việc dùng các chất phá bọt. Các phương tiện cơ học phá
bọt cần đạt một số tiêu chuẩn sau:
- Hao tốn năng lượng ít
- Cấu trúc đơn giản
- Dễ vệ sinh, dễ khử trùng
- Không cần bảo trì nhiều
Phương tiện phá bọt cơ khí sử dụng ít nhất một trong bốn cơ chế: làm thay đổi áp
suất đột ngột, tạo lực kéo, nén áp, lực tác động ảnh hưởng.

88
Hình 6. 11. Cyclone, thiết bị làm vỡ bọt cơ học thường được lắp đặt trên đường ống
thoát khí của nồi lên men. Khi bọt theo khí thoát ra sẽ di chuyển theo hướng ly
tâm trong cyclone và do va chạm cơ học bọt sẽ vỡ ra. Phần khí trong bọt sẽ
thoát ra ngoài, phần dịch sẽ được hồi lưu về lại nồi lên men.

7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men

1. Nồng độ sản phẩm
Trong quá trình lên men, để đánh giá tốc độ sản xuất và chiều hướng của tiến
trình, việc theo dõi nồng độ sản phẩm trong dịch lên men là rất quan trọng. Tùy theo
loại sản phẩm mà có phương pháp phân tích khác nhau. Tuy nhiên, trong thực tế
người ta thường chọn phương án đơn giản, rẻ tiền, dễ thao tác. Bên cạnh việc phân
tích đánh giá nồng độ sản phẩm mong muốn, việc đánh giá nồng độ các sản phẩm
không mong muốn cũng rất quan trọng, giúp nhận biết được tình trạng của quá trình
lên men và có những tác động kịp thời nhằm hạn chế kết quả sản xuất kém. Ví dụ
trong lên men sản xuất glutamic acid, bên cạnh việc xác định nồng độ sản phẩm là
glutamic acid người ta thường đo hàm lượng lactic acid trong dịch lên men. Nếu
nồng độ lactic acid cao, nguyên nhân là do thiếu lượng oxygen hòa tan và do vậy có
thể tăng cường tốc độ sục khí hoặc giảm tốc độ nạp nguyên liệu đường nạp vào.

2. Sản lượng
Sản lượng (P) là lượng sản phẩm có trong dịch lên men của một mẽ.
n
P= ∑Vi × Ci
i =1
(6.11)

trong đó, Vi là thể tích dịch lên men và Ci là nồng độ sản phẩm. Tùy theo loại hình lên
men mà i có giá trị khác nhau. Đối với nuôi cấy mẻ, i = 1. Đối với nuôi cấy mẻ-bổ
sung, i tùy thuộc vào số lần chiết dịch lên men ra trong quá trình nuôi cấy. Đối với

89
lên men liên tục thì việc xác định P còn phụ thuộc vào thời gian kể từ khi chiết dịch,
tuy nhiên trong trường hợp này thì khái niệm sản lượng không rõ ràng.

3. Hiệu suất
Là tỷ lệ phần trăm giữa lượng sản phẩm thu được và lượng nguyên liệu đưa
vào sử dụng cho qui trình. Ví dụ hiệu suất chuyển hóa đường thành rượu trong lên
men ethanol:
Ethanol
Ye/s(%) = ×100 (6.12)
Sugar
Hiệu suất tế bào là lượng sinh khối thu được trên lượng đường dùng cho mẻ
lên men đó.
Biomass
Yb/s(%) = ×100 (6.13)
Sugar
Để đánh giá chính xác hiệu quả lên men của từng giai đoạn trong tiến trình lên
men và để đánh giá thời điểm dừng lên men với chi phí sản xuất thích hợp nhất,
người ta phân tích sản lượng và hiệu suất lên men theo thời gian nuôi cấy. Kết quả
đánh giá này giúp trả lời được các câu hỏi như giai đoạn nào thì tốc độ tích lũy sản
phẩm hoặc/và hiệu suất đạt giá trị cực đại? Nên dừng qui trình lên men ở thời điểm
nào thì thích hợp, mang lại chi phí sản xuất thấp nhất? Việc đánh giá có thể thực hiện
theo từng giai đoạn nhất định trong quá trình lên men hoặc/và đánh giá kết quả tích
lũy của quá trình.
Ví dụ một quá trình lên men được quan tâm ở 3 thời điểm là 0 giờ, 10 giờ và
20 giờ. Phân tích kết quả lên men của giai đoạn từ 0 - 10 giờ và từ 10 - 20 giờ được
gọi là đánh giá theo giai đoạn. Nếu kết quả được xem xét từ 0 - 10 giờ, rồi từ 0 - 20
giờ thì gọi là đánh giá theo sự tích lũy của tiến trình. Bên cạnh đó, thường phải tính
tốc độ sử dụng đường đặc trưng (TS/DCW/Hr) và tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng
(P/DCW/Hr) của chủng thông qua việc phân tích kết quả lượng sinh khối để đánh
giá năng lực tiêu thụ đường và năng lực sản xuất sản phẩm của chủng.
Sau đây là một ví dụ về phân tích kết quả lên men trong quá trình nuôi cấy
(Bảng 6.4). Theo dõi một mẻ lên men chìm, hiếu khí, có bổ sung cơ chất giới hạn là
đường glucose trong quá trình nuôi cấy khi đường trong môi trường cạn kiệt và có
chiết dịch với thời gian nuôi cấy là 20 giờ. Thể tích dịch lên men ban đầu là 50 KL,
nồng độ đường trong môi trường ban đầu là 10 g/dl, nồng độ đường trong dịch nạp
bổ sung là 50 g/dl, lượng đường sử dụng trong quá trình nhân giống là 2 t. Cứ mỗi 2
giờ, lấy mẫu và phân tích nồng độ sản phẩm, và ghi nhận các chỉ số kỹ thuật như thể
tích dịch nạp vào (Vf), thể tích dịch chiết ra (Vout). Trên cơ sở đó có thể tính được sản
lượng, hiệu suất của từng giai đoạn cụ thể.

90
Bảng 6.4. Kết quả theo dõi các thông số của quá trình lên men
CT Vf cp sr Vout Vinn Sf Sr out Sr inn Sr Su Pout Pinn P Y Phr Yhr
[hr] [KL] [g/dl] [g/dl] [KL] [KL] [t] [t] [t] [t] [t] [t] [t] [t] [%] [t/hr] [%/hr]
0 0.5 10.0 50 0.0 5.00 5.00 2.0 0.25 0.25 12.50
2 1.2 5.0 50 0.0 2.50 2.50 4.5 0.60 0.60 13.33 0.18 14.00
4 5 2.4 4.0 55 2.5 2.20 2.20 7.3 1.32 1.32 18.08 0.36 25.71
6 11 4.5 1.5 61 5.5 0.92 0.92 11.6 2.75 2.75 23.69 0.71 33.26
8 19 6.8 0.9 69 9.5 0.62 0.62 15.9 4.69 4.69 29.55 0.97 45.34
10 26 9.1 0.8 5 71 13.0 0.04 0.57 0.61 19.4 0.46 6.46 6.92 35.66 1.11 63.31
12 31 11.7 0.4 10 71 15.5 0.06 0.28 0.34 22.2 1.04 8.31 9.35 42.19 1.22 87.95
14 36 13.8 0.3 16 70 18.0 0.08 0.21 0.29 24.7 1.87 9.66 11.53 46.65 1.09 85.33
16 39 14.4 0.7 21 68 19.5 0.11 0.48 0.59 25.9 2.59 9.79 12.38 47.78 0.43 71.06
18 42 14.5 0.4 23 69 21.0 0.12 0.28 0.40 27.6 2.88 10.01 12.88 46.67 0.25 29.73
20 46 14.4 0.1 25 71 23.0 0.12 0.07 0.19 29.8 3.17 10.22 13.39 44.92 0.25 23.01

Chú thích:
CT: Culture time, thời gian nuôi cấy
cp: Concentration of product: nồng độ sản phẩm
Vout: Thể tích dịch lên men chiết ra trong quá trình nuôi cấy
Vinn: Thể tích dịch lên men trong nồi lên men
Vf: Thể tích dịch cơ chất (môi trường) nạp bổ sung trong quá trình nuôi
cấy
Sf : Tổng lượng cơ chất nạp bổ sung
sr: Nồng độ cơ chất còn lại trong môi trường lên men
Sr: Tổng lượng cơ chất còn lại trong môi trường lên men
Su: Tổng lượng cơ chất đã được vi sinh vật sử dụng
P: Lượng sản phẩm
Y: Hiệu suất (yield) chuyển đổi cơ chất
Phr: Lượng sản phẩm tổng hợp được theo thời gian (giờ -1)
Yhr: Hiệu suất sinh tổng hợp theo thời gian nuôi cấy (giờ -1)

Trong quá trình nuôi cấy, nồng độ sản phẩm, thể tích dịch môi trường bổ
sung, thể tích dịch lên men chiết ra được phân tích và ghi nhận bởi những thiết hổ
trợ. Các thông số còn lại được tính toán trên cơ sở của thể tích và nồng độ phân tích
được.

91
 Vinn = Vo + Vf - Vout, trong đó Vo là thể tích dịch lên men tại thời điểm bắt đầu
nuôi cấy.
Sf = Vf × cf, trong đó cf là nồng độ cơ chất trong dịch nạp bổ sung.
Su = So + Sf - Sr, trong đó So và Sr lần lượt là nồng độ cơ chất ban đầu và còn lại
tại thời điểm đánh giá.
P = cp×V, trong đó V là thể tích dịch lên men tại thời điểm đánh giá,
V = Vinn + Vout
Y = P/Su
Phr = (Pt2-Pt1)/(t2-t1), trong đó Pt1, Pt2 là lượng sản phẩm ở thời điểm t1 và t2
Yhr = Phr/Suhr, trong đó Suhr là lượng cơ chất đã sử dụng trong 1 giờ ở giai đoạn
đánh giá.
Suhr = (Sut2-Sut1)/(t2-t1)

Áp dụng vào tính toán ở Bảng 6.4:

- Giả sử tính toán tại thời điểm nuôi cấy sau 12 giờ
Sf(12) = cf×Vf(12) = 50 g/dl×11 KL = 15,5 tấn
Su(12) = So + Sf(12) – Sr(12) = (2,0 + 10 g/dl×50KL) + 15,5 – 0,34 = 22,2 t.
P(12) = Pinn(12) + Pout(12) = cp(12)×Vinn(12) + Pout(10) + Pout(10-12)
Pout(10-12) = Vout(10-12)×cp(12) = (10-5) × 11,7 = 1,04 t.
P(12) = 11,7 × 71 + 0,46 + 1,04 = 9,35 t
Y(12) = (P(12)/Su(12))×100 =(9,35/22.2)×100 = 42,19%.
- Lượng sản phẩm sinh tổng hợp trong giai đoạn từ giờ nuôi cấy 10 → 12 là:
Phr (10-12) = (P(12)-P(10))/(12-10) = (9,35-6,92)/(12-10) = 1,22 t/giờ
- Hiệu suất sinh tổng hợp trong giai đoạn nuôi cấy từ 10 → 12 giờ là:
Yhr(10-12) = P(10-12)/Su(10-12) = [(9,35-6,92)/(22,2-19,4)]×100 = 87,95
(%/Hr).

92
 Hình 6. 12. Kết quả đánh giá lên men tích lũy theo thời gian.

Hình 6. 13. Kết quả đánh giá hiệu quả lên men theo từng giai đoạn.
Nhận xét:

93
 Trong lag phase, từ thời gian nuôi cấy tiếng thứ 0 - 4, mặc dù có sự tích lũy
của sản phẩm trong dịch lên men nhưng không nhiều, nồng độ sản phẩm tăng chậm.
Lượng sản phẩm theo đó cũng tăng dần. Tuy nhiên hiệu suất sinh tổng hợp sản
phẩm không tăng đáng kể (Hình 6.11). Trong giai đoạn này, có thể do tế bào tăng
trưởng mạnh, tạo sinh khối. Trong giai đoạn tiếp theo, quá trình lên men đi vào log
phase, lượng sản phẩm được sản xuất với tốc độ khá cao, tăng dần từ 0,71 t/Hr và
đạt giá trị cực đại 1,22 t/Hr ở thời điểm nuôi cấy tiếng thứ 12. Trong giai đoạn này,
hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm cũng tăng rất mạnh và đạt giá trị cao nhất 87,95%.
Phase ổn định rất ngắn, chỉ khoảng từ 2 - 4 giờ và quá trình lên men bắt đầu đi vào
phase suy vong. Hiệu quả lên men giảm mạnh trong giai đoạn từ 16 - 20 giờ. Và đây
là giai đoạn cần phải xác định dừng qui trình lên men ở thời điểm thích hợp nhất.

94
CHƯƠNG 7. TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN

Tối ưu hóa (optimization) một qui trình lên men là hoạt động nhằm làm cho
chủng vi sinh vật tăng trưởng cực đại, đạt năng suất và hiệu suất sản xuất và tối đa.
Tối ưu hoá có ý nghĩa rất quan trọng đối với thực tế sản xuất giúp tăng cường hiệu
quả sản xuất, giảm giá thành sản phẩm. Để đánh giá hiệu quả sản xuất, cần phải xem
xét ba yếu tố cơ bản: nồng độ sản phẩm trong dịch lên men, tốc độ sản xuất sản
phẩm và hiệu suất chuyển đổi cơ chất (ví dụ glucose) thành sản phẩm mong muốn.
Nồng độ sản phẩm tích lũy trong dịch lên men có ý nghĩa quan trọng trong
việc thu hồi sản phẩm. Nồng độ càng cao, hiệu quả thu hồi càng tốt và do vậy, chi phí
sản xuất sẽ thấp. Trong quá trình lên men sản phẩm mục tiêu được tích lũy nhiều
đồng nghĩa với việc làm gia tăng áp suất thẩm thấu trong dịch nuôi cấy và đây là yếu
tố bất lợi đối với quá trình trao đổi chất và sinh tổng hợp sản phẩm lên men chủng vi
sinh.
Tốc độ sản xuất là lượng sản phẩm sinh tổng hợp được (trong dịch lên men)
trong một đơn vị thời gian (g/L/giờ). Tốc độ sản xuất cao thì sản lượng lên men lớn
do vậy công suất sản xuất của hệ thống tăng lên, làm giảm chi phí đầu tư, giảm chi
phí cố định.
Hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm mục tiêu có ý nghĩa quan trọng
trong cơ cấu giá thành sản phẩm. Khi hiệu suất lên men cao, định mức tiêu hao
nguyên liệu giảm và như vậy sẽ góp phần làm giảm chi phí sản xuất.
Kết quả của quá trình lên men chịu sự chi phối của nhiều yếu tố bao gồm (1)
khả năng sản xuất của chủng giống sử dụng; (2) hệ thống thiết bị của qui trình lên
men đặc biệt là các hệ thống liên quan trực tiếp đến kiểm soát vận hành các điều
kiện lên men và (3) kiểm soát các điều kiện thích hợp cho quá trình lên men. Do vậy,
để tối ưu hóa hiệu quả lên men, cần thực hiện đồng bộ các yếu tố nêu trên.

1. Cải tiến giống

Công việc cải tiến bao gồm việc thay đổi một số đặc tính của chủng như: tăng
cường khả năng sinh tổng hợp một sản phẩm mong muốn, hạn chế khả năng tổng
hợp các sản phẩm phụ, tăng cường tính ổn định của chủng trong quá trình sản xuất,
tăng tính chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường như nhiệt độ, nồng độ cơ
chất hoặc sản phẩm, hàm lượng oxygen thấp, tính kháng nhiễm tốt, tăng cường hiệu
suất chuyển đổi cơ chất, …(xem thêm về các cơ chế điều hòa biểu hiện gen). Việc cải
tiến giống được thực hiện trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu lớn có đầy đủ
phương tiện thiết bị, cơ sở vật chất do vậy chủng giống khi đưa vào sử dụng ở qui

95
mô sản xuất thương mại thường là những chủng đã được đánh giá tính ổn định và
bảo đảm hiệu quả sản xuất cao.

Bài thực hành:

Hãy nêu phương pháp tiến hành đánh giá độ ổn định của chủng trước khi đưa
vào sản xuất.
Các bước hoạch định để đánh giá:
- Cần thông tin khoảng thời gian dự tính sử dụng cho sản xuất. Ví dụ dự định
sử dụng ống giống này cho sản xuất trong 3 năm.
- Đánh giá độ ổn định theo chiều ngang. Từ cùng một thế hệ giống, tính ổn
định của kết quả lên men như thế nào.
- Đánh giá sự ổn định theo chiều dọc: qua nhiều thế hệ nhân giống, kết quả
sản xuất có còn được ổn định hay không.

2. Cải tiến thiết bị

- Tăng cường độ oxygen hòa tan trong dịch lên men
+ Tăng lưu lượng không khí sục vào bồn
+ Cải tiến hệ thống phân phối khí (air sparger) theo hướng chia nhỏ
dòng khí tiếp xúc với dịch lên men
+ Tăng áp suất vận hành của nồi lên men
- Tăng cường độ đồng nhất của dịch lên men trong suốt quá trình nuôi cấy
+ Tăng tốc độ khuấy trộn
+ Tăng chiều dài cánh khuấy
- Tăng cường tính chính xác của các thiết bị cảm biến đo các chỉ số sinh lý
kiểm soát quá trình lên men như pH, nhiệt độ nhằm làm giảm biên độ dao động so
với giá trị cài đặt theo yêu cầu.
- Tăng độ tự động hóa của thiết bị nhằm giảm thiểu những sai sót kỹ thuật do
vận hành.

3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy
Xét một ví dụ về kết quả theo dõi quá trình lên men trong bốn trường hợp
trên Hình 7. 1. Trong trường hợp lên men bình thường, tăng trưởng của vi sinh vật
trong nồi lên men trải qua các 4 giai đoạn như đã mô tả ở chương 2. Trong đó lag
phase tương đ ối dài và tro
rất ngắn, sau đó quá trình lên men đi vào pha suy vong (Trường hợp 1).

96
 Trong chương 2, chúng ta đã đề cập đến sự phụ thuộc của tốc độ sản xuất đặc
trưng ()vào tốc độ tăng trưởng đặc trưng ()và hiệu suất chuyển đổi cơ chất của
chủng vi sinh vật nuôi cấy.
Ta có  =  ×Yp/x
P
Mà =
X ×t
Trong đó, P là lượng sản phẩm, X là sinh khối, t là thời gian nuôi cấy.
Như vậy, P= .t
.X.Y
p/x
Mặt khác: X = Yx/s.(So - Sr)
Do vậy: P = .Yx/s.Yp/x.(So- Sr).t
Như vậy, P phụ thuộc vào (X), Sr và thời gian nuôi cấy. Có thể biểu diễn sự
phụ thuộc này bằng phương trình:
P = ∫ dx.dsr.dt
Sản lượng P là phần diện tích giới hạn bởi 3 hàm số: đường cong tăng trưởng,
hàm lượng cơ chất giới hạn (đường) còn lại và thời gian nuôi cấy (phần màu vàng
Hình 7.1).

97
Hình 7. 1. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong các điều kiện lên men khác nhau.

Trong trường hợp có sự tác động làm cho chủng tăng trưởng tốt hơn trong lag
pha và log pha ( ần đ2), quá trình lên men đạt nồng độ tế
max,dTrường hợp

bào cực đại sớm hơn Trường hợp 1. Lúc này, sản lượng thu được khi kết thúc quá
trình lên men sẽ là (P + P1), tốt hơn trong Trường hợp 1.
Trong trường 3, có sự tác động làm cho nồng độ tế bào được duy trì trong
suốt quá trình lên men (pha ổn định được kéo dài), lúc đó, sản lượng lên men sẽ là
(P+P1+P2).
Trường hợp 4: Lượng giống nạp vào nồi lên men tăng lên, mật độ tế bào trong
dịch mau đạt đến giá trị cần thiết cho sản xuất, nghĩa là thời lượng sản xuất tăng lên
nhưng tổng thời gian nuôi cấy của mẻ không thay đổi, kết quả là tăng được sản
lượng lên men, sản lượng thu được trong trường hợp này là (P + P1 + P2 + Pa).
Trong thực tế, việc thực hiện phương án này gặp một số khó khăn về hệ thống nhân
giống như công suất, giá thành… nên không được áp dụng nhiều. Chúng ta tập trung
nghiên cứu trường hợp 2 và trường hợp 3.
Từ trường hợp 2 và 3 trong ví dụ trên cho thấy, để tăng được lượng sản phẩm
lên men trong một mẻ sản xuất, chúng ta cần quan tâm một số vấn cần quan tâm:
1. Tăng cường tối đa tốc độ tăng trưởng đặc trưng: µ → µmax
2. Duy trì hoạt tính tế bào trong thời gian dài, duy trì được µ
3. Bổ sung các chất tác động cho từng mục đích ở từng giai đoạn cụ thể trong
quá trình nuôi cấy (làm tăng cường khả năng sinh tổng hợp sản phẩm cũng như việc
vận chuyển các sản phẩm này ra khỏi màng tế bào)
4. Giảm thiểu sự suy giảm số lượng tế bào do chiết dịch lên men trong quá
trình nuôi cấy.
Chúng ta lần lượt xem xét các vấn đề trên:
1. Tăng cường tối đa tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng: µ → µmax
Để tăng cường tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng trong quá trình nuôi
cấy người ta thường thực hiện một số biện pháp sau:
- Bảo đảm các điều kiện sinh lý như pH, nhiệt độ, độ oxy hoà tan từ ngay từ
khi nạp giống vào và trong suốt quá trình nuôi cấy phải ở mức tối thích. Trong quá
trình lên men, pH của môi trường thay đổi do sự suy giảm nồng độ các chất dinh
dưỡng đồng thời có sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Do vậy cần phải
thường xuyên điều chỉnh pH môi trường bằng cách bổ sung các chất H+/OH- để duy
trì trạng thái pH tốt nhất cho chủng sinh trưởng, phát triển và tổng hợp sản phẩm
mục tiêu. Việc bổ sung các tác nhân điều chỉnh pH cần phải tránh làm cho pH có biên

98
độ dao động pH quá lớn, tác động không tốt đến hoạt tính của chủng. Nhiệt độ của
môi trường lên men cần phải được đảm bảo đúng giá trị tối thích cho sự phát triển
của chủng ngay từ khi bắt đầu và trong suốt quá trình nuôi cấy. Trong một số trường
hợp, do nhiệt độ không khí môi trường xung quanh thấp hơn nhiệt độ cài đặt, nhiệt
độ môi trường lên men có khuynh hướng giảm thấp hơn mức tối thích do vậy không
bảo đảm cho chủng tăng trưởng tốt. Cần phải có thiết bị gia nhiệt để bảo đảm nhiệt
độ đúng theo giá trị cài đặt. Trong quá trình lên men, do vi sinh vật đồng hoá các cơ
chất trong môi trường như đường nên đã giải phòng ra môi trường nuôi cấy một
lượng lớn năng lượng sinh học, làm cho nhiệt độ môi trường tăng lên. Do vậy, cần
phải bảo đảm có hệ thống giải nhiệt để duy trì nhiệt độ nuôi cấy theo mong muốn.
- Bảo đảm không tồn tại các chất gây ức chế tăng trưởng trong môi trường. Ví
dụ do hiện tượng quá nhiệt trong quá trình khử trùng môi trường nên làm xuất các
thành phần gây ức chế nhưng sản phẩm của quá trình caramen hóa.
- Hàm lượng các khoáng vi lượng (C, N, P, Mn, Mg, Fe, Vit…) phải được cung
cấp đầy đủ cho việc tổng hợp tế bào và duy trì hoạt tính của hệ enzyme. Các thành
phần khoáng vi lượng này thường tồn tại tự nhiên trong các loại nguyên liệu như
mật rỉ đường, cao ngô… Tuy nhiên các thành phần này có nhiều biến động tùy theo
từng vùng/mùa canh tác, từng qui trình chế biến hay từng mẻ sản xuất xuất. Do vậy,
cần phải tính toán bổ sung một lượng khoáng thích hợp dưới dạng tinh khiết để bảo
đảm cung cấp đầy đủ theo nhu cầu vi sinh vật.
- Hạn chế áp suất thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy bằng cách giảm thiểu
nồng độ các chất gây áp suất thẩm thấu cao như muối khoáng, đường …
- Bổ sung các nguồn cơ chất cần thiết cho việc tổng hợp tế bào mà chủng đang
nuôi cấy hoặc không thể hoặc tổng hợp với tốc độ rất chậm. Ví dụ như nguồn amino
acids không thay thế, các chất tiền thân như PABA, folic acid …

2. Duy trì hoạt tính của chủng quá trình nuôi cấy
- Bảo đảm tính ổn định của các yếu tố sinh lý trong suốt quá trình nuôi cấy
(nhiệt độ, độ pH không dao động nhiều so với giá trị tối ưu)
- Hạn chế việc tổng hợp các sản phẩm gây ức chế tính ổn định của chủng (ví
dụ khi thiếu oxygen, hàm lượng lactic acid tăng cao gây ảnh hưởng đến hoạt tính của
vi sinh vật)
- Bổ sung thêm các chất dinh dưỡng bị thiếu hụt
- Giảm áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy

3. Bổ sung các chất tác động

- Giúp tăng cường khả năng tăng trưởng (trường hợp tăng µ → µmax)

99
 - Giúp tăng cường khả năng sản xuất, tăng hiệu suất. Ví dụ bổ sung biotin
trong quá trình nuôi cấy các chủng sinh tổng hợp glutamic acid.
- Giúp tăng cường sự bài tiết sản phẩm sinh tổng hợp ra môi trường nuôi cấy.
Ví dụ bổ sung betaine làm yếu cấu trúc màng, tăng cường tính thấm của màng, giảm
áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy.

4. Giảm thiểu sự suy giảm số lượng tế bào do chiết dịch lên men trong quá trình
nuôi cấy.
Trong quá trình lên men, đặc biệt là đối với lên men liên tục hoặc lên men mẻ-
bổ sung thay đổi thể tích, do phải bổ sung chất dinh dưỡng liên tục nên thể tích dịch
lên men trong nồi tăng lên. Đến một giới hạn nhất định, một phần dịch lên men được
chiết ra ngoài để tiến hành thu sản phẩm. Trong nhiều trường hợp, lượng sinh khối
tế bào trong dịch lên men này không được hồi lưu lại nên đã làm thất thoát một
lượng lớn sinh khối. Điều này làm giảm hiệu suất lên men do đã tốn nguồn dinh
dưỡng, đặc biệt là nguồn carbon, để tổng hợp tế bào nhưng các tế bào này không
tham gia sản xuất hết thời gian lên men và do vậy sản lượng men cũng bị suy giảm
đáng kể. Để cải thiện tình trạng này cần phải nghiên cứu cân đối tỷ lệ chiết dịch thích
hợp, đặc biệt là phải tăng nồng độ môi trường dinh dưỡng bổ sung để giảm thiểu tỷ
lệ chiết dịch, tăng nồng độ sản phẩm trong dịch lên men. Tuy nhiên cần lưu ý là phải
kiểm soát được áp suất thẩm thấu thích hợp trong môi trường lên men để bảo đảm
là không ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật.

Áp suất thẩm thấu:

Là áp lực gây nên bởi sự chuyển động dung môi từ dung dịch có độ đậm đặc
thấp đến dung dịch có độ đậm đặc cao hơn qua màng bán thấm.

Dòch sucrose
Nöôùc ñaäm ñaëc

h àP

Maøng cellophane Maøng cellophane

Hình 7. 2. Mô hình sự tạo thành áp suất thẩm thấu.

Cách tính áp suất thẩm thấu (ð):

100
 ð=i×M×R×T
Trong đó, M: nồng độ phân tử gam của chất tan
R: hằng số khí, R = 0,08206 L.atm/K.mol
T: nhiệt độ tuyệt đối (độ K), (T = t + 273)
i: hằng số van 't Hoff, số lượng ion phân ly trong dung dịch
Đối với chất không điện phân, i = 1; trong trường hợp là chất điện phân
mạnh thì i = tổng số ion sinh ra từ sự phân ly toàn bộ các phân tử trong dung
dịch. Ví dụ đối với NaCl, i = 2, CaCl2, i = 3.
Đối với chất điện phân yếu, nếu gọi n là số ion sinh ra trong trường hợp
phân ly 100% và a là mức độ phân ly thực tế, lúc đó
i = (1 - a) + n×a.
Ví dụ trong trường hợp của CH3COOH, giả sử độ phân ly a = 80% thì
i = (1 - 0,8) + 2×0,8 = 0,2 + 1,6 = 1,8.

Hình 7. 3. Thiết bị đo áp suất thẩm thấu.

Áp suất thẩm thấu có vai trò rất quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của vi
sinh vật. Màng tế bào vi sinh vật là một màng bán thấm. Áp suất thẩm thấu tối thích
cho giai đoạn tăng trưởng tạo sinh khối tế bào và giai đoạn sinh tổng hợp sản phẩm
thường là khác nhau. Nhìn chung, trong giai đoạn phát triển, vi sinh vật thích hợp
với áp suất thẩm thấu thấp, trong khi đó, đối với giai đoạn tạo sản phẩm thì áp suất
thẩm thấu cao thì tốt hơn. Tuy nhiên khi áp suất thẩm thấu quá cao thì sẽ gây nên
hiện tượng tế bào bị mất nước, tế bào co lại và ảnh hưởng đến quá trình trao đổi
chất bên trong tế bào. Do vậy, kiểm soát áp suất thẩm thấu trong quá trình nuôi cấy
vi sinh vật được xem là một yếu tố rất quan trọng nhằm bảo đảm vi sinh vật sản xuất
hiệu quả cao.

101
4. Phương pháp thiết kế thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho lên men

102
CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG
CHỐNG TẠP NHIỄM TRONG LÊN MEN

1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn

Sự nhiễm tạp khuẩn là một trong những vấn đề gây nhiều trở ngại đối với
nuôi cấy vi sinh và chi phí xử lý môi trường sau khi bị tạp nhiễm. Vi khuẩn tạp nhiễm
hiện diện trong nồi lên men sẽ sử dụng các thành phần dinh dưỡng của môi trường
để phát triển gây nên sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng để nuôi cấy chủng đang sản
xuất, dẫn đến làm suy giảm hiệu suất và sản lượng lên men. Mặt khác, chủng tạp
nhiễm tạo ra các sản phẩm không mong muốn trong dịch lên men, gây ức chế cho
chủng đang nuôi cấy hoặc gây trở ngại cho qui trình thu hồi sau lên men, làm tăng
hàm lượng tạp chất trong sản phẩm.

Trong trường hợp tạp nhiễm thực khuẩn thể (bacteriophage), toàn bộ tế bào
của chủng đang nuôi cấy có thể bị vỡ ra trong thời gian ngắn nên không thể tiếp tục
quá trình lên men. Cần phải dừng hệ thống, tiến hành xử lý triệt để trước khi bắt đầu
hoạt động trở lại.

2. Phát hiện tạp nhiễm

Trong điều kiện lên men sản xuất bình thường, quá trình lên men được lặp đi
lặp lại và do vậy, động học tăng trưởng của chủng và các thông số kỹ thuật khác như
độ nhớt của dịch lên men… đã được phân tích đánh giá và ghi nhận. Trong trường
hợp xảy ra tạp nhiễm, do sự tồn tại và phát triển của chủng tạp nhiễm nên sẽ gây ra
những biến động bất thường trong quá trình nuôi cấy, chính những thay đổi này sẽ
là cơ sở cho việc phát hiện tạp nhiễm.
1. Thông qua việc theo dõi giá trị OD trong quá trình lên men. Khi có sự hiện
của chủng tạp nhiễm trong nồi lên men, do là chủng hoang dại nên trong điều kiện
thích hợp, chủng tạp nhiễm này sẽ phát triển tăng số lượng tế bào rất nhanh. Do vậy
khi theo dõi nuôi cấy nếu giá trị OD tăng bất thường thì có thể hệ thống lên men đã
bị nhiễm tạp khuẩn. Trường hợp OD giảm bất thường thì có thể đã bị nhiễm thực
khuẩn thể do thực khuẩn thể tấn công làm vỡ tế bào kéo theo sự suy giảm số lượng
tế bào rất nhanh.
2. Dùng kính hiển vi quan sát. Nhận diện sự khác biệt về đặc điểm hình thái
của tạp khuẩn: hình dạng, kích thước tế bào, khả năng di động, tạo bào tử …
3. Kiểm tra trên đĩa pettri chứa môi trường dinh dưỡng tổng hợp: xuất hiện
khuẩn lạc lạ (đặc điểm hình thái). Cần lưu ý là phải ủ ở những nhiệt độ khác nhau để
phát hiện khuẩn lạc, thông thường từ 33-39oC. Trong thực tế, người ta dùng môi

103
trường dinh dưỡng đặc trưng (khuyết dưỡng) để cho chủng nuôi cấy không mọc
được. Khi có khuẩn lạc xuất hiện, có thể đã bị tạp nhiễm.
4. Trong quá trình nuôi cấy, lấy mẫu dịch nuôi cấy đo độ nhớt, nếu độ nhớt
tăng lên đột ngột, có khả năng đã bị nhiễm. Trong một trường hợp nếu bị tạp nhiễm
nặng, tính chất của dịch nuôi cấy có thể biểu hiện bất thường như màu, mùi….
Trong một số trường hợp nhất định, để phát hiện tạp nhiễm, cần lấy mẫu để
tách riêng nuôi cấy ở qui mô và các điều kiện khác nhau.

3. Nguyên nhân tạp nhiễm

1. Do thiết bị
- Thiết kế hệ thống thiết bị không hợp lý, cấu trúc thiết bị không phù hợp, tạo
nên các “túi” làm cho việc vệ sinh khó khăn hoặc tạo điều kiện cho việc hình thành
các lớp cặn-vảy bám chắc vào thành thiết bị gây trở ngại cho việc vệ sinh-khử trùng.
- Thiết bị bị rò rỉ gây nên sự tiếp xúc giữa các phần vô trùng và không vô trùng
trong quá trình lên men như rò rỉ nồi lên men, đường ống, lọc khí, thiết bị gia-giải
nhiệt.
- Các thiết bị cảm biến hiển thị các thông số như nhiệt độ khử trùng, thời gian
khử trùng, áp suất khử trùng … không chính xác: giá trị thực tế nhỏ hơn giá trị hiển
thị. Ví dụ trong trường hợp cài đặt nhiệt độ khử trùng hiển thị là 120oC nhưng thực
tế chỉ 110oC. Do nhiệt độ khử trùng không đạt yêu cầu nên trong một thời gian trùng
nhất định sẽ không diệt hết các chủng tạp nhiễm trước khi đưa vào hệ thống lên
men.
2. Do nguyên liệu
Nguyên liệu (bao gồm nguồn nước), đặc biệt là các nguyên liệu thô có nguồn
gốc tự nhiên chứa vi sinh vật tạp nhiễm với mật độ rất cao, trong đó có cả các chủng
chịu nhiệt, tạo bào tử hoặc các chủng có kích thước tế bào nhỏ…. Việc loại bỏ toàn bộ
các vi sinh vật này là rất khó khăn. Mặt khác, trong nguyên liệu có chứa nhiều cặn bả,
tạp chất… làm nơi “ẩn náu” tốt cho vi sinh vật tránh được tác động của nhiệt khi khử
trùng.
3. Do vận hành
- Khử trùng thiết bị hoặc môi trường không đúng theo nguyên tắc đã được xác
định.
- Không bảo đảm các yếu tố vô trùng trong quá trình thao tác vận hành đặc
biệt ở các công đoạn nạp giống, lấy mẫu, nạp liệu …
- Vệ sinh, khử trùng thiết bị không tốt dẫn đến việc nhiễm dây chuyền từ mẽ
nuôi cấy trước đó.

104
4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men
Có 3 nguyên tắc căn bản
1. Không để sót lại (not remaining). Vệ sinh hoặc khử trùng hoặc lọc… để bảo
đảm rằng không còn tế bào vi sinh vật tạp nhiễm nào trong thiết bị, môi trường
trước khi nuôi cấy.
2. Không để xâm nhập vào (not entering). Bảo đảm rằng trong quá trình vận
hành không có sự xâm nhiễm từ bên ngoài vào môi trường hay thiết bị đang nuôi
cấy.
3. Không để lây lan (not spreading). Ngăn chặn không cho vi sinh vật tạp
nhiễm lây lan trong môi trường thao tác, hoặc ngăn chặn sư lây lan một khi có tạp
nhiễm xảy ra.

Thực hành phòng chống tạp nhiễm

- Thường xuyên vệ sinh thiết bị trước khi khử trùng. Thông thường người ta
dùng NaOH loãng 3~5% hoặc HNO3 loãng 0,5~1% để rữa, làm sạch toàn bộ cặn bả
(scale) còn lại từ mẻ nuôi cấy trước trong thiết bị lên men.
- Thường xuyên kiểm tra sự rò rỉ của thiết bị (nồi lên men, van, đường ống,
các mối hàn …). Các phương pháp kiểm tra như nạp khí nén cao áp vào thiết bị rồi
dùng nước xà phòng xịt bên ngoài để kiểm tra, hoặc phương pháp dùng chỉ thị màu
như nạp khí nén áp suất 0,5-4,0 kgf/cm2 có chứa NH3 với nồng độ thấp vào thiết bị
rồi phủ giấy có tẩm phenolphtalein bên ngoài thiết bị ở các mối nối, đường hàn… để
nhận diện sự rò rỉ. Khi có sự rò rỉ, NH3 từ bên trong thiết bị sẽ khuếch tán ra và được
giữ lại trên giấy có tẩm phenolphtalein làm giấy đổi sang màu hồng. Đối với các thiết
bị trao đổi nhiệt bề mặt, người ta phát hiện các vết nứt bằng cách dùng chất chỉ thị
màu; gồm 3 hợp chất căn bản (bộ kit):
1. Hợp chất tẩy sạch bề mặt;
2. Hợp chất nền thấm vào trong các vết nứt;
3. Hợp chất hiển thị màu khi phản ứng với chất thứ 2.
Sau khi phun hợp chất thứ 2 lên bề mặt thiết bị, dùng vải khô lau sạch, sau đó phun
hợp chất thứ 3. Ở vị trí nào có xuất hiện màu chỉ thị, ở đó đã bị nứt hoặc rò rỉ.
- Thường xuyên kiểm tra độ chính xác của các thiết bị đo đạc như thiết bị đo
nhiệt độ, áp suất, thời gian, lưu lượng… bằng cách so sánh với các dụng cụ đo chuẩn.
- Phải bảo đảm việc vận hành khử trùng đúng qui trình và các điều kiện khử
trùng thích hợp.
- Trong một số trường hợp chủng tạp nhiễm chịu nhiệt, có khả năng tạo bào
tử nên rất khó xử lý. Nhằm loại bỏ triệt để các bào tử còn tồn tại trong nồi lên men
cần sử dụng phương án “khử trùng-nuôi cấy-khử trùng”. Nguyên tắc của phương

105
pháp này là sau khi khử trùng nồi lên men, chuẩn bị một môi trường tổng hợp có
thành phần dinh dưỡng đơn giản bao gồm các nguồn dinh dưỡng C, N, P, Mg, amino
acid với nồng độ thấp, điều chỉnh pH 7,0-7,5, nhiệt độ 30-35oC và tiến hành khuấy
trộn, sục khí trong vòng khoảng 3-4 giờ. Đây là điều kiện thích hợp để các bào tử của
chủng tạp nhiễm còn tồn tại trong nồi sẽ “nở” (germination) thành tế bào sinh
dưỡng. Sau đó, lập tức xả bỏ toàn bộ dịch nuôi cấy này và tiến hành khử trùng thiết
bị ngay nhằm diệt bỏ các tế bào tạp khuẩn còn lại trong nồi lên men. Khi cần thiết có
thể lặp lại qui trình này 2~3 lần.
5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm

Việc phát hiện tạp nhiễm có thể thông qua nhiều phương pháp như đã trình
bày trên đây tuy nhiên trong nhiều trường hợp cần phân tích phối hợp đồng thời
nhiều phương pháp mà trong đó quan trọng nhất là kiểm tra tạp nhiễm theo cách sử
dụng đĩa pettri chứa môi trường tổng hợp. Trong quá trình nuôi cấy, theo thời gian,
cần lấy mẫu và tiến hành kiểm tra trên đĩa petrri bằng cách hút khoảng 1 ml dịch
nuôi cấy trãi lên mặt đĩa và ủ ở nhiệt độ thích hợp (~37-390C), nếu có khuẩn lạc lạ
xuất hiện, có thể hiện tượng tạp nhiễm đã xảy ra. Ghi nhận số lượng khuẩn lạc lạ này
và thực hiện đánh giá qua các thông số: hình thái, số lượng tế bào, khả năng tạo bào
tử, đặc tính di động… và thời gian thế hệ. Trên cơ sở thời gian thế hệ, số lượng và
loại tế bào tạp nhiễm tại thời điểm đánh giá, ta có thể tính được thời điểm tạp nhiễm
bắt đầu xảy ra tại trong trong quá trình lên men, từ đó có thể phân tích được khả
năng nguồn gây nhiễm là từ đâu. Khi phân tích nguồn gốc tạp nhiễm cần tiến hành
theo các bước sau đây.
1) Có thể do còn vi khuẩn tạp nhiễm tồn tại trong thiết bị hoặc/và môi trường
mà nguyên nhân là do hoạt động khử trùng không triệt để (remaining).
+ Do không đủ nhiệt độ/ thời gian khử trùng (thiết bị cảm biến bị hư
hỏng, không bảo đảm độ chính xác theo yêu cầu.
+ Do có sự tồn tại lớp vảy cặn bám trong thành thiết bị (scale), làm nơi
“trú ẩn” tốt cho các vi sinh vật tạp nhiễm tồn tại.
+ Do trong thiết bị/ môi trường có sự hiện diện của các chủng tạp
nhiễm chịu nhiệt nên khi khử trùng với điều kiện như thường lệ thì khả nguy
cơ tế bào các chủng này còn lại là rất lớn.
+ Do thiết bị khử trùng môi trường liên tục (thiết bị gia nhiệt sơ cấp,
Hình 5. 4) bị rò rỉ dẫn đến có sự trộn lẫn giữa môi trường chưa được khử
trùng (đầu vào) và môi trường đã được khử trùng (đầu ra).
+ Do mật độ tế bào tạp nhiễm trong các thành phần nguyên liệu quá
lớn, khả năng khử trùng triệt để giảm.

106
 2) Có thể giống có chứa các tế bào tạp nhiễm hoặc hoạt động thao tác nạp
giống gây nên tạp nhiễm.
+ Do nguồn giống nạp vào nồi lên men đã bị tạp nhiễm bởi quá trình
nhân giống/ chuẩn bị giống.
+ Do hoạt động nạp giống vào nồi lên men không đúng thao tác gây nên
tạp nhiễm.
3) Có thể do vi khuẩn tạp nhiễm thâm nhập vào trong quá trình nuôi cấy mà
nguyên nhân là do thiết bị bị rò rỉ (van, mối hàn …), màng lọc (hệ thống lọc khí) bị
hư hỏng hoặc do thao tác vận hành của nhân viên kỹ thuật trong quá trình lên men
không phù hợp (entering).
+ Thiết bị bị rò rỉ: van, mối hàn, roong đệm bề mặt ở các vị trí liên kết
thiết bị bị bể hoặc bị lỏng ra trong quả trình vận hành. Đặc biệt là thiết bị giải
nhiệt bị rò rỉ sẽ gây hiện tượng tạp nhiễm nghiêm trọng do nguồn nước giải
nhiệt chứa rất nhiều vi khuẩn tạp nhiễm có thể thâm nhậm vào dịch lên.
+ Màng lọc không khí cung cấp cho nồi lên men bị hư hỏng dẫn đến việc
không khí chưa được lọc triệt để được nạp vào nồi lên men trong quá trình
nuôi cấy.
+ Hoạt động vận hành của nhân viên kỹ thuật không đúng trình tự các
thao tác chuẩn dẫn đến việc dịch/ không khí bên ngoài hoặc từ các qui trình
không bảo đảm vô trùng thâm nhập vào nồi lên men trong quá trình nuôi cấy.

Ví dụ: Trong nuôi cấy mầm (nhân giống- seed cultivation) lên men sản xuất
amino acid với thể tích dịch là 10 KL, tỷ lệ nạp giống là 0,05%. Theo thời gian người
ta ghi nhận được tại giờ nuôi cấy thứ 14 và 16 số tế bào (khuẩn lạc) tạp nhiễm tương
ứng là 21 và 95 của cùng một loại tạp khuẩn xuất hiện trên đĩa pettri khi ủ với 1 ml
dịch với môi trường đặc trưng. Hãy đánh giá thời điểm bắt đầu xảy ra tạp nhiễm và
khả năng nguồn gốc tạp nhiễm.
Ta có thể tính được tg = 120/log2(95/21) = ~55 phút (~0,918 giờ).
Thời điểm mà trong 1 ml dịch nuôi cấy có 1 tế bào tạp nhiễm là (có thể phát
hiện được): 14 - 0,918×log2 (21/1) = ~10 giờ.
Tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy, trong nồi lên men có 10×106/210/0,918 = 5.258
tế bào. Trên cơ sở này ta có thể nhận xét về nguồn tạp nhiễm:
1. Tạp nhiễm có thể đã xuất hiện ngay từ khi bắt đầu nuôi cấy.
2. Nguồn gốc của tạp nhiễm từ đâu?
- Nguồn tạp nhiễn từ giống mầm?
Thể tích giống mầm nạp vào là 0,05% × 10 KL = 5.000 ml. Nếu toàn bộ số tế
bào tạp nhiễm trên do từ giống thì trong dịch giống nạp vào có 5.258/5.000 = 1,05 tế

107
bào / ml, tức là có hơn 1 tế bào tạp nhiễm /1 ml dịch giống mầm. Giống mầm sau khi
nhân giống cũng được kiểm tra tạp nhiễm với qui trình kiểm tra nghiêm ngặt nên
với tỷ lệ tạp nhiễm này chắc chắn sẽ được phát hiện. Điều đó cho thấy nguồn gốc tạp
nhiễm không phải từ giống mầm.
- Tạp nhiễm do hệ thông khử trùng môi trường sự cố? Theo thô ng tin được
ghi nhậ n được thı̀ sự tạp nhiễm là của một chủng duy nhất nên sự tạ p nhie� m không
phải do hệ tho� ng thiết bị khử trùng môi trường có va� n đe� . Đặ c biệ t càng khô ng the� là
thie� t bị gia nhiệ t sơ cấp bị rò rỉ vì nếu như the� thì có sự trộn lẫn giữa pha� n môi
trường đã thành trùng với pha� n môi trường chưa được khử trùng, mà trong môi
trường chưa khử trùng thì không chỉ có một chủng gây tạp nhiễm. Không phải do
trong thành phần nguyên liệu có hàm lượng tạp nhiễm tổng số cao mà có thể là do có
chủng chịu nhiệt hiện diện trong hệ thống thiết bị hoặc trong thành phần nguyên
liệu dù chỉ với mật độ thấp. Do vậy, cần tiến hành các hoạt động kie� m tra cá c thiết bị
có liên quan đến nồi lên men như:
+ Kiểm tra các thiết bị cảm biến nhiệt độ hiển thị có chính xác hay không.
+ Kiểm tra và vệ sinh các lớp vảy cặn bám vào thiết bị.
+ Kiểm tra lại các bước thao tác vận hành của nhân viên kỹ thuật.

6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm
Chủng tạp nhiễm thường gặp trong quá trình lên men là thuộc họ Bacillaceae
với đặc điểm là di động, tạo bào tử, chịu nhiệt, phát triển nhanh. Nguồn gốc có thể từ
các nguyên liệu thô (raw materials) hoặc trong các thiết bị do khử trùng không triệt
để.
Nếu chủng tạp nhiễm là thuộc họ Micrococcus thì nguồn gốc có thể từ hệ
thống lọc khí, hệ thống nước giải nhiệt.
Nếu trong nồi lên men tồn tại từ hai chủng tạp nhiễm trở lên với số lượng
nhiều và thời gian thế hệ trung bình của các chủng tạp nhiễm ngắn thì có thể suy
đoán là do thiết bị bị rò rỉ (hệ thống khử trùng, hệ thống lọc khí, hệ thống giải nhiệt
…)
Cần nghiên cứu thêm động học của sự tác động nhiệt khi khử trùng đối với vi
sinh vật.

108
CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN

1. Giới thiệu
Chiết tách và tinh sạch sản phẩm lên men là một qui trình rất phức tạp, khó
thực hiện và chi phí rất cao. Người ta cố gắng thu nhận sản phẩm có chất lượng cao
trong thời gian ngắn với chi phí đầu tư và chi phí vận hành thấp nhất. Trong thực tế,
chi phí thu hồi sản phẩm lên men chiếm từ 15% -70% tổng giá thành của sản phẩm.
Do vậy, việc chọn lựa qui trình công nghệ thu hồi là rất quan trọng và tùy thuộc vào
đặc điểm của từng loại sản phẩm.

Nếu phân tích dịch lên men tại thời điểm thu nhận thì có thể thấy trong dịch
có chứa: sản phẩm mục tiêu với nồng độ thấp (nếu là sản phẩm ngoại bào), tế bào
nguyên vẹn, tế bào bị vỡ, các chất tan và không tan của môi trường nuôi cấy còn lại
và các sản phẩm trao đổi chất khác. Sản phẩm cũng có thể là ngoại bào, nhạy cảm với
nhiệt hoặc dễ dàng bị phá vỡ cấu trúc do các chủng vi sinh vật tạp nhiễm. Toàn bộ
những yếu tố này góp phần làm tăng mức độ khó khăn cho quá trình thu hồi. Để bảo
đảm cho việc thu hồi hoặc tinh sạch sản phẩm tốt thì tốc độ vận hành cũng là yếu tố
quan trọng do một số sản phẩm có tính nhạy cảm cao. Do vậy qui trình thiết bị phải
phù hợp để bảo đảm rằng việc thu hồi sản phẩm được thực hiện trong một khoảng
thời gian thích hợp nhất. Sự chọn lựa qui trình thu hồi dựa trên các tiêu chí sau:

1. Xác định loại môi trường lên men (rắn, bán rắn hay môi trường lỏng)
2. Sản phẩm thu nhận là nội bào hay ngoại bào
3. Nồng độ của sản phẩm trong dịch lên men
4. Đặc tính lý - hóa của sản phẩm (giúp cho việc chọn lựa phương án tách)
5. Mục đích sử dụng của sản phẩm
6. Độ tinh khiết thấp nhất có thể chấp nhận được
7. Tầm quan trọng của độc tính sinh học của sản phẩm và của dịch lên men.
8. Độ tạp chất trong dịch lên men
9. Giá cả thị trường của sản phẩm

Mục đích chính của giai đoạn đầu trong quá trình thu hồi sản phẩm ngoại bào
là loại bỏ các hạt tử rắn có kích thước lớn và tế bào vi sinh vật. Thông thường người
ta sử dụng hệ thống thiết bị là máy ly tâm hoặc máy lọc. Công đoạn tiếp theo là dịch
lên men được phân đoạn hoặc được chiết tách nhờ đưa vào hệ thống phân đoạn
chính, có thể là hệ thống lọc tinh, hệ thống đảo chuyển áp suất thẩm thấu, hấp phụ,
trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, chiết tách hệ dịch lỏng-dịch lỏng, chiết tách dịch lỏng hai

109
phase hoặc đông tụ. Sau cùng, các phân đoạn có chứa sản phẩm mục tiêu sẽ được
tinh chế bằng cách đông tụ phân đoạn và đạt được độ tinh sạch cao thì dùng kỹ thuật
sắc ký và kết tinh để thu hồi sản phẩm. Việc thu hồi một số sản phẩm khác có thể
biến đổi một vài công đoạn trong qui trình chính này (Hình 9.1).
Có thể thay đổi một số đặc tính của dịch sau lên men qua đó có thể vận hành
xử lý nhanh hơn với một qui trình đơn giản hơn nhờ một số kỹ thuật sau:

1. Chọn lựa chủng vi sinh vật không sinh tổng hợp các chất màu hoặc các chất
trao đổi không muốn.
2. Thay đổi điều kiện lên men nhằm giảm thiểu sự sản xuất các sản phẩm
trao đổi chất không mong muốn.
3. Xác định chính xác thời điểm thu hồi thích hợp nhất.
4. Kiểm soát pH sau khi dừng lên men
5. Xử lý nhiệt độ sau khi dừng lên men
6. Bổ sung các chất gây kết tụ
7. Dùng enzymes phá thành tế bào

Cần phải lưu ý rằng lên men và thu hồi sản phẩm là hai giai đoạn liên tục của
một quá trình và có sự tác động tương hổ. Darbyshire (1981) đã quan tâm đến vấn
đề này trong qui trình thu nhận enzyme. Các thông số liên quan bao gồm thời gian
thu hoạch, sự sản xuất các phân tử màu, lực ion và thành phần môi trường nuôi cấy.
Lượng lớn dịch nổi có chứa enzyme cần phải được xử lý ngay sau khi thu nhận dịch
lên men, hiệu suất thu hồi enzyme có thể không dự đoán được. Điều này gây khó
khăn cho việc thiết lập kế hoạch thu hồi. Sự sản xuất ra các chất màu gây trở ngại lớn
cho qui trình thu hồi do chúng liên kết với resin giống như các enzyme. Chất phá bọt
còn lại trong dịch lên men gây ảnh hưởng đến hệ thống lọc tinh hoặc nhựa trao đổi
ion được sử dụng trong các giai đoạn của quá trình thu hồi và tinh sạch. Cần thực
hiện các bước thử nghiệm để chọn ra loại chất phá bọt nào thích hợp nhất cho quá
trình lên men. Hàm lượng các ion trong môi trường sản xuất có thể quá cao dẫn đến
việc cần phải pha loãng dịch nỗi sau ly tâm với nước đã được khử khoáng trước khi
đưa dịch nỗi này vào công đoạn xử lý. Công thức môi trường nuôi cấy được quyết
định bởi các yêu cầu sản xuất, nhưng hàm lượng protein trong các môi trường phức
tạp nên được đánh giá dưới góc độ thu hồi sản phẩm enzyme sau lên men. Quan
điểm này cũng đã được đồng tình bởi Topiwala và Khosrovi (1978), khi tái sử dụng
nước cho qui trình lên men thu nhận sinh khối.

110
 Sự thu hồi và tinh sạch nhiều hợp chất khác nhau có thể thực hiện được bằng
nhiều con đường khác nhau. Trong một điều kiện nhất định, việc chọn phương án
nào liên quan đến việc so sánh các yếu tố được đề cập sau đây:

1. Vốn đầu tư
2. Chi phí xử lý
3. Các yêu cầu của toàn bộ qui trình
4. Hiệu suất thu hồi
5. Chất lượng thành phẩm
6. Tính sẵn có các kỹ thuật công nghệ
7. Sự phù hợp với các yêu cầu đã qui định
8. Nhu cầu xử lý chất thải
9. Qui trình liên tục hay theo mẻ
10. Tính tự động
11. Vệ sinh an toàn cho nhân viên vận hành

Vấn đề chính hiện nay đang đối mặt trong các qui trình thu hồi sản phẩm là
việc tinh sạch các phân tử có hoạt tính sinh học trong qui mô lớn.

111
 Dòch sau leân men Giöõ ôû ñieàu kieän thích
hôïp veà pH, nhieät ñoä

Loïc
Tách tế bào Ly taâm

Sinh khối

Phá tế bào

Tách loại

Dòch noãi Dòch noãi

Lắng tủa Lắng tủa

Cheá phaåm thoâ Cheá phaåm thoâ

Tinh sạch Tinh sạch

Saûn phaåm Saûn phaåm

Hình 9. 1. Sơ đồ qui trình thu hồi sản phẩm sau lên men.

112
2. Các phương pháp tách tế bào
Tế bào vi sinh và các nguyên liệu không tan có thể được tách ra ngay khi thu
nhận dịch lên men bằng cách lọc hoặc ly tâm. Do kích thước của tế bào vi sinh rất
nhỏ nên có thể dùng thêm các hệ thống hổ trợ nhằm tăng cường tốc độ tách loại. Có
nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tách loại tế bào ra khỏi dịch lên
men.

2.1. Phương pháp lắng tủa

Là phương pháp dựa trên sự kết lắng do trọng lực của chất rắn trong môi
trường nước. Phương pháp này thường được sử dụng nhiều trong thu nhận protein.
Để tăng cường tốc độ lắng tủa người ta thường dùng một số phương pháp thúc đẩy
quá trình lắng:

+ Phương pháp tạo keo tụ

- Thay đổi pH (nếu không ảnh hưởng đến các bước tiếp theo)
- Bổ sung các chất có khả năng làm đông tụ:
+ Muối calcium, muối Fe, muối Al có thể gây đông tụ vi khuẩn,
nấm men, tảo… (Nakamura, 1961)
+ Acid tanic, titan chloride và các cation như hợp chất
quaternary amoni, alkyl amin, alkyl pyridine: làm tăng tốc độ lắng tụ
gấp nhiều lần khi thu nhận sinh khối candida intermedia (Gasner và
Wang, 1970)
+ Chất đa điện phân
+ Hàn the: gây đông tụ tế bào nấm men (Bentham và cộng sự,
1990)
- Bổ sung các loại keo có điện tích nghịch
+ Gia nhiệt dung dịch lên men

2.2. Phương pháp ly tâm

Nguyên tắc của phương pháp ly tâm là dựa vào trọng lượng của tế bào. Lực ly
tâm càng lớn, việc tách loại tế bào ra khỏi dịch lên men càng dễ. Lực ly tâm phụ
thuộc vào tốc độ quay của rotor (rpm) và bán kính thùng quay theo phương trình:

C = m.w2/R
Trong đó m: khối lượng, kg;
w: tốc độ thùng quay, m/s
R: bán kính thùng quay, m

113
 Hình 9. 2. Mô hình máy ly tâm liên tục.

2.3. Phương pháp lọc

Lọc là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất về mặt kích thước qua
lớp lọc. Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ lớp lọc thì được giữ lại bên
trên, dung dịch đi xuyên qua lọc dưới một áp suất dư so với áp suất bên dưới vật
ngăn. Phương pháp này được sử dụng để thu sinh khối các chủng vi sinh vật có kích
thước tế bào lớn. Tế bào vi sinh vật càng lớn, lọc càng nhanh và hiệu suất lọc càng
cao. Tuy nhiên phương pháp lọc thường chỉ áp dụng trong trường hợp thu nhận sinh
khối tảo do kích thước lớn, còn các chủng vi sinh vật khác thường kích thước nhỏ,
lọc không hiệu quả.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc:

+ Chênh lệch áp suất

Độ lệch áp (ΔP) trước và sau màng lọc chính là động lực của quá trình lọc và
do vậy khi ΔP càng lớn thì tốc độ lọc càng cao. Động lực của quá trình lọc có thể được
tạo ra bằng cách dùng áp lực của cột chất lỏng (áp suất thuỷ tĩnh), dùng máy bơm
hay máy nén được dịch huyền phù vào hệ thống lọc (lọc áp suất), hoặc có thể dùng
bơm chân không để hút phần dịch ra trong hệ thống lọc kín (lọc chân không). Cần

114
phải lưu ý rằng, tuỳ theo hệ thống lọc mà giới hạn của ΔP khác nhau. Nếu ΔP quá lớn,
lớp bã trên mặt lọc sẽ bị nén chặt, các ống mao quản (lỗ lọc) bị thu hẹp, chất lỏng
không chui qua được màng lọc, tốc độ lọc do vậy cũng bị giảm xuống và có thể dẫn
đến tình trạng “nghẹt lọc”. Ngoài ra, khi ΔP cao, có thể làm cho màng lọc bị rách, gây
hư hỏng thiết bị. Do vậy, cần phải thiết kế ΔP phù hợp với từng hệ thống lọc. Ngoài
ra, để tăng cường tốc độ và hiệu quả lọc, người ta thường sử dụng chất trợ lọc.

Chất trợ lọc là một loại bột mịn dùng để hỗ trợ quá trình lọc bằng cách tạo
thành một lớp bã bổ sung trên bề mặt lọc, làm tăng khả năng giữ pha rắn và giảm trở
lực của pha lỏng. Bột trợ lọc cần phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Tạo được trên bề mặt lọc một lớp bã có độ xốp lớn (ɛ = 0,85 ÷ 0,90) nhưng
kích thước lỗ xốp bé.
- Bề mặt riên của bột trợ lọc không quá lớn (vì bề mặt riêng lớn thì kích
thước hạt bé và trở lực lớn)
- Giới hạn thành phần cở hạt của bột trợ lọc trong phạm vi hẹp (hạt đồng
nhất)
- Khối lượng riêng của bột trợ lọc không quá lớn (khối lượng riêng lớn sẽ
tạo ra sự phân lớp trong dịch huyền phù)
- Độ nén dưới áp suất không cao
- Không hoà tan và phải trơ về mặt hoá học với pha lỏng của huyền phù.

Bột trợ lọc thường được sử dụng bằng 2 cách sau: (1) Hoà bột trợ lọc vào
huyền phù (khoảng 0,01 ÷ 4%), cách này thường dùng cho hệ thống lọc liên tục. (2)
Phủ một lớp bột trợ lọc lên trên bề mặt của màng lọc với độ dày khoảng từ 0,8 ÷ 2,5
mm tương ứng với khối lượng khoảng 0,1 ÷ 0,75 kg/m2. Cách này thường được dùng
trong trường hợp lọc gián đoạn (theo mẻ). Các loại bột trợ lọc thường dùng bao
gồm: diatomit, perolit, amiang, mùn cưa, than hoạt tính…

• Diatomit: được sử dụng rất rộng rãi để dùng cho quá trình trợ lọc. Do cấu trúc
của diatomit có các lỗ xốp lớn và nhiều khoảng trống nên vật liệu này có khả năng
thấm hút cao. Diatomit có tính trơ về mặt hoá học và do năng suất lọc cao (tốc độ lọc
lớn), có khả năng tách các hạt chất rắn có kích thước < 0,5 mm. Diatomit rất nhẹ và
có thể chịu nén, trong khi đó vẫn có thể giữ được 90% các khoảng trống do vậy
thường dùng hơn là perolit.
• Perolit: là một loại khoáng chất gốc dung nham núi lửa trông giống như thủy
tinh, perolit được sử dụng làm chất trợ lọc. Perolit đặc và thô hơn diatomit nên chỉ
có thể giữ lại các hạt tạp chất có kích thước >1 mm.

115
 • Nhóm zeolit: clinoptilolit là loại zeolit được sử dụng nhiều nhất trong các quá
trình lọc do có khả năng giữ các hạt tạp chất ở trong lỗ xốp hay trên bề mặt thô ráp
của nó.
Vật ngăn lọc
Nhằm để ngăn cản và giữ lại pha rắn, bề dày của vật ngăn lọc và tính chất của
nó ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ lọc.Vật ngăn lọc thường phải xốp, mỏng và dễ
thay thế như vải lọc, màng xốp, tơ nhân tạo hay cát sỏi... Các đặc điểm cơ bản của vật
ngăn lọc bao gồm:
- Hiệu quả giữ pha rắn cao, trở lực đối với pha liên tục nhỏ
- Các lỗ xốp mao dẫn trên bề mặt vật ngăn lọc phải được phân bố đồng đều
- Chịu được tác động của môi trường lọc như: độ thấm ướt, độ bền về áp suất,
nhiệt độ, hóa học, cháy nổ, điều kiện tái sinh bề mặt lọc.
Người ta có thể đánh giá khả năng giữ pha rắn của vật ngăn lọc bằng hiệu
quả của quá trình phân riêng:
η = (Cm - Cn) × 100%, với Cm là nồng độ pha rắn trong hỗn hợp huyền phù, Cn
là nồng độ pha rắn trong nước lọc.
Trở lực của vách ngăn lọc: được biểu diễn bằng phương trình cân bằng:
Rv = ∆P.Sτ / Mv
hay RvT = Rv.eKtN
trong đó,
RvT là trở lực của vật ngăn lọc theo thời gian sử dụng
Rv là trở lực vật ngăn còn mới
Kt là hằng số lưu ý đến vật ngăn lọc
N là thời gian hoặc chu kỳ sử dụng.
Chọn vật ngăn lọc phù hợp với yêu cầu cụ thể là một việc hết sức phức tạp,
liên quan đến nhiều yếu tố khác như: chất lượng nước lọc, thời gian sử dụng và giá
thành sản phẩm.
Các phương pháp lọc thường được sử dụng bao gồm:

+ Lọc chân không thùng quay

+ Lọc khung bản
+ Lọc tiếp tuyến
Dịch tế bào khi chảy ngang qua bề mặt lọc sẽ có một áp lực tạo thành dòng
chảy vuông góc giúp cho phần dịch đi qua màng còn các phần tử sẽ tiếp tục di
chuyển tới giảm thiểu khả năng bị tắc nghẽn, tốc độ lọc cao. Tuy vậy, sự tác nghẽn
vẫn xảy ra và các màng lọc vẫn phải rửa bằng các tia nước.

116
 Để tăng cường hiệu quả lọc, người ta thường bổ sung chất trợ lọc vào dịch lên
men để kéo dài chu kỳ vận hành của lọc. Chức năng của chất trợ lọc là giữ lại các hạt
rất mịn bằng cách làm đường kính tương đối lớn của các lỗ xốp trong vật liệu dùng
làm phiên lọc và tăng độ xốp của các hạt đóng cặn trên phin nhờ hỗn hợp với các hạt
đó. Các chất trợ lọc thường được dùng là đất infusoa hay Kieselgua, amiang tán mịn,
than, đất sét tán nhỏ.
Cách sử dụng: Trộn vào với chất dùng để lọc, làm cho chất trợ lọc bám trên
phim (màng) lọc tạo thành một lớp tương đối ở mặt ngoài tang trống lọc chân
không, sau đó lấy dần dần đi trong quá trình lọc để giữ cho lớp này có chiều dày cố
định.
Các kiểu phim lọc:
1. Các loại phim lọc ép: thường dùng các loại bằng gang hoặc bằng thép không rỉ.
Các loại này có thể khử trùng bằng nhiệt độ cao
2. Các phim lọc đĩa: gồm một chồng đĩa làm bằng khung kim loại thưa mắt cáo,
bọc trong vật liệu lọc như giấy amiang hoặc cellulose
3. Các phim lọc kim loại bằng những đĩa mỏng thép không rỉ, có rãnh nhỏ trên
một mặt. Người ta chồng một số lớn đĩa này vào trong một trụ rỗng để làm
thành phim lọc và tăng hiệu lực lọc bằng cách bổ sung các chất phụ gia thích
hợp.
4. Các phễu lọc chân không hình trống là những thiết bị có lưu lượng lớn và chủ
yếu dùng để lọc môi trường lên men.
5. Phim lọc vô trùng: Các vật liệu lọc bảo đảm mức độ vô trùng phải có các tiêu
chuẩn sau:
• Tính chất lý học cho phép chịu được áp suất khử trùng
• Có khả năng lọc nhanh
• Có thể khử trùng được bằng hơi nước hoặc hơi nóng.
• Có khả năng tái sử dụng

117
 Lọc tiếp tuyến

Hình 9. 3. Sơ đồ thiết bị lọc tiếp tuyến sử dụng trong công nghiệp [Nguồn…].

2.4. Phương pháp tạo bọt

Là phương pháp phân tách tế bào ra khỏi dịch lên men dựa trên sự khác nhau
về độ hoạt động bề mặt của các chất. Tế bào sẽ được lôi kéo theo trên bề mặt các bọt
khí đi ra khỏi pha lỏng nên sẽ phân tách với pha lỏng giúp dễ dàng loại bỏ.

118
 Ñöôøng oáng chaûy traøn

Thieát bò laøm vôõ boït

Phaàn boït
Dịch chöùa teá baøo

Phaàn loûng

Suïc khí

Hình 9. 4. Sơ đồ hệ thống tách tế bào bằng phương pháp tạo bọt.

3. Phương pháp phá màng tế bào

3.1. Phương pháp vật lý
a. Đông lạnh- giải đông
Phương pháp này thường được sử dụng để ly giải tế bào vi khuẩn và tế bào
động vật hữu nhũ. Kỹ thuật này liên quan tới việc làm đông huyền phù vi khuẩn
trong bể ethanol khô hay máy làm đông, sau đó giải đông ở nhiệt độ phòng 37oC.
Nguyên lý của phương pháp này là tế bào sẽ trương lên khi bị đông lạnh và vỡ ra khi
các tinh thể đá được hình thành trong suốt chu trình đông và tan ra trong chu trình
giải đông. Cần phải lập lại nhiều lần chu trình đông – giải đông để đạt hiệu quả ly giải
cao. Ưu điểm của phương pháp này là không gây biến tính protein mục tiêu, không
bổ sung bất kỳ loại hóa chất nào, tuy nhiên nhược điểm là hiệu quả ly giải thấp, tốn
nhiều thời gian.
b. Phương pháp trượt rắn
Nguyên tắc của phương pháp này là đẩy nguyên liệu tế bào đã đông lạnh
khoảng -25oC qua một lỗ hẹp ở áp suất cao. Phương pháp này ít được sử dụng ở quy
mô công nghiệp, do nó không thể dùng một lượng lớn nguyên liệu để phá vỡ tế bào.
c. Phương pháp trượt lỏng
Phương pháp này đặc biệt thuận lợi cho phá vỡ tế bào vi khuẩn và nấm men
và được sử dụng rộng rãi phục vụ cho nghiên cứu cũng như ở qui mô công
nhiệp. Nguyên tắc của phương pháp này là dịch huyền phù tế bào được nén dưới áp

119
suất cao di chuyển qua một lỗ hẹp sau đó đi qua buồng có thể tích lớn hơn, áp suất
giảm đột ngột, tế bào vỡ ra.

Hình 9. 5. Mặt cắt ngang của thiết bị đồng hoá Manto-Gaulin.

Máy đồng hóa áp lực cao Manton-Gaulin (APV Ltd. Crawley, UK) được sử dụng
rộng rãi, với cấu tạo bao gồm một máy bơm kiểu piston, có thiết bị điều chỉnh áp
suất hoạt động theo yêu cầu vận hành, có thể đạt tới 95 MPa. Tốc độ phá vỡ tế bào và
giải phóng protein phụ thuộc vào một số nhân tố như: loại tế bào, điều kiện lên men,
nồng độ và tiền xử lý (chẳng hạn đông lạnh, vì các tế bào vi sinh vật thường dễ vỡ
hơn nhiều nếu chúng được làm lạnh trước)... Tỷ lệ protein giải phóng khỏi các tế bào
nấm men có thể được mô tả bằng một phương trình được xây dựng dựa trên kinh
nghiệm như sau:
Log [Rm/(Rm - R)] = K.n.P
trong đó, Rm là lượng protein hòa tan cực đại được giải phóng theo lý thuyết, R là
lượng protein được giải phóng thực tế, K là hằng số phụ thuộc nhiệt độ, n là số rãnh
(number of passes), P là áp suất ngược hoạt động và α là hằng số phụ thuộc vào loại
vi sinh vật. Giá trị α khác nhau tùy thuộc vào chủng giống, đối với nấm men nó
khoảng 2,9 và E. coli khoảng 2,0.
Thiết bị đồng hoá Manton-Gaulin để phá vỡ tế bào vi sinh vật ở quy mô lớn nhằm
thu nhận một số enzyme điển hình như β-galactosidase từ tế bào E. coli,
carboxypeptidase từ tế bào Pseudomonas spp và một số lớn enzyme từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus stearothermophilus như glycerokinase, hexokinase đặc trưng glucose.
Các điều kiện để phá vỡ tế bào phải được thiết kế cẩn thận để đạt kết quả tối ưu, vì
mức độ phá vỡ tế bào và giải phóng protein có thể ảnh hưởng đến các bước tinh
sạch tiếp theo.

120
 Hình 9. 6. Máy phá tế bào Microfluidizer M-110EH-30.
Thiết bị Microfluidizer (M-110EH-30) được sử dụng trong công nghệ làm huyền phù-
đồng nhất các loại dung dịch. Thiết bị này còn được ứng dụng để phá màng tế bào vi sinh vật
nhằm thu nhận dịch huyền phù có chứa các sản phẩm bên trong tế bào. Nguyên tắc của thiết
bị này là dịch tế bào sau thu hoạch từ giai đoạn lên men được bơm nén lên áp suất cao, có thể
đến 40.000 psi, sau đó được đưa qua một thiết bị gọi là interraction chamber (phòng tương
tác) được phủ bằng kim cương, tạo sự va đập mạnh làm cho tế bào vỡ ra có thể đến kích
thước 74 microns, với hiệu suất phá màng tế bào có thể đạt đến 99%. Tùy theo loại tế bào vi
sinh mà điều kiện vận hành khác nhau. Tốc độ nạp dịch và áp suất là hai thông số quan trọng
quyết định hiệu suất phá màng tế bào. Người ta thường hồi lưu dịch huyền phù nhiều lần để
tăng cường hiệu quả phá màng tế bào.
d. Phương pháp nghiền
Tế bào có thể được phá vỡ bằng phương pháp cơ học nhờ hệ thống chứa 1 dãy
đĩa quay và các hạt nhỏ. Các hạt này được làm từ những vật liệu có khả năng chống
chịu cơ học tốt như thủy tinh, alumina ceramide hay các hợp chất titan. Một sản
phẩm đặc trưng là Dyno-Muhle (WA Bachofen, Basle, Switzerland) có thể được dùng
để giải phóng protein khỏi tế bào của rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Dịch
huyền phù tế bào được bơm vào buồng, sau đó được khuấy trộn với tốc độ rất
nhanh đủ để phá vỡ thậm chí cả các tế bào vi khuẩn dai nhất. Buồng phân hủy cần

121
phải được làm lạnh để giữ được hoạt tính của protein khỏi tác đông do sự sinh nhiệt
trong quá trình nghiền. Với qui mô phòng thí nghiệm, thể tích buồng 600 ml có thể
thực hiện nghiền tới 5 kg tế bào vi khuẩn trên một giờ, và ở quy mô sản xuất, buồng
có thể tích lên tới 250 L.
e. Phương pháp siêu âm: sử dụng sóng có tần số cao để phá tế bào
Cơ sở của phương pháp này là sóng siêu âm (có tần số từ 20 KHz đến 1 MHz)
tạo ra xen kẽ các sóng áp suất cao và áp suất thấp trong chất lỏng mà nó truyền qua.
Trong suốt chu kỳ áp suất thấp, sóng siêu âm tạo ra các bong bóng chân không nhỏ
trong chất lỏng và sau đó sẽ bị phá vỡ hoàn toàn trong chu kỳ áp suất cao. Hiện
tượng này được gọi là cavitation. Sự nổ của bong bóng trong cavitation gây ra lực cắt
thủy động lực rất mạnh và lực này sẽ tác động lên màng tế bào và nếu đủ mạnh sẽ
gây vỡ tế bào.

Hình 9. 7. Dãy các sóng âm có tần số từ 20 KHz đến 1 MHz tạo ra hiện tượng
cavitation nhưng sóng âm có tần số ở vùng gần 20 KHz tạo cavitation hiệu quả
hơn. (http://www.sonotronic.de/pictures/ultrasonic-and-cavitation-
principles)

122
 Hình 9. 8. Thay đổi cấu trúc sinh khối thông qua sóng siêu âm.
(http://www.sonotronic.de/pictures/change-of-the-biomass-structure-through-
sonication)
Ưu điểm của phương pháp dùng sóng siêu âm là đơn giản, dễ thực hiện và
không cần bổ sung chất vào hỗn hợp cần tách. Nhược điểm của phương pháp này là
chi phí đầu tư cao và do lực tác động mạnh nên có thể làm vỡ các sản phẩm nhạy
cảm với lực.

3.2. Phương pháp hóa học

a. Dùng áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu là sự chuyển động của các phân tử nước theo cách tự sinh,
hay thụ động (không cần năng lượng) từ nơi có thế nước cao tới nơi có thế nước
thấp do sự chênh lệch về nồng độ của 2 dung dịch (còn gọi là dung dịch ưu trương và
dung dịch nhược trương). Theo cơ chế đó, nước đi từ dung dịch nhược trương vào
trong tế bào ưu trương hơn khi tế bào nằm trong dung dịch. Do đó khi tế bào hồng
cầu hay tế bào động vật không vách tế bào khi cho vào nước cất rất dễ bị phá vỡ
màng tế bào. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể áp dụng cho những tế bào

123
không có vách như tế bào động vật. Đối với các tế bào có vách như tế bào thực vật, vi
khuẩn, nấm men, không thể chỉ dùng dung dịch nhược trương để phá màng tế bào
mà phải xử lý thêm bằng các enzyme phá vách như: lysosyme, celluloase, pectinase,
hemicellulase... để loại vách tế bào trước khi xử lý tiếp bằng phương pháp áp suất
thẩm thấu. Sau khi tế bào đã được loại vách, tiến hành ly tâm để thu phần cặn bên
dưới, đó là những tế bào đã được loại vách và cả phần vách đã bị vỡ ra, chúng ta có
thể cho dung dịch nhược trương vào hay là cho phần cặn này vào dung dịch nhược
trương để phá màng thu dịch bên trong. Để thu dịch nguyên chất không lẫn xác hay
các mảnh vụn của tế bào hoặc nhân và 1 số bào quan không cần thiết, ta có thể ly
tâm thu dịch và bỏ phần cặn bên dưới. Dịch này bao gồm sản phẩm sinh học quan
tâm và cả dung dịch nhược trương đã dùng để phá màng tế bào, do đó để thu dịch
dưới dạng cô đặc ta có thể kết hợp phương pháp lọc để thu dịch dưới dạng cô đặc
hơn.
Ưu điểm của phương pháp này là thực hiện nhanh chóng, dễ làm, ít tốn chi phí,
không cần tốn thời gian và công sức để loại bỏ các tạp chất hóa học khác khi sử dụng
các phương pháp hóa học khác, không cần dụng cụ hay máy móc phức tạp…Tuy
nhiên, nhược điểm tồn tại là khi phá màng tế bào trực tiếp trong lên men, lượng
dung dịch cần dùng là rất lớn. Do đó, khó có thể thu lại dịch tế bào với nồng độ cao,
đậm đặc.

Ưu trương Đẳng trương Nhược trương

Hình 9. 9. Hiện tượng di chuyển của nước vào và ra tế bào trong các dung dịch
có nồng độ chất tan khác nhau.

124
 b. Dùng các tác nhân acid hoặc base
Phương pháp hóa học thường sử dụng nhất là dùng acid để thủy phân các
thành phần tế bào. Tuy nhiên, hàm lượng acid quá nhiều có thể dẫn đến những thay
đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào. Trong
một số trường hợp enzyme ổn định ở giá trị pH cao, có thể sử dụng dung dịch kiềm
để phân giải các tế bào vi khuẩn. Xử lý bằng kiềm đã được sử dụng thành công trong
tách chiết ở quy mô nhỏ và lớn các protein vi khuẩn. Ví dụ, enzyme trị liệu, L-
asparaginase, có thể được giải phóng khỏi Erwinia chrysanthemi bằng cách ủ tế bào
ở pH 11,0 - 12,5 trong 20 phút. Thành công của phương pháp này là nhờ vào khả
năng ổn định của sản phẩm mong muốn. Giá trị pH cao có thể làm bất hoạt
protease.Nhưng nếu sản phẩm là acid thì không sử dụng kiềm để xử lý.
c. Dùng chất phá màng
- Phá vỡ tế bào bằng cách sử dụng chất tẩy rửa
Ly giải tế bào dựa trên tác động của chất tẩy rửa được chọn thay thế cho sự
phá vỡ tế bào bằng tác nhân vật lý. mặc dù đôi khi nó được sử dụng kết hợp với đồng
nhất. Chất tẩy rửa phá vỡ các rào cản lipid xung quanh tế bào bằng cách phá vỡ
tương tác lipid - lipid, lipid - protein và protein - protein. Tất cả các tế bào động vật,
vi khuẩn và nấm men có yêu cầu khác nhau cho ly giải tối ưu do sự hiện diện hay
vắng mặt của một rào cằn tế bào. Để phá vỡ tế bào vi khuẩn, chất tẩy rửa có thể được
sử dụng kết hợp với lysozyme. Chất tẩy rửa được phân loại thành ba loại: cation,
anion và không ion. Nhìn chung, chất tẩy rửa không chứa ion và chất tẩy rửa
zwitterionic tác động nhẹ hơn, dẫn đến sự biến tính protein ít khi ly giải tế bào, hơn
các chất tẩy rửa ion và được sử dụng để phá vỡ các tế bào khi nó là rất quan trọng
để duy trì chức năng protein hoặc tương tác. CHAPS, zwitterionic, và các dòng Triton
X (Triton X-100…) là các chất tẩy rửa không chứa ion thường được sử dụng cho các
mục đích này. Ngược lại, các chất tẩy rửa ion như sodium lauryl sulphate hay còn gọi
là sodium dodecyl sulfate, sodium cholate (anion) và cetyl trimethyl ammonium
bromide (cation) là tác nhân mạnh mẽ hòa tan và có xu hướng biến tính protein, do
đó phá hủy protein và chức năng hoạt động. SDS một chất tẩy rửa liên kết ion và
biến tính protein, được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu đánh giá mức độ
protein bằng điện di và Western Blot.
Ngoài việc lựa chọn các chất tẩy rửa, cân nhắc quan trọng khác cho tối ưu ly
giải tế bào bao gồm các bộ đệm, pH, cường độ ion và nhiệt độ. Ngoài ra, chất tẩy rửa
cần phải được sau đó được loại bỏ khỏi sản phẩm và điều này thường liên quan đến

125
việc khử lọc bổ xung, tinh sạch trong tiến trình. Do đó việc sử dụng các chất tẩy rửa
được tránh nếu có thể.
-Dùng dung môi
Nhiều phương pháp hóa học đã được sử dụng để trích xuất các thành phần nội
tế bào từ các vi sinh vật do tính thấm các rào cản bên ngoài. Nó có thể đạt được với
các dung môi hữu cơ mà tác động bằng cách tạo ra các kênh rạch qua màng tế bào
như toluene, ether, phenylethyl, methanol, chloroform…Một trường hợp rất quan
trọng là EDTA, được sử dụng rộng rãi cho làm thấm của các vi sinh vật gram
âm. Hiệu quả của nó là một kết quả để liên kết các cation hóa trị hai của Ca2+, Mg2+,
cùng ổn định cấu trúc của màng bên ngoài, bằng cách liên kết các
lipopolysaccharides với nhau. Một khi các cation được loại bỏ từ EDTA,
lipopolysaccharides được loại bỏ, kết quả làm tăng tính thấm qua các rào cản bên
ngoài.
Ngoài ra các dung môi hữu cơ như acetone chủ yếu hoạt động trên màng tế
bào bằng cách hòa tan của nóphospholipid và bằng cách làm biến tính protein của
nó. Một số dung môi như toluene được biết làphá vỡ vách tế bào nấm. Những hạn
chế của việc sử dụng các dung môi hữu cơ cũng tương tự nhưvới các chất tẩy rửa,
tức là sự cần thiết phải loại bỏ những từ các sản phẩm và biến tínhprotein. Tuy
nhiên, dung môi hữu cơ được dễ dàng hơn để loại bỏ hơn so với chất tẩy rửa.

3.3. Phương pháp sinh học-Enzyme

Một số enzyme thuỷ phân các liên kết nhất định tồn tại trên thành tế bào của
một số vi sinh vật nhất định. Các enzyme này bao gồm lysozyme và enzyme chiết
tách từ tế bào bạch cầu, Streptomyces spp., Micromonospora spp., Penicillium spp.,
Trichoderma spp., và ốc sên. Phương pháp sử dụng enzyme thuỷ phân khá đơn giản,
hiệu quả nhưng tốn kém và sự hiện diện của enzyme có thể làm phức tạp các quá
trình tách chiết phía sau. Do vậy người ta đã phát triển và ứng dụng phương pháp sử
dụng lysozyme cố định nhằm giải quyết được những nhược điểm trên. Ngoài ra,
enzyme cũng có thể được sử dụng như là một phương pháp tiền xử lý để thuỷ phân
một phần thành tế bào trước khi phá vỡ tế bào bằng các phương pháp cơ học.
Lysozyme, được biết đến với tên gọi khác là muramidase hay N-
acetylmuramide glycanhydrolase, là các glycoside hydrolase (EC 3.2.1.17) có khả
năng phá hủy thành tế bào vi khuẩn thông qua việc xúc tác sự thủy phân của liên kết
1,4-beta giữa các tiểu phần N-acetylmuramic acid và N-acetyl-D-glucosamide trong
chitodextrins. Lysozyme tồn tại trong một số chất tiết như nước mắt, nước bọt, sữa

126
người và màng nhầy, trong các bào quan của bạch cầu trung tính nhân đa hình và
trong lòng trắng trứng.

Enzyme hoạt động phân huỷ peptidoglycan (tìm thấy trên thành tế bào của vi
khuẩn, nhất là vi khuẩn gram dương) và thủy phân liên kết glycoside liên kết N-
acetylmuramic acid với carbon số 4 của N-acetylglucosamide bằng cách gắn vào
phân tử peptidoglycan tại vị trí gắn trong một hốc chính nằm giữa hai domain của nó
làm cho cơ chất tạo thành một dạng trung gian dễ phân hủy. Theo nghiên cứu của
Phillips, lysozyme gắn vào một hexasaccharide, cắt phân tử đường thứ 4 trong vòng
hexasaccharide (vòng D) tạo thành cấu trạng nửa ghế. Ở trạng thái này, liên kết
glycoside rất dễ đứt gãy.

4. Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm

4.1. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
Chiết lỏng - lỏng là một phương pháp tách dựa trên sự chuyển pha của các
chất từ pha lỏng này sang pha lỏng khác do tính tan của chúng khác nhau trong hai
pha lỏng riêng biệt, trong đó một pha là dung dịch chứa chất cần chiết, pha còn lại là
dung môi chiết. Đây là phương pháp hiệu quả để tách hoặc loại bỏ các hợp chất
không mong muốn ra khỏi hỗn hợp được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích
vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi
này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết,
như phễu chiết, bình chiết. Hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng trong quá
trình chiết là yếu tố tiên quyết định hiệu quả của sự chiết tách và tiếp đến là sự ảnh
hưởng của nhiệt độ, của pH. Phương pháp chiết này có hai cách là chiết tĩnh (hay còn
gọi là chiết theo mẻ) và chiết theo dòng chảy liên tục. Kiểu chiết tĩnh được ứng dụng
nhiều hơn do rất đơn giản, hiệu quả cao.

Chiết tĩnh

Có thể chiết một lần hoặc chiết nhiều lần tuỳ theo ứng dụng; thường được áp dụng
trong các phòng thí nghiệm hóa học có phạm vi nhỏ, thiết bị thường sử dụng là phễu
chiết. Phương pháp chiết nhiều lần (được sử dụng phổ biến) dùng cùng một loại
dung môi để thu được hoàn toàn lượng chất cần chiết trong mẫu.

Chiết ngược dòng

127
 Phương pháp chiết này được ứng dụng nhiều trong chiết sản xuất công nghiệp
đạt hiệu suất cao. Hai pha lỏng không trộn được vào nhau (hai dung môi, có một
dung môi có chứa chất phân tích) được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc
độ nhất định trong hệ chiết, như phễu chiết, hay bình chiết liên hoàn đóng kín để
chúng tiếp xúc với nhau. Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, cần một
pha đứng yên trong bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi
theo tính chất của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Các ưu và nhược điểm
chung của kỹ thuật chiết là:
- Dùng được cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lượng lớn.
- Lấy riêng chất phân tích, loại được các chất ảnh hưởng, nhất là chất nền của
mẫu.
- Thích hợp cho làm giàu lượng nhỏ chất phân tích (có thể 10-50 lần).
- Phục vụ cho chiết được cả các chất vô cơ và các chất hữu cơ.
- Sản phẩm chiết phù hợp được cho nhiều phương pháp phân tích.

4.2. Phương pháp thẩm tích

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân
tử khác nhau như polysaccharide, nucleic acid, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ
như đường monose, các chất lipid, muối khoáng... do vậy cần kế hợp nhiều biện pháp
để tách loại các chất này. Muối khoáng và đường là các tạp chất có phân tử lượng
thấp, để tách loại chúng người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis).

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất
keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dạng dịch
các tinh thể. Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử
thấp...) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung
dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó
các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có áp suất
thẩm thấu hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa). Trong quá trình tách chiết và
tinh sạch protein, để loại muối ammonium sulphate ra khỏi dung dịch protein thì
cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông
thường người ta hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng
hơn). Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm
được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng
cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào
các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Như vậy, muối sẽ khuyến tán
vào nước hoặc dung dịch đệm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước

128
hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những
đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Bằng cách
thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein, mặc dầu
trong quá trình thẩm tích, nó là dung dịch được pha loãng hơn. Có thể làm giảm bớt
hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là
khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động
học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch.
Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt. Một điều nữa là phương pháp
này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng không phân biệt được
các loại protein với nhau.

Hình 9. 10. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein.

Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi
thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản
protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que
thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi
nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên (hình 5.1).
Muối (NH2)SO4 hòa tan trong nước và bị loại dần. Thời gian thẩm tích có thể từ 24 -
48 giờ, làm thẩm tích lần cuối cùng bằng nước cất. Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi
khuấy dung dịch rửa bằng máy trộn cơ học hay máy trộn từ hoặc là quay chậm túi
nhờ động cơ không lớn. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả
các thao tác ở môi trường lạnh.

129
4.3. Phương pháp kết tủa
Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử
sinh học mà nhất là protein và enzyme. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác
nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch
có chứa protein và enzyme.

a. Phương pháp kết tủa bằng muối

Đây là phương pháp phổ biến để tủa protein và enzyme. Bởi vì 1 protein hoặc
enzyme chứa các nhóm thay đổi khác nhau cho nên khả năng hòa tan của protein,
enzyme tùy thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, enzyme
như pH, nhiệt độ, nồng độ của muối, sự phân cực của dung môi… Các muối
(NH4)2SO4, NaCl được dùng để tủa protein do có thể vừa làm trung hòa điện (do các

ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu) vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate
của phân tử protein mà không làm ảnh hưởng đến hoạt tính và cấu trúc enzyme và
protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau vì vậy
có thể dùng muối ở các nồng độ khác nhau để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp
của chúng. Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in), ở nồng
độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).

Hình 9.11. Mô hình hiện tượng “salting in” và “salting out” khi kết tủa protein bằng
muối.

Đầu tiên, giả thuyết “salting in” ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye -
Huckel. Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang
điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm
các phân tử protein không mang điện tích, làm suy yếu lực hút giữa các phân tử
protein, ổn định các nhóm khác nhau trên phân tử protein do đó làm tăng tính tan
của protein trong dung môi. Giả thuyết của Debye – Huckel cho rằng: tính tan của

130
protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của
cường độ ion trong dung dịch.

Thuật ngữ “salting out” trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi
Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate
hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa (biểu hiện các tương tác kỵ nước,
kết lại và tủa ra khỏi dung dịch).

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:

LgS = B - KI

Trong đó,
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong
dung dịch)
I: cường độ ion của muối.

Hình 9.12. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng
độ muối.

Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế,
khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta có thể lựa
chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu. Độ dốc của
đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ

131
muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của
protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống.

Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp
theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride >
nitrate > thiocyanate.

b. Phương pháp kết tủa bằng các dung môi hữu cơ

Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ đã được sử dụng cả ở qui
mô công nghiệp từ lâu. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa vào quá trình
solvat hóa của nước đối với những protein mang điện tích và sự ưa nước sẽ giảm khi
nồng độ dung môi tăng, do sự giảm hằng số điện môi của dung dịch. Các phân tử
xung quanh vùng kỵ nước của phân tử protein sẽ bị thay thế bởi các phân tử dung
môi, làm cho các phân tử protein tiến gần nhau hơn tạo nên lực tương tác tĩnh điện
và lưỡng cực các phân tử protein sẽ tập hợp lại và kết tủa. Lực đẩy do các phần kỵ
nước của phân tử protein khi này là không đáng kể do chúng bị bao quanh các phân
tử dung môi. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi:

Ln(S/Sw) = (A/RT) × (1/Dw - 1/D)

Trong đó,
S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ
Sw: độ hòa tan của protein trong nước
D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào
Dw: hằng số điện môi của nước
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
A: hằng số khí

Công thức trên cho thấy khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số
điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy

132
nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với bề mặt kỵ nước của phân tử protein có
khả năng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử
dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp (mặc dù một số dung môi như 2–methyl–
2,4–pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và ethanol có thể được sử dụng
ở nồng độ cao.

Hình 9.13. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo
pH

c. Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện

Phương pháp này dựa trên nguyên tác là mức độ tủa của protein phụ thuộc
vào pH của dung dịch protein. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị
proton hóa (thu nhận proton), ở pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carboxyl
trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectric point -
điểm đẳng điện), protein không tích điện, điều này làm giảm tính tan của protein (độ
hòa tan của protein là thấp nhất) vì protein không còn khả năng tương tác với môi
trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường và kết tủa.

d. Tủa protein, enzyme bằng các non - ionic polymer

Nguyên tắc của phương pháp này là cho thêm non–ionic vào trong dung dịch
protein làm cho số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm
xuống. Các chất thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols.

µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj)

Trong đó,
µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần tử i
µi: điện thế hóa học của phần tử i
R: hằng số khí
T: nhiệt độ tuyệt đối
mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j
fii: hệ số tương tác của phần tử i
fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j

Quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein chỉ xảy ra khi dung dịch
protein có nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện. Tuỳ thuộc

133
vào trọng lượng phân tử của protein đó mà chọn loại non – ionic polymer thích hợp
bồ sung vào trong dung dịch protein. Tương tự như trong trường hợp tủa protein
bằng phương pháp điểm đẳng điện, tại 1 giá trị pH nhất định (sau khi thêm non-
ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống.

e. Tủa bằng ion kim loại

Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử
protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung
dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm: (1) Các ion như Mn2+, Fe2+,
Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa
nitrogen; (2) Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid
carboxylic; (3) Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu
huỳnh.

5. Phương pháp sắc ký tinh sạch sản phẩm lên men

Phương pháp sắc ký là quá trình tách liên tục từng phần hỗn hợp các chất do
sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha động và pha tĩnh khi cho pha động
đi xuyên qua pha tĩnh. Dựa vào tính chất của phân tử các chất ta có:

- Dựa vào kích thước phân tử: Sắc ký lọc gel

- Dựa vào trọng lực: theo nguyên tắc phân tử nào nặng thì sẽ di chuyển
nhanh hơn ra khỏi cột lọc gel theo chiều trọng lực.
- Dựa vào lực hút
i. Ái lực: dựa vào ái lực đặc hiệu của protein với các ion gắn
trên cột gọi là sắc ký ái lực (có tính đặc hiệu cao)
ii. Lực ion: Sắc ký trao đổi ion
iii. Lực Val der Waal: Sắc ký hấp phụ

Nếu phân loại sắc ký dựa trên trạng thái vật lí của pha động thì có sắc ký khí
và sắc ký lỏng. Ngoài ra, cũng có thể phân loại theo bản chất của tương tác giữa chất
tan với pha tĩnh, gồm các loại sắc ký hấp phụ, phân bổ, trao đổi ion, lọc gel, ái lực,…
Nếu phân loại sắc ký theo hình dạng pha tĩnh thì có sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc
ký cột,… Sắc ký cũng được phân loại theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh. Nếu
quá trình phân tách dùng pha động có độ phân cực lớn hơn nhiều so với pha tĩnh thì
có sắc ký pha đảo, nếu ngược lại thì có sắc ký pha thường. Trong tinh sạch các sản
phẩm lên men, các phương pháp sắc ký được dùng phổ biến nhất là sắc kí lọc gel, sắc
ký ion, và sắc ký ái lực.

134
5.1. Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion
Chromatography)
Là kỹ thuật dùng để phân tách các hợp phần khác nhau trong hỗn hợp, dựa
trên sự di chuyển khác nhau trong pha động của các chất hòa tan trong hỗn hợp. Cơ
sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng và
phân tử lượng của phân tử có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Cấu tạo của hệ thống
sắc kí lọc gel gồm pha động là dung môi chứa hỗn hợp chất cần phân tách và pha
tĩnh là cột chứa gel.
• Cấu tạo pha động: Dung môi cho pha động trong sắc kí lọc gel được lựa
chọn theo tiêu chí làm giảm thiểu tương tác giữa chất tan và chất mang. Ngoài ra
dung môi phải có độ tinh sạch cao, không phản ứng với pha tĩnh hay cạnh tranh với
cấu tử của hệ thống. Dung môi phải hòa tan được chất cần tách, có độ nhớt thấp,
thấm ướt được bề mặt chất mang. Toluene, tetrahidrofuran dược dùng rộng rãi để
tách các chất có phân tử khối lớn.
• Cấu tạo pha tĩnh: Để đảm bảo cho việc tách protein được tốt, chất rây
phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein. Chất này cũng phải không hòa
tan trong dung môi và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học.
Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn
hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl).
Các gel lọc phân tử được sản xuất với 4 cỡ hạt cùng trong một vòng lọc phân
tử: hạt thô, hạt trung bình, hạt mịn, hạt siêu mịn. Các hạt gel dùng làm chất nhồi cho
sắc kí lọc gel có thể phân thành ba nhóm:
 Chất nhồi cứng: có bản chất là thủy tinh hoặc silicagel. Chúng có đường
kính lỗ cố đính. Nhược điểm của các loại hạt này là không chịu được
kiềm và có tính hấp phụ. Tuy nhiên chúng có thể chịu được áp suất cao.
 Chất nhồi nửa cứng: là loại gel được diều chế bằng phương pháp trùng
hợp với số liên kết ngang lớn, có thể chịu dược các dung môi hữu cơ.
 Chất nhồi mềm: là loại gel dược điều chế bằng phương pháp trùng hợp
với số liên kết ngang nhỏ hơn nhiều so với chất nhồi nửa cứng.

Sephadex là loại gel điển hình thường được sử dụng nhất, là chế phẩm
dextran do các loài vi sinh vật khác nhau như Leuconostoc tạo ra khi chúng được
nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose. Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do
các gốc glucose tạo thành các liên kết glucosid 1,6 nên trọng lượng phân tử của
dextran có thể đạt tới hàng triệu hoặc lớn hơn. Sephadex được tạo thành từ dextran
bằng cách xử lý hóa học (do tác dụng của epichlohidrin) để tạo ra các lưới phân

135
nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử" và chất này trở thành không tan trong
nước. Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.

 Nguyên lý lọc gel: Khi dung môi chuyển động chảy qua cột, các phân tử protein có
kích thước lớn không thể đi vào bên trong lõi của hạt gel, chúng theo dung môi đi
vào các khoảng trống giữa các hạt gel và đi ra khỏi cột trước. Phân tử có kích thước
vừa sẽ bị giữ lại một khoảng thời gian và đi ra chậm hơn. Phân tử nhỏ sẽ khuyếch
tán vào trong các hạt gel theo lỗ khoang trên bề mặt gel, cần thời gian nhiều nhất để
đẩy ra ngoài sau đó mới đi vào thể tích dung môi.

(A) (B)

Hình 9.14. Mô hình về cấu tạo hạt gel (A) và cơ chế lọc gel (B)

 Ưu và nhược điểm:
• Ưu điểm: phương pháp sắc ký lọc gel đơn giản và chi phí thấp, giúp phân
tách tốt những phân tử lớn từ những phân tử nhỏ. Do dung dịch đệm và
hạt gel không tương tác với sản phẩm nên kỹ thuật này thường kết hợp với
kỹ thuật khác có thêm các phần tử riêng biệt mang các đặc tính khác như
độ axit, độ base, sự tích điện và ái lực cho các hợp chất nhất định, và mẫu
không bị mất đi.

136
 • Nhược điểm: phương pháp sắc ký lọc gel không áp dụng được cho lượng
thể tích mẫu lớn, độ chính xác chưa cao, chỉ tách được sản phẩm có kích
thước khác nhau còn sản phẩm có kích thước giống nhau thì phân tách
chưa được.

5.2. Sắc kí ái lực (Affinity Chromatography)

Sắc ký ái lực là phương pháp tách các hỗn hợp hóa sinh và dựa trên sự tuơng
tác sinh học cụ thể như là giữa kháng nguyên và kháng thể, enzyme và cơ chất, hoặc
receptor và ligand. Sắc ký ái lực kết hợp khả năng phân loại kích thước của sắc ký lọc
gel với khả năng tạo sắc ký có liên kết nghịch với một tập hợp phân tử. Phương pháp
sắc ký ái lực có ưu điểm là tính chọn lọc rất cao có thể dùng để tách phân tử đặc hiệu
với số lượng nhỏ trong một hỗn hợp các chất sinh học. Sắc ký ái lực thường dùng để
tinh sạch một loại enzyme nhất định hoặc tinh chế các protein tái tổ hợp.
Cơ cở của phương pháp sắc kí ái lực là quá trình tách dựa vào ái lực khác nhau
của các cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ rắn, nhờ đó mà các chất được tách riêng ra
theo tuần tự chất có khả năng hấp phụ yếu thì ra trước, chất có khả năng hấp phụ
mạnh thì ra sau. Trong đó lực hấp phụ bao gồm:
 Lực van der wall, là lực tương tác giữa các phân tử.
 Lực tĩnh điện, là lực hình thành khi trong phân tử có sẵn điện trường.
 Lực liên kết hóa học, là khi giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ hình
thành lực liên kết hóa học.
 Lực liên kết hydro, là khi chất hấp phụ là chất phân cực hấp phụ các chất
có nhóm cho proton.

Cơ chất Ligand
Enzyme Substrate, cofactor
Antibody Antigen, Virus, Cell
Polysaccharide, glycoprotein Lectin
Nucleic acid binding protein Nucleic acid
Hormone receptor Hormone
(Cơ chất và ligand trong sắc ký ái lực)

Cấu tạo của hệ thống sắc kí ái lực gồm pha động, là dung dịch chứa chất cần
tinh sạch và pha tĩnh là hệ thống ma trận gel, được gắn với các ligand hoạt động đặc
hiệu như NHS-, EAH, ECD… bằng liên kết cộng hóa trị. Các gel trong pha tĩnh hiện
nay thường dùng là sepharose, superpose …

137
 Đầu tiên các ligand liên kết cộng hóa với các hạt gel không hòa tan như các hạt
agarose, sau đó các hạt gel được nhồi vào cột sắc ký. Hỗn hợp chứa protein cần tinh
sạch sẽ được cho vào cột khi đó sẽ xảy ra sự tương tác giữa các protein với các
ligand được cố định trên trên các hạt gel, các phân tử protein liên kết càng chặt thì
được giữ lại trong cột lâu hơn, những chất tương tác yếu với hạt gel sẽ chảy qua cột
nhanh hơn. Sự tương tác này có tính đặc thù và thuận nghịch. Protein được tách khỏi
hạt gel bằng cách làm giảm lực liên kết của chúng bằng các phương pháp rửa giải
khác nhau.
Sự tương tác sinh học giữa ligand và các phân tử cần tinh sạch có thể là kết
quả của liên kết tĩnh điện, tương tác kỵ nước, lực vander wall hoặc liên kết hydro. Để
rửa giải có thể sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng hoặc là không cạnh tranh bằng
cách thay đổi pH, nồng độ ion hoặc là sự phân cực để phá vỡ liên kết.

Hình 9.15. Cơ chế sắc lý ái lực.

5.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion là phương pháp tách riêng các chất khác nhau dựa vào
hiện tượng trao đổi thuận nghịch các ion pha động với các ion của pha tĩnh (chất
trao đổi ion hay còn gọi là ionit). Sắc ký trao đổi ion thường được dùng để tinh sạch
các chất có hoạt tính sinh học. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác
nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác phương pháp
này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc
dung dịch đệm loãng và các nhân trao đổi ion. Có hai loại sắc ký trao đổi ion: trao đổi
anion và trao đổi cation.
Sắc ký ion bao gồm pha động, thường ở dạng lỏng với pH thích hợp để giữ
vững cấu trúc không gian của protein và pha tĩnh là vật liệu trao đổi ion chứa trong
cột thủy tinh, có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion. Pha tĩnh thường là những
chất trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose, chất gel dextran có lưới
phân nhánh hay chất nhựa polystirol thường kết hợp các nhóm ion hóa. Các chất
trao đổi ion có giá thể là cellulose, sephadex, molselect thường dùng để tách protein,

138
enzyme. Các chất trao đổi ion có giá thể là polystirol thường dùng để tách peptide có
trọng lượng phân tử nhỏ.
Pha động sẽ được cho qua cột sắc ký chứa đầy pha tĩnh, phần tử mang điện
tích sẽ được gắn thuận nghịch với pha tĩnh mang điện tích trái dấu, chất điện tích
cùng dấu hay trung hòa điện sẽ lắng xuống đáy cột và được thu lấy. Phần tử sẽ không
tách khỏi cột cho đến khi có sự thay đổi pH trong dung dich pha động hay lực ion
mạnh đi qua cột. Khi thay đổi dần pH, các chất sẽ được rút chiết từ từ một loại riêng
biệt, do thay đổi độ pH làm điện tích bề mặt thay đổi, hoặc có thể dùng dung dịch
đệm để trung hòa điện tích của pha tĩnh, khi đó protein cũng được rửa giải.
Cơ chế trao đổi ion
• Trao đổi cation. Ví dụ giá thể là sephadex thì chất trao đổi ion là loại CM-
sephadex. Trên giá thể sephadex có nhóm COO-: R- O-CH2-COOH phân ly
thành COO-
• Trao đổi anion. Ví dụ giá thể là cellulose thì aniot DEAE – cellulose là chất
trao đổi ion.

139
Hình 9.16. Cơ chế sắc ký trao đổi ion.

140
CHƯƠNG 10. XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN
1. Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý
1.1. Giới thiệu
Các qui trình lên men đều sử dụng nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm
mong muốn khác nhau đồng thời thải ra một lượng đáng kể chất thải. Chất thải bao
gồm các hợp chất vô cơ, hợp chất hữu cơ, tế bào vi sinh vật (chủng nuôi cấy) và
nhiều chất rắn lơ lửng. Các thông số dùng để đánh giá chất lượng nước thải bao gồm:
1. BOD (Biological Oxygen Demand)
2. COD (Chemical Oxygen Demand)
3. Độ pH
4. Nhiệt độ
5. Hàm lượng nitrogen tổng
6. Hàm lượng nitrogen ammonia
7. Hàm lượng chất rắn lơ lửng (TSS, total suspended solid)
8. Mùi
9. Màu
10. Hàm lượng các kim loại nặng
11. Mật độ vật sinh vật gây bệnh

Tùy theo thành phần và hàm lượng các chất trong chất thải mà xây dựng
những phương án xử lý khác nhau. Trước đây, người ta thường xử lý theo cách tự
nhiên như tưới tiêu cho một khu vực lớn rừng trồng đối với chất thải lỏng hoặc chôn
dưới đất đối với chất thải rắn. Do yêu cầu về môi trường ngày càng nghiêm ngặt và
lượng chất thải ngày càng lớn nên hiện nay toàn bộ chất thải của qui trình lên men
phải được kiểm soát và xử lý chặt chẽ.
Trước khi xây dựng qui trình xử lý chất thải cần phải hiểu rõ tiêu chuẩn do địa
phương qui định và đặc tính của loại chất thải cần xử lý từ đó xây dựng phương cách
xử lý khác nhau.
Có ba phương pháp thường được dùng để xử lý chất thải của qui trình lên
men: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học. Đặc tính
của các qui trình xử lý này như sau:
1. Xử lý sơ cấp: dùng phương pháp vật lý, phương pháp hoá học- lắng, đông
tụ
2. Xử lý thứ cấp: dùng Phương pháp sinh học (bùn hoạt tính) sau khi xử lý sơ
cấp.

141
 3. Xử lý cấp 3: dùng phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học (chẳng hạn
dùng microstrainers, lọc cát và dùng để tưới cỏ) để cải thiện chất lượng của dịch thải
từ các giai đoạn trước.
4. Bùn hoạt tính và xả bỏ; dùng phương pháp vật lý, hóa học và sinh học.
Dùng phương pháp xử lý hiếu khí để kiểm soát bùn (làm cho bùn thải trở nên dễ
dàng bị khử nước).

(A) (B) (C) (D)

Bể chứa nước thải từ
các công đoạn của
qui trình sản xuất

Xử lý vật lý

Gaïn caën laéng, taùch loaïi

Bể cân
bằng,
Chỉnh pH

Bể xöû lyù yeám khí

Bể xöû lyù hieáu khí

Bể laéng

Maùy eùp buøn hoaït tính

Nöôùc ñaõ
ñöôïc xöû lyù

Hình 10.1. Sơ đồ qui trình xử lý chất thải lỏng.

142
1.2. Các phương pháp xử lý chất thải
2. 1. Phương pháp vật lý
Việc tách bỏ các chất rắn lơ lửng bằng trong nước thải bằng phương pháp vật
lý trước khi xử lý sinh học sẽ làm giảm đáng kể giá trị BOD. Đối với hầu hết các qui
trình lên men, tế bào vi sinh vật bị tách khỏi dịch thải trong quá trình thu hồi sản
phẩm. Trong một số trường hợp khi tách bỏ tế bào, người ta kết hợp dùng chất trợ
lọc do vậy cả tế bào và chất trợ lọc đều là chất thải, chất thu hồi có thể được thực
hiện theo hai cách căn bản sau:
- Loại bỏ chất thải mà không cần thông qua xử lý
- Lượng chất thải có thể sẽ giảm xuống thống qua hệ thống khử nước như
lọc áp, ly tâm, lọc quay chân không… Chất thải sau khi được ép có thể được xử lý
bằng phương án chôn dưới đất.
Chất thải rắn được phát sinh trong một số qui trình trước khi cấy giống. Đối
với trường hợp của nhà máy sản xuất bia, một lượng rất lớn chất thải từ ngũ cốc,
malt sau khi sử dụng được loại ra khỏi qui trình. Theo tính toán cứ 180 L bia được
sản xuất thì có 5 kg chất thải rắn dạng này được thải ra. Các qui trình xử lý sơ cấp
theo phương pháp vật lý bao gồm các công đoạn sau:
a. Lọc để tách bỏ phần tử lơ lửng và nổi trong dịch
b. Nghiền nhỏ để giảm kích thước các hạt
c. Thổi qua các kênh với tốc độ không đổi (0,3 m/s) để loại bỏ các hạt cát sạn
để phòng ngừa sự gây hại lên cây trồng (khi dùng cho bón cây) hoặc các qui trình
sau đó.
d. Dùng các bồn lắng để tách bỏ những hạt tử lơ lửng nhỏ. Hê thống này được
thiết kế để vận hành liên tục với thời gian lưu dịch khoảng từ 6-15 giờ. Hệ thống các
bồn lắng này có thể tách tới 70% các chất rắn lơ lửng và phụ thuộc vào đặc tính của
chất thải, có thể tách đến 40% hàm lượng BOD. Trong một số trường hợp có thể
dùng thêm chất trợ lắng. Trong giai đoạn xử lý bậc ba, Phương pháp vật lý được
dùng để lọc các chất còn lại, nhằm nâng cao chất lượng chất thải. Một số loại lọc có
thể được dùng là: microstraines, lọc cát chảy chậm, lọc cát ngược dòng … tốc độ lọc
thay đổi từ 3m3/m2/ngày đối với lọc cát chậm và đạt đến 700m3/m2/ngày đối với
dạng lọc microstrainers. Thông qua phương án này có thể tách bỏ tới 50-70% chất
lơ lửng và khoảng 30-50% BOD.

2. 2. Phương pháp hóa học

Các phần tử lơ lửng kích thước nhỏ có thể bị lắng tụ khi dùng các chất trợ lắng
thông dụng như Fe(SO4), Fe2(SO4)3, Al2(SO4)3, Ca(OH)2, và các chất điện giải polymer.
Chuẩn bị chất trợ lắng với nồng độ thích hợp trong một bồn sau đó bổ sung vào qui

143
trình xử lý nhằm gây lắng tụ các hạt tử kích thước nhỏ đang lơ lửng trong dịch chất
thải. Bùn lắng này sau đó được khử nước và đưa vào giai đoạn xử lý sau. Do kích
thước của các hạt tử này nhỏ nên đòi hỏi thời gian lắng tụ dài hơn, vậy nên cần phải
thiết kế hệ thống với một loạt các bồn có kích thước lớn.
2. 3. Phương pháp sinh học
Sử dụng vi sinh vật (vi khuẩn) để phân hủy sinh hóa các hợp chất hữu cơ, biến
các hợp chất có khả năng phân hủy thành những chất ổn định, sản phẩm cuối cùng là
CO2, nước và các chất vô cơ khác. Hầu hết các chất thải hữu cơ đều bị phân hủy sinh
học diễn ra trong điều kiện hiếu khí hoặc/và kỵ khí.

1. Phương pháp xử lý hiếu khí

- Dùng hệ thống màng film sinh học với dòng chảy nhỏ giọt (trickling filters).
Sinh khối sinh vật trên màng film sử dụng nguồn oxygen từ không khí thổi từ dưới
lên và xử lý chất thải khi đi qua bề mặt màng film từ trên xuống làm giảm BOD. Mục
đích của hệ thống này là tăng cường bề mặt tiếp xúc của màng biofilm với không khí
và dòng chất thải. Theo cách này có thể làm giảm từ 75-95% giá trị BOD và 90-95%
chất rắn lơ lửng khi nạp tốc độ dịch thải 0,06 - 0,12 kg BOD/m3/ngày.

Hình 10.2. Hệ thống màng sinh học xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí.

144
 -Dùng hệ thống tháp. Do phương pháp dùng màng film sinh học với dòng
chảy nhỏ có diện tích đặc trưng và khoảng không thông thoáng nhỏ do vậy công suất
thấp không đáp ứng được yêu cầu xử lý lượng lớn chất thải. Khi mở rộng qui trình
phải tốn nhiều mặt bằng và các hồ lưu chứa. Hệ thống tháp với chiều cao khoảng từ
6-9m làm bằng nhiều module đa diện bằng plastic nhẹ có thể giải quyết vấn đề trên.
Do cấu trúc mở nên tạo được độ thông thoáng tốt (90-98%) và diện tích bề mặt đặc
trưng đặt đến 100-300 m2/m3, đồng thời có thể làm giảm BOD tốt. Với tải BOD 3,2
kg/m3/ngày có thể giảm 50% và có thể giảm đến 70% với tải BOD 1,5 kg/m3/ngày.
- Hệ thống lọc hiếu khí sinh học. Phát triển trên cơ sở của biofilm reactor
(phương pháp 1). Phương pháp này bao gồm các bể chứa có hệ thống khí xuyên qua
theo dòng từ dưới lên tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tốt. Sự kết hợp cả qui
trình xử lý hiếu khí và lọc này cho phép làm giảm BOD và NH3 cùng với chất thải rắn
do vậy không cần phải đầu tư nhiều bồn lắng
- Hệ thống đĩa quay tiếp xúc sinh học
- Hệ thống các trống quay. Một hệ thống dạng trống quay lớn do các ống hoặc
quả hình cầu làm bằng plastic được kết lại với nhau. Dạng này tương tự như dạng
đĩa, có thể vận hành với tải BOD 6 kg/m2/ngày.
- Hệ thống bể dịch. Đây là một phương pháp mới. Giá thể có diện tích bề mặt
lớn trên đó có màng film sinh học với lượng sinh khối lớn cho phép xử lý chất thải
với tốc độ cao.
- Hệ thống bùn hoạt tính. Hệ thống này bao gồm nguồn cung cấp không khí và
khuấy trộn chất thải trong khi có sự hiện diện của vi sinh vật xử lý ở dạng huyền phù
trên các phần tử hữu cơ dạng hạt trong dịch gọi là bùn hoạt tính. Nước thải từ bể
lắng có chứa các chất hữu cơ hòa tan và các chất lơ lửng làm nơi khu trú của vi
khuẩn, giúp vi khuẩn phát triển, thường được gọi là bùn hoạt tính. Vi sinh vật hấp
thụ và oxy hóa các chất có trong nước thải chuyển hóa chúng thành các chất trơ. Qui
trình hoạt động theo sơ đồ trong Hình 10.3 bao gồm:
+ Khuấy trộn nước thải cần xử lý với bùn hoạt tính
+ Sục khí kết hợp với khuấy trộn để cung cấp oxy cho quá trình sinh hóa
+ Làm trong nước và tách bùn hoạt tính ra khỏi hỗn hợp bằng bể lắng 2
+ Tuần hoàn lại lượng bùn cần thiết từ đáy bể lắng đợt 2 vào bể hiếu khí
+ Xả bùn dư và xử lý bùn
Ưu điểm của phương pháp này là có thể xử lý được 80-90% thành phần hữu
cơ. Tuy nhiên thành phần rắn lơ lửng tồn tại sau quá trình cao (bùn hoạt tính) có thể
gây mùi khó chịu, cần phải có biện pháp xử lý thích hợp.

145
 Hình 10.3. Qui trình xử lý chất thải bằng phương pháp hiếu khí qua hệ thống
bùn hoạt tính.
2. Phương pháp xử lý yếm khí
Xử lý yếm khí là quá trình sinh học phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải
trong điều kiện yếm khí. Quá trình này sinh ra khí CH4, CO2, NH3 và các sản phẩm vô
cơ khác.
Xử lý yếm khí đựơc thực hiện nhằm giải quyết chất thải hữu cơ bao gồm một
số lý do sau:
- Tăng cường khả năng xử lý trong giai đoạn hiếu khí
- Giảm định mức sử dụng điện năng trên cùng một đơn vị BOD
- Sản phẩm cuối của quá trình xử lý này là hữu ích như bùn tiêu hủy được
- Các chất hữu cơ được cố định theo dạng ổn định
- Có sự biến đổi đặc tính kết hợp nước làm cho bùn dễ bị khử nước hơn
- Lượng vi sinh vật trong bùn hoạt tính giảm do vậy dễ kiểm soát bùn hơn.
- Mức độ phát triển của vi sinh vật thấp do vậy không cần bổ sung các chất
dinh dưỡng thiếu trong nước thải.
Quá trình chuyển hóa trong giai đoạn xử lý yếm khí bao gồm:
+ Quá trình phân hủy (hydrolysis): thủy phân những chất có phân tử lượng
cao thành các monomer và polymer có phân tử lượng thấp hơn nhờ hệ enzyme
trong tế bào vi sinh vật.

146
 + Quá trình acid hóa (Acidogenesis): vi sinh vật lên men các sản phẩm của quá
trình thủy phân thành các chất dễ bay hơi như acetic acid, formic acid, propionic
acid, rượu, NH3, CO2, H2…
+ Quá trình acetate hóa (Acetogenesis): chuyển hóa các sản phẩm của quá
trình acid hóa thành acetic acid để thuận lợi trong việc methane hóa.
+ Quá trình methane hóa (Methanogenesis): phân hủy các chất đơn giản của
giai đoạn trước thành CH4 và CO2.

2. Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp
Ví dụ trong trường hợp qui trình lên men sản xuất amino acid phục vụ cho
lãnh vực thực phẩm. Các nguyên liệu chính sử dụng có nguồn gốc tự nhiên như tinh
bột khoai mì (để đường hóa thành glucose), mật rỉ mía đường và nguyên liệu phụ
như MgSO4, urea, H3PO4, các vitamin…. Điều cần lưu ý là trong qui trình lên men, đặc
biệt là lên men trong lãnh vực thực phẩm toàn bộ nguồn nguyên liệu đưa vào sử
dụng đều an toàn không chứa các chất độc hại và đạt tiêu chuẩn thực phẩm (food
grade). Do vậy, tất cả các nguồn phát thải (nếu có) thì trong thành phần của chất thải
không tồn tại các chất gây độc hại (ví dụ như kim loại nặng, cyanua…).
1. Liệt kê và phân loại các chất thải phát sinh trong quá trình lên men
1. Chất thải rắn: Nguyên liệu rắn rơi vãi, các vỏ bao bì chứa nguyên liệu (bao
giấy, bao nylon...)
2. Chất thải lỏng: Các nguyên liệu dạng lỏng bị rò rỉ, dịch môi trường sau lên
men đã được thu hồi sản phẩm bao gồm cả sinh khối tế bào vi sinh vật…, các loại
dịch NaOH, H2SO4 loãng dùng để vệ sinh thiết bị …
2. Xác định tiêu chuẩn cần xử lý
Xử lý chất thải đạt theo tiêu chuẩn qui định của Việt nam
3. Chọn lựa phương pháp xử lý thích hợp
1. Đối với chất thải rắn:
a. Các nguyên liệu rắn rơi vãi: thu gom và pha loãng, tận dụng
b. Các bao bì: phân loại và bán phế liệu để tái chế
2. Đối với chất thải lỏng:
a. Đối với nguyên liệu dạng lỏng bị rò rỉ: xử lý rò rỉ; thu gom và đưa về
trạm xử lý nước thải.
b. Đối với dịch lên men chứa sinh khối tế bào sau khi đã thu hồi sản
phẩm: có thể tận dụng theo hai hướng:
b1. Dùng làm phân bón dạng lỏng: Bổ sung các thành phần dinh
dưỡng nhất định cần thiết cho cây trồng, điều chỉnh pH và hàm lượng N, P, K phù
hợp rồi sử dụng để bón cho cây trồng.

147
 b2. Dùng làm nguồn đạm cung cấp cho chế biến thức ăn chăn
nuôi gia súc: Tiến hành tách sinh khối tế bào và sấy để giảm độ ẩm đến một mức
nhất định. Sản phẩm sinh khối tế bào sau khi sau được sử dụng làm nguồn nguyên
liệu quí cung cấp để chế biến làm thức ăn cho chăn nuôi gia súc hoặc cho lĩnh vực
nuôi trồng thủy sản.

3. Triết lý “không phát thải”

Với khẩu hiệu “không phát thải” (Zero emission) trong qui trình sản xuất, hiện
nay nhiều công ty đã áp dụng chương trình zero emmission một mặt nhằm giảm
thiểu gánh nặng xử lý chất thải không thân thiện với môi trường, một mặt giúp làm
giảm chi phí sản xuất.
Chất thải phát sinh trong qui trình sản xuất suy cho cùng là từ chính các
nguyên-vật liệu đầu vào do sử dụng không hiệu quả tạo ra. Lượng chất thải phát sinh
trong qui trình càng nhiều đồng nghĩa với nguồn nguyên vật liệu thất thoát càng cao.
Do đó, việc giảm thiểu nguồn phát thải giúp tiết kiệm được nguồn nguyên vật liệu
đồng thời giảm chi phí xử lý chất thải phát sinh và như vậy sẽ giúp hạ giá thành sản
xuất của sản phẩm. Để đạt được điều này cần phải đầu tư cho việc cải tiến công nghệ
để tăng hiệu quả sản xuất và quá trình quản lý chuỗi sản xuất từ khâu thu mua
nguyên vật liệu, hoạch định tạo sản phẩm và đến khâu cung cứng sau cùng.
Ngoài ra, trong một số trường hợp, chất thải phát sinh trong quá trình cần
phải tìm cách tái chế/ tái sử dụng để vừa làm giảm chi phí xử lý vừa tạo được giá trị
gia tăng cho chính các chất thải này.

148
CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG

1. Bài tập
Bài 1
Trong một thí nghiệm nuôi cấy nấm men để thu sinh khối theo phương pháp
mẻ. Theo yêu cầu, lượng sinh khối thu được phải đạt 5 tấn/mẻ trong thời gian nuôi
cấy là 30 giờ. Hiệu suất tổng hợp sinh khối là 56%, thể tích dịch lên men là 100 KL,
tỷ lệ nạp giống là 0,1% (t/KL), nồng độ đường glucose còn lại là 0,5 g/dl.
a. Lượng đường cần thiết đưa vào hệ thống để thu nhận đủ lượng sinh khối
trên?
b. Tính  trung bình c ủa cả quá trình.
c. Với nồng độ rượu đo được sau quá trình lên men là 3% (v/v), hãy cho biết
tốc độ sản xuất rượu đặc trưng của nấm men trong thí nghiệm trên (d
EtOH: 0,789 g/ml).
Bài 2
Trong nuôi cấy theo phương pháp fed-batch thu nhận sản phẩm là amino acid
của một chủng vi khuẩn, người ta thực hiện trong nồi lên men với thể tích môi
trường ban đầu là 50 KL, nồng độ đường glucose ban đầu trong môi trường 2,0 g/dl.
Thể tích nồi lên men là 100 KL, với công suất tới hạn là 80%, D trung bình là 0,0375
hr-1. Lúc ngừng qui trình, nồng độ sản phẩm là 3,6 g/dl, nồng độ sinh khối là cb = 1,2
g/dl, hiệu suất tổng hợp tế bào là 20%.
1. Thời gian nạp liệu cho hệ thống?
2. Tính nồng độ đường trong dịch nạp vào hệ thống.
3. Hãy tính hiệu suất sinh sản phẩm?
4. Biết rằng, hàm lượng C trong sản phẩm là 42%. Hãy nhận xét về
hiệu suất sử dụng carbon hữu ích trong mẻ lên men nói trên.

149
Bài 3
Kết quả theo dõi tiến trình lên men thu nhận amino acid của một chủng vi
khuẩn theo phương pháp fed-batch được ghi nhận theo bảng sau (Bảng 11.1). Thể
tích dịch lên men khi bắt đầu nuôi cấy V0=20 KL, nồng độ đường nạp bổ sung cf = 25
g/dl.
1. Hãy nhận xét về tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng theo giai đoạn.
2. Nhận xét hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm của tiến trình (thực tế).
3. Hiệu suất tế bào theo từng giai đoạn nuôi cấy, Có nhận xét gì?

Bảng 11.1. Số liệu theo dõi quá trình lên men

CT cb cp sr Sf
[Hr] [g/dl] [g/L] [g/dl] [t]
0 0.20 1.0 5.00 0.00
2 0.30 6.5 2.50 0.00
4 0.50 11.0 0.90 0.00
6 1.10 22.5 0.40 1.20
8 1.33 30.0 0.30 1.70
10 1.39 38.5 0.35 1.90
12 1.45 45.0 0.20 2.30
14 1.44 50.0 0.32 2.50
16 1.43 55.0 0.40 2.60
18 1.42 58.5 0.30 2.67
20 1.40 60.5 0.10 2.70

Ghi chú: CT: thời gian nuôi cấy; cb: nồng độ sinh khối; Sf: lượng đường nạp bổ
sung tích lũy; cp: nồng độ sản phẩm; sr: nồng độ đường còn lại trong môi trường
nuôi cấy.

Bài 4
Trong nuôi cấy sản xuất bia với thể tích 30 KL, người ta ghi nhận có sự tạp
nhiễm xảy ra và ở các giờ nuôi cấy thứ 22 và 26 số lượng tế bào tạp nhiễm tương
ứng là 23 và 481 trong 1 ml dịch nuôi cấy.
1. Hãy tính tg (thời gian thế hệ) của chủng tạp nhiễm trên
2. Ở thời điểm nào của quá trình nuôi cấy, người ta bắt đầu có khả năng phát
hiện được tạp nhiễm trên đĩa pettri (1 ml).

150
 3. Tạp nhiễm có thể xảy ra từ lúc nào?
4. Khi dừng nuôi cấy (giờ thứ 30), có bao nhiêu tế bào tạp nhiễm trong 1 ml
dịch.

Bài 5
Trong qui trình lên men sản xuất glutamic acid sử dụng glucose làm nguồn
carbon. Cứ 1 mol glucose được sử dụng để chuyển thành glutamic acid thì có 193,4
Kcal nhiệt lượng được phóng thích ra môi trường nuôi cấy, do vậy cần dùng nước
giải nhiệt để kiểm soát nhiệt độ của hệ thống. Biết rằng nhiệt độ nguồn nước giải
nhiệt cấp vào là 28oC, sau khi thoát ra khỏi hệ thống là 31oC, thiết diện trao đổi nhiệt
là 20 m2. Lượng đường tiêu thụ tại thời điểm cao nhất là 2 t/hr.
1. Hãy tính lưu lượng nước giải nhiệt tối thiểu cần thiết để có thể kiểm soát
được nhiệt độ nuôi cấy (37oC).
2. Tính hiệu suất trao đổi nhiệt của thiết bị

2. Bài giải

Bài 1
Tóm tắt:
Lên men phương pháp mẻ; X = 5 t/B, Yx/s = 56%, Vinn = 100 KL;
Tỷ lệ nạp giống Is = 0,1 %, thời gian nuôi cấy CT = 30 giờ, nồng độ đường
glucose còn lại sr = 0,5 g/dl.
1. Lượng glucose cần
Do Yx/s = X/Su, , trong đó Su là lượng đường đã sử dụng
 Su = X/Yx/s = 5/0,56 = 8,93 t.
Sr = sr×V = 0,5.10-2 (t/KL) × 100KL = 0,5 t.
S = Su + Sr = 8,93 + 0,5 = 9,43 t.
2. Tốc độ tăng trưởng đặc trưng:
Với tỷ lệ nạp giống 0,1 % (t/KL) cho nồi lên men có thể tích dịch là
100KL thì lượng sinh khối giống mầm Xo= 0,1/100 × 100 = 0,1 t.
µ = (LnX/X0)/t = (Ln(5/0,1)/30 = 0,130 hr-1
3. Lượng ethanol tổng hợp được:
P = cp × V × d = 3% × 100 KL × 0,789 g/ml = 2,367 t.
Yp/x = P/X = 2,367t/5t = 47,34%
Ta có tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng ρ = µ × Yp/x
 ρ = 0,130 × 0,4734 = 0,062 hr-1.
Bài 2

151
Tóm tắt:
Fed-batch, Vo = 50 KL, si = 2,0 g/dl, Vfer = 100 KL, f = 0,8; Độ pha loãng trung
bình Daver = 0,0375 hr-1, cp = 3,6 g/dl, x = 1,2 g/dl, Yx/s = 20%.

1. Thời gian nạp liệu

Vinn = 100 × 0,8 = 80 KL,
Vf = 80 - 50 = 30 KL,
Daver = Faver / V
 F = D × V = 0,0375 × 80 = 3 KL/Hr,
Do vậy, Tf = 30/3 = 10 giờ.

2. Nồng độ đường feed

Tổng đường feed: Sf = Su - Si = (1,2 × 80/0,2 - 2,0 × 50)/100 = 3,8 t
cf = 3,8/30 = 12,67 g/dl
3. Hiệu suất sinh thổng hợp sản phẩm
P = 3,6× 80 = 2,88 t.
Yp/s = P/Su = 2,88/4,8 = 60%.
4. Hiệu quả sử dụng carbon hữu ích
Lượng carbon đã sử dụng C = 6 × 12/180 × 4,8t = 1,92 t
Lượng C ở sản phẩm = 42/100 × 2,88 = 1,21 t
Lượng C ở sinh khối = 12/24,6 × 1,2 × 80/100 = 0,467 t
Hiệu quả sử dụng carbon = (1,21 + 0,467)/1,92 × 100 = 87,4%
Nhận xét: Hiệu suất sử dụng carbon hữu ích là 87,3%, như vậy một phần
carbon không tham gia cấu tạo vào trong sản phẩm mục tiêu cũng như trong sinh
khối. Điều này có thể do (1) Một phần carbon thất thoát do CO2 sinh ra trong quá
trình lên men, (2) một phần carbon tham gia trong cấu trúc của các sản phẩm phụ,
(3) một phần carbon tham gia trong cấu trúc sinh khối nhưng một lượng sinh khối tế
bào bị chết, vở ra trong quá trình lên men nên không được nhận diện để tính toán.
Cũng bàn phải bàn bạc thêm rằng, lượng carbon đầu vào trong trường hợp này chỉ
tính trên lượng được glucose thực tế trong môi trường, tuy nhiên trong môi trường
ban đầu có thể có những thành phần khác có chứa carbon như meat extract, yeast
extract,…nên lượng C thực chất sẽ lớn hơn lượng tính toán trên.

Bài 3
Tóm tắt:
Lên men theo phương pháp fed-batch; Vo = 20 KL; cf = 25 g/dl.
Vinn: Thể tích dịch trong nồi lên men; Vinn = Vo + Vf

152
Vf: Thể tích dịch đường nạp bổ sung vào trong quá trình nuôi cấy; Vf = Sf/cf
Su: Lượng đường đã được sử dụng; Su = So + Sf - Sr
So: Lượng đường trong môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy, So = so×Vo; so = sr tại thời
điểm bắt đầu nuôi cấy.
Sr: Lượng đường còn lại trong quá trình nuôi cấy; Sr = sr × Vinn
P: Lượng sản phẩm thu được; P = cp × Vinn
B: Lượng sinh khối thu được; B = cb × Vinn

T ốc– đlnBt1)/(t2 – t1)

t2 ộ tăng trư
Hiệu suất sản phẩm của tiến trình Yp/s = (Pt - Po)/(Sut - Su0) × 100
Hiệu suất sinh khối theo từng giai đoạn Yb/sHr = (Bt2 - Bt1)/(Sut2 - Sut1) × 100

Bảng 11. 2. Tính toán đánh giá kết quả lên men

CT cb cp sr Sf Vf Vinn Sr Su P B µ Yp/s Yb/sHr

[Hr] [g/dl] [g/L] [g/dl] [t] [KL] [KL] [t] [t] [t] [t] [hr-1] [%] [%]
0 0.20 1.0 5.00 0.00 0.00 20.0 1.00 0.00 0.02 0.04 0.000 ║ ║
2 0.30 6.5 2.50 0.00 0.00 20.0 0.50 0.50 0.13 0.06 0.203 22.00 4.00
4 0.50 11.0 0.90 0.00 0.00 20.0 0.18 0.82 0.22 0.10 0.255 24.39 12.50
6 1.10 22.5 0.40 1.20 4.80 24.8 0.10 2.10 0.56 0.27 0.502 25.61 13.49
8 1.33 30.0 0.30 1.70 6.80 26.8 0.08 2.62 0.80 0.36 0.134 29.93 16.12
10 1.39 38.5 0.35 1.90 7.60 27.6 0.10 2.80 1.06 0.38 0.037 37.19 14.80
12 1.45 45.0 0.20 2.30 9.20 29.2 0.06 3.24 1.31 0.42 0.049 39.92 9.07
14 1.44 50.0 0.32 2.50 10.00 30.0 0.10 3.40 1.50 0.43 0.010 43.48 5.30
16 1.43 55.0 0.40 2.60 10.40 30.4 0.12 3.48 1.67 0.43 0.003 47.49 3.66
18 1.42 58.5 0.30 2.67 10.68 30.7 0.09 3.58 1.79 0.44 0.001 49.60 0.94
20 1.40 60.5 0.10 2.70 10.80 30.8 0.03 3.67 1.86 0.43 -0.005 50.24 -4.88

153
 Nhận xét:
1. Tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng tăng mạnh trong giai đoạn đầu (lag
phase) ngay sau khi bắt đầu nuôi cấy và đạt cực đại ở giờ nuôi cấy thứ 6, sau đó giảm
mạnh và dần đến 0 ở giờ nuôi cấy thứ 14. Từ giờ nuôi cấy thứ 16 trở đi, chủng hầu
như không tăng trưởng, tỷ lệ tế bào sinh ra (nếu có) thấp hơn tỷ lệ tế bào mất đi nên
tốc độ tăng trưởng đặc trưng có giá trị âm ở vào giai đoạn cuối của quá trình nuôi
cấy. Như vậy, nếu mục đích lên men là để thu sinh khối thì nên dừng mẻ lên men này
ở khoảng thời gian nuôi cấy trước tiếng thứ 16.

154
 2. Hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm tăng dần liên tục theo thời gian nuôi cấy.
Khi kết thúc nuôi cấy hiệu suất vẫn tiếp tục tăng tuy nhiên ở mức độ tăng chậm. Điều
này cho thấy có thể nuôi cấy dài hơn để thu thêm sản phẩm.
3. Hiệu suất sinh tổng hợp tế bào ban đầu thấp sau đó tăng mạnh ở log pha và
đạt cực đại (15%) ở giai đoạn từ giờ thứ 7-10. Sau 10 giờ nuôi cấy, hiệu suất sinh
tổng hợp sinh khối bắt đầu giảm mạnh đều cho đến kết thúc qui trình lên men.

Bài 4.
Tóm tắt: Vo = 30KL, CT22 = 23 tế bào, CT26 = 481 tế bào.

1. Ta có: N = No × 2n trong đó No, N là số tế bào tạp nhiễm ghi nhận được ở

thời điểm nuôi cấy 22 và 26 giờ, n là số thế hệ tế bào tạp nhiễm sinh ra
trong khoảng thời gian từ giờ nuôi cấy thứ 22 đến 26.
 n = log2(N/No) = log2(481/23) = 4,4
tg = T/n, với tg là thời gian thế hệ, T là thời lượng cần thiết để tế bào tạp
nhiễm sinh ra qua n thế hệ.
 tg = (26 - 22) × 60/4,4 = 55 phút.

2. Khả năng phát hiện được tạp nhiễm trên đĩa pettri khi trong 1 ml của dịch
nuôi cấy có chứa 1 tế bào.
Số thế hệ tế bào tạp nhiễm tính từ lúc có khả năng phát hiện đến lúc thời gian
nuôi cấy 22 giờ là:
n = log2(23/1) = 4,5;
Thời lượng (T) từ lúc có 1 tế bào tạp nhiễm đến giờ nuôi cấy thức 22:
T = 4,5 × 55/60 = 4 giờ.
Như vậy, lúc 22 - 4 = 18 giờ thì có khả năng phát hiện tạp nhiễm.

3. Tạp nhiễm xảy ra ở giờ nuôi cấy thứ mấy?

Đánh giá số lượng tế bào tạp nhiễm ở lúc bắt đầu nuôi cấy:
N18 = No × 2n với n là số thế hệ sau 18 giời nuôi cấy.
 No = N18/2n = 1 × 30 × 106 / 2(18×60/55) = 38 tế bào
Như vậy, tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy thì có thể đã xảy ra hiện tượng tạp
nhiễm.

4. Khi dừng nuôi cấy ở thời điểm dừng nuôi cấy, giờ thứ 30:
N30 = N22 × 2n,
với n = T/tg = (30 - 22) × (60/55) = 8,73;

155
  N30 = 23 × 28,73 = 9.766 tế bào.

Trong trường hợp tính từ CT26: N30 = 481 × 2(30-26)×60/55 = 9.905 tế bào.
Tại sao có sự khác biệt này?
Nguyên nhân có thể là (1) sai số do cách lấy mẫu; (2) tg của chủng tạp nhiễm
không phải khi nào cũng giống nhau trong quá trình nuôi cấy.

Bài 5.
Tóm tắt: T1 = 28oC, T2 = 31oC, T3 = 37, A = 20 m2, Su max = 2,0 t/Hr
Ta có phương trình:
Glucose + [O] + [N] + …  [P] + CO2 + … + 193,4 Kcal
MW của glucose: 180 g

1. Năng lượng sinh ra khi đồng hóa glucose để tổng hợp glutamic acid ở thời
điểm tốc độ đồng hóa tối đa là:
Q1 = 2,0/180 × 193,4 = 2,149 Gcal/hr.
Mặt khác ta có:
Q2 = m × c × delT với Q2 là nhiệt lượng cần phải giải phóng khỏi nồi lên men
để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, m là khối lượng nước giải nhiệt cần thiết để giải hết
lượng nhiệt Q2, c là nhiệt dung riêng của nước c = 1 kcal/kg.độ; DelT = (T2 - T1)
Để toàn bộ lượng nhiệt sinh ra đều được giải phóng hết thì Q1 = Q2
Khi đó m × c × DelT = 2,149
 m = 2,149/[1 × (31 - 28)] = 716,3 KL/hr.

2. Hiệu suất trao đổi nhiệt

Ta có:
U= Q A × ∆Tm
(Hiệu suất trao đổi nhiệt, Mcal/hr.m2.0C)
(T 3 − T 1) − (T 3 − T 2)
Trong đó: ∆Tm =
(T 3 − T 1)
Ln
(T 3 − T 2)
= (31-28)/[Ln(37-28)/(37-31)] = 7,40oC
Do vậy:
U = 2,149/[20 × 7,40] = 14,52 Mcal/hr.m2.0C.

156
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Anh

1. Stanbury, Whitaker and Hall, 1995. Principles of fermentation technology, Second

edition, Pergamon.
2. Mardigan, Martinko, Parker, 2000. Brock Biology of Microorganisms, Ninth edition,
Prentice Hall.
3. Arnold L. Demain, Julian E. Davies, Ronald M. Atlas, Gerald Cohen, Charles L.
Hershberger, Wei-Shou Hu, David H. Sherman, Richard C. Willson, J. H. David Wu,
1999. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, second edition, ASM
press, Washington DC.
4. Henry C. Vogel, Celeste L. Todaro, Celeste C. Todaro, 1997. Fermentation and
Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design, and Equipment,
Noyes Publications, USA.
5. Visvanathan, 2004. Physico-Chemical Processes, Environment Engineering &
Management, Asian Institute of Technology.
6. Tarun K. Ghose, Bioprocess computations in biotechnology, Volume 1, Ellis
Horwood.
7. G.M.A. Van Beynum, J.A. Roles, Starch Conversion Technology, Marcel Darker Inc.,
1985.
8. Avinash Gupta, 2003, Hand book of chemical engineering calculation
9. Nduka Okafor, 2007, Modern industrial and biotechnology
10. Brian Mc Neil and Linda M. Harvey, 2008, Practical fermentation technology

Tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Môi trường nuôi cấy
2. Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng, giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh
vật- Vietsciences
3. Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh, 2010, Cơ sở công nghệ vi sinh vật và ứng dụng
4. Trần Thị Thanh, 2003, Công nghệ vi sinh
5. Lê Xuân Phương, 2001, Vi sinh vật công nghiệp, Nxb Xây Dựng, Hà Nội.
6. Trần Linh Thước, 2003, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục.
7. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5945: 2005, Nước thải công nghiệp – Tiêu chuẩn chất
thải, xuất bản lần 2, Hà nội 2006.

157
 PHẦN PHỤC LỤC

1. Phụ lục 1. Hình ảnh các thiết bị liên quan của hệ thống lên men
2. Phụ lục 2. Tiêu chuẩn về nước thải ở Việt Nam (TCVN 5945: 2005)
Giá trị giới hạn
TT Thông số Đơn vị
A B C
1 Nhiệt độ oC 40 40 45
2 pH - 6-9 5,5-9 5-9
3 Mùi - Không khó chịu Không khó chịu -
4 Màu sắc, Co-Pt ở pH=7 20 50 -
5 BOD5 (20o C) mg/L 30 50 100
6 COD mg/L 50 80 400
7 Chất rắn lơ lửng mg/L 50 100 200
8 Arsen mg/L 0.05 0.1 0.5
9 Thuỷ ngân mg/L 0.005 0.01 0.01
10 Chì mg/L 0.1 0.5 1
11 Cadimi mg/L 0.005 0.01 0.5
12 Crome (VI) mg/L 0.05 0.1 0.5
13 Crome (III) mg/L 0.2 1 2
14 Đồng mg/L 2 2 5
15 Kẽm mg/L 3 3 5
16 Niken mg/L 0.2 0.5 2
17 Mangan mg/L 0.5 1 5
18 Sắt mg/L 1 5 10
19 Thiếc mg/L 0.2 1 5
20 Xianua mg/L 0.07 0.1 0.2
21 Phenol mg/L 0.1 0.5 1
22 Dầu mỡ khoáng mg/L 5 5 10
23 Dầu thực vật mg/L 10 20 30
24 Clo dư mg/L 1 2 -
25 PCBs mg/L 0.003 0.01 -
26 Hoá chất bảo vệ tực vật: Lân hữu cơ mg/L 0.3 1
27 Hoá chất bảo vệ tực vật: Clo hữu cơ mg/L 0.1 0.1 -
28 Sufua mg/L 0.2 0.5 1
29 Florua mg/L 5 10 15
30 Clorua mg/L 500 600 1000
31 Amoni (tính theo Nitơ) mg/L 5 10 15
32 Tổng nitơ mg/L 15 30 60
33 Tổng phốtpho mg/L 4 6 8
34 Coliform MPN/100ml 3000 5000 -
90% cá sống sót sau 96 giờ
35 Xét nghiện sinh học (Bioassay) trong 100% nước thải -
36 Tổng hoạt động phóng xa α Bq/l 0.1 0.1 -
37 Tổng hoạt động phóng xa β Bq/l 1 1 -

158
Phụ lục 3. Bảng mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ hơi nước

Áp suất Nhiệt độ Nhiệt hoá hơi Thể tích riêng Tỷ trọng Thể tích riêng, m /kg
3

kg/m ở 250 C ở 300 C

2 o 3 3 o o
kg/cm C kcal/kg m /kg
1 99.1 638.8 1.725 0.580 2.454 2.691
2 119.6 646.2 0.902 1.109 1.223 1.342
3 132.9 650.6 0.617 1.621 0.812 0.893
4 142.9 653.7 0.471 2.123 0.607 0.668
5 151.1 656.0 0.382 2.618 0.484 0.533
6 158.1 657.0 0.321 3.115 0.402 0.443
7 164.2 659.5 0.278 3.597 0.343 0.379
8 169.6 660.8 0.245 4.082 0.299 0.331
9 174.5 661.9 0.219 4.566 0.265 0.293
10 179.1 662.9 0.198 5.051 0.238 0.263
12 187.1 664.5 0.166 6.024 0.196 0.218
14 194.1 665.7 0.143 6.993 0.167 0.186
16 200.4 666.7 0.126 7.937 0.145 0.162
18 206.1 667.4 0.112 8.929 0.128 0.143
20 211.4 668.0 0.101 9.901 0.114 0.128
22 216.2 668.4 0.092 10.870 0.103 0.116
24 220.7 668.7 0.085 11.765 0.093 0.106
26 225.0 669.0 0.078 12.821 0.085 0.097
28 229.0 669.1 0.073 13.699 0.078 0.089
30 232.7 669.2 0.068 14.706 0.072 0.083
(http://www.instrumentation.co.za/article.aspx?pklarticleid=626)

159
Phụ lục 4: Các bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật hàng đầu trên thế giới

Ở Anh:
- National Collection of Type Cultures (NCTC)
- National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB)
- Natonal Collection of Yeast Cultures (NCYC)
- Collection of International Mycological Institute (IMI)
Ở Mỹ:
- American Type Culture Collection (ATCC)
Ở Đức:
- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSM)
Ở Hà Lan:
- Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)
Ở Cộng hoà Séc:
- Czechoslovak Collection of Microorganisms (CCM)
Ở Pháp
- Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM)
Ở Nhật
- Japan Collection of Microoranisms (JCM)
- Culture Collection of the Institute for Fermentation (IFO)

160