(123doc) Nghien Cuu Phuong Phap Xac Dinh Ham Luong Tinopal Cbs X Trong Thuc Pham Nen Tinh Bot Bang Thiet Bi Sac Ky Long Hieu Nang Cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
PHẠM DUY
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG

TINOPAL CBS-X TRONG THỰC PHẨM NỀN TINH BỘT
BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Nghệ An, năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
PHẠM DUY
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG

TINOPAL CBS-X TRONG THỰC PHẨM NỀN TINH BỘT
BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.
Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.0118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

PGS. TS. Nguyễn Hoa Du
Nghệ An, 2014

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp xác định
hàm lượng Tinopal CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị sắc
ký lỏng hiệu năng cao”. Tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện
của Ban Lãnh đạo, tập thể viên chức Phòng Phân tích thử nghiệm thuộc
Trung tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Đồng
Tháp; Ban giám hiệu, Khoa Sau Đại học, Khoa Hóa học, giảng viên, cán bộ
các phòng ban chức năng của trƣờng Đại học Vinh. Tôi xin bày tỏ sự chân
thành và lòng cảm ơn về sự giúp đỡ đó.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoa Du, thầy
giáo trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp của tôi đang công tác
tại Phòng Phân tích thử nghiệm thuộc Trung tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng
dụng Khoa học Công nghệ Đồng Tháp và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành luận văn
này.
Nghệ An, ngày ....... tháng ....... năm 2014
Ngƣời thực hiện
Phạm Duy
MỤC LỤC
Trang bìa phụ

Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, các hình vẽ và đồ thị
MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................ 4
1.1. Sơ lƣợc về tinh bột gạo .................................................................. 4
1.2. Các sản phẩm làm từ tinh bột gạo ................................................. 5
1.3. Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang ......... 6
1.3.1. Giới thiệu .................................................................................... 6
1.3.2. Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học...... 6
1.3.3. Tinopal CBS-X ........................................................................... 8
1.3.3.1. Khái niệm ................................................................................. 8
1.3.3.2. Tính chất .................................................................................. 8
1.3.3.3. Phạm vi ứng dụng của các chất làm trắng quang học ............. 9
1.3.3.4. Một số kết nghiên cứu và phƣơng pháp xác định .................. 10
1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)........................ 13
1.4.1. Cơ sở phƣơng pháp và phạm vi ứng dụng ................................ 13
1.4.1.1. Khái niệm ............................................................................... 14
1.4.1.2. Phân loại ................................................................................ 15
1.4.1.3. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................. 16
1.4.2. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang
(HPLC-RF) .................................................................................................... 19
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích
tinopal CBS X. .............................................................................................. 20
1.4.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) .......................................................................................................... 21
1.4.4.1. Phƣơng pháp chiết tách mẫu .................................................. 21
1.4.4.2. Phƣơng pháp làm sạch mẫu ................................................... 22
1.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích. ................................................ 23
1.5.1. Khoảng tuyến tính..................................................................... 23
1.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ). .......... 25
1.5.3. Độ chụm .................................................................................... 26
1.5.4. Độ đúng..................................................................................... 27
CHƢƠNG 2: KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM .................................... 29
2.1. Hóa chất và thiết bị ...................................................................... 29
2.1.1. Hóa chất. ................................................................................... 29
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị. ................................................................... 31
2.2. Kỹ thuật xử lý mẫu bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở................ 31
2.2.1. Lựa chọn dung môi phù hợp. .................................................... 31
2.2.2. Khảo sát kỹ thuật chiết tách chất phân tích .............................. 32
2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch .............................................................. 33
2.2.4. Pha loãng mẫu ........................................................................... 33
2.3. Kỹ thuật phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu
dò huỳnh quang (HPLC-RF). ........................................................................ 33
2.3.1. Chọn điều kiện sắc ký. .............................................................. 33
2.3.2. Trình tự bơm mẫu, tính toán kết quả. ....................................... 35
2.4. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu phân tích ........................................ 36
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu ........................................................ 36
2.4.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ........................................................ 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN ........ 38
3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định tinopal CBS-X. ............... 38
3.1.1. Chọn hệ dung môi pha động ..................................................... 38
3.1.2. Khảo sát chƣơng trình gradient. ............................................... 39
3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ pha động ................................. 40
3.2. Khảo sát qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X ...................... 41
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ................................................. 44
3.3.1. Khoảng tuyến tính ..................................................................... 44
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ....... 47
3.3.3. Độ chính xác của phƣơng pháp ................................................ 48
3.4. Xác định tinopal CBS-X trong các mẫu thực ............................. 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng

hiệu năng cao.
- HPLC UV-VIS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - đầu dò tử ngoại – khả
kiến.
- HPLC-RF (High Performance Liquid Chromatography /

Fluorescence): Sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang.
- LC/MS (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry): Sắc ký lỏng

ghép khối phổ một lần.
- LC/MS/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần.
- ICP-AES: Đầu dò phổ phát xạ nguyên tử.
- AAS: Hấp thụ nguyên tử.
- OBs: Chất làm trắng quang học.
- FWAs: Chất làm trắng huỳnh quang.
- LOD (Limit of detection): Giới hạn phát hiện.
- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lƣợng.
- Sr: Độ lặp lại (µg/kg).
- RSD: Độ lặp lại (%).
- H: Hiệu suất thu hồi (%).

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Bảng 2.1: Các hệ dung môi chiết trên nền mẫu tinh bột gạo.
Bảng 2.2: Chƣơng trình hệ dung môi pha động methanol : nƣớc.
Bảng 3.1: Ảnh huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu
suất thu hồi của quá trình chiết.
Bảng 3.2: Chƣơng trình theo tỷ lệ Gradient dung môi.
Bảng 3.3: Khoảng tuyến tính của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.4: Đƣờng chuẩn của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng
hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.5: Độ lặp lại tại nồng độ 20 ug/L, 50 ug/L chất chuẩn tinopal
CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.7: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bột gạo tại nồng độ 70 µg/kg.
mẫu bún tại nồng độ 70 µg/kg.
mẫu hủ tiếu tại nồng độ 70 µg/kg.
mẫu bánh phở tại nồng độ 70 µg/kg.
Bảng 3.13: Tóm tắt đánh giá phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tinopal
CBS-X trên nền tinh bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,...
Bảng 3.14: Thống kê số lƣợng mẫu và hàm lƣợng tinopal CBS-X trong
sản phẩm từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013
Bảng 3.15: So sánh kết quả phân tích tinopal CBS-X giữa hai phòng thí
nghiệm.
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4- anilino-6-
morpholino-1,3,5-triazin-2- yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate.
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’-diyldi-2,1-
ethenediyl)bis-, disodium salt.
Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X.
Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên
trái sang bên phải bằng đèn phát cực tím cầm tay.
Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ.
(Courtesy of R. David Holbrook, National Institute of Standards and
Technology).
Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC).
Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc.
Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính.
Hình 3.1: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X của hệ pha động 1.
Hình 3.3: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X theo chƣơng trình
gradient.
Hình 3.4: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X theo tốc độ dòng dung
môi pha động
Hình 3.5: Giản đồ biểu thị hiệu suất chiết tinopal CBS-X bằng MeOH
và ACN.
Hình 3.6: Khảo sát hai qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X. (a)
methanol có mặt axit photphoric (H3PO4), (b) acetonitril có mặt axit
photphoric (H3PO4).
Hình 3.7: Đồ thị khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X.
Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X.
Hình 3.9: Đồ thị của đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.
Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X.
1
MỞ ĐẦU
Chất làm sáng quang học hoặc chất làm trắng huỳnh quang đƣợc sử
dụng nhiều trong ngành công nghiệp hóa chất và trong ngành công nghiệp
chất tẩy rửa, sản xuất giấy, bao bì để làm tăng độ trắng sáng cho sản phẩm.
Chất làm trắng huỳnh quang là những hợp chất có thể hấp thụ ở bƣớc sóng
350 - 365 nm của ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở
bƣớc sóng 400 - 440 nm[16], [27]. Chất làm sáng huỳnh quang đƣợc phát hiện
nhiều trong chất tẩy rửa gia dụng, nƣớc rửa chén, vải sợi, giấy vệ sinh,…
Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là 4,4-
bis(2-sulfostyryl)biphenyl, công thức phân tử C28H20Na2O6S2[8]. Tinopal CBS-
X là chất làm trắng huỳnh quang có khả năng phát huỳnh quang
(fluorescence) và gây ra hiệu ứng tán xạ trên bề mặt sản phẩm mà chúng bám
vào làm cho sản phẩm có cảm giác trắng hơn.
Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch đƣợc
dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ
phẩm và đƣợc dùng làm chất tẩy rửa trong gia dụng để tẩy trắng sản phẩm và
làm sạch bề mặt vật dụng, … nhƣng không đƣợc phép sử dụng trong thực
phẩm.
Gần đây, tình trạng một số cơ sở sản xuất các sản phẩm làm từ tinh bột
nhƣ bún, hủ tiếu, bánh phở,… sử dụng chất tinopal CBS-X trong sản xuất để
làm tăng độ trắng sáng, cải thiện độ bóng bề mặt và làm cho sản phẩm hấp
dẫn hơn, đã gây ra nỗi lo ngại về sức khỏe đối với ngƣời tiêu dùng. Các cơ
quan kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm và các phòng phân tích thử nghiệm,
kiểm nghiệm đang rất quan tâm đến vấn đề phân tích định lƣợng hàm lƣợng
tinopal CBS –X trong các loại thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm chế biến từ
tinh bột nhƣ bánh phở, hủ tiếu, bún, …
2
Để kiểm soát tinopal CBS-X trong thực phẩm, ngày 16 tháng 8 năm
2013, Cục An toàn thực phẩm – Bộ Y Tế đã có công văn số 1731/ATTP-KN
về việc áp dụng qui trình kiểm nghiệm tinopal CBS-X trong thực phẩm[1].
Hiện nay, đã có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tinopal CBS-
X trong các đối tƣợng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau. Phƣơng pháp
kiểm tra sàng lọc tinopal CBS-X bằng cách soi dƣới ánh sáng đèn tử ngoại
UV 366 nm trong buồng tối[1] ,[12]. Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi
thiết bị mà có độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhƣng đầu dò huỳnh quang
đƣợc xem là có độ chọn lọc, độ nhạy cao song chi phí đầu tƣ ban đầu rất tốt
kém. Tuy nhiên, khi áp dụng qui trình kiểm tinopal CBS-X đối tƣợng các loại
thực phẩm đƣợc làm từ tinh bột gạo có rất ít công trình nghiên cứu một cách
tỉ mỉ và chi tiết, cần phải thực hiện xác nhận, đánh giá phƣơng pháp tại địa
phƣơng, xây dựng và kiểm định phƣơng pháp trên thiết bị cụ thể.
Với những lý do trên tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác
định hàm lượng tinopal CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị
sắc ký lỏng hiệu năng cao” làm luận văn tốt nghiệp.
Để đóng góp thêm phƣơng pháp phân tích cho các đối tƣợng các loại
thực phẩm nền tinh bột chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện định
lƣợng Tinopal CBS-X (chất phát huỳnh quang) trong bột gạo, hủ tiếu, bún và
bánh phở ở huyện Cao Lãnh bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao –
đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
+ Nghiên cứu phƣơng pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lƣợng tinopal
CBS-X trong tinh bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở.
+ Nghiên cứu điều kiện định lƣợng hàm lƣợng tinopal CBS-X bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
3
Xác định các điều kiện sắc ký, xây dựng đƣờng chuẩn, đánh giá phƣơng pháp
phân tích định lƣợng.
+ Định lƣợng các chất nghiên cứu trong các loại mẫu thực nghiệm nhƣ:
bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở đƣợc thu thập tại chợ thực phẩm và các cơ
sở sản xuất tại huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp, mỗi mẫu đƣợc lấy một ít
đựng vào túi nilong sạch.
4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về tinh bột gạo[24].

Gạo là nguyên liệu chủ yếu trong bữa ăn chính của nhiều nƣớc Châu Á
thì bột gạo là thành phần chính của rất nhiều loại thực phẩm dùng hằng ngày.
Tinh bột là cấu tử chính của gạo (chiếm đến 90% chất khô). Hàm lƣợng
amiloza trong gạo tẻ có thể chiếm từ 7 % đến 33 % chất khô. Amilopectin là
cấu tử chính của tinh bột và thành phần duy nhất của gạo nếp. Tinh bột gạo
nếp chiếm từ 0,8 % đến 1,3 % amiloza, tập trung chủ yếu ở tâm hạt tinh bột.
Tinh bột lúa nếp bị nhuộm màu đỏ hay nâu với iot còn gạo tẻ thì nhuộm màu
xanh hay xanh tím. Hàm lƣợng amiloza phụ thuộc vào trị số và hình dạng hạt
tinh bột.
Hạt tinh bột lúa nếp và lúa thƣờng có nhiệt độ hồ hóa giống nhau. Nhiệt
độ hồ hóa có thể dao động từ 55 0C đến 79 0C phụ thuộc vào giống và điều
kiện canh tác. Nhiệt độ hồ hóa phản ánh độ bền của hạt tinh bột tới sự tác
động của các loại thuốc thử khác nhau. Những sự khác biệt về nhiệt độ hồ hóa
phản ánh rõ tới thời gian nấu gạo.
Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo
có nhiệt độ hồ hóa thấp. Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút
nƣớc và trƣơng nở ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao.
Nhiệt độ hồ hóa cũng có thể phản ánh độ rỗng tƣơng đối của nội nhũ.
Tỷ lệ amiloza: Amilopectin xác định các tính chất của cơm. Hàm lƣợng
amiloza càng cao, các hạt tinh bột hút nƣớc càng mạnh, thể tích các hạt tinh
bột tăng nhƣng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amiloza tạo thành
các liên kết nƣớc ở mức cao. Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó
đƣợc quyết định bởi tỷ số amiloza : amilopecin trong tinh bột.
5
Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thƣớc nhỏ (3 – 8 µm)
đƣợc bao bởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nƣớc, nên
để tách đƣợc tinh bột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25% - 0,35%)
trong một thời gian dài để làm mềm hạt. Tách hết kiềm, rửa bằng nƣớc, sau
đó gạo đƣợc nghiền để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột. Tiếp đó
khối nghiền đƣợc khuấy đều với một lƣợng dƣ dung dịch kiềm loãng. Phần
lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vào lớp trên của dung dịch kiềm nên có
thể tách ra bằng cách gạn.
Khuếch tán khối tinh bột vào nƣớc để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho
qua rây có kích thƣớc nhất định để loại bỏ các tạp chất. Tinh bột đƣợc rửa và
lắng gạn, lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ thu đƣợc tinh bột tinh sạch.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO2 ở một nhiệt độ và thời gian
nhất định (50 oC, 72h) để làm cho khung protein bị trƣơng lên và bị khuếch
tán vào dung dịch dễ dàng. Tiếp đó, gạo đƣợc nghiền trong cối nghiền. Khối
nghiền cho qua sàng quay và sàng rung để tách vỏ và xơ. Sau đó khuấy đều
với dung dịch NaOH để tạo ra huyền phù rồi cho vào ly tâm để tách ra làm 2
lớp: lớp chất lỏng ở phía trong (quanh tâm của máy ly tâm) chứa nhiều
protein và lớp đặc có khối lƣợng riêng lớn thì ở vòng ngoài chứa chủ yếu là
tinh bột có lẫn ít protein. Ly tâm nhiều lần dịch sữa tinh bột trong kiềm, rồi
trong nƣớc sẽ thu đƣợc tinh bột tinh sạch.
1.2. Các sản phẩm làm từ tinh bột gạo
Có rất nhiều loại sản phẩm có thành phần chính là tinh bột gạo nhƣ
bánh tráng, bánh phở, hủ tiếu, bún tƣơi, bún khô, các loại bột gạo,... Các sản
phẩm này đƣợc làm từ tinh bột gạo đƣợc chế biến qua nhiều công đoạn, quá
trình chế biến rất quan trọng là đảm bảo về vệ sinh an toàn thực phẩm.
6
Một số cơ sở sản xuất các sản phẩm từ bột gạo cho các chất phụ gia bị
cấm nhƣ : hàn the, tinopal CBS-X, formol, chất bảo quản và các chất màu vào
trong sản phẩm làm gây ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
1.3. Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang.
1.3.1. Giới thiệu[6], [7], [8], [16], 26], [27].
Chất làm trắng quang học (Optical Brighteners - OBs) đƣợc dùng trong
ngành công nghiệp hóa chất, hoặc các chất làm trắng huỳnh quang
(Fluorescent Whitening Agent - FWAs) đƣợc dùng trong ngành công nghiệp
chất tẩy rửa, là những hợp chất có thể hấp thụ ở bƣớc sóng 350 - 365 nm của
ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bƣớc sóng 400 -
440 nm. Electron trong phân tử huỳnh quang đƣợc kích thích lên một trạng
thái năng lƣợng cao hơn bằng cách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó
phân tử chuyển một lƣợng nhỏ năng lƣợng thành nhiệt huỳnh quang, phần
còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnh quang khi các electron quay
trở lại trạng thái cơ bản của nó. Nhiệt huỳnh quang đƣợc tạo ra từ trạng thái
kích thích thứ nhất có thể đƣợc đo đƣợc bằng thiết bị nhƣng rất phức tạp và
tốn kém. Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai đƣợc đo
bằng thiết bị gọi là fluorometers.
1.3.2. Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học[6],
[7], [8], 26], [27]
.
Các chất làm trắng quang học có thể đƣợc phân loại dựa trên cấu trúc
và thuộc tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc
khác nhau, hàng trăm hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả
OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể
đƣợc kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím. Hàng ngàn công thức OBs đã đƣợc
dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, nhƣng tƣơng đối ít đáp
ứng đƣợc yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất tẩy rửa làm trắng huỳnh
7
quang (FWAs) đã đƣợc nghiên cứu sử dụng.

FWAs đƣợc sử dụng nhiều trong các chất tẩy rửa bao gồm các hợp chất
stilben nhƣ:
+ FWA-1 có tên hóa học: Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6-morpholino-
1,3,5-triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate.
Công thức cấu tạo hóa học:
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6-

morpholino-1,3,5-triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[7].
+ FWA-5 có tên hóa học: Benzenesulfonicacid, 2,2’-([1,1’- biphenyl]-
4,4’-diyldi-2,1-ethenediyl)bis-disodiumsalt. FWA-5 thƣờng đƣợc gọi là DSBP
(Distyrylbiphenylsulfonate) hoặc tinopal CBS-X.
Công thức cấu tạo hóa học:
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2, 2’- ([1, 1’ - biphenyl] - 4, 4’ - diyldi
- 2, 1 - ethenediyl) bis, dạng muối đinatri[8].
8
1.3.3. Tinopal CBS-X.

1.3.3.1. Khái niệm[8], 26], [27].
Tên thƣờng đƣợc gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate).
Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-2,1-ethenediyl)bis, dạng
muối đinatri.
Công thức phân tử: C28H20Na2O6S2
Công thức cấu tạo hóa học: xem hình 1.2.
1.3.3.2. Tính chất[8], [26].
+ Khối lƣợng phân tử: 562,58 g/mol.
+ Màu sắc: màu vàng.
+ Điểm nóng chảy: >300 °C.
+ Điểm sôi: N/A.
+ Áp suất hơi ở 25 °C: < 7E-16 ở 25 °C.
+ Hệ số phân số octanol - nƣớc [log10]: - 2,32 ở pH 6,8; 25 °C.
+ Độ tan trong nƣớc [mg/L]: 17’600 ở 20°C.
+ Hằng số Henry: < 1E-15 ở 25°C.
+ Hằng số Koc: 125 L/kg.
+ Tỷ trọng: 1490 kg/m3.
+ pH: 10,4 ở 50 g/L.
+ pKa (axit tự do): - 2,5 > pKa > - 3,0.
+ Sự ổn định trong nƣớc: T1/2 ≥ 1 năm ở pH từ 4 đến 9.
Nguồn: Theo Adapted from Klimisch et al, “Criteria for reliability
Categories”, (1997) [8].
Theo [Ullann’s 1991] Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất
Distyrylbiphenylsulfonate bắt đầu với biphenyl, đƣợc sản xuất cùng với các
hợp chất thơm khác trong tinh chế dầu thô. Nó phản ứng nhanh với hydrogen
chloride và formaldehyde và tạo thành 4, 4’–bis(chloromethyl)biphenyl, sau
9
đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphono-

methyl)biphenyl. Biphenylphosphonate đối xứng này đƣợc phản ứng với hai
phân tử benzaldehyde-2-sulphonic axit, đƣợc sản xuất từ một hợp chất là 2-
chlorbenzaldehyde và natri sunfit. Thành phần sản phẩm hoạt chất sinh ra là
xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số dƣ là
natri clorua và nƣớc.
1.3.3.3. Phạm vi ứng dụng của các chất làm trắng quang học[6], [7], [8],
[16], [26], [27]
.
Chất làm trắng quang học và chất làm trắng huỳnh quang đƣợc sử dụng
trong dệt may, nhiều loại giấy, nhựa, và sợi tổng hợp, cộng với sử dụng rộng
rãi trong một số y tế, hóa chất, dầu khí. Các nhóm này bao gồm các công thức
hóa học OBs đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong ngành công nghiệp chất tẩy
rửa là carbocycles (chủ yếu là distyrylbiphenyls), và triazinylaminostilbenes.
FWA-1 đƣợc sử dụng trong các chất tẩy rửa nhà khoảng nồng độ từ
0,05% đến 0,15% và phân hủy > 50 % trong 12 tháng. FWA-5 đƣợc sử dụng
chất tẩy rửa gia dụng ở khoảng nồng độ 0,02% đến 0,10% và phân hủy > 70
% trong 28 ngày. OBs đƣợc dùng nhiều các ngành công nghiệp chất tẩy rửa,
nhƣng tƣơng đối ít đáp ứng đƣợc yêu cầu của ngành công nghiệp và đã đƣợc
thêm vào chất tẩy rửa làm trắng huỳnh quang (FWAs).
Tinopal CBS-X đƣợc sử dụng làm hóa chất để sản xuất các sản phẩm
tiêu dùng, nó có trong trong các môi trƣờng nƣớc bị ô nhiễm, trầm tích và
đất.
Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch đƣợc
dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ
phẩm và đƣợc dùng làm chất tẩy rửa trong gia dụng để tẩy trắng sản phẩm và
làm sạch bề mặt vật dụng.
10
1.3.3.4. Một số kết nghiên cứu và phƣơng pháp xác định[6], [7], [8], [17],
[18], [20], [21], [26], [27]
.
Các muối axit distyrylbiphenyldisulfonicdisodium có khả năng hòa tan
tốt trong nƣớc và hằng số Koc rất thấp, có khả năng tích lũy sinh học. Theo
hằng số Henry, áp suất hơi của nó rất thấp và do đó DSBP không hòa tan
vào trong khí quyển và chất này không có thủy phân. Các hợp chất này đƣợc
phát hiện trong các môi trƣờng nƣớc, bùn, bùn cát và đất,...
Khi tinopal CBS-X đƣợc tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, bƣớc đầu tiên
là sự đồng phân hóa bởi ánh sáng. Các dữ liệu xác nhận rằng khi tiếp xúc với
ánh sáng mặt trời, DSBP hòa tan trong nƣớc đƣợc chuyển đổi sang các
photoisomers trong vòng vài phút. Thành phần chính 85% là đồng phân E, E
có phát huỳnh quang, trong khi đó 15% ở dạng đồng phân E, Z mà không
phát huỳnh quang.
Đƣợc biết, tinopal CBS-X sẽ bị mất tính chất huỳnh quang theo các
điều kiện khác nhau khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Nghiên cứu tại Thụy
Sĩ trên hồ Greifensee và sông Glatt chứng minh quy mô và tốc độ quang phân
trong điều kiện một khu vực đông dân cƣ. DSBP có trong hồ Greifensee vào
mùa hè chứng tỏ phân hủy quang đáng kể và ở sông Glatt sự phân hủy quang
70% trong vòng 28 ngày xảy ra vào mùa đông. Vào mùa hè phân hủy quang
là 70% chỉ sau 1,5 ngày.
Sự cân bằng khối lƣợng chỉ ra rằng 80% bị chuyển hóa bởi quang phân.
Còn lại 20% DSBP đƣợc phân bố đồng đều hấp phụ vào trong đất đá, trầm
tích [Stoll, 1999] [8].
Sự phân hủy quang học ban đầu mang lại một sản phẩm 1a chính (muối
axit benzaldehyde-2 - sulphonic) và 1b trung gian hình ảnh không ổn định đó,
với tốc độ chậm, phá vỡ để tạo thành một 1c sản phẩm thứ hai chính
(diphenyl - 4, 4' - dialdehyde). Cả hai sản phẩm phân hủy quang học đƣợc
11
chứng minh là có thể dễ dàng phân hủy sinh học trong thử nghiệm OECD
301F. diphenyl-4,4'-dialdehyde là không ổn định và bị ôxy hóa để diphenyl-
4,4'-dicarboxylic acid (1c, oxit.) trong vòng 24 giờ. [Theo Richner, 1999] [8].
Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X[8].

Một trong những tầm quan trọng nhất phát hiện chính xác và xác định
OBs (hoặc FWAs) trong các nguồn bị ô nhiễm nhƣ nguồn nƣớc và một số sản
phẩm khác. Việc phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang thực sự là một phép đo
rất ít các nhà khoa học nghiên cứu. Phép đo huỳnh quang là một mục tiêu
chuyển đổi của các tiêu chuẩn phòng thí nghiệm; do đó các phép đo phải đƣợc
thực hiện hoặc so sánh với một vài khoảng nồng độ.
Một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất để phát hiện FWAs đã
đƣợc sử dụng là kiểm tra huỳnh quang dùng đèn cực tím cầm tay hoặc một
nguồn tia cực tím. Phƣơng pháp cho cách tiếp cận này bao gồm phát hiện
nhanh, thiết bị rẻ tiền, dễ dàng kiểm tra số lƣợng lớn các mẫu trong một thời
gian ngắn (phƣơng pháp định tính). Hạn chế của phƣơng pháp này là không
xác định nồng độ, độ nhạy kém, có tính chính xác không cao (không có khả
năng phân biệt giữa FWAs và các hợp chất huỳnh quang khác).
12
Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên trái
sang bên phải bằng đèn phát cực tím cầm tay[27].
Năm 1935, Judd là ngƣờixác định các tác nhân làm trắng huỳnh quang
đầu tiên. Kể từ đó, một số phƣơng pháp xác định làm trắng huỳnh quang đã
đƣợc phát triển, trong số đó phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC), phƣơng pháp sắc ký lỏnghiệu năng cao pha đảo đƣợc
sử dụng rộng rãi nhất để tách hỗn hợp hóa học của nó.
Phƣơng pháp huỳnh quang càng chính xác hơn liên quan đến việc sử
dụng phân tích công cụ (thiết bị) mà sử dụng cả hai nguồn kích thích và
nguồn phát xạ để định lƣợng chất cần phân tích. Ƣu điểm của phƣơng pháp
này phát hiện nhanh, dễ dàng kiểm tra số lƣợng lớn các mẫu trong một thời
gian ngắn, chính xác hơn (khả năng phân biệt giữa FWAs và các hợp chất
huỳnh quang khác), định lƣợng khoảng nồng độ, và độ nhạy tốt hơn (phát
hiện nồng độ thấp hơn). Đơn vị là µg/L.
13
Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ[27].
(Courtesy of R. David Holbrook, National Institute of Standards and
Technology) [27].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các đầu dò UV, huỳnh quang,
khối phổ cho độ chính xác và độ nhạy cao thích hợp cho việc phát hiện chất
cần phân tích của bất kỳ mẫu thử nào, nhƣng tƣơng đối tốn thời gian.
Dƣới đây sẽ trình bày chi tiết về phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao.
1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.4.1. Cơ sở phƣơng pháp và phạm vi ứng dụng[3]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid chromatography)
hoặc sắc ký lỏng cao áp (High - pressure liquid chromatography) là một kỹ
thuật sắc ký đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến để phân tách một hỗn hợp
trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry ) và sinh hóa
(biochemistry ) với mục đích xác định, định lƣợng và tinh sạch từng thành
phân riêng lẻ của hợp chất. Sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng đƣợc xem là một
14
kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lƣợng (gravimetric
technique).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một
dung môi lỏng để tải hỗn hợp vào cột, trong đó quá trình phân tách xảy ra.
Một cột phân tách sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc nạp vật liệu pha rắn
(nhƣ silica , polymers hay chất hấp phụ) và hỗn hợp mẫu đƣợc phân tích
thành những hợp chất tƣơng tác với các phần tử trong cột. Sự phân tách sắc
ký lỏng hiệu năng cao bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện dung môi lỏng (nhƣ áp
suất và nhiệt độ), tƣơng tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môi lỏng (nhƣ
tính không ƣa nƣớc, quá trình proton hóa, v.v) và tƣơng tác hóa học giữa các
hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (nhƣ ái lực ligand,
trao đổi ion,…).
Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến vì
nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lƣợng tốt, thích hợp tách các hợp
chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt, nhƣ phân tích lĩnh vực dầu mỏ, hóa
chất công nghiệp, các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ
gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dƣợc phẩm, môi trƣờng…
1.4.1.1. Khái niệm[3].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia
dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã đƣợc biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Sắc ký là một phƣơng pháp tách, trong đó các cấu tử đƣợc tách và phân
bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển
động theo một huớng xác định (theo IUPAC (1993)).
15
1.4.1.2. Phân loại[3].

Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, quá trình tách sắc ký lỏng hiệu năng
cao có thể tiến hành theo các cơ chế sau:
+ Pha tĩnh là chất lỏng: đƣợc phủ lên trên bề mặt chất mang trơ nhồi
trong cột tách tạo thành một lớp màng mỏng có độ dày từ 2 – 3 µm. Cơ chế
quá trình tách là phân bố (sắc ký phân bố) của chất tan giữa hai pha không
trộn lẫn, còn đƣợc gọi là sắc ký chiết.
+ Pha tĩnh là chất rắn: cơ chế của quá trình tách là hấp thụ (sắc ký hấp
thụ).
+ Pha tĩnh là chất rắn chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi ion với
mẫu phân tích, cơ chế quá trình tách là trao đổi ion (sắc ký trao đổi ion).
+ Pha tĩnh là các loại hạt rắn có kích thƣớc lỗ xốp khác nhau, khi đó
các phân tử mẫu có kích thƣớc nhỏ sẽ chui sâu vào bên trong lỗ xốp nên đƣợc
pha động rửa giải ra sau. Các phân tử có kích thƣớc lớn nằm ở bên ngoài nên
đƣợc rửa giải ra trƣớc, cơ chế quá trình tách là rây phân tử (sắc ký gel).
+ Pha tĩnh là chất rắn bất đối có khả năng tách chọn lọc các dạng của
đồng phân quang học, cơ chế của quá trình tách xảy ra các tƣơng tác khác
nhau giữa pha tĩnh bất đối với các dạng đồng phân quang học nhƣ liên kết
hydro, tƣơng tác π – π, tƣơng tác lƣỡng cực,... (sắc ký các đồng phân quang
học).
Phƣơng pháp sắc ký hấp phụ hiệu năng cao là chất tan bị giữ trên bề
mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
+Pha tĩnh: Pha tĩnh là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên
bề mặt của chất mang trơ, thƣờng là những bột mịn, silicagen và nhôm
oxit,…. Nếu là hạt thì phải có kích thƣớc đồng đều, có thể dƣới dạng hình
cầu hoặc mảnh. Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện
16
sắc ký. Các chất càng bị phân cực càng bị lƣu giữ mạnh và ra chậm khi rửa
giải.
+ Pha động: Thƣờng ở trạng thái lỏng, có thể là hợp chất hữu cơ hoặc
là hỗn hợp hợp chất hữu cơ với nƣớc. Các chất này phải thỏa mãn các điều
kiện sau: hòa tan đƣợc các chất hữu cơ; trơ với pha tĩnh; có độ nhớt càng thấp
càng tốt, bền theo thời gian, có độ tinh khiết cao; cân bằng động thiết lập
nhanh; phù hợp với detector đem sử dụng…
Trong HPLC nhiều thông số phải đƣợc xác định và thiết lập trƣớc khi
mẫu đƣợc cho vào trong máy. Vì thế, khi thực hiện phân tích mẫu với HPLC,
cần thời gian để thiết lập chế độ và điều kiện hoạt động thích hợp cho máy
trong mỗi phép phân tích. Điều này có thể mất hàng giờ hoặc ngày tùy theo
kinh nghiệm và kiến thức của ngƣời phân tích.
1.4.1.3. Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[3], [25].
(1)
(2) (6)
(3) (4)
(5)
Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) [25].
+ (1): Hệ thống dung môi: bình chứa dung môi, ống dây dẫn, đầu lọc
0,45 µm, các đầu nối.
+ (2): Bơm cao áp.
17
+ (3): Bộ phận tiêm mẫu.

+ (4): Cột tách sắc ký.
+ (5): Đầu dò (Detector).
+ (6): Bộ ghi nhận tín hiệu.
+ Bình chứa pha động.
Thiết bịsắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thƣờng có 4 kênh dung môi
vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng
một lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ của 4 kênh là 100%.
Hệ pha động đƣợc pha trộn đồng nhất giúp ổn định quá trình rửa giải. Và có
thể thay đổi thành phần bởi chƣơng trình gradient.
Bình chứa dung môi bằng thủy tinh có dung tích khoảng 1 lít. Dung
môi cần lọc qua giấy lọc 0,45 µm trƣớc khi sử dụng và để an toàn hơn ở đầu
của ống nhựa trong bình chứa dung môi cần phải có đầu lọc. Loại bỏ các
không khí hòa tan hoặc các bọt không khí trong dung môi bằng cách chạy
siêu âm, hoặc sục khí trơ nhƣ heli…
+ Bơm cao áp.
Bơm cao áp là vận chuyển pha động qua cột tách với một tốc độ xác
định. Bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
chịu đƣợc áp suất cao khoảng 250 – 600 bar và tạo dòng liên tục. Lƣu lƣợng
bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút.
Áp suất trong cột phụ thuộc vào chiều dài cột, kích thƣớc hạt của pha
tĩnh, độ nhớt và tốc độ dòng của pha động. Cột tách thông thƣờng chịu áp suất
khoảng 20 – 300 bar.
+ Bộ phận tiêm mẫu.
Để đƣa mẫu vào cột phân tích qua bộ phận tiêm mẫu với thể tích bơm
có thể thay đổi từ 1 – 100 µL.
18
Có 2 cách đƣa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự
động (autosamper).
+ Cột sắc ký.
Cột chứa pha tĩnh đƣợc coi là bộ phận không thể thiếu của của hệ thống
sắc ký lỏng hiệu năng cao, đƣợc làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay
đổi từ 50 – 250 mm, đƣờng kính trong 1 – 10 mm, hạt nhồi cỡ 0,3 – 5 µm.
Chất nhồi trong cột tách là silicagen hoặc gắn một màng mỏng chất hữu
cơ. Bên cạnh silicagen nguời ta còn dùng Al2O3, hạt polime xốp, hạt chất trao
đổi ion.
Ví dụ: Cột phân tích C18, kích thƣớc hạt nhồi cỡ 5 µm, đƣờng kính 4,5
mm, chiều dài cột 250 mm, Ecosil HPLC column.
Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ: Sau bộ phận tiêm mẫu và truớc cột tách cần
phải lắp cột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ cột khỏi sự xâm nhập của
của các hạt bẩn nhỏ có trong dung môi và trong mẫu tiêm vào. Nó đƣợc thiết
kế kích thƣớc nhỏ và thể tích nhỏ, các hạt nhồi nhƣ cột phân tích, không làm
thay đổi hiệu quả tách của cột tách.
+ Đầu dò (Detector).
Là bộ phận phát hiện các chất phân tích khi chúng kéo ra khỏi cột bằng
dung môi pha động và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính
và định lƣợng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà ngƣời ta lựa chọn
lọai đầu dò phù hợp.
Các yêu cầu sử dụng đầu dò trong kỹ thuật HPLC: Có tính chọn lọc, có
độ nhạy cao đối với chất phân tích, hoạt động ổn định và bền vững trong các
điều kiện phân tích, có vùng tuyến tính rộng. Không bị ảnh hƣởng hoặc ít bị
ảnh hƣởng bởi các tác động của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, áp suất, nhiệt độ.
Có độ nhiễu nền nhỏ.
Trên cơ sở đó, các lọai đầu dò sử dụng trong kỹ thuật HPLC sau:
19
- Đầu dò tử ngọai (UV), ứng vùng phổ 190 - 360nm.

- Đầu dò tử ngoại khả kiến (UV-VIS), ứng với vùng phổ 360 – 900 nm.
Đây là loại đầu dò thông dụng nhất.
- Đầu dò hùynh quang (RF): Đèn Xenon (Xe) cho vùng phổ 250 – 600
mm.
- Đầu dò khối phổ (MS).
- Đầu dò phổ phát xạ nguyên tử (ICP-AES), hấp thụ nguyên tử (AAS).
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo điện thế, đo độ dẫn nhiệt, đo chiết suất, hiệu ứng nhiệt,…
+ Bộ phận ghi nhận tín hiệu.
Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
Đối với các hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đại, phần này
đƣợc phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lƣu các thông số, sắc ký đồ, các
thông số liên quan, đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết
quả phân tích.
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ đƣợc in ra qua máy in kết nối với
máy tính.
1.4.2. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang
(HPLC-RF)[3].
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu nâng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF)
để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có
huỳnh quang.
Chiếu một chùm tia ánh sáng kích thích có bƣớc sóng xác định (λ ex) và
phát xạ huỳnh quang (λem) phù hợp với chất phân tích. Sử dụng nguồn phát
ánh sáng kích thích là đèn Xenon (Xe) cho vùng phổ 250 – 600 mm.
+ Buồng mẫu và môi trƣờng hấp thụ mẫu.
20
+ Hai bộ đơn sắc: Một bộ cung cấp ánh sáng kích thích, bộ còn lại thu
nhận chùm tia phát xạ huỳnh quang của chất phân tích.
+ Bộ thu nhận và khuếch đại tín hiệu.
Những hợp chất nhƣ vậy thƣờng có vòng liên hợp nhƣ các hợp chất
vòng thơm có nhiều nhân. Nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể
chuyển sang các dẫn xuất có phổ này nhờ xử lý với những thuốc thử thích
hợp.
1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích
tinopal CBS X[9],[10],[11] [22],[23].
Từ năm 1970s, sắc ký lỏng hiệu năng cao đã đƣợc sử dụng để tách và
xác định FWAs trong chất tẩy rửa và mẫu môi trƣờng. Đến nay, có một số
nghiên cứu xác định FWAs nhƣ: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò
tử ngoại khả kiến HPLC/UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh
quang HPLC-RF, sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ LC/MS là một
phƣơng pháp để xác định FWAs trong các đối tƣợng mẫu nhƣ nguyên liệu
giấy, vải sợi, nguyên liệu vải sợi, sản phẩm bao bì chứa thực phẩm .
Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) hoặc (LC/MS/MS) tƣơng
đối đắt tiền, không dễ dàng hoạt động và không có nhiều phòng thí nghiệm
đƣợc trang bị.
Hiện nay, đã có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tinopal CBS-
X trong các đối tƣợng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau. Phƣơng pháp
kiểm tra sàng lọc tinopal CBS-X bằng cách soi dƣới ánh sáng đèn tử ngoại
UV 366 nm trong buồng tối. Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc ký
lỏng (HPLC) để định lƣợng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà có độ
nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhƣng đầu dò huỳnh quang đƣợc xem là có độ
chọn lọc, độ nhạy cao. Việc nghiên cứu phân tích tinopal CBS-X trong nền
21
mẫu thực phẩm nền tinh bột và một số sản phẩm nền tinh bột bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) là rất cần thiết.
1.4.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân tích sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC).
1.4.4.1. Phƣơng pháp chiết tách mẫu[4].
+ Chiết bằng dung môi: Dựa trên cơ sở của chất phân tích vào hai pha
lỏng không trộn lẫn vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi
chứa chất phân tích) đƣợc để trong một dụng cụ chiết, nhƣ phểu chiết bình
chiết. Và có hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố
quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hƣởng của nhiệt độ,
môi trƣờng axit. Hằng số Kpb là hằng số nhiệt động. Chiết theo kiểu này có
hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng liên tục. Trong phân tích, chiết tĩnh
đơn giản hơn và đƣợc ứng dụng nhiều hơn. Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá
trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo các yêu cầu nhƣ sau:
- Dung môi chiết phải tinh khiết cao, không có chất cần phân tích.
- Dung môi chiết phải hòa tan tốt các chất cần phân tích, nhƣng lại
không hòa tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết đƣợc hoàn toàn.
- Cân bằng quá trình chiết nhanh, để giải chiết đƣợc tốt.
- Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, riêng biệt các pha.
- Phải chọn môi trƣờng axit, pH, loại axit thích hợp.
- Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá
trình chiết.
- Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra đƣợc tốt.
Các dung môi chiết đƣợc sử dụng phổ biến nhất là metanol, acetonitril,
dichlometan, aceton, ethyl acetat, eter dầu hỏa,…. Bên cạnh đó ngƣời ta
thƣờng có khuynh hƣớng dùng nhiều dung môi tạo thành một hỗn hợp dung
22
môi chiết mẫu đặc biệt là trong phân tích kháng sinh, đa dƣ lƣợng thuốc bảo
vệ thực vật, các chất phân tích khác,... vì nhƣ vậy sẽ hoà tan tốt các hoạt chất
phân cực cũng nhƣ kém phân cực.
Ngoài việc chọn hệ dung môi thích hợp để chiết triệt để hơn các hoạt
chất ra khỏi dung môi thƣờng đƣợc hỗ trợ thêm một số kỹ thuật sau.
+ Chiết phân tán pha rắn (Matrix Solid Phase Dispersion Extraction).
Đây là một phƣơng pháp dùng cho các loại mẫu rắn trong đó quá trình
chiết tách và làm sạch đƣợc thực hiện trong cùng một công đoạn. Mẫu sau khi
say nhuyễn đƣợc trộn đều với một chất hấp phụ nhƣ C18, C8, florisil,… tạo
thành dạng bột tơi, sau đó hỗn hợp đƣợc nhồi vào cột sắc ký nhỏ, tạp chất và
dƣ lƣợng chất phân tích hấp phụ sẽ đƣợc rửa giải với những dung môi thích
hợp. Khuyết điểm của phƣơng pháp này là lƣợng mẫu phân tích bị giới hạn và
khó làm giàu mẫu.
1.4.4.2. Phƣơng pháp làm sạch mẫu[4].
+ Phƣơng pháp sắc ký loại trừ theo kích thƣớc (Size Exclusion
Chromatography - SEC).
Sắc ký loại theo cở hay còn gọi là sắc ký gel là một công cụ mạnh cho
phân tích các chất có khối lƣợng phân tử lớn.
Chất nhồi cột cho sắc ký này là các hạt nhỏ cở 10 µm bằng polime hoặc
silica chứa mạng lƣới các lỗ đồng nhất, trong đó các chất tan và dung môi có
thể khuếch tán vào.
Hầu hết sắc ký gel đƣợc thực hiện trên chất nhựa đồng trùng hợp giữa
divinyl benzene với styrene. Kích thƣớc lỗ của loại polime này đƣợc kiểm
soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến phần trăm
divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa. Vì vậy có nhiều loại gel với kích cở
lỗ khác nhau.
23
Những nhƣợc điểm của hạt silica là có khuynh hƣớng lƣu giữ chất tan
bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân hủy các
phân tử chất tan.
+ Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction- SPE).
Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật nhanh, tính chọn lọc và làm sạch
trƣớc khi phân tích sắc ký. SPE làm sạch các mẫu phân tích, độ thu hồi, và
cần thiết cho phân tích định lƣợng chính xác.
Nguyên lý hoạt động của cột chiết pha rắn là dựa vào tƣơng tác của các
chất có trong dịch chiết với pha động (dung môi), và pha tĩnh (chất hấp phụ
rắn). Pha tĩnh là các hạt nhỏ và xốp đƣờng kính 40 - 70 µm đƣợc nhồi trong
ống tiêm bằng nhựa, pha tĩnh SPE cũng đa dạng tƣơng tự nhƣ pha tĩnh của
sắc ký lỏng nhƣ cột C18, polystyrenedivinylbezen, amin, nhựa trao đổi anion,
nhựa trao đổi cation, carbon graphite, florisil, silica gel, và alumina. Có 2
hƣớng để làm sạch với SPE: cô lập chất phân tích hoặc cô lập nền mẫu.
1.5. Đánh giá phƣơng pháp phân tích[5].
1.5.1. Khoảng tuyến tính.
+ Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng
độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất
phân tích.
+ Khoảng làm việc của một phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ
giữa giới hạn trên và giới hạn dƣới của chất phân tích, tại đó có thể xác định
đƣợc bởi phƣơng pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính.
24
Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc[5].

Đối với hầu hết các phƣơng pháp định lƣợng, cần phải thực hiện việc
xác định khoảng tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thƣờng đƣợc
khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lƣợng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới
hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính tối
thiểu là 5 điểm nồng độ khác nhau.
Xây dựng đƣờng chuẩn ngoại: Chuẩn bị dãy nồng độ của đƣờng
chuẩn (tối thiểu 5 điểm nồng độ khác nhau). Xác định các giá trị đo đƣợc y
theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đƣờng
biểu diễn theo phƣơng trình có dạng:
y = ax+ b (1.1)
Trongđó:
a: Giá trị độ dốc (slope), hệ số góc.
b: Giá trị hệ số chặn (intercept), tung độ góc.
R: Hệ số tƣơng quan.
 
R
 ( xi  x)( yi  y)
(1.2)
 2 
 (x i  y) (y i  y)
Nếu 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt.

25
1.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ).
Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đƣợc. Đây là
nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng
chƣa thể định lƣợng đƣợc (đối với phƣơng pháp định lƣợng).
Cách xác định: Chỉ áp dụng đƣợc cho các phƣơng pháp có xây dựng
đƣờng chuẩn.
LOD có thể đƣợc xác định dựa vào hệ số góc của đƣờng chuẩn và độ
lệch chuẩn của tín hiệu đo.
(1.3)
(1.4)
Trongđó:
SD : Độ lệch chuẩn của tín hiệu;
a: Hệ số góc của đƣờng chuẩn
Giá trị a có thể dễ dàng tính đƣợc từ đƣờng chuẩn.
Giá trị SD có thể đƣợc tính theo nhiều cách khác nhau, bao gồm:
+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu trắng: Phân tích mẫu trắng lặp lại
10 lần và tính SD tƣơng ứng;
+ Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu thêm chuẩn ở nồng độ nhỏ gần
LOD, lặp lại 10 lần và tính SD;
+ Dựa trên hệ số chặn của đƣờng chuẩn, làm 10 lần để tính SD của giá
trị b;
+ Dựa trên độ lệch chuẩn của khoảng cách các giá trị đo thực với
đƣờng chuẩn.
Giới hạn định lƣợng là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu
thử mà ta có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp khảo sát và cho kết quả có độ
26
chụm mong muốn.

LOQ trong nhiều trƣờng hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng
tuyến tính.
Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính[5].
Cách tính tƣơng tự nhƣ trong phần LOD nhƣng theo công thức sau:
10 * SD
LOQ  (1.5)
a
1.5.3. Độ chụm
Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến
giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và đƣợc biểu thị định lƣợng
bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch
chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.
Độ chụm có thể đƣợc phân ra thành ba trƣờng hợp sau:
- Độ lặp lại (repeatability).
- Độ chụm trung gian (intermediate precision).
- Độ tái lập (reproducibility).
Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại ít nhất 6 lần trên cùng một mẫu. Mẫu
phân tích có thể là mẫu chuẩn, hoặc mẫu trắng có thêm chuẩn, tốt nhất là làm
trên mẫu thử hay mẫu thử thêm chuẩn.
27
Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc, mỗi nồng
độ làm lặp lại ít nhất 6 lần. Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tƣơng
đối RSD hay hệ số biến thiên CV.
Giá trị trung bình số học: đƣợc lấy làm ƣớc lƣợng cho độ lớn của đại
lƣợng đo, càng gần với giá trị thực khi số lần đo n càng lớn.
n
X i
X i 1
(1.6)
n
Độ lệch chuẩn (Độ lệch bình phƣơng trung bình):
SD
RSD%  CV %  *100 (1.7)
X
Trong đó:
SD: Độ lệch chuẩn, xem (1.4)
X : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm.
1.5.4. Độ đúng
Muốn xác định độ đúng cần phải tìm đƣợc giá trị đúng, có nhiều cách
khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm
với kết quả thực hiện bởi một phƣơng pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã
biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận) và phƣơng
pháp xác định hiệu suất thu hồi.
Độ thu hồi đƣợc tính theo công thức:
- Đối với mẫu thử:
Cmc  Cm
H (%)  *100 (1.7)
C0
- Đối với mẫu trắng:
Ctt
H (%)  *100 (1.8)
C0
28
Trong đó:
- H%: Độ thu hồi, (%).
- Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn (µg/kg).
- Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/kg).
- C0: Nồng độ chuẩn thêm lý thuyết (µg/kg).
- Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (µg/kg).
Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm
lặp lại.
29
Chƣơng 2
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1. Hóa chất và thiết bị.

2.1.1. Hóa chất[1].
Các dung môi hóa chất sử dụng thuộc loại tinh khiết phân tích, nƣớc cất
hai lần không chứa chất phân tích.
+ Chuẩn tinopal CBS-X (4,4’-bis(2-sulfostyryl)biphenyl disodium),
Toronto research chemical Tnc, Canada, Cat: #B53520 hoặc tƣơng đƣơng.
+ Tetrabutylammoni hydro sulphat (TBA), Tetra-n-butyl-ammonium
hydroxide (12,5% trong methanol).
+ Acetonitril (ACN), loại dùng cho HPLC.
+ Methanol (MeOH), loại dùng cho HPLC.
+ Axit Photphoric (H3PO4).
+ Axit Formic (HCOOH).
+ Amoni hydroxit (NH4OH).
+ Dung dịch NaOH 5M: Cân chính xác 20 g NaOH bằng cân phân tích
hoà tan bằng nƣớc cất vào bình định mức 100 ml, và định mức tới vạch, lắc
đều hỗn hợp.
+ Dung dịch TBA 0,4%:
Cân 4,0 g TBA khan bằng cân phân tích hoà tan bằng nƣớc cất vào
bình định mức 1000 ml rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp. Dùng máy đo
pH điều chỉnh pH tới 8,00  0,05, bằng dung dịch NaOH 5M. Lắc đều cho tan
hết.
Có thể sử dụng dung dịch TBA dung dịch 12,5% trong methanol pha
loãng đến nồng độ 0,4%. Dùng máy đo pH điều chỉnh pH tới 8,00  0,05
bằng dung dịch NaOH 5M.
30
+ Dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L: Cân 100,0 mg chất chuẩn tinopal
CBS-X bằng cân phân tích vào bình định mức 100 ml hoà tan và định mức
đến vạch bằng methanol (MeOH). Dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 2 – 8oC,
có thể sử dụng đƣợc trong 03 tháng.
- Nồng độ dung dịch chuẩn gốc đƣợc tính thực tế theo lƣợng chuẩn đã
cân và độ tinh khiết của chất chuẩn.
- Dung dịch chuẩn gốc đƣợc pha trong điều kiện tránh ánh sáng trực
tiếp và bảo quản trong lọ màu nâu.
+ Dung dịch chuẩn trung gian:
Dung dịch chuẩn 100 mg/L: Dùng pipet lấy chính xác 1,0 ml dung dịch
chuẩn gốc ở trên cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng
acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.
Dung dịch chuẩn 10,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml
dung dịch chuẩn 100 mg/L cho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch
bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4 lắc đều.
Dung dịch chuẩn 1,0 mg/L: Dùng micropipet lấy chính xác 1,0 ml dung
dịch chuẩn 10mg/Lcho vào bình định mức 10 ml, định mức tới vạch bằng
+ Dung dịch chuẩn khoảng tuyến tính: Dãy dung dịch chuẩn chạy sắc
ký có nồng độ 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 50,0 µg/L; 100,0 µg/L; 500,0 µg/L.
+ Dung dịch chuẩn làm việc: Dãy dung dịch chuẩn chạy sắc ký có nồng
độ 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 20,0 µg/L; 50,0 µg/L; 70,0 µg/L; 100,0 µg/L.
Sử dụng pipet ứng với từng thể tích hút với mỗi điểm chuẩn dung dịch
chuẩn 1,0 mg/L và các bình định mức 10 ml định mức tới vạch bằng
Xây dựng đƣờng chuẩn gồm từ 05 hoặc 06 điểm chuẩn. Các dung dịch
chuẩn làm việc đƣợc pha và sử dụng trong ngày.
31
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị[1].

+ Pipet cấp A: 1, 2, 5, 10 ml.
+ Ống ly tâm nhựa, loại 25, 50 ml.
+ Cốc có mỏ: 100, 250,ml.
+ Bình định mức các loại 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml.
+ Phễu lọc.
+ Màng lọc 0,45 µm.
+ Lọ đựng chất chuẩn màu nâu loại 100 ml.
+ Lọ đựng mẫu 1,5 ml.
+ Cân phân tích có độ chính xác 0,01 mg.
+ Máy nghiền mẫu.
+ Máy lắc Vortex.
+ Máy siêu âm.
+ Máy đo pH.
+ Máy ly tâm, có tốc độ 5000 vòng/phút.
+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - 20A) với đầu dò huỳnh
quang (RF-10Axl) – Shimadzu, cột phân tích C18 - Ecosil HPLC column C18
(250 mm x 4,6 mm x 5 µm).
2.2. Kỹ thuật xử lý mẫu bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở
2.2.1. Lựa chọn dung môi phù hợp.
Phƣơng pháp xử lý mẫu cho phân tích HPLC sử dụng dung môi chiết
phù hợp, việc chiết tinopal CBS-X trong mẫu từ tinh bột gạo và các sản phẩm
đƣợc chế biến từ nó, bằng các hệ dung môi chiết methanol có mặt H3PO4 hoặc
acetonitril có mặt H3PO4,...
Trong nghiên cứu của đề tài chỉ để cập đến hai dung môi dung để chiết,
tách mẫu.
+Acetonitril có mặt H3PO4.
32
+ Methanol có mặt H3PO4.

2.2.2. Khảo sát kỹ thuật chiết tách chất phân tích.
Có hai cách chiết:
Cách 1: Cân chính xác khoảng 5,00 g mẫu đã đồng nhất bằng cân phân
tích cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml, thêm 10 ml methanol có mặt H3PO4,
lắc trong 1 phút bằng máy lắc xoáy, sau đó rung siêu âm trong 20 phút. Ly
tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định
mức 25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml methanol có mặt H3PO4.
Gộp dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng methanol có mặt H3PO4. Lọc
dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ thống
HPLC[1].
Cách 2: Cân 5,00 g mẫu đã đồng nhất ở trên bằng cân phân tích vào
ống ly tâm dung tích 50 ml. Thêm 10 ml acetonitril có mặt H3PO4, lắc đều
trong 2 - 3 phút bằng máy lắc xoáy (vortex), tiếp theo siêu âm trong 20 phút.
Sau đó ly tâm ở tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào
bình định mức 25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml acetonitril có mặt
H3PO4. Gộp dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng acetonitril có mặt H3PO4.
Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ
thống HPLC.
Tiến hành khảo sát một số qui trình chiết nhƣ sau: bằng hai dung môi
methanol (MeOH) và acetonitril (ACN) và có mặt axit photphoric (H3PO4).
Bảng 2.1: Các hệ dung môi chiết trên nền mẫu tinh bột gạo.
Qui trình chiết Dung môi chiết
E1 MeOH
E11 1% H3PO4 trong MeOH
E14 3,5% H3PO4 trong MeOH
33

E2 ACN
E21 1% H3PO4 trong ACN
E24 3,5% H3PO4 trong ACN
2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch.

Sử dụng thiết bị ly tâm các dung dịch chiết cho lắng các huyền phù
trong dịch chiết. Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu
1,5 ml và tiêm vào hệ thống HPLC.
2.2.4. Pha loãng mẫu.
Đối với mẫu có hàm lƣợng cao vƣợt ngoài đƣờng chuẩn ta cần pha
loãng mẫu cho đến khi nồng độ của mẫu nằm trong khoảng đƣờng chuẩn, khi
tính toán kết quả cần phải tính đến hệ số pha loãng.
2.3. Kỹ thuật phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao –
đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
2.3.1. Chọn điều kiện sắc ký.
Thông số chung:
+ Cột phân tích: Ecosil HPLC column C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm)
hoặc loại tƣơng đƣơng.
+ Pha động: Cần khảo sát.
+ Nhiệt độ buồng cột: 40 0C.
+ Đầu dò huỳnh quang: ở λex = 350 nm và λem = 430 nm.
+ Thể tích bơm mẫu: 10 µL.
+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút. Cần khảo sát.
Điều kiện 1:
34
+ Cột phân tích: Ecosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) hoặc loại
tƣơng đƣơng.
+ Pha động: Acetonitrile : TBA 0,4%, pH = 8,0  0,05, tỷ lệ 60 : 40.
+ Nhiệt độ buồng cột 40 0C.
+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút. Cần khảo sát.
Điều kiện 2:
tƣơng đƣơng.
+ Pha động: MeOH: H2O, theo tỷ lệ Gradient dung môi:
+ Nhiệt độ buồng cột 400C.
+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút; Cần khảo sát.
Thiết lập khảo sát chƣơng trình gradient:
Bảng 2.2: Chƣơng trình hệ dung môi pha động methanol : nƣớc.
Gradient 0 Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 Gradient 4
T % T % T % T % T %
(phút) MeOH (phút) MeOH (phút) MeOH (phút) MeOH (phút) MeOH
0,01 10 0,01 10 0,01 30 0,01 50 0,01 50
- - 5,00 50 5,00 50 5,00 50 5,00 50
7,00 90 7,00 90 7,00 90 7,00 90 7,00 50
15,00 90 15,00 90 15,00 90 15,00 90 15,00 50
- - 17,00 50 17,00 50 17,00 50 17,00 50
20,00 10 20,00 10 20,00 30 20,00 50 20,00 50
30,00 30,00 30,00 30,00 30,00
35
Gradient 5 Gradient 6 Gradient 7 Gradient 8

T % T % T % T %
(phút) MeOH (phút) MeOH (phút) MeOH (phút) MeOH
0,01 50 0,01 50 0,01 50 0,01 50
5,00 50 5,00 50 5,00 50 5,00 50
7,00 60 7,00 70 7,00 80 7,00 95
15,00 60 15,00 70 15,00 80 15,00 95
17,00 50 17,00 50 17,00 50 17,00 50
20,00 50 20,00 50 20,00 50 20,00 50
30,00 30,00 30,00 30,00
Khảo sát tốc độ dòng: Với chƣơng trình gradient đã chọn lọc. Chúng
ta tiến hành khảo sát tốc độ dòng pha động: 0,5 ml/phút, 0,8 ml/phút, 1,0
ml/phút, 1,2 ml/phút.
2.3.2. Trình tự bơm mẫu, tính toán kết quả.
Khi tiến hành phân tích trên thiết bị HPLC theo trình tự bơm mẫu nhƣ
sau:
+ Mẫu trắng (dung môi).
+ Các điểm chuẩn của đƣờng chuẩn.
+ Mẫu thử (khoảng 10 mẫu thử).
+ Mẫu kiểm soát (điểm chuẩn hoặc mẫu thử thêm chuẩn).
Tính toán kết quả: Kết quả của mẫu thử đƣợc tính toán bằng cách dựa
vào đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn,
căn cứ vào diện tích pic mẫu thử tính hàm lƣợng tinopal CBS-X (µg/kg) và
đƣợc tính theo công thức sau:
36
C *V * F
X (2.1)
m
Trong đó :
V: Thể tích định mức dịch chiết cuối cùng chạy máy HPLC (ml).
C: Nồng độ tinopal CBS-X trong dịch chiết mẫu tính theo đƣờng chuẩn
(µg/L).
m: Khối lƣợng của mẫu phân tích (g).
F: Hệ số pha loãng (nếu có).
X: Hàm lƣợng tinopal CBS-X trong mẫu thử (µg/kg).
Yêu cầu về độ tin cậy của phƣơng pháp[1], [5]:
+ Khoảng làm việc của phƣơng pháp: Độ tuyến tính của đƣờng chuẩn
phải có hệ số tƣơng quan hồi quy 0,99 ≤ R2 ≤ 1.
+ Độ ổn định của thiết bị: RSD < 2 %.
+ Độ lặp lại của phƣơng pháp: RSD < 15 %.
+ Hiệu suất thu hồi: từ 70 % đến 110 %.
2.4. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu phân tích
Mẫu phải đƣợc lấy tại vị trí phản ánh đƣợc bản chất của sản phẩm. Đảm
bảo tính đại diện và đồng nhất của sản phẩm. Lƣợng mẫu lấy tối thiểu 200 g
để đồng nhất.
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Dụng cụ lấy mẫu phải sạch và không tƣơng tác với mẫu. Bao bì chứa
mẫu phải thật sạch, khô, không chứa chất gây nhiễm.
Mẫu thử phải còn nguyên vẹn, đƣợc chứa trong bao gói thích hợp
không có nhiễm bẩn, không có hƣ hỏng, bảo quản mẫu từ 0 oC đến 4 oC.
Sau khi lấy mẫu, mẫu phải đƣợc niêm yết / đậy kín và dán nhãn nhận
dạng để dễ dàng truy cập thông tin về mẫu. Mẫu phải đƣợc bảo quản thích
37
hợp để hạn chế đến mức thấp nhất việc thay đổi tính chất và đƣợc chuyển đến
phòng thí nghiệm trong thời gian sớm nhất.
2.4.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích
Đồng nhất mẫu thử, nghiền thô mẫu thử bằng dụng cụ nghiền thích hợp
và trộn kỹ. Mẫu đƣợc bảo quản lạnh tránh để mẫu tiếp xúc với ánh sáng nhiệt
độ trong thời gian dài. Trƣớc khi phân tích cần phải để mẫu đồng nhất ở nhiệt
độ phòng, rồi tiến hành phân tích.
38
Chƣơng 3
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định tinopal CBS-X.
Để tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định tinopal CBS-X, chúng ta phải
khảo sát các điều kiện của thiết bị phân tích trên sắc ký lỏng hiệu năng cao
đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) nhƣ chọn hệ dung môi pha động, thiết lập
chƣơng trình gradient và sự ảnh hƣởng tốc độ của dung môi pha động.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn tinopal CBS-X có nồng độ là 50 µg/L. Tiến
hành phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang
(HPLC-RF). Với các điều kiện đã nêu ở mục 2.3.1. Thực nghiệm thu đƣợc
những kết quả sau:
3.1.1. Chọn hệ dung môi pha động
+ Hệ pha động 1: Acetonitrile : Tetra-n-butyl-ammonium hydroxide
(TBA) 0,4%, pH = 8,0  0,05, tỷ lệ 60 : 40.
[E,E]-Tinopal CBS-X
[E,Z]- Tinopal CBS-X
39
+ Hệ pha động 2: Methanol (MeOH): Nƣớc (H2O).
Tinopal CBS-X
Nhận xét:
Hệ pha động 1 cho ra 2 pic gần nhau dạng đồng phân của tinopal CBS-
X ([E,Z]-DSBP, [E,E]-DSBP) tách không rõ.
Hệ pha động 2 thể hiện 1 pic rõ ràng không tách hai dạng đồng phân
của tinopal CBS-X nhƣng chân pic hơi bị tù phía bên trái. Vì vậy, để tính toán
kết quả phải tính tổng các dạng đồng phân, ta chọn hệ dung môi pha động 2
tiếp tục khảo sát các thông số khác.
3.1.2. Khảo sát chƣơng trình gradient.
Từ khảo sát hệ pha động, chọn hệ pha động 2 để khảo sát chƣơng trình
gradient (GRA). Thực nghiệm thu đƣợc kết quả sau:
40
GRA-3
GRA-2
GRA-8
GRA-7
GRA-1
GRA-6
GRA-5
GRA-0
GRA-4
Hình 3.3: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X theo chƣơng trình
gradient.
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát cho ta thấy chƣơng trình gradient 3 cho
pic tốt và có độ nhạy cao hơn các chƣơng trình gradient khác.
3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ pha động.
Với chƣơng trình gradient tối ƣu là chƣơng trình gradient 3 ta tiến hành
thay đổi tốc độ dòng dung môi pha động.
Tốc độ dòng pha động (v): 0,5 ml/phút, 0,8 ml/phút, 1,0 ml/phút, 1,2
ml/phút.
41
v = 1,0 ml/phút
v = 0,8 ml/phút
v = 1,2 ml/phút
v = 0,5 ml/phút
Hình 3.4: Sắc ký đồ của chuẩn tinopal CBS-X theo tốc độ dòng dung
môi pha động.
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát cho ta thấy tốc độ dòng dung môi pha
động là 1,0 ml/phút cho pic rõ và đẹp nhất.
3.2. Khảo sát qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X.
Khảo sát qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X bằng hai hệ dung môi
chiết acetonitril và methanol có mặt axit photphoric (H3PO4). Xem xét sự ảnh
huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu suất thu hồi của quá
trình chiết.
Bảng 3.1: Ảnh huởng của nồng độ axit photphoric (H3PO4) đến hiệu
suất thu hồi của quá trình chiết.
Nồng độ H3PO4 (%)
Dung môi chiết
0,0 1,0 2,0 3,0 3,5 4,0
MeOH 0,00 0,77 1,88 18,04 24,19 41,47
ACN 0,00 0,08 14,31 28.22 41,71 73,91
42
Hình 3.5: Giản đồ biểu thị hiệu suất chiết tinopal CBS-X bằng MeOH
và ACN.
(a) (b)
Hình 3.6: Khảo sát hai qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X. (a)
methanol có mặt axit photphoric (H3PO4), (b) acetonitril có mặt axit
photphoric (H3PO4).
43
Nhận xét: Dựa vào giản đồ cho ta thấy: Hiệu suất thu hồi tăng theo
nồng độ axit có trong dung môi, điều này là do dạng chiết của tinopal CBS-X
vào pha hữu cơ là dạng axit. Hiệu suất thu hồi bằng dung môi acetonitril có
mặt axit photphoric tốt hơn dung môi methanol có mặt axit photphoric.
Từ các kết quả khảo sát các thông số điều kiện của dung môi chiết
thông qua điều kiện phân tích trên HPLC - RF, hiệu suất thu hồi quá trình
chiết mẫu ta có đƣợc:
- Điều kiện phân tích trên HPLC - RF:
tƣơng đƣơng.
+ Pha động: MeOH: H2O.
Bảng 3.2: Chƣơng trình theo tỷ lệ Gradient dung môi.
T (phút) 0,01 5 7 15 17 20 30
MeOH (%) 50 50 90 90 50 50 50
H2O (%) 50 50 10 10 50 50 50
+ Nhiệt độ buồng cột 40 0C.

+ Tốc độ dòng pha động: 1,0 mL/phút.
- Qui trình tối ƣu chiết tinopal CBS – X trong nền mẫu tinh bột gạo:
Cân 5,00 g mẫu đã đồng nhất ở trên bằng cân phân tích vào ống ly tâm dung
tích 50 ml. Thêm 10 ml acetonitril có mặt 4% H3PO4, lắc đều trong 2 - 3 phút
bằng máy lắc xoáy (vortex), tiếp theo siêu âm trong 20 phút. Sau đó ly tâm ở
tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút. Gạn lấy dịch trong vào bình định mức
25 ml. Tiếp tục chiết lặp lại lần 2 với 10 ml acetonitril có mặt 4% H3PO4. Gộp
dịch chiết và định mức đến 25 ml bằng acetonitril có mặt 4% H3PO4. Lọc dịch
44
chiết qua màng lọc 0,45 µm rồi chuyển vào lọ mẫu và tiêm vào hệ thống sắc
ký lỏng hiệu năng cao.
Với các điều kiện khảo sát trên thiết bị và qui trình chiết tách mẫu ra
khỏi nền mẫu bột gạo đã phù hợp cho một phƣơng pháp phân tích. Tiến hành
đánh giá phƣơng pháp phân tích tinopal CBS-X trên nền mẫu bột gạo.
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
Qua các kết quả khảo sát trên ta tiến hành xây dựng khoảng tuyến tính
và đƣờng chuẩn, phân tích mẫu để đánh giá phƣơng pháp phân tích.
3.3.1. Khoảng tuyến tính
Xây dựng khoảng tuyến tính gồm các điểm chuẩn 1,0 µg/L; 10,0 µg/L;
50,0 µg/L; 100,0 µg/L; 500,0 µg/L.
Bảng 3.3: Khoảng tuyến tính của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
STT 1 2 3 4 5
Nồng độ (µg/L) 1,0 10,0 50,0 100,0 500,0
Diện tích 209878 1462753 7041749 13284177 50013568
Hình 3.7: Đồ thị khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X.
45
Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X

Xây dựng đƣờng chuẩn gồm các điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến
tính 1,0 µg/L; 10,0 µg/L; 20,0 µg/L; 50,0 µg/L; 70,0 µg/L; 100 µg/L.
Bảng 3.4: Đƣờng chuẩn của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký lỏng
hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
STT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ (µg/L) 1,0 10,0 20,0 50,0 70,0 100,0
Diện tích 199528 1824153 3342337 8628027 11650719 17265261
Hình 3.9: Đồ thị của đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.

46
Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X.

Nhận xét: Đƣờng chuẩn của tinopal CBS-X có phƣơng trình tuyến tính
bậc nhất y = 170751x + 8607,1 và hệ số tƣơng quan r2 = 0,9993.
Bảng 3.5: Độ lặp lại tại nồng độ 20 µg/L, 50 µg/L chất chuẩn tinopal
CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
Trung bình Độ lặp lại
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/L) %RSD
Nồng độ 20
18,9 19,0 19,0 19,1 19,1 18,8 19,00 0,67
µg/L
Nồng độ 50
48,9 49,2 48,7 49,0 49,0 49,3 49,02 0,46
µg/L
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tƣơng đối của chất chuẩn tinopal CBS-X trên
sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang nhỏ hơn 2% thỏa mãn yêu cầu
phép phân tích.
47
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Thực hiện 10 mẫu song song trên nền mẫu trắng (mẫu không chứa chất
phân tích) có thêm nồng độ dung dịch chuẩn tinopal CBS-X là 1,00 µg/L.
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
Nồng độ Nồng độ
trên dịch trên 5g
STT Diện tích
chiết mẫu/25ml
(µg/L) (µg/kg)
1 175185 0,98 4,88
2 180721 1,01 5,04
3 179953 1,00 5,02
4 180586 1,01 5,04
5 179345 1,00 5,00
6 183675 1,03 5,13
7 177899 0,99 4,96
8 171521 0,95 4,77
9 177874 0,99 4,96
10 173068 0,96 4,82
Giá trị trung bình: 177982,7 0,99 4,96
Độ lặp lại %RSD: 2,10 2,21 2,21
LOD (µg/L) 0,07
LOQ (µg/L) 0,22
Nhận xét:
Giới hạn phát hiện của Tinopal CBS-X tính theo dung dịch chuẩn là
0,07 µg/L và giới hạn định lƣợng của Tinopal CBS-X tính theo dung dịch
chuẩn là 0,22 µg/L. Giới hạn phát hiện của Tinopal CBS-X tính trên nền mẫu
thử với lƣợng cân 5,00 g mẫu thử và chiết với lƣợng dung môi chiết là 25 ml,
LOD là 0,35 µg/kg và LOQ là 1,1 µg/kg.
48
Khi thực hiện giới hạn phát hiện trên nền mẫu thử, ta thêm nồng độ 0,3
µg/L trong 5,00 g mẫu thử và chiết với lƣợng dung môi chiết là 25 ml. Khi
đó, giới hạn phát hiện trên nền mẫu thử là 1,50 µg/kg, giới hạn định lƣợng
trên nền mẫu thử là 4,995 µg/kg.
3.3.3. Độ chính xác của phƣơng pháp
ể đánh giá độ chính xác của phƣơng pháp ta thực hiện đánh giá độ
chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi).
Tiến hành thực hiện phân tích trên các nền mẫu giả nhƣ (bột gạo, hủ
tiếu, bún, bánh phở,..).
+ Trên nền mẫu bột gạo: Cân 5,00 g mẫu thêm dung dịch chuẩn vào
nền mẫu ứng với các nồng độ sau: hút 3,5 ml từ dung dịch tinopal CBS-X có
nồng độ 100,0 µg/L; hút 1,25 ml; 2,0 ml từ dung dịch tinopal CBS-X có nồng
độ 1,0 mg/L và tiến hành chiết mẫu với 25 ml dung môi chiết. Thực nghiệm
thu đƣợc kết quả sau:
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Bột (µg/kg) 21,1 25,6 27,7 21,2 26,3 25,5 24,6 11,2
Bột + C 70
79,3 89,6 85,0 76,1 84,1 87,3 83,5 6,0
(µg/kg)
Độ thu hồi
70,6 74,2 73,0 70,2 76,2 83,1 74,5 6,4
(%)
49
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Bột (µg/kg) 21,1 25,6 27,7 21,2 26,3 25,5 24,6 11,2
Bột + C 250
209,4 226,4 222,4 224,2 224,3 237,5 224,0 4,0
(µg/kg)
Độ thu hồi
68,5 76,6 75,0 84,8 81,5 89,4 79,3 9,4
(%)
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Bột (µg/kg) 21,1 25,6 27,7 21,2 26,3 25,5 24,6 11,2
Bột + C 400
348,4 351,0 342,2 356,4 359,6 362,1 353,5 2,1
(µg/kg)
Độ thu hồi
79,3 74,0 74,5 83,1 84,0 82,2 79,5 5,5
(%)
Nhận xét: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bột gạo tại nồng độ 70, 250, 400 µg/kg có thể chấp nhận và đáp ứng
đƣợc yêu cầu đặt ra nhƣ độ lặp lại trên nền mẫu thật là 11,2 %, trên mẫu thật
thêm chuẩn là từ 2,1 % đến 6,0 %, hiệu suất thu hồi là 68,5 % đến 89,4 %.
+ Trên nền mẫu bún: Cân 5,00 g mẫu thêm dung dịch chuẩn vào nền
mẫu ứng với các nồng độ sau: hút 3,5 ml từ dung dịch tinopal CBS-X có nồng
độ 100,0 µg/L và tiến hành chiết mẫu với 25 ml dung môi chiết. Thực nghiệm
thu đƣợc kết quả sau:
50
mẫu bún tại nồng độ 70 µg/kg.
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Bún
0 0 0 0 0 0 0 0
(µg/kg)
Bún + C 70
49,2 49,8 49,6 48,2 50,5 50,0 49,6 1,6
(µg/kg)
Độ thu hồi
73,0 72,2 71,6 74,4 67,6 79,7 73,1 5,4
(%)
+ Trên nền mẫu hủ tiếu: Cân 5,00 g mẫu thêm dung dịch chuẩn vào
nồng độ 100,0 µg/L và tiến hành chiết mẫu với 25 ml dung môi chiết. Thực
nghiệm thu đƣợc kết quả sau:
mẫu hủ tiếu tại nồng độ 70 µg/kg.
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Hủ tiếu
24,1 26,7 28,5 25,5 21,1 26,7 25,4 10,1
(µg/kg)
Hủ tiếu + C
72,7 78,9 79,2 76,4 76,9 80,4 77,4 3,5
70 (µg/kg)
Độ thu hồi
73,0 70,2 69,6 75,2 81,2 72,3 73,6 5,8
(%)
+ Trên nền mẫu bánh phở: Cân 5,00 g mẫu thêm dung dịch chuẩn vào
nồng độ 100,0 µg/L và tiến hành chiết mẫu với 25 ml dung môi chiết. Thực
nghiệm thu đƣợc kết quả sau:
51
mẫu bánh phở tại nồng độ 70 µg/kg.
STT 1 2 3 4 5 6
(µg/kg) %RSD
Bánh phở
0 0 0 0 0 0 0 0
(µg/kg)
Bánh phở + C
46,2 50,3 46,9 44,7 47,6 53,7 48,2 6,7
70 (µg/kg)
Độ thu hồi
68,0 80,2 70,3 69,6 68,7 77,5 72,4 7,1
(%)
Nhận xét: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bún, hủ tiếu, bánh phở tại nồng độ 70 µg/kg, có thể chấp nhận đƣợc yêu
cầu đặt ra nhƣ độ lặp lại trên nền mẫu thật là 10,1 % , trên mẫu thật thêm
chuẩn là từ 1,6 % đến 6,7 %, hiệu suất thu hồi là 67,6 % đến 81,2 %.
Bảng 3.13: Tóm tắt đánh giá phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tinopal
CBS-X trên nền tinh bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,...
Hiệu suất
Nồng độ Trung bình Độ lặp lại Độ lặp lại
Nền mẫu thu hồi
(µg/kg) (µg/kg) Sr(µg/kg) %RSD
(%)
- 24,6 2,8 11,2 -
70 83,6 5,0 6,0 74,5
Tinh bột gạo
250 224,0 9,0 4,0 79,3
400 353,3 7,5 2,1 79,5
- - - - -
Bún
70 49,6 0,8 1,6 73,1
- 25,4 2,6 10,1 -
Hủ tiếu
70 77,4 2,7 3,7 73,6
- - - - -
Bánh phở
70 48,2 3,2 6,7 72,4
52
Nhận xét: Phƣơng pháp HPLC-RF xác định tinopal CBS-X có trong
tinh bột gạo và các sản phẩm đƣợc chế biến từ tinh bột gạo với đƣờng chuẩn
có hệ số tƣơng quan r2 = 0,9993 và có giới hạn phát hiện là 0,35 µg/kg, giới
hạn định lƣợng là 1,10 µg/kg. Hiệu thu hồi trên các nền mẫu, mẫu thêm chuẩn
khác nhau từ 67,6 - 89,4 %, hiệu suất thu hồi trung bình lớn hơn 72,4 %, độ
chính xác trên các nền mẫu, mẫu thêm chuẩn khác nhau từ 1,6% đến 11,2%.
Do đó, tinopal CBS-X trong tinh bột gạo và các sản phẩm đƣợc chế biến từ
tinh bột gạo có thể đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký lỏng
hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang.
3.4. Xác định tinopal CBS-X trong các mẫu thực.
Thống kê kết quả phân tích tinopal CBS-X trên các mẫu thực (tinh bột
gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,...) trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp do Công ty Sắc
ký Hải Đăng thực hiện từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013 các mẫu nhƣ: tinh
bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,...... (Phòng phân tích thử nghiệm thuộc Trung
tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng dụng Khoa học Công nghệ Đồng Tháp gửi
mẫu cho Công ty Sắc ký Hải Đăng).
Kết quả phân tích

Nền mẫu Không phát hiện
Hàm lƣợng Hàm lƣợng
(LOD = 0,1)
≤ 1,00 mg/kg > 1,00 mg/kg
mg/kg
Bột gạo, 4 mẫu 4 - -
Bún, 26 mẫu 19 3 4
Hủ tiếu, 5 mẫu 3 1 1
Bánh phở, 2 mẫu 1 - 1
Sản phẩm khác, 23 mẫu 18 - 5
53
Nhận xét: Qua bảng thống kê số liệu thí sản phẩm bột gạo, bún, hủ
tiếu, bánh phở và các sản phẩm khác ta có một số nhận xét nhƣ sau:
Đối với sản phẩm bột gạo phân tích 4 mẫu không có mẫu nhiễm.
Đối với sản phẩm bún phân tích 26 mẫu có 7 mẫu nhiễm. Trong đó có
3 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức ≤ 1,0 mg/kg, và có 3 mẫu nhiễm với hàm
lƣợng ở mức >1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất là 3,15 mg/kg.
Đối với sản phẩm hủ tiếu phân tích 5 mẫu có 2 mẫu nhiễm. Trong đó
có 1 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức ≤ 1,0 mg/kg, và có 1 mẫu nhiễm với
hàm lƣợng ở mức >1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất là 6,98 mg/kg.
Đối với sản phẩm phở phân tích 2 mẫu có 1 mẫu nhiễm. Trong đó có 1
mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức >1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất là 14,0 mg/kg.
Đối với sản phẩm khác phân tích 23 mẫu có 5 mẫu nhiễm. Trong đó có
5 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức > 1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất là 6,73 mg/kg.
Từ tháng 11 đến tháng 12 năm 2013, chúng tôi tiến hành thử nghiệm
phân tích tinopal CBS-X bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang
và có gửi mẫu phân tích so sánh kết quả với Công ty Sắc ký Hải Đăng kết quả
của các mẫu thử tƣơng đối giống nhau. Nhƣng giới hạn phát hiện của Công ty
Sắc ký Hải Đăng thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bằng đầu
dò UV là 0,1 mg/kg. Còn giới hạn phát hiện tại phòng Phân tích Thí nghiệm
là 0,005 mg/kg.
Bảng 3.15: So sánh kết quả phân tích tinopal CBS-X giữa hai phòng thí
nghiệm.
Công ty Sắc ký Hải Phòng phân tích thử
Nền mẫu So sánh
Đăng nghiệm
Không phát hiện Không phát hiện
Bột gạo Giống nhau
(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg
Bột gạo Giống nhau
(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg
Bún tƣơi Không phát hiện Không phát hiện Giống nhau
54
(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg

Bún tƣơi Giống nhau
(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg
Bún tƣơi Giống nhau
(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg
Từ những kết quả đạt đƣợc trên, tiến hành triển khai phƣơng pháp xác
định tinopal CBS-X trên nền mẫu nhƣ: tinh bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở và
một số sản phẩm khác.
Kết quả phân tích tinopal CBS-X từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2014 trên
các mẫu thực (tinh bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,...) trên địa bàn tỉnh Đồng
Tháp.
Kết quả phân tích

Nền mẫu Không phát hiện
Hàm lƣợng ≤ Hàm lƣợng
(LOD = 0.005)
1.00 mg/kg > 1.00 mg/kg
mg/kg
Bột gạo, 1 mẫu 1 - -
Bún, 14 mẫu 14 - -
Hủ tiếu, 7 mẫu 6 1 -
Bánh phở - - -
Sản phẩm khác, 8 mẫu 6 2 -
Nhận xét: Qua bảng thống kê số liệu sản phẩm bột gạo, bún, bánh phở
không có nhiễm tinopal CBS-X. Đối với các sản phẩm khác phân tích 8 mẫu
có 2 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức ≤ 1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất là 0,34
mg/kg. Đối với sản phẩm hủ tiếu phân tích 7 mẫu có 1 mẫu nhiễm với hàm
lƣợng là 0,10 mg/kg.
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Qua thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài xác định hàm lƣợng tinopal
CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột và các sản phẩm của chúng. Đánh giá
phƣơng pháp phân tích và một số kết quả phân tích các mẫu thực tƣơng đối
khách quan. Chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:
1- Đã xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF) để phân tich tinopal CBS-X.
Với cột phân tích: Ecosil C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), pha động: MeOH:
H2O theo chƣơng trình Gradient dung môi ở bảng 3.2, nhiệt độ buồng cột 40
0
C, đầu dò huỳnh quang ở λex = 350 nm và λem = 430 nm, thể tích bơm mẫu là
10 µl, tốc độ dòng pha động là 1,0 ml/phút.
2- Đã khảo sát và tìm phƣơng pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lƣợng
Tinopal CBS-X trong tinh bột gạo, với hệ dung môi là acetonitril có mặt 4%
H3PO4. Hiệu suất thu hồi mẫu là 73,91 %.
3- Đã khảo sát và tìm đƣợc khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn phân
tích chất tinopal CBS-X bằng HPLC-RF nằm trong khoảng 1µg/L đến 100
µg/L, có phƣơng trình tuyến tính bậc nhất y = 170751x + 8607,1 và hệ số
tƣơng quan r2 = 0,9993.
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang nhỏ hơn 2% thỏa mãn yêu cầu phép
phân tích.
Giới hạn phát hiện của tinopal CBS-X tính theo dung dịch chuẩn là
0,07 µg/L và giới hạn định lƣợng của tinopal CBS-X tính theo dung dịch
chuẩn là 0,22 µg/L, tính trên nền mẫu thử với lƣợng cân 5,00 g mẫu thử và
chiết với lƣợng dung môi chiết là 25 ml, LOD là 0,35 µg/kg và LOQ là 1,1
µg/kg.
56
4- Đánh giá hiệu thu hồi trên các nền mẫu, mẫu thêm chuẩn khác nhau
từ 67,6 - 89,4 %, hiệu suất thu hồi trung bình lớn hơn 72,4 %, độ chính xác
trên các nền mẫu, mẫu thêm chuẩn khác nhau từ 1,6% đến 11,2%. Do đó,
tinopal CBS-X trong tinh bột gạo và các sản phẩm đƣợc chế biến từ tinh bột
gạo có thể đƣợc phát hiện bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng
cao đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
5- Tiến hành phân tích tinopal CBS-X trên các mẫu thực (tinh bột gạo,
bún, hủ tiếu, bánh phở,...) trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp, từ tháng 7 đến tháng
12 năm 2013, tổng số mẫu phân tích tinopal CBS-X là 60 mẫu có 15 mẫu
nhiễm chiếm 25 %. Trong đó có 4 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức ≤ 1,0
mg/kg, và có 11 mẫu nhiễm với hàm lƣợng ở mức >1,0 mg/kg, mẫu lớn nhất
là 14,0 mg/kg (Công ty Sắc ký Hải Đăng phân tích). Thử nghiệm phân tích
tinopal CBS-X bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang so sánh
kết quả với Công ty Sắc ký Hải Đăng cho kết quả của các mẫu thử (bột gạo,
bún) tƣơng đối giống nhau.
6- Tiến hành phân tích các mẫu thực từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2014,
tại Đồng Tháp, với tổng số mẫu phân tích tinopal CBS-X là 30 mẫu chúng tôi
đã phát hiện có 3 mẫu nhiễm chiếm 10 %, với hàm lƣợng ở mức ≤ 1,0 mg/kg,
mẫu lớn nhất là 0,34 mg/kg.
Nhìn chung, qua hai đợt phân tích các mẫu thực trên địa bàn tỉnh Đồng
Tháp, chất tinopal CBS-X trong các nền mẫu có giảm. Các cơ sở sản xuất và
kinh doanh sản phẩm bột gạo và các sản phẩm chế biến từ bột gạo nhƣ: bún,
hủ tiếu, bánh phở, các sản phẩm khác,… đã ý thức đƣợc tác hại của chất
tinopal CBS-X làm ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. Các cơ quan có thẩm
quyền cần phải thƣờng xuyên giám sát các cơ sở sản xuất và kinh doanh này
một cách chặt chẽ.
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
[1]- Công văn số 1731/ATTP-KN ngày 16 tháng 08 năm 2013 của Cục
An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế về việc áp dụng quy trình kiểm nghiệm
Tinopal CBS-X trong thực phẩm.
[2]- Lâm Ngọc Thụ (2005), Cơ sở hóa học phân tích. Nhà xuất bản Đại
học quốc gia Hà Nội.
[3]- Nguyễn Khắc Nghĩa, Các phƣơng pháp sắc ký trong phân tích,
Trƣờng Đại học Vinh.
[4]- TS. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phƣơng pháp cô lập hợp chất
hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
[5]- Thẩm định phƣơng pháp trong phân tích hóa học và sinh vật
(2010), Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Nhà xuất bản
khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
Tiếng Anh
[6]- Ciba Specialty Chemicals, Additives, (1999), Optical Brighteners,
Fluorescent Whitening Agents for Plastics, Paints, Imaging and Fibers.
[7]- Ciba Specialty Chemicals, (Inc. 2004). Human and environmental
risk assessment on ingredients of European household cleaning products:
Fluorescent Brightener FWA-1.
[8]- Ciba Specialty Chemicals, (Inc. 2004). Human and environmental
risk assessment on ingredients of European household cleaning products:
Fluorescent Brightener FWA-5.
[9]- Hsin-Chang Chen, Shu-Ping Wang, Wang-Hsien Ding, (2005),
Determination of fluorescent whitening agents in environmental waters by
58
solid-phase extraction and ion pair liquid chromatography tandem mass

spectrometry, Journal of Chromatography A, 1102 (2006) 135–142.
[10]- Hsin-Chang Chen, Wang-Hsien Ding, (2006), Hot-water and
solid-phase extraction of fluorescent whitening agents in paper materials and
infant clothes followed by unequivocal determination with ion - pair
chromatography - tandem, Journal of Chromatography A, 1108, 202–207.
[11]- Jeong Soo Kim, Do Hwan Kim, and Keon Kim, (2012);
Determination of Fluorescent Whitening Agents in Paper Materials by Ion-
Pair Reversed - Phase High - Performance Liquid Chromatography, Bull.
Korean Chem. Soc. 2012, Vol. 33, No. 12.
[12]- L. Lepri, P. G. Desideri and W. Coas, (1984), High-performance
thin-layer Chromatography of fluorescent whitening agents and their
identification in detergents, Journal of Chromatography, 322 (1985) 363-370.
[13]- Mai-Ling Jao, Mei-Ing Liao, Chung-Tzu Hang, Chieu-Chen
Cheng and Shin-Shu Chou, (1999); Studies on Analytical Method for
Determination of Fluorescent Whitening Agent in Paper Containers for Food,
Journal of Food and Drug Analysis, 53-63.
[14]- M. Uchiyama, (1978), Separation and determination of
fluorescent whitening agent and alkyl benzenesulfonate in water, Water
Research Vol. 13, pp. 847 to 853.
[15]- Mario de los Santos, Ramon Batlle, Jesus Salafranca, Cristina
Nerin, (2004), Subcritical water and dynamic sonication-assisted solvent
extraction of fluorescent whitening agents and azo dyes in paper samples,
Journal of Chromatography A, 1064 (2005) 135–141.
[16]- Philip Horsch, Andreas Speck, Fritz H Frimmel, (2003),
Combined advanced oxidation and biodegradation of industrial effluents from
59
the production of stilbene-based fluorescent whitening agents, Water

Research 37 (2003) 2748–2756.
[17]- Pascal Wong-Wah-Chung, Gilles Mailhot, Jean-Pierre Aguer,
Michele Bolte, (2006), Fate of a stilbene-type fluorescent whitening agent
(DSBP) in the presence of Fe(III) aquacomplexes: From the redox process to
the photodegradation, Chemosphere 65 (2006) 2185–2192.
[18]- P. Wong-Wah-Chung, G. Mailhot, M. Bolte, (2001), 4,4’-
Diaminostilbene-2,2’-disulfonate (DSD) behaviour: under irradiation in
water. Decrease of its activity as a fluorescent whitening agent, Journal of
Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 138 (2001) 275–280.
[19]- R. N. Sturm and k. E. Williams, k. J. Macek, (1974), Fluorescent
whitening agents: Acute fish toxicity and accumulation studies, Water
Research Vol. 9. pp 211 to 219.
[20]- Satoshi Managaki, Hideshige Takada, (2004), Fluorescent
whitening agents in Tokyo Bay sediments: Molecular evidence of lateral
transport of land-derived particulate matter, Marine Chemistry 95 (2005)
113– 127.
[21]- Satoshi Managaki, Hideshige Takada, Dong-Myung Kim,
Toshihiro Horiguchi, Hiroaki Shiraishi, (2006), Three-dimensional
distributions of sewage markers in Tokyo Bay water fluorescent whitening
agents (FWAs), Marine Pollution Bulletin 52 (2006) 281–292.
[22]- Wei-Chuan Shu, Wang-Hsien Ding, (2005), Determination of
fluorescent whitening agents in laundry detergents and surface waters by
solid-phase extraction and ion-pair high-performance liquid chromatography,
Journal of Chromatography A, 1088 (2005) 218–223.
[23]- Wei-Chuan Shu, Wang-Hsien Ding (2009), Determination of
Fluorescent Whitening Agents in Infant Clothes and Paper Materials by Ion-
60
pair Chromatography and Fluorescence Detection, Journal of the Chinese

Chemical Society, 56, 797-803.
Trang web
[24]- fdlserver.files.wordpress.com/2008/06/tinhbotthucpham.pdf.
[25]- http://phantichmoitruong.com.
[26]- http://www.heraproject.com/RiskAssessment.cfm.
[27] - http://www.sites.ext.vt.edu/newsletter-archive.
[28]- www.google.com.vn.
1
PHỤ LỤC
1. Khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X

STT 1 2 3 4 5
Nồng độ (ug/L) 1,0 10,0 50,0 100,0 500,0
Diện tích 209878 1462753 7041749 13284177 50013568
2. Đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.

STT 1 2 3 4 5 6
Nồng độ (ug/L) 1,0 10,0 20,0 50,0 70,0 100,0
Diện tích 199528 1824153 3342337 8628027 11650719 17265261
2
3. Tính toán số liệu.
Kết Kết
Diện tích Co H
Tên mẫu m (g) Vđm quả, quả,
pic (µg/L) (%)
(µg/kg) (mg/kg)
BUN-1 5.1720 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
BUN-2 5.0240 0 -0.05 25 -0.3 -0.0003
BUN-3 5.0263 0 -0.05 25 -0.3 -0.0003
BUN-4 5.1472 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
BUN-5 5.2740 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
BUN-6 5.1726 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
BUN+C1-1 5.1690 1745276 10.17 25 49.2 0.0492 73.0
BUN+C1-2 5.0483 1725585 10.06 25 49.8 0.0498 72.2
BUN+C1-3 5.0273 1713014 9.98 25 49.6 0.0496 71.6
BUN+C1-4 5.3710 1777257 10.36 25 48.2 0.0482 74.4
BUN+C1-5 4.6618 1615757 9.41 25 50.5 0.0505 67.6
BUN+C1-6 5.5491 1903447 11.10 25 50.0 0.0500 79.7
HT-1 6.0674 1008150 5.85 25 24.1 0.0241
HT-2 5.5948 1029277 5.98 25 26.7 0.0267
HT-3 5.7681 1130682 6.57 25 28.5 0.0285
HT-4 5.6264 986758 5.73 25 25.5 0.0255
HT-5 5.4271 790833 4.58 25 21.1 0.0211
HT-6 5.8142 1069150 6.21 25 26.7 0.0267
HT+C1-1 5.2606 2621143 15.30 25 72.7 0.0727 73.0
HT+C1-2 4.7014 2543403 14.85 25 78.9 0.0789 70.2
HT+C1-3 4.8018 2606339 15.21 25 79.2 0.0792 69.6
HT+C1-4 5.1640 2703539 15.78 25 76.4 0.0764 75.2
HT+C1-5 5.0943 2683760 15.67 25 76.9 0.0769 81.2
HT+C1-6 4.7162 2597251 15.16 25 80.4 0.0804 72.3
BG-1 5.2853 770508 4.46 25 21.1 0.0211
BG-2 5.9490 1050726 6.10 25 25.6 0.0256
BG-3 5.7654 1098283 6.38 25 27.7 0.0277
BG-4 5.5735 814810 4.72 25 21.2 0.0212
BG-5 5.5850 1011745 5.87 25 26.3 0.0263
3
BG-6 5.8642 1028920 5.98 25 25.5 0.0255

BG+C1-1 4.2444 2307365 13.46 25 79.3 0.0793 70.6
BG+C1-2 4.0627 2494785 14.56 25 89.6 0.0896 74.2
BG+C1-3 4.4568 2595820 15.15 25 85.0 0.0850 73.0
BG+C1-4 4.4747 2333584 13.62 25 76.1 0.0761 70.2
BG+C1-5 4.6128 2658194 15.52 25 84.1 0.0841 76.2
BG+C1-6 4.7063 2814003 16.43 25 87.3 0.0873 83.1
BG+C2-1 4.5451 6508432 38.07 25 209.4 0.2094 68.5
BG+C2-2 4.7674 7380372 43.17 25 226.4 0.2264 76.6
BG+C2-3 4.8167 7326296 42.86 25 222.4 0.2224 75.0
BG+C2-4 5.2218 8004488 46.83 25 224.2 0.2242 84.8
BG+C2-5 5.1490 7895685 46.19 25 224.3 0.2243 81.5
BG+C2-6 5.2670 8553579 50.04 25 237.5 0.2375 89.4
BG+C3-1 4.8467 11541580 67.54 25 348.4 0.3484 79.3
BG+C3-2 4.5490 10914469 63.87 25 351.0 0.3510 74.0
BG+C3-3 4.7372 11081120 64.85 25 342.2 0.3422 74.5
BG+C3-4 4.9591 12078816 70.69 25 356.4 0.3564 83.1
BG+C3-5 5.0370 12380936 72.46 25 359.6 0.3596 84.0
BG+C3-6 4.8846 12087447 70.74 25 362.1 0.3621 82.2
P-1 5.1873 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P-2 5.2614 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P-3 5.0735 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P-4 5.6790 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P-5 5.2170 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P-6 5.1539 0 -0.05 25 -0.2 -0.0002
P+C1-1 5.1246 1625629 9.47 25 46.2 0.0462 68.0
P+C1-2 5.5561 1915513 11.17 25 50.3 0.0503 80.2
P+C1-3 5.2186 1680745 9.79 25 46.9 0.0469 70.3
P+C1-4 5.4217 1664747 9.70 25 44.7 0.0447 69.6
P+C1-5 5.0249 1643770 9.58 25 47.6 0.0476 68.7
P+C1-6 5.0349 1853799 10.81 25 53.7 0.0537 77.5
STD1-1 5.0000 175185 0.98 25 4.88 0.0049
STD1-2 5.0000 180721 1.01 25 5.04 0.0050
STD1-3 5.0000 179953 1.00 25 5.02 0.0050
4
STD1-4 5.0000 180586 1.01 25 5.04 0.0050

STD1-5 5.0000 179345 1.00 25 5.00 0.0050
STD1-6 5.0000 183675 1.03 25 5.13 0.0051
STD1-7 5.0000 177899 0.99 25 4.96 0.0050
STD1-8 5.0000 171521 0.95 25 4.77 0.0048
STD1-9 5.0000 177874 0.99 25 4.96 0.0050
STD1-10 5.0000 173068 0.96 25 4.82 0.0048
STD6-1 8354070 48.9
STD6-2 8417546 49.2
STD6-3 8322731 48.7
STD6-4 8367739 49.0
STD6-5 8383057 49.0
STD6-6 8425120 49.3
STD4-1 3233422 18.9
STD4-2 3255121 19.0
STD4-3 3257332 19.0
STD4-4 3275679 19.1
STD4-5 3277325 19.1
STD4-6 3223359 18.8
STD –
40 µg/L 5696149
MeOH-1 5.0126 0 0.00
MeOH-2 5.1520 43647 0.77
MeOH-3 5.0418 107166 1.88
MeOH-4 5.0291 1027464 18.04
MeOH-5 4.9512 1377906 24.19
MeOH-6 4.9624 2362390 41.47
ACN-1 5.0517 0 0.00
ACN-2 5.0193 4721 0.08
ACN-3 4.9728 814976 14.31
ACN-4 4.9382 1607492 28.22
ACN-5 5.0162 2375670 41.71
ACN-6 5.0391 4210295 73.91
5
Chú thích:
BUN: Bún
BG: Bột gạo
HT: Hủ tiếu
P: Bánh phở
C1: Nồng độ tinopal CBS-X là 14,0 µg/L.
STD1: Nồng độ tinopal CBS-X là 1,0 µg/L.
4. Phân tích mẫu thực.
Kết quả khảo sát tinopal CBS-X trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp từ tháng 7
đến tháng 12 năm 2013 và từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2014.
STT Loại mẫu Kết quả (mg/kg)
Tháng 7, 8, 9, 10 năm 2013
1 Bún 0,33
2 Bún 1,43
3 Bánh tằm 5,51
4 Bún 3,15
5 Bún 1,37
6
6 Bánh canh 4,67
7 Hủ tiếu 6,98
8 Bánh phở 14,0
9 Bánh hỏi 6,73
10 Bánh canh 3,13
11 Bánh ƣớt 1,93
12 Hủ tiếu 0,43
13 Bún 0,74
14 Bún 0,65
Không phát hiện

15 Hủ tiếu
(LOD=0,1)
16 Bún 2,45
Không phát hiện

17 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
18 Bánh tằm
(LOD=0,1)
Không phát hiện
19 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
20 Bánh tằm
(LOD=0,1)
7
Không phát hiện

21 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
22 Bánh tằm
(LOD=0,1)
Không phát hiện
23 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
24 Hủ tiếu
(LOD=0,1)
Không phát hiện
25 Bánh phở
(LOD=0,1)
Không phát hiện
26 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
27 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
28 Bánh hỏi
(LOD=0,1)
Không phát hiện
29 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
30 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
31 Bánh tằm
(LOD=0,1)
Không phát hiện
32 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
33 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
34 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
35 Bún
(LOD=0,1)
8
Không phát hiện

36 Bánh ƣớt
(LOD=0,1)
Không phát hiện
37 Bột năng
(LOD=0,1)
Không phát hiện
38 Bột gạo
(LOD=0,1)
Không phát hiện
39 Tinh bột khoai mì
(LOD=0,1)
Không phát hiện
40 Hủ tiếu
(LOD=0,1)
Không phát hiện
41 Bánh canh
(LOD=0,1)
Không phát hiện
42 Bánh bò
(LOD=0,1)
Không phát hiện
43 Bánh hỏi
(LOD=0,1)
Tháng 11, 12 năm 2013
Không phát hiện

44 Bánh tráng
(LOD=0,1)
Không phát hiện
45 Bột gạo
(LOD=0,1)
Không phát hiện
45-1 Bột gạo
(LOD=0,005)
Không phát hiện
46 Bột nếp
(LOD=0,1)
Không phát hiện
47 Bột gạo
(LOD=0,1)
Không phát hiện
48 Bột khoai mì
(LOD=0,1)
9
Không phát hiện

49 Bột nếp
(LOD=0,1)
Không phát hiện
50 Bột gạo
(LOD=0,1)
Không phát hiện
50-1 Bột gạo
(LOD=0,005)
Không phát hiện
51 Bột năng
(LOD=0,1)
Không phát hiện
52 Bột bánh xèo
(LOD=0,1)
Không phát hiện
53 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
53-1 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
54 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
54-1 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
55 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
55-1 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
56 Bánh canh
(LOD=0,1)
Không phát hiện
57 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
58 Bún
(LOD=0,1)
Không phát hiện
59 Bún
(LOD=0,1)
10
Không phát hiện

60 Bún
(LOD=0,05)
Tháng 4, 5, 6, 7, 8 năm 2014
Không phát hiện

61 Bánh tằm
(LOD=0,005)
Không phát hiện
62 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
63 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
64 Bánh tằm
(LOD=0,005)
Không phát hiện
65 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
66 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
67 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
68 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
69 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
70 Bột gạo
(LOD=0,005)
Không phát hiện
71 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
72 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
73 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
11
Không phát hiện

74 Bún
(LOD=0,005)
75 Bánh canh 0,34
Không phát hiện

76 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
77 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
78 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
Không phát hiện
79 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
Không phát hiện
80 Bún
(LOD=0,005)
Không phát hiện
81 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
Không phát hiện
82 Bánh tằm
(LOD=0,005)
Không phát hiện
83 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
84 Hủ tiếu 0,10
Không phát hiện

85 Bánh canh
(LOD=0,005)
Không phát hiện
86 Bánh hỏi
(LOD=0,005)
87 Bánh canh 0,26
Không phát hiện

88 Hủ tiếu
(LOD=0,005)
12
Không phát hiện

89 Bánh tằm
(LOD=0,005)
Không phát hiện
90 Bún
(LOD=0,005)
Chú thích: Các mẫu 45-1, 50-1, 53-1, 54-1, 55-1, tại phòng Phân tích
Thử nghiệm thực hiện để tiến hành đánh giá so sánh kết quả với Công ty Sắc
ký Hải Đăng.

(123doc) Nghien Cuu Phuong Phap Xac Dinh Ham Luong Tinopal Cbs X Trong Thuc Pham Nen Tinh Bot Bang Thiet Bi Sac Ky Long Hieu Nang Cao

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

(123doc) Nghien Cuu Phuong Phap Xac Dinh Ham Luong Tinopal Cbs X Trong Thuc Pham Nen Tinh Bot Bang Thiet Bi Sac Ky Long Hieu Nang Cao

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nghệ An, năm 2014

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG

Chuyên ngành: Hóa phân tích

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

Nghệ An, 2014

Nghệ An, ngày ....... tháng ....... năm 2014

Ngƣời thực hiện

Trang bìa phụ

- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng

- HPLC-RF (High Performance Liquid Chromatography /

- LC/MS (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry): Sắc ký lỏng

- LC/MS/MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần.

- ICP-AES: Đầu dò phổ phát xạ nguyên tử.

- AAS: Hấp thụ nguyên tử.

- OBs: Chất làm trắng quang học.

- FWAs: Chất làm trắng huỳnh quang.

- LOD (Limit of detection): Giới hạn phát hiện.

- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lƣợng.

- Sr: Độ lặp lại (µg/kg).

- RSD: Độ lặp lại (%).

- H: Hiệu suất thu hồi (%).

1.1. Sơ lƣợc về tinh bột gạo[24].

quang (FWAs) đã đƣợc nghiên cứu sử dụng.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6-

1.3.3. Tinopal CBS-X.

đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphono-

Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X[8].

1.4.1.2. Phân loại[3].

+ (3): Bộ phận tiêm mẫu.

- Đầu dò tử ngọai (UV), ứng vùng phổ 190 - 360nm.

Hình 1.7: Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc[5].

Nếu 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1: có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt.

chụm mong muốn.

2.1. Hóa chất và thiết bị.

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị[1].

+ Methanol có mặt H3PO4.

E15 4% H3PO4 trong MeOH

2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch.

Gradient 5 Gradient 6 Gradient 7 Gradient 8

[E,Z]- Tinopal CBS-X

+ Hệ pha động 2: Methanol (MeOH): Nƣớc (H2O).

+ Nhiệt độ buồng cột 40 0C.

Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X

Hình 3.9: Đồ thị của đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.

Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X.

Kết quả phân tích

(LOD = 0,1) mg/kg (LOD = 0,005) mg/kg

Kết quả phân tích

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

solid-phase extraction and ion pair liquid chromatography tandem mass

the production of stilbene-based ﬂuorescent whitening agents, Water

pair Chromatography and Fluorescence Detection, Journal of the Chinese

1. Khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X

2. Đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.

3. Tính toán số liệu.

BG-6 5.8642 1028920 5.98 25 25.5 0.0255

STD1-4 5.0000 180586 1.01 25 5.04 0.0050