KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN

1
1. Mở đầu: Ý nghĩa của thao tác trên gen
2. Thể mang gen (vector) và tế bào chủ
3. Thu nhận và tinh chế DNA từ tế bào
4. Enzyme dùng trong thao tác DNA
5. Thao tác trên DNA tinh chế
6. Chuyển gen vào trong tế bào
7. Kỹ thuật PCR
8. Tạo dòng gen của prokaryote và eukaryote
9. Tuyển chọn dòng mang gen mục tiêu
10. Sản xuất protein tái tổ hợp
11. Nghiên cứu sự hiện diện và cấu trúc của gen
12. Nghiên cứu sự biểu hiện và chức năng của gen
13. Nghiên cứu bộ gen
14. Các ứng dụng khác của kỹ thuật thao tác trên gen

2
4. Vector dùng cho eukaryote

4.1 Vector cho nấm men S. cerevisiae

4.2 Vector cho tế bào ĐV hữu nhũ
4.3 Vector cho ĐV không xương sống
4.4 Vector cho thực vật

3
4.1 Vector dùng cho Sacchomyces cerevisiae

- Vector plasmid YEp (Yeast Episomal plasmid)

- Vector sát nhập YIp (Yeast Integrating plasmid)
- Vector sao chép YRp (Yeast Replicating plasmid)
- Vector trung thể YCp (Yeast Centromeric plasmid)
- Nhiễm sắc thể nhân tạo YAC (Yeast Artificial Chromosome)

4
 Vector plasmid YEp
- Dựa trên plasmid tự nhiên 2m của nấm men
- Vector YEp có thể nhân bản trong E. coli và nấm men

Yeast 2m DNA 5
 Vector YEp13
- Trình tự 2m DNA của nấm men để nhân bản trong nấm men
- Đoạn nhiễm sắc thể nấm men chứa leu để sàng lọc trong nấm men
- Trình tự của pBR322 để nhân bản và sàng lọc trong E. coli
- Vector YEp13 có thể nhân bản trong E. coli và nấm men

6
Tái tổ hợp tương đồng thông qua gen leu

7
Sàng lọc dòng tái tổ hợp bằng gen leu

8
Tạo dòng và
sàng lọc nấm
men tái tổ hợp
bằng YEp13

9
Vector Yep24

10
 Vector sát nhập YIp
Sát nhập vào bộ gen nấm men bằng cơ chế tái tổ hợp tương
đồng; không bền khi thiếu áp lực chọn lọc

11
 Vector sao chép YRp
Chứa trình tự ARS (autonomously replicating sequence, 25 –
65 bp) có khả năng tự sao chép; không bền do thiếu centromer

12
Vector trung thể YCp
Chứa trình tự ARS và
centromer

13
 Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men
(Yeast artificial chromosome, YAC)
Chứa trình tự telomer và centromer: bền ở dạng thẳng và
mang DNA kích thước lớn

14
Tạo dòng bằng pYAC3

15
4.2 Vector dùng cho tế bào ĐV hữu nhũ

- Vector dựa trên virus SV40

- Vector dựa trên retroviruses

16
 Đặc điểm của SV40
- Virus xâm nhiễm nhiều loài ĐVHN
- TB cho phép (permissive): nhân bản ngay sau khi xâm nhiễm
(African grey monkey cell)
- TB không cho
phép (non-
permissive):
gắn vào DNA
bộ gen (hamster
cell line)
- Bộ gen DNA
mạch kép

17
 Đặc điểm biểu hiện gen
- 8 giờ sau khi xâm nhiễm: bóc vỏ, DNA đi vào nhân
- 4 giờ tiếp theo: biểu hiện gen sớm
- 36 giờ tiếp theo: sao mã, biểu hiện gen muộn, lắp ghép tạo virion
mới
- mRNA sớm được chế biến thành 2 mRNA khác nhau:
+ t-antigen: cần cho sự xâm nhiễm vào TB không cho phép
+ T-antigen: cần cho khởi sự sao mã của virus, điều hòa sự biểu
hiện chính nó và một số gen khác
- mRNA muộn: mã hóa ba protein vỏ VP1, VP2, VP3

18
 Các dạng vector SV40
1. Cấu trúc vector:
- Thay một vùng gen của SV40 bằng DNA ngoại lai, cho phép sao
mã và nạp DNA tái tổ hợp vào vỏ nhờ helper virus
- Tạo vector DNA không đươc nạp vào vỏ, hiện diện tức thời
trong host ở dạng plasmid
2. Các loại vector:
- Vector thay thế (replacement vectors)
- Vector tự sao (autonousmy replicating vector): chứa ori nhưng
thiếu gen sớm; dùng với tế bào COS chứa SV provirus không có
ori để cung cấp T-antigen cần cho sự sao mã của SV40 tái tổ hợp
(dạng plasmid)
- Vector biểu hiện tức thời (transient expression vectors)

19
Vector biểu hiện tức thời pMSG

20
 Đặc điểm của Vaccinia virus
- Bộ gen DNA mạch kép
- Xaâm nhieãm baèng phöông phaùp thöïc baøo
+ RNA polymerase chöùa trong viruùt phieân maõ moät soá
protein, trong ñoù coù protein coù taùc duïng taùch boä gen
khoûi voû capsid
+ Hình thaønh inclusion body ñeå thöïc hieän sao maõ,
phieân maõ gen muoän, laép gheùp nucleocapsid, phoùng
thích virion khoûi teá baøo qua maøng teá baøo chaát
- Vaccinia virus ñöôïc duøng roäng raõi laøm vaéc xin vector
ôû ngöôøi vaø ñoäng vaät

21
 Vector vaccinia virus
- Dạng plasmid: pBR322 chứa DNA của virus chứa gen thymidine
kinase TK
- DNA mục tiêu được chèn vào gen TK
- Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào TK- đã được nhiễm
vaccinia virus tự nhiên TK+
- Chọn lọc tế bào mục tiêu dạng
TK- (do tái tổ hợp tương đồng)
bằng môi trường chứa BUdR

22
4.3 Vector dùng cho động vật không xương sống

- Vector dựa trên P element dùng cho ruồi dấm

- Vector dựa trên Baculovirus dùng cho côn trùng

23
 Trình tự P (P element) ở ruồi giấm Drosophila
- P element: một dạng gen chuyển vị (transposon), 2,9k

24
 Vector dựa trên trình tự P (P element)
ở ruồi giấm Drosophila
- Vector: plasmid chứa 2 P element:
+ 1st P có thể chèn DNA mục tiêu bất hoạt transposase
+ 2nd P không chứa IR nên không thể chuyển vị bởi transposase
- Transposase của 2nd P giúp chuyển 1st P vào NST tế bào

25
Vector Baculovirus dùng cho tế bào côn trùng

26
Tạo baculovirus
tái tổ hợp bằng
trao đổi đoạn
tương đồng

27
Tạo dòng bằng vector baculovirus dựa trên sự tái
tổ hợp tương đồng

HyNPV DNA pAcHLT A E/NS1

Co-transfection in
insect cell line

r HyE/NS1 Polyhedrin promoter

Polyhedrin gene
Polyhedrin non coding region
Target gene
His tag
28
4.4 Vector dùng cho thực vật

29
 Crown Gall disease
- Hợp chất phenol từ vết thương thu hút Agrobacterium
tumefaciens
- VK xâm nhập và chuyển
một đoạn gen sát nhập
vào nhân tế bào kích
thích sự tổng hợp các
kích thích tố tạo khối u

30
 Đặc điểm của Ti plasmid
- Cảm ứng tạo khối u ở thực vật: tumor-inducing plasmid (200kb)
- T-DNA: 20kb, mã hóa các dẫn xuất amino acid và các kích thích tố
tăng trưởng thực vật, được chuyển vào cây nhờ A. tumefaciens
- vir: chứa các gen cần cho chemotaxis và cho sự chuyển T-DNA

31
Vai trò của
T-DNA

32
 Tạo vector Ti-plasmid tái tổ hợp:
phương thức hai vector (binary vector)
- Vector: T-DNA được mang bởi một plasmid của E. coli, gen mục
tiêu được chèn vào vùng T-DNA (không gây bất hoạt chèn)
- Ti-Plasmid A không chứa T-DNA giúp chuyển T-DNA vào tế bào
TV

33
Tạo vector Ti-
plasmid tái tổ
hợp: phương
thức đồng sát
nhập
(cointegration)

- Biến nạp vào A.

tumefaciens vector
chứa gen mục tiêu
và 1 đọan của
T-DNA
- Tái tổ hợp tương
đồng tạo ra Ti-
plasmid tái tổ hợp
mang gen mục tiêu 34
35