https://www.ncbi.nlm.nih.

gov/pmc/articles/PMC7239045/

https://vjol.info.vn/index.php/tcdh/article/view/47059

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7092802/

- Phương pháp

Lấy mẫu vật:

+ Mẫu bệnh phẩm “dịch tỵ hầu” được lấy bằng tăm bông sợi tổng hợp
+ Mỗi miếng gạc được đưa vào một ống vô trùng riêng biệt chứa 2 – 3 ml môi trường vật chuyển
virut

(mẫu vật bảo quản trong khoảng từ 2 o C đến 8 o C

Chuẩn đoán 2019 – nCoV

+ Mẫu vật được xét nghiệm bằng rRT-PCR (vi rút corona có ba dịch gen nucleocapsid và một đích
kiểm soát dương tính

Giải trình tự gen

- Kết quả

- Phương pháp

Lấy mẫu vật:

+ Mẫu bệnh phẩm “dịch tỵ hầu” được lấy bằng tăm bông sợi tổng hợp
+ Mỗi miếng gạc được đưa vào một ống vô trùng riêng biệt chứa 2 – 3 ml môi trường vật chuyển
virut

(mẫu vật bảo quản trong khoảng từ 2 o C đến 8 o C )

Chuẩn đoán 2019 – nCoV

+ Mẫu vật được xét nghiệm bằng rRT-PCR

Các mẫu dương tính với PCR đã xác nhận chia nhỏ và đông lạnh cho đến khi quá trình phân lập vi
rút được bắt đầu

- Nuôi cấy tế bào: Vero E6, Vero CCL-81, HUH 7.0, 293T, A549 và EFKB3 được nuôi cấy trong môi
trường thiết yếu tối thiểu (DMEM) của Dulbecco được bổ sung huyết thanh bào thai bò bất hoạt
bằng nhiệt (5 hoặc 10%) và kháng sinh/thuốc kháng cơ (GIBCO). Cả gạc dịch tỵ hầu và dịch hầu
họng đều được sử dụng để phân lập vi rút.
 - Các phương pháp nhận diện virus

+ Nhận diện virus bằng nhiều phương pháp khác nhau, dựa trên những đặc điểm và cơ chế gây
bệnh của virus:
+ Qua vật chất di truyền (DNA hoặc RNA) : dùng các kỹ thuật PCR và biến thể của PCR
+ Nhận diện qua sự bắt cặp kháng nguyên – kháng thể của virus: dùng kỹ thuật elisa và
Western Blot
+ Nhận diện qua hình thái đặc điểm của virut: quan sát bằng kính hiển vi, TEM(chụp hạt
virus), Flow Cytometry

- Sau khi nuôi cấy virus

+ Kính hiển vi điện tử (Electron microscopy)

+ Các tế bào Vero bị nhiễm bệnh được cạo ra khỏi bình, được tạo viên bằng cách ly tâm tốc độ
thấp, rửa sạch bằng dung dịch đệm phốt phát 0,1M, được tạo viên lại và cố định trong 2 giờ trong
glutaraldehyde đệm 2,5%.
+ Các mẫu được cố định sau đó bằng 1% osmium tetroxide, cả khối được nhuộm bằng 4% uranyl
axetat, khử nước và nhúng vào nhựa epoxy. Các phần siêu mỏng được cắt, nhuộm bằng 4% uranyl axetat
và chì citrate, rồi kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử Thermo Fisher/FEI Tecnai Spirit.
(A–C) Hình ảnh tương phản pha 10X của các đơn lớp vero sau 3 ngày sau khi cấy. Các bảng được hiển thị
là (A) giả, (B) mũi họng và (C) hầu họng. (D) Hình ảnh hiển vi điện tử của chủng vi-rút cho thấy các hạt
hình cầu ngoại bào có mặt cắt ngang qua các nucleocapsid, được coi là các chấm đen.

+ Protein và Western Blot

+ Tạo kháng thể Nucleocapsid SARS:

+ Sử dụng Plasmid, pBM302

+ Protein SARS CoV N có chiều dài đầy đủ , được thi hồi đã được sử dung để gây miễn dịch cho
thỏ nhắm tạo ra kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV N được làm sạch bằng ái lực của thỏ

+ Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS)

Bước 1: Tạo thư viện: DNA sẽ được cắt ngắn phù hợp theo phương pháp và thường được gắn một đoạn
nucleotide và 2 đầu.
Bước 2: Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp: Các thành phần cho phản ứng khuếch đại được thêm
vào và xác định nucleotide theo nguyên lý của phương pháp.

Bước 3: Ghép nối các đoạn DNA đã được giải trình tự.

Bước 4: Sử dụng các phần mềm tin sinh phân tích dữ liệu trình tự thu được theo mục tiêu nghiên cứu
Ứng dụng trong phát hiện và xác định chủng virus mới gây bệnh Covid-19 bằng thiết bị giải trình tự gen
thế hệ mới -NGS
+ Phương pháp lấy mẫu và phân lập virus;
+ Phương pháp tách chiết RNA của virus và chuyển thành cDNA;
+ Giải trình tự NGS;
+ Phân tích kết quả;

Nhờ vào kết quả giải trình tự gen và phân tích phát sinh loài mà các nhà khoa học đã biết virus 2019n-
CoV là một chủng virus mới thuộc chi Betacoronavirus, thuộc phân chi Sarbecovirus. Chủng này khác biệt
về mặt di truyền với chủng MERS-CoV và SARS-CoV nhưng lại có họ hàng gần với hai chủng giống SARS
phân lập từ dơi là bat-SL-CoVZC45 và chủng bat-SL-CoVZXC21, được phân lập vào năm 2018 ở phía tây
Trung Quốc.

Atomic model of the external structure of the SARS-CoV-2 virion. Each "ball" is
Không chỉ xác định nguồn gốc của virus, phương pháp giải trình tự gen đã giúp các nhà nghiên cứu có cái
nhìn rõ ràng về cấu trúc hệ gen, kiểm soát được các đột biến phát sinh, giúp phát triển phương pháp
phát hiện virus bằng phương pháp sinh học phân tử khác thông qua mồi và đoạn dò đặc hiệu.

Nhờ vậy quá trình phát hiện virus được rút ngắn rất nhiều so với thời gian giải toàn bộ bộ gen của virus.
Việc xây dựng mô hình liên kết thụ thể của virus cũng được dự đoán dựa vào kết quả giải trình tự gen,
giúp phát triển vaccin phòng bệnh.

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới-NGS và các phần mềm tin sinh học đã nâng cao sự hiểu biết về
nguồn gốc và cơ chế truyền bệnh, giúp đẩy nhanh việc xác định mầm bệnh và thúc đẩy chia sẻ dữ liệu.

Chính điều này đã hỗ trợ con người trong cách giải quyết đối phó với sự bùng phát của các bệnh truyền
nhiễm hay đại dịch.