TL. Vi sinh-đã chuyển đổi

VAI TRÒ CỦA CÁC XÉT NGHIỆM
VI SINH CƠ BẢN
Mục tiêu học tập

- Trình bày được các xét nghiệm vi sinh cơ bản.
- Nêu được giá trị của những xét nghiệm này.
1. Xét nghiệm vi sinh cơ bản

1.1. Soi tươi và nhuộm soi
Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không yêu cầu trang thiết bị
phức tạp, đắt tiền và nhanh có kết quả. Vì vậy, có thể áp dụng được ở các tuyến
y tế cơ sở, tuy bằng cách này chẩn đoán chưa được chính xác.
Làm tiêu bản soi tươi bệnh phẩm để quan sát tính chất di động của vi
khuẩn; ở kỹ thuật này ta cũng có thể tìm được một số căn nguyên gây bệnh (nấm
Candida, Trichomonas, thấy nhiều bạch cầu đa nhân trung tính trong những ổ
viêm do vi khuẩn; thấy hồng cầu trong phân...).
Làm tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm để tìm vi khuẩn dựa vào hình thể, tính
chất bắt màu, kích thước và cách sắp xếp và mối tương quan của chúng. Đồng
thời đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ giữa vi khuẩn với các tế bào này.
Trong một số trường hợp như bệnh lậu, giang mai, nếu nhuộm soi bệnh phẩm
thấy vi khuẩn thì có nghĩa cho chẩn đoán.
Đối với một số bệnh cấp tính và có thể gây dịch như bạch hầu, dịch hạch,
tả… thì việc chẩn đoán nhanh có vai trò hết sức quan trọng.
Trong đa số các trường hợp, kết quả nhuộm soi chỉ có giá trị chẩn đoán sơ
bộ và định hướng cho nuôi cấy; ngoài ra nó cần để so sắnh với các công đoạn
xét nghiệm sau (nuôi cấy...).
1.2. Nuôi cấy
Nuôi cấy xác định vi khuẩn sẽ cho kết quả chính xác, song đòi hỏi thời
gian lâu hơn và trang thiết bị phức tạp hơn cách nhuộm soi.
Nhờ có sự phát triển của khoa học kỹ thuật tiên tiến, hiện nay người ta có
thể chẩn đoán nhanh các bệnh nhiễm khuẩn với độ chính xác cao.
1
1.3. Phản ứng huyết thanh học
Là tìm kháng thể trong huyết thanh người bệnh bằng các kỹ thuật miễn
dịch như ngưng kết, ELISA, miễn dịch huỳnh quang…
Tuỳ theo tưng loại bệnh, tính chất cấp tính, khả năng gây dịch và tình
trạng trang thiết bị của phòng xét nghiệm mà áp dụng phương pháp thích hợp.
Hiện nay, ở khoa xét nghiệm của bệnh viện tuyến huyện chỉ mới thực
hiện được một số kỹ thuật xét nghiệm vi sinh như soi tươi, nhuộm soi và một số
phản ứng nhanh để chẩn đoán bệnh. Do vậy, để có thể thực hiện được các xét
nghiệm vi sinh cơ bản nhằm đáp ứng yêu cầu khánh bệnh, chữa bệnh của bệnh
viện thì cần phải đào tạo cán bộ kỹ thuật, đầu tư trang thiết bị, máy móc thiết
yếu và các hoá chất sinh phẩm tối thiểu cần phải có.
2.Vai trò của xét nghiệm vi sinh cơ bản
Là những xét nghiệm dễ thực hiện, không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền,
nhanh, kịp thời và có giá trị nhất định trong cong tác chẩn đoán vi sinh vật.
- Thực hiện các xét nghiệm vi sinh cơ bản nhằm đáp ứng yêu cầu khám
bệnh, chữa bệnh của bệnh viện
- Góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh và theo dõi kết quả điều trị.
- Phát hiện và giám sát các dịch bệnh xảy ra ở địa phương.
-----------------------------------------------------------------------------------------------
Câu hỏi lượng giá
1. Trình bày các xét nghiệm vi sinh cơ bản?
2. Nêu giá trị của các xét nghiệm vi sinh cơ bản?
2
VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN VÀ TRÊN CƠ THỂ NGƯỜI
NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN

- Trình bày được những môi trường tự nhiên có vi sinh vật; những vị trí
có nhiều vi sinh vật trên cơ thể người bình thường.
- Trình bày được các nhóm mầm bệnh, đường lây truyền và cách phòng
chống nhiễm trùng bệnh viện.
A- VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN

- Vi sinh vật trong môi trường: không khí, đất , nước
- Vi sinh vật trong cơ thể: người, động vật
I. Vi sinh vật trong môi trường
1. Trong đất: có nhiều điều kiện cho vi sinh vật phát triển (nước, không khí,
chất vô cơ và hữu cơ)
* Nguồn vi sinh vật:
- Ô nhiễm thêm từ các chất thải của người, động vật.
* Chủng loài vi sinh vật: Cầu khuẩn gram dương, trực khuẩn gram âm
Đất ở những khu vực khác nhau, độ sâu khác nhau, có nhiệt độ khác nhau
thì có số lượng và cơ cấu vi sinh vật khác nhau.
a.Vi sinh vật tự dinh: tự tổng hợp được chất cần cho sự sống.
b.Vi sinh vật dị dinh: phân huỷ xác động vật, thực vật.
c.Vi sinh vật gây bệnh: lỵ, thương hàn, uốn ván, tụ cầu vàng….
2. Trong nước
- Vi sinh vật trong nước
- Vi sinh vật ô nhiễm vào nước: E. coli chỉ điểm nhiễm phân.
+ Nhiệt độ diệt được vi khuẩn: 1000c/10 phút.
+ Thời gian lưu trữ nước chín
+ Nước lưu trữ
3
* Chủng loài vi sinh vật: Cầu khuẩn gram dương, trực khuẩn gram âm
3. Trong không khí: nghèo dinh dưỡng.
- Vi sinh vật tái nhiễm từ: người, động vật, bụi đất…
- Số lượng: phụ thuộc độ ẩm.
* Chủng loài vi sinh vật:
Cầu khuẩn gram dương: nhiều
Trực khuẩn gram âm: hiếm
II. Vi sinh vật trong cơ thể người (vi hệ)
1. Trên da
Chủ yếu là cầu khuẩn gram dương, Corynebacterium không có độc lực.
2. Đường hô hấp
- Mũi: cầu khuẩn (20-50% người bình thường có S.aureus), trực khuẩn giả
bạch hầu.
- Họng mũi (tỵ hầu): cầu khuẩn, S. pneumoniae, H. influenzaea…
- Họng: nhiều loại (S. pyogenes)
- Khí, phế quản: thường âm tính do thực bào và niêm dịch.
3. Đường tiêu hoá
- Ở miệng: trẻ sơ sinh vài giờ đầu đã có tụ cầu, liên cầu, lactobacilus.
Số lượng: hàng triệu TBVK/1ml -> đeo khẩu trang
- Trong dạ dày:
+ pH thấp (=2): hạn chế vi sinh vật
+Vi khuẩn: lao, H.pylory.
- Ở ruột:
+ Sau sinh vài giờ có vi khuẩn ở ruột
+ Số lượng, cơ cấu, chủng loài vi khuẩn phụ thuộc cấu chúc và chức
năng (ruột non có enzyme ly giải vi sinh vật nên số lượng vi sinh vật ít; đại tràng
nhiều)
=>Tạo vi khuẩn chí: bảo vệ cơ thể, giúp tiêu hoá, tạo vitamine.
4
4. Ở đường tiết niệu
- Nam: lỗ niệu đạo ( miệng sáo): tụ cầu, trực khuẩn gram âm
- Nữ: cầu khuẩn gram dương, lactobacillus.
5. Ở niêm mạc mắt: tụ cầu trắng.
6. Ở hệ thống tuần hoàn, phủ tạng: không có ( trừ vãng khuẩn khuyết)
B – NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN

(nosocomial infection)
I. Khái niệm
NTBV là nhiễm trùng mà bệnh nhân mắc trong thời gian ở bệnh viện.
- Không ủ bệnh khi nhập viện
- Có khi ra viện hàng tháng mới có biểu hiện triệu trứng.
+Về mốc thời gian 48 giờ sau khi vào viện:
* NTBV xảy ra ở mọi nước: đã và đang phát triển; khoa học công nghệ
càng cao thì càng nhiều cơ hội cho NTBV.
* Hậu quả:
- Tăng tỉ lệ tử vong.
- Tăng chi phí cho điều trị và chăm sóc sức khoẻ.
II. Căn nguyên của NTBV
1. Vi khuẩn
-Gram âm: trực khuẩn (E.coli, P.earuginosa…)
-Gram dương: cầu khuẩn gram dương (S.aureus, S.epidermidis…)
*liên quan đến việc sử dụng kháng sinh
2. Virus: viêm gan, cúm, HIV…
3. Ký sinh trùng: nấm…
III. Đường lây truyền
1.Trực tiếp: chín mé từ tay BS phẫu thuật
2. Gián tiếp
Truyền qua đối tượng trung gian:
+ Không khí
5
+ Nước
+ Đất
+ Dung cụ y tế
+ Nhân viên y tế
+ Người thăm bệnh nhân
+ Côn trùng, tiết túc
IV. Cơ chế cảm thụ
- Có cửa mở qua hàng rào phẫu thuật (phẫu thuật, nội soi, thủ thuật)
- Khi có sự đề kháng già yếu (già, suy dinh dưỡng…)
+Suy giảm miễn dịch: mắc AIDS, dùng thuốc ức chế miễn dịch
- Rối loạn vi khuẩn chí: nằm viện lâu, stress (tâm lí, phẫu thuật).
V. Nguyên nhân
1. Từ thầy thuốc: thực hiện đúng nguyên tắc vô trùng
- Khi làm phẫu thuật
- Khi làm thủ thuật
- Khi thăm khám
- Khi tiêm truyền, thay băng
- Khi vận chuyển bệnh nhân (giữa các khoa, tới nhà mổ…),vận chuyển
dụng cụ y tế và phẫu thuật.
- Xây dựng bệnh viện: cần xây dựng các khoa trong bệnh viện hợp lí; nhà
mổ 1 chiểu…
2. Từ bệnh nhân
- Tự gây nhiễm trùng do thiếu hiểu biết
- Sức đề kháng yếu
- Lo lắng quá mức, người thăm bệnh nhân
VI. Hạn chế nhiễm trùng bệnh viện
1. Tác động vào mầm bệnh
Với căn nguyên vi khuẩn: sử dụng kháng sinh hợp lí.
6
2. Tác động vào đường lây truyền
Cắt đứt đường lây truyền
3. Tác động vào cơ thể cảm thụ
Nâng cao sức đề kháng.
-------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Trình bày các môi trường tự nhiên có vi sinh vật; những vị trí có nhiều vi sinh
vật trên cơ thể người bình thường?
2. Trình bày các nhóm mầm bệnh, đường lây truyền và cách phòng chống nhiễm
trùng bệnh viện?
7
CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT
MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP
1. Trình bày được hai phương pháp chẩn đoán vi khuẩn.
2. Làm được tiêu bản soi tươi, nhộm đơn, nhuộm Gram.
3. Thực hiện được kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn.
Chẩn đoán vi sinh vật là chẩn đoán nguyên nhân (vi khuẩn gây bệnh) hay hậu
quả (đáp ứng miễn dịch của cơ thể) của sự nhiễm khuẩn. Có 2 phương pháp
chẩn đoán vi sinh vật bệnh nhiễm khuẩn là chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán
gián tiếp.
1. Chẩn đoán trực tiếp
Trong chẩn đoán trực tiếp vi khuẩn muốn xác định và định danh một chủng
vi khuẩn ở trong một bệnh phẩm người ta phải tiến hành qua các bước:
o Quan sát trực tiếp từ kính hiển vi.
o Phân lập bằng nuôi cấy ở môi trường thích hợp.
o Định danh vi khuẩn đã phân lập căn cứ vào tính chất nuôi cấy vi khuẩn,
khuẩn lạc, hình thái ở kính hiển vi, tính chất sinh vật hóa học và tính chất
ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu.
1.1. Quan sát trục tiếp bằng kính hiển vi
Các bệnh phẩm được lấy đúng quy cách, cách thức và số lượng tùy theo
từng loại bệnh phẩm. Các bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng thí nghiệm
mới đảm bảo sự sống sót của một lượng mầm bệnh đủ để có thể phân lập được.
Nếu phải chuyển đi xa thì bệnh phẩm phải được cất giữ trong môi trường bảo
quản.
Các bệnh phẩm đặc biệt như phân và mủ cần được quan sát trực tiếp qua
soi tươi hoặc sau khi nhuộm Xanh metylen hoặc nhuộm Gram.
- Soi tươi để phát hiện các ký sinh trùng gây bệnh như Amipe di động
Giardia lamblia… hoặc kén Amipe, trứng giun, trứng sán. Trong trường hợp
phẩn tả soi tươi có thể thấy phẩy khuẩn tả di động đặc biệt nhanh.
8
- Soi kính hiển vi tiêu bản nhuộm Xanh metylen để tìm bạch cầu đa nhân.
Những tế bào này tìm thấy nhiều trong phân lỵ trực tràng.
- Soi kính hiển vi tiêu bản nhuộm Gram cho phép phân biệt được hình thể
và tính chất bắt màu Gram của vi khuẩn và nấm men.
Quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi cần thiết để chọn môi trường nuôi cấy
trong bước nuôi cấy tiếp theo. Trong một số trường hợp nó có thể cho biết kết
quả sơ bộ. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và nhanh có kết quả. Đối
với một số bệnh cấp tính có thể gây thành dịch (ví dụ bệnh bạch hầu, dịch
hạch,…) thì việc chuẩn đoán nhanh có vai trò hết sức quan trọng, tuy rằng cách
chẩn đoán này chưa được chính xác. Trong một số trường hợp như bệnh giang
mai, bệnh lậu thì việc nhuộm soi bệnh phẩm thấy vi khuẩn lại có ý nghĩa quyết
định cho chẩn đoán.
1.1.1. Soi tươi
Soi tươi có thể phát hiện được khả năng di động của vi khuẩn, trong phạm
vi bài này chúng tôi giới thiệu cách làm tiêu bản giọt ép như sau:
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy bệnh phẩm lỏng hoặc canh khuẩn, rồi nhỏ
một giọt lên lam kính (còn đối với bệnh phẩm đặc hoặc môi trường đặc thì nhỏ
một giọt NaCL 0.9% vô khuẩn lên lam kính rồi dùng que cấy lấy bệnh phẩm
hoặc khuẩn lạc vi khuẩn và hòa đều vào giọt NaCL 0.9%).
- Đặt lá kính lên giọt canh khuẩn thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt
khí.Muốn vậy để một cạnh ls kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính
xuống.
- Soi kính hiển vi với vật kính X10, vật kính X40.
1.1.2. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
Làm tiêu bản để nhuộm vi khuẩn gồm 3 bước:
- Dàn đồ phiến:
Chọn phiến kinh sạch, không mốc, không xước. Dùng que cấy bệnh phẩm
(hoặc canh khuẩn) dàn mỏng lên phiến kính theo đường xoắn ốc từ trong ra
ngoài tạo nên một vùng có đường kính khoảng 1cm (đồ phiến).
9
- Để khô:
Sau khi dàn đồ phiến, để tiêu bản khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc để
vào tủ ấm 37ºC.
Trường hợp cố định bằng hóa chất, nếu tiêu bản chưa khô mà đã cố định thì
vi khuẩn sẽ bị trôi mất. Trường hợp cố định bằng nhiệt nếu tiêu bản chưa khô
mà đã cố định thì vi khuẩn sẽ không chết hoặc biến dạng.
- Cố định:
Cố định có 3 tác dụng:
+ Giết chết vi khuẩn
+ Gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.
+ Làm cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn.
Có nhiều phương pháp cố định tiêu bản, có thể cố định bằng nhiệt, bằng
hóa chất hoặc phối hợp cả 2 phương pháp tùy thuộc vào từng kỹ thuật nhuộm cụ
thể. Thông thường người ta cố định bằng nhiệt bằng cách đưa phiến kính qua lại
trên ngon lửa đèn cồn 3 – 4 lần, lâu chừng vài giây sao cho nhiệt độ lên khoảng
80ºC.
1.1.3. Kỹ thuật nhuộm đơn
Nhuộm đơn là chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trên một loại tiêu bản.
Người ta có thể dùng các loại thuốc nhuộm kiềm sau: Xanh metylen, tím
Gentian, đỏ Fuchsin. Trong thực hành hay dùng Xanh metylen để nhuộm đơn.
- Nhỏ dung dịch Xanh metylen lên tiêu bản đã cố định, để 1 – 2 phút. Đổ
thuốc nhuộm đi, rửa phiến kính dưới vòi nước chảy nhẹ, rồi để khô và soi kính
hiển vi.
- Kết quả: Các vi khuẩn và tế bào đều bắt màu của thuốc nhuộm.
1.1.4. Kỹ thuật nhuộm Gram
+ Nhỏ dung dịch tím Gentian lên tiêu bản đã cố định, để một phút,
nghiêng tiêu bản đổ dung dịch tím Gantian, rửa nước nhẹ.
+ Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản, để 30s, nghiêng tiêu bản đổ dung
dịch Lugol, rửa nước nhẹ.
10
+ Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn tuyệt đối lên tiêu bản, nghiêng phiến kính
qua lại để cho cồn chảy từ cạnh phiến kính bên này sang cạnh phiến kính bên
kia, mắt quan sát màu tím, khi nào thấy màu tím trên đồ phiến vừa phai hết thì
rửa nước ngay.
+ Nhỏ dung dịch Fuchsin (hoặc Safranin) lên tiêu bản, để 1 phút, nghiêng tiêu
bản đổ thuốc nhuộm, rửa nước kỹ.
- Để khô tiêu bản, soi kính hiển vi với vật kính dầu X100.
- Kết quả: Các vi khuẩn bắt màu tím là Gram (+)
Các vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram (-)
1.2. Nuôi cấy
1.2.1. Môi trường nuôi cấy
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn rất thay đổi. Có loại vi khuẩn có thể
mọc ở môi trường tổng hợp chứa muối vô cơ kể cả muối amoni, thêm một hợp
chất đơn giản như Glucoza hoặc asparagin làm nguồn cacbon và năng lượng,
trong khi các loại vi khuẩn khác đòi hỏi những hợp chất đặc biệt chỉ tìm thấy
trong máu hoặc mô động vật.
Một cách tổng quát môi trường nuôi cấy vi khuẩn được phát triển qua
thực nghiệm từ một môi trường dinh dưỡng cơ bản chứa pepton và nước thịt
hoặc cao thịt. Dung dịch của môi trường dinh dưỡng cơ bản trên có thể biến đổi
theo nhiều cách. Để điều chế môi trường hoặc chỉ cần thêm thạch, môi trường
phong phú thêm huyết thanh, nước báng hoặc máu khử tơ huyết.
Trong môi trường phân biệt làm nổi bật những tính chất sinh lý của vi
khuẩn cho phép phân biệt một loại vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn này với
những vi khuẩn khác người ta cho thêm một loại đường và một chỉ thị màu axit -
kiềm. Ví dụ: Thạch lactoza, đỏ phenol dung để phân lập Salmonella và Shigella
ở trong phân. Môi trường phân biệt có thể không có tính chọn lọc hoặc có tính
chọn lọc lúc nó chứa thêm những tác nhân ức chế cho phép những vi khuẩn cần
phân lập phát triển nhưng lại ức chế các vi khuẩn khác, môi trường SS. Là một
ví dụ về môi trường phân biệt và chọn lọc.
11
Trong phòng thí nghiệm để phân lập một loại vi khuẩn hoặc một nhóm vi
khuẩn người ta sử dụng những sơ đồ phân lập trong đó ghi rõ các môi trường
nuôi cấy thích hợp cho mỗi giai đoạn.
1.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn
Người ta nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường thích hợp lỏng hoặc đặc. Môi
trường lỏng thông dụng nhất là canh thang. Dùng que cấy hoặc pipet Pasteur cho
bệnh phẩm vào canh thang. Đem ủ ở nhiệt độ thích hợp, thông thường 37ºC
trong vòng 18 – 24h. Vi khuẩn phát triển làm đục môi trường hoặc làm tăng ở
đáy ống hoặc tạo váng trên bề mặt môi trường…
Môi trường đặc thông dụng nhất là thạch dinh dưỡng đổ vào ống nghiệm
tạo thành mặt phẳng ngiêng gọi là thạch nghiêng hoặc tạo thành một hình trụ gọi
là ống thạch, đổ vào hộp petri gọi là thạch đĩa. Ở mặt thạch dinh dưỡng, vi
khuẩn phát triển từ một tế bào riêng rẽ dính lại với nhau thành một quẩn thể
trông thấy bằng mắt gọi là khuẩn lạc. Kích thước, màu sắc, hình thái khuẩn lạc
khác nhau ở mỗi loại vi khuẩn, nên dựa vào khuẩn lạc ở môi trường đặc người ta
có thể phân lập được các loại vi khuẩn ròng.
Hình thái khuẩn lạc có thể biến đổi trong quá trình cấy chuyển. Khuẩn lạc
của phế cầu lúc mới phân lập thì trong suốt, lồi, bóng gọi là khuẩn lạc dạng S rất
độc lực, nhưng cấy chuyển nhiều lần ở phòng thí nghiệm thì vi khuẩn tạo thành
những khuẩn lạc nhỏ, khô xù xì gọi là khuẩn lạc R độc lực kém.
Người ta cấy vi khuẩn bằng pipet Pasteur hoặc bằng que cấy: pipet
Pastuer dùng để cấy bệnh phẩm lỏng và canh thang hoặc ở trên mặt thạch. Ở
canh thanh, sau khi lấy bệnh phẩm phải cho pipet Pasteur vào ống canh thang
cho tới khi đầu nhọn pipet chạm vào canh thang.
Que cấy dùng để cấy bệnh phẩm đặc. Que cấy gồm 2 loại: Que cấy thẳng
và que cấy vòng mang một vòng tròn ở đầu kim. Que cấy vòng dùng để ria cấy
ở mặt thạch hoặc cấy vào canh thang. Que cấy thẳng dùng để cấy thẳng về sâu
của mặt thạch ống.
12
1.2.3. Xác định vi khuẩn
Sau khi đã phân lập người ta phát hiện vi khuẩn qua các bước:
Soi kính hiển vi tiêu bản nhuộm Gram: để kiểm tra hình thể tính chất bắt
màu của vi khuẩn.
Khảo sát những tinh chất sinh hóa:
Muốn thế người ta thực hiện giá sinh hóa bao gồm nhiều phản ứng phát
hiện những enzyme của những vi khuẩn hoặc các sản phẩm chuyển hóa của các
enzyme.
Đối với vi khuẩn đường ruột thông thường người ta làm giá sinh hóa đơn
giản. Trong những trường hợp cần thiết người ta mới làm giá sinh hóa hoàn
chỉnh.
- Ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu: Phản ứng kết hợp kháng
nguyên kháng thể là một phản ứng rất đặc hiệu. Một loại vi khuẩn chỉ ngnưng
kết với kháng huyết thanh do nó kích thích cơ thể tạo thành. Trong phòng thí
nghiệm, người ta có sẵn những kháng huyết thanh của những vi khuẩn cần định
danh. Sau khi đã định danh của một chủng vi khuẩn bằng giá sinh hóa, người ta
thực hiện phản ứng ngưng kết để kiểm tra những kháng nguyên đặc hiệu cảu nó.
Ví dụ: dựa vào hình thể ở kính hiển vi và tính chất sinh hóa người ta định
danh được chủng vi khuẩn khảo sát la Salmonella typhy thì người ta làm phản
ứng ngưng kết với huyết thanh kháng O và kháng H của vi khuẩn nói trên.
Trong một số trường hợp người ta còn hoàn chỉnh thêm việc chẩn đoán bằng
thử nghiệm độc lực, định typ huyết thanh, định typ phage.
2. Chẩn đoán gián tiếp
Là tìm kháng thể trong huyết thanh người bệnh.
2.1. Nguyên tắc
Dựa vào kháng nguyên đã biết trước và bằng các phản ứng kết hợp kháng
nguyên - kháng thể đặc hiệu để tìm kháng thể. Thông qua sự có mặt của kháng
thể mà kết luận sự có mặt của kháng nguyên vi khuẩn gây bệnh.
13
2.2. Các bước tiến hành
2.2.1. Lấy bệnh phẩm
Lấy máu tĩnh mạch (khoảng 3ml) cho vào ống nghiệm, để máu đông, ly
tâm lấy huyết thanh. Phải lấy máu 2 lần phải cách nhau 7 -10 ngày để xác định
động lực kháng thể.
2.2.2. Làm phản ứng huyết thanh
- Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau,
thường pha loãng bậc 2.
- Hai mẫu huyết thanh 1 và 2 cùng được tiến hành làm phản ứng trong cùng
điều kiện.
- Xác định hiệu giá kháng thể (HGKT): HGKT được tính đến nồng độ
huyết thanh pha loãng nhất mà ở đó phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể
còn xảy ra dương tính.
- Xác định động lực kháng thể (ĐLKT): So sánh hiệu giá kháng thể của 2
mẫu huyết thanh lần 1 và lần 2 để tìm ĐLKT. ĐLKT là sự gia tăng HGKT lần 2
so với lần 1, ít nhất là 2 lần (với vi khuẩn) và gấp 4 lần (với virus). Khi có động
lực kháng thể thì kết luận người bệnh bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, có một số
bệnh không cần phải tìm ĐLKT và kỹ thuật xác định IgM cũng không cần phải
làm 2 lần.
Hiện nay, có nhiều phản ứng huyết thanh được dùng để chẩn đoán các bệnh
nhiễm khuẩn.
Ví dụ: Phản ứng ASO, phản ứng Widal, phản ứng VDRL, phản ứng TPHA,
phản ứng ELISA, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu, phản ứng kết hợp bổ thể,
phản ứng trung hòa…
-----------------------------------------------------------------------------------------
Câu hỏi ôn tập:
1. Trình bày hai phương pháp chẩn đoán vi khuẩn.
2. Thực hiện tiêu bản soi tươi, nhộm đơn, nhuộm Gram.
3. Thực hiện được kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn.
14
CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT KHUẨN VÀ KHỬ KHUẨN TRONG
PHÒNG THÍ NGHIỆM

1. Trình bày được các phương pháp tiệt khuẩn và khử khuẩn dụng cụ,
môi trường, sinh phẩm…dùng trong xét nghiệm vi sinh.
2. Thực hiện được các bước xử lý dụng cụ thủy tinh trong phòng thí
nghiệm…
3. Vận hành được tủ sấy và tủ ấm.
1. Tiệt khuẩn
Tiệt khuẩn là tiêu diệt tất cả các vi sinh vật bao gồm cả các nha bào.
Thường dùng trong phương pháp vật lý để tiệt khuẩn. Phương pháp này
bao gồm: Dùng khí nóng khô và dung hơi nóng ẩm. Tất cả các phương pháp đều
phải đảm bảo hoạt tính tiêu diệt ở cả bên trong và bên ngoài vật cần tiệt khuẩn.
1.1. Tiệt khuẩn bằng khí nóng khô nhờ sử dụng tủ sấy
1.1.1. Nguyên lý:
Dùng tủ kín bằng kim loại có nguồn nhiệt nâng nhiệt độ không khí trong
tủ lên tới 170-1800C. Ở 1700C/60’ hoặc 1600C/120’ tất cả các vi khuẩn và nha
bào đều bị tiêu diệt.
1.1.2. Cấu trúc của tủ sấy:
• Bộ phận điều chỉnh dòng điện
• Nhiệt kế
• Bộ ngắt tự động (phòng khi nhiệt độ lên quá mức yêu cầu)
• Các đèn hiệu (để báo cho biết dòng điện có hoạt động hay
không)
1.1.3. Cách sử dụng
• Cho các đồ vật cần sấy vào tủ (ống nghiệm, ống hút, hộp lồng
Petri…), các dụng cụ này sau khi đã rửa sạch, phơi khô, phải
được gói thành từng gói băng giấy. Để đồ vật trên các giá lưới
15
thép, tránh chạm vào thành tủ vì nhiệt độ ở thành tủ cao có thể
làm cháy giấy bọc hoặc làm vỡ đồ thủy tinh.
• Đóng mạch điện (mở nguồn điện, chờ khi nhiệt kế chỉ đủ nhiệt
độ yêu cầu thì duy trì ở nhiệt độ đó 60’. Tắt nguồn điện.
• Chờ khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 40-500C (mùa hè) và 30-
400C (mùa đông) mới được mở tủ lấy dụng cụ ra.
➢ Lưu ý:
− Tủ sấy chỉ dùng để sấy dụng cụ thủy tinh, không sấy đồ nhựa, cao su.
Dụng cụ kim loại có thể sấy, nhưng nếu sấy nhiều sẽ gỉ.
− Cửa tủ sấy và lỗ thong hơi phải được đậy kín khi bắt đầu sấy. Chú ý
theo dõi các đèn hiệu và nhiệt kế. Khi nhiệt độ đang cao không được
mở tủ. Muốn mở tủ sấy phải mở lỗ thong hơi trước.
− Sauk hi sấy, đồ vật được lấy ra nên để trên giấy, vải, gỗ vì nếu để trực
tiếp xuống nền đá lạnh thì đồ vật dễ vỡ. Có thể kiểm tra nhiệt độ sấy
có đủ đảm bảo tiệt khuẩn không bằng cách xem các nút bông, nếu có
màu nâu là vừa đủ, nếu bông còn trắng là nhiệt độ thấp (dưới 1400C)
chưa đạt yêu cầu; nút bông cháy là nhiệt độ quá cao.
− Dụng cụ sấy tiệt khuẩn có thể dùng trong 7 ngày. Khi để quá thời gian
này phải sấy lại.
1.2. Tiệt khuẩn bằng hơi nước căng nhờ sử dụng nồi hấp
(autoclave)
Có các loại:
− Loại cung cấp nhiệt băng điện.
− Loại cung cấp nhiệt bằng cách đun.
1.2.1. Nguyên lý
Trong một nồi kín không có không khí, chỉ có hơi nước, khi áp lực hơi
nước tăng thì nhiệt độ cũng tăng theo một tương quan nhất định. Trong nồi
kín khi nhiệt độ duy trì ở 1200C/30’ tương ứng với áp lực 1,0 at thì các vi
khuẩn và nha bào đều bị tiêu diệt.
16
1.2.2. Cấu trúc nồi hấp
- Nồi hấp là một loại thùng có 2 lần vỏ:
+ Lớp vỏ ngoài rất dầy, có thể chịu được áp suất 5-6 at.
+ Lớp vỏ trong dùng để đựng đồ cần hấp.
- Nắp nồi hấp bằng thép dầy, chắc, có các ốc để vặn giữ cho nắp không
bị bật khi áp suất trong nồi lên cao.
- Đồng hồ đo áp lực và nhiệt độ.
- 1 van xả hơi
- 1 van an toàn
- 1 van ở nơi đổ nước vào.
1.2.3. Cách sử dụng
- Đổ nước cất vào nồi với số lượng quy định (quan sát vạch mức nước).
Mỗi lần hấp nên thay nước.
- Mở nắp nồi, xếp các đồ vật cần hấp vào (môi trường, sinh phẩm, đồ vải,
đồ nhựa…). Giữa các vật thủy tinh bên trong có chứa chất lỏng thì nên chèn vải
hoặc giấy để khi sôi không chạm vào nhau, đồ vật tiệt khuẩn không nên để sát
nhau và để sát thành quá. Đậy nắp, vặn ốc từng cặp đối diện nhau để tránh kênh
nắp nồi.
- Điều chỉnh kim dồng hồ áp kế (1,0 at).
- Đóng mạch điện. Khi nước sôi thì mở van xả hơi, lúc đầu hơi trắng và
chưa đều, khi hơi ra đều và trong xanh thì đóng van lại. Làm như vậy để không
khí trong nồi hấp ra hết nhằm tránh sai lệch về nhiệt độ, áp suất (có thể kiểm tra
không khí trong nồi còn hay hết bằng cách dùng một ống cao su, một đầu lắp
vào khóa thoát khí, đầu kia nhúng vào chậu nước lạnh. Khi không thấy sủi bọt
trong chậu nước chứng tỏ không khí trong nồi đã ra hết). Đóng van xả hơi.
- Tiếp tục đun nóng đến khi áp kế chỉ 1 at, nhiệt độ 1200C thì duy trì trong
30’. Với các môi trường dinh dưỡng chỉ cần duy trì 1200C trong vòng 15-20’.
Ngắt điện khi đủ thời gian cần thiết.
17
- Chờ kim áp kế chỉ về số 0 mới mở nắp nồi cho thoát hơi ra từ từ và lấy
dụng cụ hóa chất đã tiệt khuẩn (phải vặn ốc nắp nồi ngay vì nếu chờ nguội hẳn
thì nắp sẽ dính chặt vào nồi sẽ rất khó mở).
➢ Lưu ý:
+ Phải kiểm tra van an toàn, vì nếu van hỏng có thể gây nổ rất nghiêm trọng
+ Phải có mặt thường xuyên bên cạnh chỗ hấp suốt thời gian vận hành.
+ Không để nhiệt độ tăng quá cao làm vỡ dụng cụ hoặc làm hỏng môi trường.
Không tháo hơi ra quá nhanh làm thủy tinh có thể bị nứt và các nút bình môi
trường có thể bị bật ra ngoài.
+ Dụng cụ hấp ướt chỉ dùng trong 3 ngày. Môi trường trong bình kín hoặc ống
nghiệm có thể giữ được một tuần.
➢ Ứng dụng: đây là phương pháp tiệt khuẩn rất tốt và thường được dùng tại
các bệnh viện, các phòng thí nghiệm và các cơ sở y tế để tiệt khuẩn dụng
cụ kim loại, cao su, nhựa, băng gạc, môi trường, hóa chất…
2. Khử khuẩn
Khử khuẩn là làm cho vật được khử khuẩn không còn khả năng gây
nhiễm khuẩn. Khử khuẩn không tiêu diệt được tất cả các vi sinh vật làm giảm
số lượng tới mức thường không gây hại đối với sức khỏe.
Có hai phương pháp vật lý và hóa học để khử khuẩn.
2.1. Phương pháp vật lý
2.1.1. Phương pháp đun sôi dụng cụ
Đun sôi và duy trì ở nhiệt độ 1000C trong thời gian 30’. Muốn làm nhiệt
độ tăng thì cho them 1-2% Na2CO3.
Ứng dụng: thường dùng để khử khuẩn bơm kim tiêm, dụng cụ tiểu phẫu
thuật.
2.1.2. Phương pháp Tyndal
− Nguyên lý:
Ở nhiệt độ 60-800C trong một giờ, protein của vi khuẩn bị đông vón lại.
Khi nhiệt độ này trở về bình thường, nha bào phát triển thành thể sinh dưỡng.
18
Sau 24h lại đun nóng lần 2, làm như vậy từ 3-4 ngày liền và cuối cùng các vi
khuẩn còn lại sẽ bị diệt.
− Ứng dụng:
Thường dùng để khử khuẩn sinh phẩm, huyết tương, huyết thanh. Vì một
số hóa chất, sinh phẩm sẽ bị hủy hoại khi khử khuẩn ở nhiệt độ cao.
2.1.3. Phương pháp dùng tia cực tím
Tác dụng của tia cực tím dựa trên cơ chế: cấu trúc các phân tử của vi sinh
vật như axit nucleic bị biến đổi khi hấp thụ tia bức xạ này. Tia cực tím
thường dùng để khử khuẩn không khí, nó có thể gây viêm kết mạc và giác
mạc.
2.2. Phương pháp hóa học
Nhiều loại chất hóa học được sử dụng và thường được pha thành các dung
dịch lỏng làm chất khử khuẩn. Các dung dịch hóa chất thường dùng ở các cơ
sở y tế để khử khuẩn là:
− Các loại cồn.
− Các dung dịch formaldehyde.
− Các dung dịch Iod.
− Các hợp chất clo.
3. Cách xử lý dụng cụ thủy tinh
3.1. Xử lý dụng cụ tinh mới (dùng lần đầu)
− Dụng cụ thủy tinh mới thường có tính kiềm, vì vậy cần xử lý qua dung
dịch axit để trùng hòa độ kiềm.
− Cách làm:
+ Ngâm dụng cụ mới vào dung dịch axit sulfuric (H2SO4) 10%
trong 3-5 ngày.
+ Rửa bằng nước thường và ngâm nước cất 1-2 ngày. Để khô.
3.2. Xử lý dụng cụ thủy tinh đã dùng bẩn
3.2.1. Đĩa Petri và ống nghiệm đã dùng
− Hấp ướt 1200C /30’. Để nguội khoảng 400C, lấy dụng cụ ra, đổ bỏ chất
chứa trong dụng cụ.
19
− Rửa nước thường, ngâm vào NaOH 20%/24h.
− Lấy dụng cụ ra, rửa nước thường rồi ngâm vào nước cất/24h.
− Lấy ra, làm khô (làm khô ở lò sấy nhiệt độ 600C hoặc phơi nắng).
− Đóng gói, sấy, tiệt khuẩn.
3.2.2. Lam kính đã dùng
− Dùng xylen lau hết dầu.
− Ngâm vào bình thuốc khử khuẩn sunfocromic trong một vài ngày.
− Rửa bằng nước máy, tráng nước cất. Sấy khô hoặc phơi khô.
− Có thể ngâm lam vào nước xà phòng rồi luộc sôi. Đem rửa nước máy,
tráng nước cất và để lam khô.
− Lau lam đã khô bằng miếng vải mềm không bị sổ long. Loại bỏ những
lam bẩn, xước nhiều, ố vàng, mờ.
− Xếp lam vào hộp.
3.2.3. Chai lọ, bình cầu, cốc đong, pipet
− Ngâm trong dung dịch sunfocromic từ 1 – 2 ngày.
− Rửa bên trong các bình, cốc bẩn bằng chổi long, rửa từng cái một, xúc
kỹ. Rửa kỹ các ống hút dưới vòi nước.
− Ngâm trong nước thường 30’ sau đó tráng bằng nước cất.
− Làm khô. Bọc giấy đối với pipet và làm nút đối với chai lọ, bình thủy
tinh để tiếp tục sấy, tiệt khuẩn.
+ Công thức dung dịch sunfocromic
Kali bicromat (K2Cr2O7) : 60g
Axit sunfuric (H2SO4) : 66g
Nước cất : 1000ml
+ Cách pha: cho K2Cr2O7 vào nước trước, sau đó cho H2SO4 vào từ
từ (không được cho axit vào nước hoặc vào K2Cr2O7 ngay).
+ Lưu ý: Dung dịch mới pha có màu vàng, trong. Dùng một thời
gian khi có màu đen thì bỏ.Các dụng cụ có chứa máu không
ngâm trong dung dịch này.
20
1. Trình bày các phương pháp tiệt khuẩn và khử khuẩn dụng cụ, môi trường,
sinh phẩm…dùng trong xét nghiệm vi sinh?
2. Thực hiện các bước xử lý dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm?
21
CẤU TẠO – CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN
KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC QUAN SÁT HÌNH THỂ VI KHUẨN

1. Thực hiện đúng các thao tác tìm vi trường.
2. Xác định được hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu và mối tương quan
của vi khuẩn trong vi trường.
3. Biết cách lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận của kính hiển vi về tư
thể nghỉ sau khi sử dụng.
Nội dung
I. Cấu tạo kính hiển vi quang học (KHV)
Những bộ phận khác nhau của KHV có thể xếp thành 4 hệ thống
1. Hệ thống giá đỡ
Gồm: Chân kính, trụ kính, ống mang vật kính và mâm kính.
2. Hệ thống phóng đại: Gồm có
- Vật kính:
+ Vật kính khô (vật kính thường): có độ phóng đại 10; 40; 60 lần.
+ Vật kính dầu: độ phóng đại 100 lần.
Đặc điểm nhận biết vật kính dầu:
Đầu dưới vật kính dầu có viền chỉ đen nổi lên hoặc chìm xuống.
Trên thân vật kính dầu có khắc độ phóng đại 90x hoặc 100x.
Thân to hơn vật kính khô.
Khẩu kính vật kính dầu nhỏ hơn khẩu kính vật kính khô.
- Thị kính: độ phóng đại 10 lần.
Độ phóng đại của KHV= Độ phóng đại vật kính  Độ phóng đại thị kính
3. Hệ thống chiếu sáng
Gồm: Nguồn sáng, gương, tụ quang, chắn sáng và kính lọc sáng.
4. Hệ thống điều chỉnh
Gồm: Vít điều chỉnh thô (vít đại cấp)
Vít điều chỉnh tinh (vít vi cấp)
22
Các vít điều chỉnh tụ quang và xe tiêu bản.
Trên mỗi chiều (trước- sau, phải- trái) của xe tiêu bản có thước giúp ta xác
định toạ độ của vi trường đang xem:
- Phần nguyên: Đọc ở thước dài, ứng với vạch số 0 của thước ngắn.
- Phần lẻ: Đọc ở thước ngắn tính từ số 0 đến vạch nào trùng với vạch trên
thước dài.
II. Cách sử dụng KHV có vật kính dầu để soi tiêu bản:
1. Cách tìm vi trường:
Quy ước “ Tìm thấy vi trường” là khi điều chỉnh nhìn thấy được hình ảnh
của vật soi (vi khuẩn, tế bào, ...)
1.1. Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp: Trong đa số trường hợp soi tiêu bản
nhuộm vi khuẩn chúng ta cần có ánh sáng tối đa. Cách điều chỉnh để có
ánh sáng tối đa như sau:
- Nâng tụ quang lên hết mức.
- Mở chắn sáng.
- Dùng gương tròn (mặt lõm) và điều chỉnh gương để ánh sáng tập trung
vào tụ quang.
1.2. Nhỏ một giọt dầu soi lên giữa tiêu bản, đặt tiêu bản lên mâm kính, tiêu bản
phải nằm sát mặt mâm kính và được giữ chắc.
1.3. Xoay vật kính dầu về đúng hãm.
1.4. Nhẹ nhàng nâng mâm kính để vật kính dầu và tiêu bản sát nhau (vật kính
chìm trong giọt dầu), trong khi thực hiện động tác này mắt không nhìn vào
thị kính mà nhìn vào khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản để tránh vỡ tiêu
bản. Tuy nhiên, để biết vật kính đã chạm vào tiêu bản hay chưa, chủ yếu
dựa vào cảm giác của tay.
1.5. Mắt nhìn vào thị kính, tay xoay vít đại cấp (vít lớn) hạ từ từ mâm kính, động
tác này làm chậm và đều (không giật cục).
Khi thấy hình ảnh thì dừng ngay rồi điều chỉnh vít vi cấp (vít nhỏ) cho rõ
nét.
23
Lưu ý:
• Trường hợp xoay vít đại cấp nhiều (vật kính đã tách khỏi giọt dầu trên tiêu
bản ) mà vẫn không thấy xuất hiện hình ảnh gì thì phải làm lại từ động tác 1.4.
• Trường hợp đã thoáng thấy hình ảnh, dừng lại điều chỉnh vít vi cấp khoảng
một vòng mà vẫn không thấy vi trường thì không cố tình xoay vít vi cấp đến
hết cỡ mà cũng phải làm lại từ động tác 1.4.
2. Cách soi tiêu bản:
Mắt nhìn vào thị kính, một tay cầm vít vi cấp để điều chỉnh cho hình ảnh
luôn rõ nét, tay kia vặn xe tiêu bản để chuyển dịch vị trí quan sát.
Khi soi tiêu bản nhuộm từ vi khuẩn đã phân lập cần chọn nơi vi khuẩn không
dày quá, quan sát xác định hình thể, tính chất bắt màu và cách sắp xếp của vi
khuẩn.
3. Lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận của kính về tư thế hợp lý (tư
thế nghỉ)
Cuối buổi thực tập phải lau ngay vật kính dầu:
- Hạ mâm kính để tiêu bản cách xa vật kính.
- Nhấc tiêu bản ra khỏi mâm kính.
- Xoay vật kính dầu tới vị trí dễ lau nhất, dùng khăn sạch, tẩm Xylen vừa ẩm
(Nếu quá đẫm thì chờ một lát cho Xylen bay hơi bớt), lau vật kính dầu tới khi
có cảm giác trơn là được.
- Điều chỉnh các bộ phận của KHV về tư thế nghỉ (hạ mâm kính xuống hết cỡ,
đóng chắn sáng, hạ tụ quang đến mức thấp nhất, đưa gương lấy ánh sáng về
phương thẳng đứng, không để lộ các đường trượt của xe tiêu bản).
- Lau bụi hoặc hơi nước rồi chụp khăn phủ kính, đặt kính vào hộp có chất
chống ẩm.
III. Nguyên tắc bảo quản KHV
Việc bảo quản KHV phải được tiến hành thường xuyên, đảm bảo 3 nguyên
tắc:
• Chống mốc: Đặc biệt quan trọng đối với những vùng có khí hậu nóng, ẩm
như nước ta.
24
KHV sau khi sử dụng phải được bảo quản trong phòng điều hoà nhiệt độ
có chất chống ẩm, hoặc bảo quản KHV trong chuông thuỷ tinh có chất chống
ẩm.
Với KHV không sử dụng trong thời gian dài cần tháo rời thị kính và các vật
kính rồi bảo quản ở nơi khô ráo có chất chống ẩm.
• Chống mòn: Hệ thống điều chỉnh và xe tiêu bản sau khi sử dụng phải được
lau sạch bụi, các đường trượt không được để lộ ra.
• Chống hỏng vỡ: Khi di chuyển KHV cần nhẹ nhàng, thận trọng tránh đổ vỡ,
di chuyển KHV theo hướng tịnh tiến.
Dưới đây là 10 điều không bao giờ được làm:
1- Lau các loại thấu kính bằng cồn.
2- Lau vật kính khi khăn đẫm Xylen.
3- Dùng giấy thường, khăn thường hoặc bông để lau các loại thấu kính.
4- Để ngón tay lên vật kính, thị kính.
5- Lau giá kính, mâm kính bằng Xylen.
6- Nhấc thị kính ra khỏi ống kính.
7- Di chuyển KHV bằng một tay.
8- Đặt KHV xuống bàn mạnh.
9- Xếp KHV cùng với dầu soi.
10- Chụp khăn phủ kính khi chưa kiểm tra tư thế nghỉ của kính.
---------------------------------------------------------------------------------------------
1. Thực hiện đúng các thao tác tìm vi trường.
2. Xác định được hình thể, cách sắp xếp, tính chất bắt màu và mối tương quan
của vi khuẩn trong vi trường.
3. Biết cách lau vật kính dầu và điều chỉnh các bộ phận của kính hiển vi về tư
thể nghỉ sau khi sử dụng.
25
TỔNG QUAN VỀ AN TOÀN SINH HỌC PHÒNG XÉT NGHIỆM

Sau bài này học viên có khả năng:
1. Trình bày được một số khái niệm liên quan đến ATSH, các tiêu chí chính để
phân loại VSV theo nhóm nguy cơ.
2. Trình bày được các lý do phải đảm bảo ATSH trong PXN.
3. Liệt kê được các quy định, hướng dẫn về ATSH đã được ban hành tại Việt Nam.
4. Trình bày được các yếu tố nhằm đảm bảo ATSH và các bước cần thực hiện
để PXN được cấp giấy chứng nhận ATSH.
Bài học này đề cập đến các thông tin cơ bản liên quan đến an toàn sinh học
phòng xét nghiệm như: một số khái niệm, phân loại vi sinh vật theo nhóm có
nguy cơ, cấp độ an toàn sinh học, lý do phải đảm bảo an toàn sinh học, các quy
định về an toàn sinh học tại Việt Nam và các yêu cầu về đảm bảo an toàn sinh học.
1. Một số khái niệm liên quan đến an toàn sinh học
An toàn sinh học (Biosafety): là thuật ngữ được sử dụng để mô tả các nỗ lực
làm giảm hoặc loại trừ các nguy cơ tiềm tàng của công nghệ sinh học và các sản
phẩm của nó.
An toàn sinh học phòng xét nghiệm (Laboratory Biosafety): là thuật ngữ
được sử dụng để mô tả những nguyên tắc, kỹ thuật và thực hành cần thiết để
ngăn ngừa những phơi nhiễm không mong muốn hoặc vô tình làm thất thoát các
tác nhân gây bệnh (TNGB) và độc tố.
An toàn sinh học (Biosecurity): là những biện pháp an ninh cho tổ chức hay
cá nhân được thiết lập để ngăn chặn sự mất mát, đánh cắp, lạm dụng, đánh tráo
hoặc vô tình phóng thích mầm bệnh và độc tố.
Tác nhân sinh học (Agent): gồm các vi sinh vật và các sinh vật biến đổi
gen, ký sinh trùng trên người có khả năng gây ra nhiễm trùng, dị ứng hoặc gây độc.
26
Hàng rào bảo vệ thứ nhất (Primarry Barriers): tủ ATSH, trang bị bảo hộ
cá nhân, dụng cụ trợ pipet, hộp đựng chất thải sắc nhọn, cố ly tâm an toàn, bơm
kim tiêm tự khóa.
Hàng rào bảo vệ thứ hai (Secondary Barriers): cơ sở vật chất, thiết kế PXN
hệ thống thông khí, dòng khí định hướng, áp suất âm, bồn rửa tay, vòi rửa mắt,
cửa tự động đóng, nồi hấp tiệt trùng…).
2. Phân loại vi sinh vật gây bệnh lây nhiễm theo nhóm nguy cơ
Để đánh giá mức độ nguy hiểm của các loại VSV gây bệnh truyền nhiễm
đối với nhân viên PXN và môi trường xung quanh. Tổ chức Y tế Thế giới đã
phân chia các loài VSV này thành bốn nhóm nguy cơ. Các tiêu chí quan trọng để
phân loại các VSV gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ bao gồm:
- Khả năng gây bệnh của VSV;
- Liều lây nhiễm;
- Đường lây nhiễm;
- Yếu tố vật chủ của VSV;
- Sự sẵn có của các biện pháp phòng và điều trị bệnh hiệu quả.
Dựa vào các tiêu chí trên, bốn nhóm nguy cơ của VSV gây bệnh truyền
nhiễm được mô tả như sau:
Nhóm nguy cơ 1: là nhóm chưa hoặc ít có nguy cơ lây nhiễm cho cá thể và
cộng đồng, bao gồm các loại vi sinh vật chưa phát hiện thấy khả năng gây bệnh
cho con người.
Ví dụ: Bacillus subtilis, Naegleria gruberi…
Nhóm nguy cơ 2: là nhóm có nguy cơ lây nhiễm cho cá thể ở mức độ trung
bình nhưng nguy cơ cho cộng đồng ở mức độ thấp bao gồm các loại vi sinh vật
có khả năng gây bệnh những ít gây bệnh nặng cho người, có khả năng lây truyền
sang người và có biện pháp phòng, chống lây nhiễm, điều trị hiệu quả trong
trường hợp mắc bệnh.
Ví dụ: Virus viêm gan B, Salmonella…
Nhóm nguy cơ 3: là nhóm có nguy cơ lây nhiễm cho cá thể cao nhưng
nguy cơ cho cộng đồng ở mức độ trung bình bao gồm các loại vi sinh vật có khả
27
năng gây bệnh nặng cho con người, có khả năng lây truyền sang người và có
biện pháp phòng, chống lây nhiễm, điều trị hiệu quả trong trường hợp mắc bệnh.
Ví dụ: Vi khuẩn lao, virus Hanta, virus cúm A/H5N1, SARS, virus HIV…
Nhóm nguy cơ 4: là nhóm có nguy cơ lây nhiễm cho cá thể và cộng đồng ở
mức độ cao bao gồm các loại vi sinh vật có khả năng gây bệnh nặng cho người,
có khả năng lây truyền sang người và chưa có biện pháp phòng, chống lây
nhiễm, điều trị hiệu quả trong trường hợp mắc bệnh.
Ví dụ: Virus Ebola, Poxvirus – Variola…
Theo khuyến cáo của WHO, các nước nên xây dựng bảng phân loại theo
nhóm nguy cơ đối với các VSV gây bệnh truyền nhiễm xuất hiện ở mỗi nước
dựa trên các tiêu chí đề cập ở trên. Do có rất nhiều các tiêu chí cần cân nhắc khi
xây dựng bảng phân loại VSV gây bệnh theo nhóm nguy cơ nên bảng phân loại
này sẽ khác nhau ở mỗi nước và chỉ nên áp dụng ở các quốc gia đó. Tại Việt
Nam, Bộ Y tế cũng đã ban hành thông tư số 07/2012/TT-BYT ngày 14/05/2012
quy định danh mục VSV gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ
ATSH phù hợp kỹ thuật xét nghiệm.
3. Cấp độ an toàn sinh học phòng xét nghiệm
Để tiến hành xét nghiệm các VSV ở các nhóm nguy cơ khác nhau, hiện nay
Tổ chức Y tế Thế giới và nhiều nước phân loại các PXN thành bốn cấp độ
ATSH (BSL). Tuy nhiên, cấp độ ATSH trong một số trường hợp không tương
ứng hoàn toàn với nhóm nguy cơ VSV vì còn liên quan đến kỹ thuật xét nghiệm
được tiến hành. Nhóm nguy cơ VSV chỉ là một trong những yếu tố cần nhắc đến
để xác định cấp độ ATSH phù hợp cho PXN. Việc đánh giá nguy cơ sẽ góp phần
quan trọng trong việc xác định cấp độ ATSH phù hợp cho mỗi PXN.
Tại Việt Nam, theo Nghị định số 92/2010/NĐ-CP, có 4 cấp độ ATSH của
PXN, đó là cấp I, cấp II, cấp III và cấp IV, Thông tư số 07/2012/TT-BYT của
Bộ Y tế cũng quy định cấp độ ATSH phù hợp với tác nhân gây bệnh và kỹ thuật
xét nghiệm tại PXN. Các yêu cầu đối với PXN ở các cấp độ ATSH cấp I, cấp II,
cấp III, cấp IV bao gồm: cơ sở vật chất, trang thiết bị, nhân sự, thực hành, phòng
ngừa, xứ lý và khắc phục sự cố ATSH.
28
4. Lý do phải đảm bảo an toàn sinh học trong phòng xét nghiệm
Nguy hiểm luôn tiềm ẩn và có thể xảy ra trong PXN như việc lây nhiễm
TNGB cho nhân viên PXN, các thương tích vật lý do vật sắc nhọn, điện, cháy,
nổ hay việc nhiễm các loại hóa chất độc hại, chất phóng xạ ion hóa… Một trong
những bằng chứng rõ ràng cho thấy nguy hiểm luôn tiềm ẩn và có thể xảy ra
trong PXN chính là các số liệu dịch tễ học về các trường hợp lây nhiễm liên
quan đến PXN. Tổng hợp số liệu nghiên cứu về các trường hợp lây nhiễm liên
quan đấn PXN từ năm 1930 đến năm 2004 của các tác giả cho thấy có 5.527
trường hợp lây nhiễm liên quan đến PXN, trong đó có 204 ca tử vong
(Biological Safety: Principle and Practices. Diane O. Fleming and Debra L.
Hunt, 2006). Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng những người làm việc trong
PXN có nguy cơ mắc một số bệnh truyền nhiễm cao hơn cộng đồng dân cư nói
chung. Nhân viên PXN có thể bị lây nhiễm với các VSV gây bệnh truyền nhiễm
qua bốn đường lây nhiễm thông thường, bao gồm: hô hấp, tiêu hóa, da, niêm
mạc và máu, vết thương. Việc lưu giữ, xét nghiệm TNGB truyền nhiễm trong
PXN có thể xảy ra nguy cơ làm thất thoát các TNGB hoặc độc tố của chúng ra
môi trường.
An toàn sinh học trong PXN là yêu cầu bắt buộc theo luật, nghị định và các
thông tư của Bộ Y tế.
5. Các quy định về an toàn sinh học tại Việt Nam
Trong Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm số 03/2007/QH12, ban hành
ngày 21 tháng 11 năm 2007, Điều 24, 25 và 26 đã đưa ra các quy định về bảo
đảm an toàn sinh học, quản lý mẫu bệnh phẩm, bảo về người làm việc trong
PXN.
Ngày 30 tháng 8 năm 2010, Chính phủ đã ban hành Nghị định số
92/2010/NĐ-CP quy định chi tiết thi hành Luật phòng, chống bệnh truyền nhiễm
về bảo đảm an toàn sinh học tại PXN. Nghị định này quy định về các vấn đề
sau:
- Phân loại VSV gây bệnh truyền nhiễm và PXN theo cấp độ ATSH;
- Điều kiện bảo đảm ATSH tại PXN;
29
- Thẩm quyền, hồ sơ, thủ tục cấp mới, cấp lại và thu hồi. Chứng nhận đạt
tiêu chuẩn ATSH;
- Kiểm tra ATSH;
- Phòng ngừa, xử lý và khắc phục sự cố ATSH.
Bảng danh mục VSV gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ
ATSH phù hợp kỹ thuật xét nghiệm đã được Bộ Y tế ban hành kèm theo thông
tư số 07/2012/TT-BYT ngày 14 tháng 5 năm 2012. Danh mục này cho phép các
PXN xác định được nhóm nguy cơ của VSV được tiến hành trong PXN và cấp
độ ATSH của PXN phù hợp với các kỹ thuật xét nghiệm TNGB.
Thông tư số 25/2012/TT-BYT ngày 29/11/2012 của Bộ y tế ban hành Quy
chuẩn Kỹ thuật quốc gia về thực hành và ATSH tại PXN, trong đó đưa ra các
yêu cầu cụ thể đối với các PXN ATSH từ cấp I đến cấp IV.
Thủ tục cấp mới, cấp lại giấy chứng nhận PXN đạt tiêu chuẩn ATSH được
Bộ Y tế quy định trong Thông tư số 29/2012/TT-BYT ngày 04/12/2012.
Việc quản lý mẫu bệnh phẩm bệnh truyền nhiễm được Bộ Y tế quy định
trong Thông tư số 43/2011/TT-BYT ngày 05/12/2011. Thông tư này quy định
việc thu nhập, bảo quản, đóng gói, vận chuyển, lưu giữ, sử dụng, nghiên cứu,
trao đổi, tiêu hủy mẫu bênh phẩm và điều kiện của cơ sở được phép bảo quản,
lưu giữ, sử dụng, nghiên cứu, trao đổi, tiêu hủy mẫu bệnh phẩm chứa chất lây
nhiễm loại A.
Quyết định số 43/2007/ QĐ-BYT của Bộ Y tế ban hành Quy chế Quản lý
chất thải y tế được áp dụng từ ngày 30/11/2007. Trong đó quy định chi tiết về
việc phân loại chất thải lấy nhiễm, phương pháp lưu giữ, vận chuyển và xử lý
đối với từng loại chất thải lây nhiễm.
Việc đảm bảo ATSH đối với các PXN thuộc Trung tâm Y tế dự phòng
tuyến tỉnh cũng được quy định trong Chuẩn Quốc gia TTYTDP tuyến tỉnh/thành
phố (ban hành kèm theo Quyết định số 4696/QĐ-BYT ngày 27 tháng 11 năm
2008 của Bộ trưởng Bộ Y tế).
30
6. Các yêu cầu về an toàn sinh học của PXN
Để đảm bảo ATSH, PXN cần đáp ứng các yêu cầu về cơ sở vật chất, trang
thiết bị; nhân sự; thực hành; phòng ngừa, xử lý và khắc phục sự cố ATSH. Các
yêu cầu này sẽ được đề cấp chi tiết trong bài 4 “Các yêu cầu đối với PXN an
toàn sinh học cấp I, cấp II”.
Theo quy định, các PXN chỉ được thực hiện hoạt động xét nghiệm khi có
giấy chứng nhận an toàn sinh học phù hợp. Để được cấp giấy chứng nhận
ATSH, đơn vị có PXN cần thực hiện các hoạt động sau:
- Phổ biến các quy định về ATSH cho tất cả nhân viên PXN;
- Cử người tham dự khóa đào tạo về ATSH do đơn vị có thẩm quyền tổ
chức;
- Đánh giá thực trạng, lập kế hoạch và triển khai các hoạt động về ATSH
của PXN về cơ sở vật chất; trang thiết bị; nhân sự; thực hành; phòng ngừa; xử lý
và khắc phục sự cố ATSH;
- Tự đánh giá về đảm bảo ATSH của PXN theo bảng kiểm;
- Khi đã đáp ứng đầy đủ các yêu cầu, chuẩn bị và nộp hồ sơ xin cấp giấy
chứng nhận cho cơ quan có thẩm quyền cấp (đối cới PXN ATSH cấp II, giấy
chứng nhận ATSH do Sở Y tế cấp).

1. Phòng ngừa phát tán TNGB có chủ ý từ PXN ra cộng đồng là hoạt động
liên quan đến (lựa chọn đáp án đúng nhất):
A. An toàn sinh học
B. An ninh sinh học
C. Vận chuyển TNGB
D. Cả A, B, C đều đúng
31
2. Phòng ngừa phát tán TNGB không có chủ ý từ PXN ra cộng đồng là hoạt
động liên quan đến (lựa chọn đáp án đúng nhất):
3. Không báo cáo về việc bị đánh cắp các mẫu bệnh phẩm là vấn đề liên
quan đến (lựa chọn đáp án đúng nhất):
4. Lựa chọn nhóm nguy cơ phù hợp với các VSV dưới đây (đánh dấu  vào
ô thích hợp):
Nhóm nguy cơ
STT Tác nhân gây bệnh
1 2 3 4
1 Virus cúm A/H5N1
2 Virus viêm gan B
3 Virus HIV
4 Vi khuẩn Bacillus subtillis
5 Vi khuẩn tả
5. Các nhóm yếu tố chính để đảm bảo ATSH bao gồm (lựa chọn đám án
đúng nhất):
A. Cơ sở vật chất; trang thiết bị; nhân sự; thực hành; phòng ngừa, xử lý và
khắc phục sự cố.
B. Cơ sở vật chất; nhân sự đào tạo; thực hành; xử lý chất thải.
C. Cơ sở vật chất; trang thiết bị; nhân sự; thực hành xử lý chất thải.
D. Cơ sở vật chất; trang thiết bị; nhân sự; đào tạo; phòng ngừa, xử lý và
khắc phục sự cố.
32
6. Hàng rào bảo vệ thứ nhất là (có thể lựa chọn nhiều đáp án):
A. Phòng xét nghiệm
B. Tủ ATSH
C. Trang bị bảo hộ cá nhân
D. Hệ thống thông khí
7. Hàng rào bảo vệ thứ hai là (có thể lựa chọn nhiều đáp án):
A. Phòng xét nghiệm
B. Tủ ATSH
C. Trang bị bảo hộ cá nhân
D. Hệ thống thông khí
33
LÂY NHIỄM LIÊN QUAN ĐẾN PHÒNG XÉT NGHIỆM

Sau bài này, học viên có khả năng:
1. Trình bày được khái niệm về lây nhiễm liên quan đến PXN.
2. Trình bày được các yếu tố liên quan đến lây nhiễm trong PXN.
3. Nêu được các biện pháp ngăn ngừa và giảm thiểu lây nhiễm liên quan đến
PXN.
Lây nhiễm liên quan đến PXN (laboratory Associated Infections – LAI) là
các lây nhiễm mắc phải thông qua các hoạt động tại PXN hay liên quan đến
PXN, kể cả các lây nhiễm có triệu chứng hay không có triệu chứng.
Thực tế cho thấy các nhân viên PXN có nguy cơ lây nhiễm một số loại
TNGB nhất định cao hơn so các đồng nghiệp (virus viêm gan B, vi khuẩn
lao…). Rất khó để có thể thống kê chính xác các trường hợp lây nhiễm liên quan
đến PXN, có thể là do các cơ quan quản lý thiếu quan tâm hoặc người bị lây
nhiễm không báo cáo. Do thiếu số liệu chính xác về lây nhiễm liên quan đến
PXN nên người ta đã phân tích các số liệu có được qua những điều tra về đánh
giá phạm vi và đặc điểm của tính trạng phơi nhiễm.
Ngoài các thông tin về các trường hợp mắc lây nhiễm liên quan đến PXN,
cần có các đánh giá về các yếu tố liên quan như: loại VSV gây bệnh, đường lây
nhiễm, yếu tố con người (tình trạng miễn dịch, hiểu biết, thực hành), trang thiết
bị, thiết kế PXN và yếu tố môi trường để giúp cho việc phòng tránh lây nhiễm
liên quan đến PXN.
1. Tình hình lây nhiễm liên quan đến phòng xét nghiệm
Đến này, ở Việt Nam chưa có thống kê về các trường hợp lây nhiễm liên
quan đến PXN. Tuy nhiên, ở nước ngoài các trường hợp lây nhiễm liên quan đến
PXN như thương hàn, Brucella và uốn ván đã được ghi nhận vào cuối thế kỷ 19.
Từ những năm 1930, các nhà dịch tễ học đã bỏ ra rất nhiều công sức để xác
minh phạm vi, mức độ của lây nhiễm liên quan đến PXN. Trong những năm
34
1940, các nghiên cứu về các trường hợp mắc bệnh truyền nhiễm liên quan đến
việc không đảm bảo ATSH trong PXN đã được thực hiện.
Năm 1950, Sulkin và Pike đã tiến hành một điều tra về lây nhiễm liên quan
đến PXN thông qua việc gửi phiếu điều tra tới 5.000 PXN trên toàn nước Mỹ.
Trên cơ sở kết quả điều tra này và các số liệu có được, năm 1976 các tác giả này
đã công bố phân tích về 3.921 trường hợp lây nhiễm liên quan đến PXN ở Mỹ
và các nước khác trong thời kỳ 1930-1975.
Năm 1978, Pike bổ sung thêm 158 trường hợp lây nhiễm mới, đưa tổng số
lên 4.079 trường hợp lây nhiễm liên quan đến PXN được ghi nhận, trong đó có
168 trường hợp tử vong. Thực tế từ các loại hình công việc tại các PXN được
điều tra cho thấy vi khuẩn gây ra 1.704 (41,8%) trường hợp lây nhiễm, virus gây
ra 1.179 (28,9%) trường hợp, Rickettsia gây ra 598 (14,7%) trường hợp, nấm
gây ra 354 (8.7%) trường hợp, Chlamydia gây ra 128 (3,1%) trường hợp và kí
sinh trùng là nguyên nhân của 116 (2,8%) trường hợp lây nhiễm. Vi khuẩn và
virus là nguyên nhân của hơn 2/3 số trường hợp lây nhiễm, trong đó có những
trường hợp tử vong, Brucella, Coxiella brunetii, virus viêm gan B, Salmonella
typhi, Francisella tularensis và vi khuẩn lao là các TNGB được ghi nhận nhiều
nhất.
Trong giai đoạn từ năm 1979 đến năm 2004, thông qua các số liệu sẵn có,
Harding và Byers đã thống kê được 1.448 trường hợp lây nhiễm có triệu chứng
và 708 trường hợp không có triệu chứng tại Mỹ và các nước khác. Trong các
trường hợp này có 36 trường hợp tử vong và có 17 trường hợp lây nhiễm thứ
phát. Vi khuẩn và virus chiếm 83% các trường hợp lây nhiễm được biết. Nếu
gộp cả các lây nhiễm với Rickettsia và các vi khuẩn thì 96% các trường hợp lây
nhiễm liên quan đến PXN đều có nguyên nhân từ vi khuẩn hay virus.
35
Bảng 1. Các trường hợp lây nhiễm liên quan đên PXN được ghi nhận từ
năm 1979 đến năm 2004
Số lượng
Loại tác
Không có Lây nhiễm
nhân gây Có triệu Lây nhiễm
triệu nguyên Tử vong
bệnh chứng thứ phát
chứng phát
Virus 608 430 1.038 18 10
Vi khuẩn 598 60 658 17 7
Ricketsia 187 214 401 1 0
Ký sinh 49 4 53 0 0
trùng
Nấm 6 0 6 0 0
Tổng 1.448 708 2.156 36 17
Nguồn: Biological Safety: Principles and Practices, Diane O. Fleming and
Debra L. Hunt,2006.
Các tác giả A. Lynn Harding và Karen Brandt Byers cũng đưa ra số liệu về
10 loại LAI có triệu chứng thường gặp nhất như sau:
36
Bảng 2: Các trường hợp lây nhiễm liên quan đến PXN có triệu chứng thường
gặp
1930 - 1978 1979 - 2004
Lây Tử Lây Tử
Tác nhân Tác nhân
nhiễm vong nhiễm vong
Brucella spp. 426 5 Lao 199 0
Coxiella burnetii 280 1 Arbovirus 192 3
Virus viêm gan B 268 3 Coxiella burnetii 177 1
Salmonella typhi 258 20 Virus Hanta 155 1
Francisella tularensis 225 2 Brucella spp. 143 4
Vi khuẩn lao 194 4 Virus viêm gan B 82 1
Blastomyces 162 0 Shigella spp. 66 0
dermatitidis
Virus viêm não ngựa 146 1 Salmonella typhi 64 2
Venezuala
Chlamydia psittaci 116 10 Viêm gan C 32 1
Coccidioides immitis 93 2 Neisseria 31 11
meningitidis
Cộng 2.168 48 1.141 24
Nguồn: Biological Safety: Principles and Practices, Diane O. Fleming and
Debra L. Hunt,2006.
Trong những năm gần đây, các bệnh truyền nhiễm có chiều hướng diễn
biến phức tạp. Một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm mới xuất hiện như SARS,
Ebola, cúm A/H5N1. Một số bệnh dịch truyền nhiễm đã bùng phát trở lại như
lao, tả, lỵ… Năm 2003, cùng với sự xuất hiện của bệnh SARS là hai trường hợp
nhiễm SARS từ các PXN ở Trung Quốc và Singapore. Các trường hợp lây
nhiễm vẫn tiếp tục xảy ra ở các PXN. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu tổng hợp
cho giai đoạn từ 2005 đến nay.
37
2. Các yếu tố liên quan đến lây nhiễm trong phòng xét nghiệm
Các yếu tố liên quan đến lây nhiễm trong PXN bao gồm đặc điểm của
TNGB, đường lây nhiễm, vật chủ và môi trường PXN (thông khí, trang thiêt bị,
quy trình).
Các điều tra đã được tiến hành cho thấy một số VSV gây ra các trường hợp
lây nhiễm liên quan đến PXN nhiều hơn các tác nhân khác (ví dụ: Brucella spp.,
vi khuẩn lao) hay một số quy trình, thiết bị thường xảy ra sự cố hơn so với các
quy trình, thiết bị khác.
Tác nhân gây bệnh có thể lây nhiễm cho người làm việc trong PXN thông
qua bốn con đường chủ yếu bao gồm: hô hấp, tiêu hóa, da, niêm mạc, máu, vết
thương. Các nguyên nhân thường gặp liên quan đến bốn con đường lây nhiễm
được liệt kê như sau:
Bảng 3: Đường lây nhiễm và nguyên nhân thường gặp
Đường lây Nguyên nhân thường gặp
nhiễm
Tiêu hóa Hút pipet bằng miệng
Văng bắn các vật liệu nhiễm trùn vào miệng
Đưa các đồ vật hoặc tay bị nhiễm bẩn lên miệng
Ăn uống trong PXN
Máu, vết thương Vết thương do vật sắc nhọn (kim tiêm, mảnh vỡ thủy
tinh…)
Động vật hoặc côn trùng cắn, cào, đốt
Da, niêm mạc Đổ vỡ hoặc văng bắn vật liệu lây nhiễm vào mắt, mũi,
miệng
Đổ vỡ, văng bắn vào da
Tiếp xúc với các bề mặt, thiết bị, vật liệu lây nhiễm trong
PXN
Hô hấp Các quy trình, kỹ thuật tạo khí dung
38
Các công việc như thu thập mẫu bệnh phẩm, xử lý mẫu, nuôi cấy VSV
thường gây nhiễm các dụng cụ, bề mặt bàn làm việc, thiết bị và tạo ra khí dung.
Ăn, uống, sử dụng mỹ phẩm trong PXN làm tăng khả năng bị lây nhiễm qua
đường tiêu hóa, do đó các hoạt động này thường bị cấm trong PXN. Không
được mang thức ăn vào trong PXN hoặc cất trong tủ lạnh bảo quản mẫu bệnh
phẩm và môi trường.
Lây nhiễm TNGB do vật sắc nhọn là một trong những nguyên nhân hàng
đầu dẫn đến lây nhiễm liên quan đến PXN. Hầu hết TNGB có thể gây lây nhiễm
khi cơ thể bị phơi nhiễm qua vết thương do vật sắc nhọn lây nhiễm như kim
tiêm, dao mổ hoặc mảnh thủy tinh. Nhân viên PXN làm việc trong các cơ sở
nghiên cứu động vật cũng có thể bị lây nhiễm do bị động vật hoặc côn trùng
nhiễm bệnh cắn, cào.
Da lành lặn là hàng rào chắc chắn giúp bảo vệ cơ thể khỏi lây nhiễm với
hầu hết các TNGB những khi da bị tổn thương thì cơ thể rất dễ bị nhiễm TNGB.
Khí dung (aerosol) là các hạt nhỏ lơ lửng trong không khí. Phần lớn các
quy trình trong PXN đều tạo ra khí dung có khả năng lây nhiễm cho người làm
xét nghiệm qua đường hô hấp. Các hạt khí dung chứa TNGB thường có kích
thước trên 0,5μm. Khí dung có thể được loại bỏ khỏi PXN trong vòng 30 – 60
phút với hệ thống không khí có tần số trao đổi không khí là 6 – 12 lần/giờ. Các
trường hợp lây nhiễm liên quan đến PXN do hít phải các hạt khí dung lây nhiễm
thường liên quan đến các tác nhân như Brucella spp., Coxiella burnetii (sốt Q),
Chlamydia psittaci, vi khuẩn lao, virus sởi và virus Coxsakie A21.
39
Bảng 4: Các thao tác sự cố có thể tạo khí dung
Loại thao tác Thao tác/sự cố tạo có thể tạo khí dung
Thao tác với que cấy Cấy chuyển, đốt que cấy, làm nguội que cấy
Sử dụng pipet Trộn dung dịch chứa VSV
Thao tác với bơm Đẩy không khí ra khỏi bơm tiêm
kim tiêm Rút kim tiêm khỏi nút của chai, lọ
Tiêm, truyền cho động vật
Tháo kim tiêm khỏi bơm tiêm
Thao tác khác Ly tâm
Sử dụng máy trộn, máy lắc, máy siêu âm
Đổ hoặc gạn dung dịch
Mở hộp nuôi cấy
Đông khô hoặc lọc bằng bơm hút chân không
Rơi, bắn các giọt dung dịch chứa TNGB trên bề mặt làm
việc
Đổ tràn các vật liệu lây nhiễm
Do phải có một liều lượng TNGB nhất định mới có khả năng gây bệnh nên
không phải nhân viên xét nghiệm nào bị lây nhiễm cũng mắc bệnh. Liều lây
nhiễm thay đổi và phụ thuộc vào loại TNGB, đường lây nhiễm và tình trạng của
cơ thể vật chủ. Tác nhân virus nguy hiểm hơn các tác nhân VSV khác vì liều lây
nhiễm của virus cho con người thường thấp hơn. Việc con người có thể mặc
bệnh khi tiếp xúc với một liều lượng rất thấp TNGB qua đường hô hấp (như F.
tularensis, C. burnetii, virus sởi và virus coxsackie A21) cho thấy tầm quan
trọng của việc ngăn ngừa sự hình thành các hạt khí dung trong môi trường PXN
cũng như việc sử dụng trang thiết bị ngăn chặn để bảo vệ nhân viên.
40
Bảng 5 : Liều lây nhiễm của một số tác nhân vi sinh vật
Đường lây
STT Tên tác nhân VSV Liều lây nhiễm
nhiễm chính
1 Bacillus anthracis 8.000 – 50.000 Hô hấp
2 Bacillus cereus 104 - 109 Tiêu hóa
3 Vibrio cholerae 106 - 1011 Tiêu hóa
4 Ebola virus 1 – 10 Hô hấp
5 Salmonella typhi 10.000 Tiêu hóa
6 Coxiella burmetii 1 – 10 Hô hấp
7 Escherichia coli 10 Tiêu hóa
8 Shigella spp. 10 – 200 Tiêu hóa
9 Helicobacter pylori 104 đối với khí Tiêm truyền
10 Mycobacterium tuberculosis 10 Hô hấp
Nguồn : Pathogen Safety Data Sheet and Risk Assessment, Public Health
Agency of Canada.
Các điều tra cho thấy, trong số các trường hợp lây nhiễm liên quan đến
PXN xác định được nguồn lây nhiễm, hầu hết đều liên quan đến các rủi ro hay
bất cẩn của con người. Trong đó, 25% liên quan đến việc sử dụng bơm kim
tiêm; 27% do đổ, vỡ hoặc văng bắn dung dịch chứa TNGB 16% bị thương do
mảnh thủy tinh vỡ hay các vật sắc nhọn khác; 13% do hút pipet bằng miệng;
13,5% do động vật cắn, cào hoặc tiếp xúc với động vật ký sinh và 5,5% do các
nguyên nhân khác.
Ngoài hai yếu tố là đặc điểm TNGB và đường lây nhiễm, yếu tố vật chủ
cũng đóng vai trò quan trọng trong việc lây nhiễm TNGB. Khi tiếp xúc với
TNGB, tất cả chúng ta đều đứng trước nguy cơ lây nhiễm nhưng có một số
người, do tình trạng sức khỏe nhất định, có thể có nguy cơ cao hơn. Tình trạng
có thể làm tăng nguy cơ lây nhiễm bao gồm: bệnh tật, các vấn đề về y tế khác
hay thuốc làm thay đổi khả năng bảo vệ, suy giảm hệ thống miễn dịch của cơ
thể, quá nhạy cảm với dị nguyên, không có khả năng tiếp nhận một loại vacxin
41
nhất định về sinh sản. Cần phải xác định được và giải quyết các yếu tố nguy cơ
này trước khi bắt đầu làm việc với TNGB.
Trong các tình huống phơi nhiễm với TNGB, con người là yếu tố trung tâm
trong kiểm soát an toàn đối với mọi hoạt động. Nhân viên phải xử lý tác nhân,
thực hiện xét nghiệm, sử dụng thiết bị, kiểm soát động vật, loại bỏ rác thải lây
nhiễm và có thể phải xử lý các vật liệu lây nhiễm bị tràn, đổ. Do vậy để đảm bảo
hiệu quả công việc và an toàn, nhân viên cần được trang bị đầy đủ kiến thức, kỹ
năng chuyên môn và được tập huấn về an toàn và phải có ý thức tự giác đảm bảo
an toàn trong công việc.
Yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng không nhỏ đến nguy cơ lây nhiễm liên
quan đến PXN. Một số công việc được thực hiện trong những môi trường khó
kiểm soát hơn (ví dụ công tác thực địa hay nghiên cứu động vật), đồng thời cũng
có những quy trình tạo ra nguy cơ phát tán TNGB cao hơn những quy trình khác.
3. Các biện pháp ngăn ngừa, giảm thiểu lấy nhiễm liên quan đến PXN
Để xây dựng được một chiến lược ngăn ngừa và giảm thiểu lây nhiễm hiệu
quả nhất, tất cả các yếu tố liên quan đến lây nhiễm đều cần được đánh giá để
đưa ra các biện pháp phù hợp. Nói chung, các biện pháp giúp ngăn ngừa và giảm
thiểu lây nhiễm liên quan đến PXN bao gồm:
- Đánh giá nguy cơ xảy ra trong PXN;
- Trang bị đầy đủ các điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị;
- Đào tạo, tập huấn nhân biên PXN về kỹ thuật xét nghiệm và ATSH;
- Xây dựng và tuân thủ các quy trình xét nghiệm, quy trình ATSH;
- Tiêm phòng vacxxin hoặc sử dụng thuốc phòng bệnh (nếu có);
- Ghi chép và báo cáo sự cố xảy ra trong PXN.
42
1. Khó khăn khi nghiên cứu số lượng các trường hợp lây nhiễm liên quan
đến PXN là do các nguyên nhân nào sau đây (có thể lựa chọn nhiều đáp án):
A. Việc nghiên cứu lây nhiễm liên quan đến PXN là không cần thiết.
B. Thường không có triệu chứng lâm sang.
C. Thường có thời kỳ ủ bệnh không điển hình.
D. Thường có đường truyền nhiễm không điển hình.
E. Nhân viên PXN và trưởng PXN không báo cáo do e ngài bị khiển trách.
2. Các TNGB nào dưới đây gây ra nhiều trường hợp lây nhiễm liên quan
đến PXN nhất (lựa chọn đáp án đúng nhất)?
A. Kí sinh trùng và vi khuẩn.
B. Vi khuản và virus.
C. Virus và nấm.
D. Vi khuẩn và Rickettsia.
E. Cả A, B, C, D đều sai.
3. Kể tên bốn đường lây nhiễm chủ yếu của TNGB đối với con người.
4. Các thao tác thực hành nào sau đây không tạo nguy cơ lây nhiễm liên
quan đến PXN (có thể lựa chọn nhiều đáp án)?
A. Sử dụng cốc ly tâm có nắp kín để ly tâm dung dịch chứa TNGB.
B. Hút pipet bằng miệng.
C. Sử dụng piprt để hút trộn dung dịch chứa TNGB.
D. Thao tác với vật sắc nhọn, bơm, kim tiêm.
E. Lau bề mặt bàn làm việc bằng dung dịch khử nhiễm.
5. Các thao tác nào sau đây có khả năng dẫn đến lây nhiễm liên quan đên
PXN do phơi nhiễm với các hạt khí dung (có thể lựa chọn nhiều đáp án đúng)?
A. Đốt que cấy.
B. Mở nắp ống nghiệm sau khi ly tâm trong tủ ATSH.
C. Đổ tràn dung dịch chứa TNGB.
D. Đeo khẩu trang khi thao tác với TNGB.
E. Bật quạt thông gió để tạo không khí trong PXN.
43
6. Yếu tố nào sau đây liên quan đến lây nhiễm trong PXN (lựa chọn đáp án
đúng nhất)?
A. Đặc điểm của TNGB.
B. Đường lây nhiễm.
C. Yếu tố vật chủ.
D. Môi trường PXN.
E. Cả A, B, C và D đều đúng.
7. Đường lây nhiễm nào sau đây thường dẫn đến lây nhiễm liên quan đến
PXN nhiều nhất (lựa chọn đáp án đúng nhất)?
A. Hít phải các hạt khí dung tạo ra do các sự cố/thao tác/quy trình xét
nghiệm.
B. Do động vật cắn, cào.
C. Ăn uống trong PXN.
D. Tiếp xúc da, niêm mạc với các bề mặt, dụng cụ lây nhiễm.
8. Chọn phương án đúng cho các câu hỏi sau đây.
8.1. Nhân viên PXN có nguy cơ lây nhiễm TNGB thấp hơn so với cộng
đồng nói chung
A. Đúng B. Sai
8.2. Tất cả các nhân viên PXN đều có khả năng bị lây nhiễm như nhau nếu
thao tác cùng loại TNGB
A. Đúng B. Sai
8.3. Các thao tác có khả năng tạo ra khí dung (như hút trộn dung dịch bằng
pipet, mở nắp ống chứa vật liệu lây nhiễm sau khi ly tâm…) nên tiến hành trong
tủ ATSH để hạn chế lây nhiễm do hít phải các hạt khí dung
A. Đúng B. Sai
44
BỆNH PHẨM VÀ NHUỘM ZIEHL – NEEHL ĐỂ CHẨN ĐOÁN LAO

1, Về lý thuyết:
- Trình bày được cách lấy bệnh phẩm và xử lý đờm;
- Trình bày cách dàn tiêu bản và nhuộm Ziehl- Neelsen;
2, Về thực hành:
- Thực hiện lấy, xử lý bệnh phẩm; nhuộm và đọc kết quả trên kính hiển vi.
1. Cách lấy và xử lí bệnh phẩm

Trực khuẩn lao có thể gây bệnh ở nhiều cơ quan trong cơ thể. Vì vậy, tuỳ
thuộc vào nơi tổn thương mà có cách lấy bệnh phẩm khác nhau. Bệnh phẩm
thông thường là đờm, nước rửa dạ dày, nước màng phổi, nước tiểu, nước não
tuỷ, nhưng cũng có thể là phân, mủ áp xe lạnh. Phải lấy vào chai vô khuẩn.
Trong phạm vi bài này chúng tôi chỉ trình bày cách lấy đờm.
1.1. Dụng cụ đựng đờm
- Dụng cụ phải sạch, vô khuẩn để đảm bảo kết quả xét nghiệm được chính
xác.
- Có miệng rộng và có nắp xoáy đậy chặt để tránh khô bệnh phẩm và
tránh lây lan.
- Phải cứng để tránh vỡ khi vận chuyển. Có thể dùng dụng cụ bằng chất
dẻo hoặc bằng thuỷ tinh dày.
1.2. Cách lấy và xử lí
- Cần thử ít nhất 3 mẫu đờm cho một bệnh nhân nghi mắc lao phổi. Một
mấu lấy tại chỗ bệnh nhân đến khám, mẫu thứ 2 lấy vào buổi sáng toàn bộ đờm
ho khạc sau khi ngủ dậy và mẫu thứ 3 lấy tại chỗ bệnh nhân mang mẫu đờm vào
buổi sáng đến khám.
- Lấy đờm ở ngoài trời càng xa mọi người càng tốt hoặc lấy trong phòng
cách ly thật thoáng khí vì khi bệnh nhân ho khạc là lúc nguy cơ lây truyền cao
nhất.
45
- Hướng dẫn bệnh nhân cách ho để lấy đờm từ trong ổ tổn thương ở phổi
và hướng dẫn mở nắp dụng cụ đựng đờm, đưa dụng cụ lên gần môi và nhổ đờm
vào.
- Phải lấy được một khối lượng đờm cần thiết từ 3-5ml, đờm có những
mảnh đặc hoặc mủ và không được chỉ có nước bọt.
- Đậy dụng cụ đựng đờm thật chặt và mang ngay đến phòng xét nghiệm.
Bệnh phẩm đờm lấy xong phải được bảo quản ở nơi thoáng mát tránh ánh sáng
mặt trời và các nguồn nhiệt. Kết quả xét nghiệm phụ thuộc vào kỹ thuật lấy
đờm và bảo quản đờm.
Đối với đờm có 2 phương pháp quan sát trực tiếp:
- Nhuộm trực tiếp từ bệnh phẩm: Có thể nhuộm ngay bệnh phẩm đờm
chưa xử lí. Chọng những chỗ đờm có máu, mủ phết lên lam kính. Nhuộm Ziel-
Neelsen và soi kính tìm vi khuẩn kháng axit-cồn.
- Nhuộm sau khi tập trung vi khuẩn để đạt tỉ lệ dương tính cao hơn chỉ sử
dụng lúc làm tiêu bản đờm trực tiếp mà không tìm thấy vi khuẩn kháng axít-
cồn. ở những phòng thí nghiệm có điều kiện nên làm phong phú vi khuẩn trong
bệnh phẩm đờm rồi mới nhộm bằng cách trộn 1 thể tích đờm với 2 thể tích
NaOH 4%, lắc đều rồi ly tâm 3000 vòng/phút/15 phút. Lấy cặn lắng rồi trung
hoà cặn lắng bằng HCL 4% hoặc H2SO4 4% rồi kiểm tra pH bằng
phenolphtalein 1%. Cặn đờm được dàn lên lam kính để làm tiêu bản nhuộm.
2. Kỹ thuật làm tiêu bản
2.1. Đánh số tiêu bản
Dùng bút chì mỡ hoặc bút viết kính viết lên đầu bên trái mỗi lam kính số
của tiêu bản. Số của tiêu bản gồm 2 phần:
- Tử số là số xét nghiệm.
- Mẫu số là số của mẫu đờm.
2.2. Dàn tiêu bản
- Dùng que cấy lấy một mảnh đờm vàng đục, mủ phết lên lam kính.
- Dàn mỏng đều mảnh đờm đặc vừa lấy lên lam với kích thước 1x2cm,
sau đó phải khử khuẩn que cấy bằng cách hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn.
46
3.2. Làm khô tiêu bản
Tiêu bản làm xong để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Không
được làm khô nhanh bằng cách hơ lửa, vì làm như vậy sẽ tạo ngưng kết hạt, vi
khuẩn kháng axít-cồn sẽ bị biến dạng khó nhận định kết quả.
2.4. Cố định tiêu bản
Khi tiêu bản khô hoàn toàn, hơ nóng tiêu bản qua ngọn lửa đèn cồn 2-3
lần mỗi lần khoảng 5 giây. Không được cháy sém, rồi đặt lam kính lên giá khô
sạch.
3. Kỹ thuật nhuộm Ziehl-neelsen
Nguyên lí của phươngpháp nhuộm là dùng một loại thuốc nhuộm mạnh,
dung dịch fuchsin có phenol của ziehl cho tác dụng trong một thời gian dài hoặc
dùng nhiệt độ, hoá chất giúp cho thuốc nhuộm thấm qua vách tế bào vi khuẩn.
sau khi rửa sạch nước người ta tẩy màu bằng hỗn hợp axit vô cơ mạnh và cồn, vi
khuẩn không bị tẩy màu được gọi là vi khuẩn kháng axit.
Vi khuẩn kháng axit như vi khuẩn lao chứa ở trong vách tế bào một lượng
lớn chất sáp làm cho vi khuẩn khó bắt màu thuốc nhuộm kiềm nhưng khi đã bắt
màu thì lại không bị tẩy màu bởi dung dịch axit-cồn.
3.1. Thuốc nhuộm
3.1.1. Dung dịch fuchsin có phenol
• Fuchsin bazơ 0.,3g
• Ethanol 95% 10ml
• Phenol 5g
• Nước cất vô khuẩn vừa đủ 100ml
3.1.2 Dung dịch HCL, cồn 95%
Cho từ từ 3ml HCL đậm đặc vào 97ml cồn 95% để được 100ml
3.1.3. Dung dịch xanh methylen kiềm
• Xanh methylen 0,3g
• Nước cất vô khuẩn vừa đủ 100ml
3.2. Kỹ thuật nhuộm
3.2.1. Kỹ thuật nhuộm cổ điển bằng nhiệt
47
• Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp fuchsin có phenol hơ nóng cho đến
khi bốc hơi thì dừng lại, làm như vậy 3 lần. Rửa nước.
Chú ý: không để dung dịch thuốc nhuộm khô hoặc sôi.
• Ngâm vào dung dịch axit cồn trong 3-5’ cho đến khi tiêu bản không còn
màu đỏ. Rửa nước.
• Phủ dung dịch xanh methylen, để 1’, rửa nước, để khô, soi kính.
3.2.3. Kỹ thuật nhuộm lạnh
• Phủ lên tiêu bản đã cố định một lớp fuchsin có phenol, nhỏ thêm một giọt
viso 1% để 2’, rửa nước.
• Ngâm vào dung dịch axit-cồn trong 3-5’ cho đến khi tiêu bản không có
màu đỏ, rửa nước.
• Phủ dung dịch xanh methylen, để 1’, rửa nước, để khô, soi kính.
3.3. Soi tiêu bản và đánh giá kết quả
Vi khuẩn kháng axit-cồn như vi khuẩn lao có hình que mảnh, màu đỏ hơi
cong, có ít hoặc nhiều hạt, đứng riêng rẽ, từng đôi hoặc từng đám, nổi rõ trên
nền xanh của tiêu bản. Những vi khuẩn thông thường tìm thấy trong đờm và các
tế bào của tổ chức động vật, bạch cầu, tế bào thượng bì bắt màu xanh, tất cả trên
một nền màu xanh nhạt.
Cách đánh giá kết quả tiêu bản nhuộm:
Kết quả Phân loại
• Không có vi khuẩn kháng axit-cồn / 100 vi trường Âm tính 0
• Từ 1 - 3 vi khuẩn kháng axit-cồn / 100 vi trường Xin thử lại
• Từ 4 - 9 vi khuẩn kháng axit-cồn / 100 vi trường Dương Ghi số AFB
• Từ 10 - 99 vi khuẩn kháng axit-cồn / 100 vi trường Dương 1+
• Từ 1 - 10 vi khuẩn kháng axit-cồn / 1 vi trường Dương 2+
• Trên 10 vi khuẩn kháng axit-cồn / 1vi trường Dương 3+
-------------------------------------------------------------------------------------------------
48
Câu hỏi ôn tập
1. Trình bày cách lấy bệnh phẩm và xử lý đờm;
2. Trình bày cách dàn tiêu bản và nhuộm Ziehl- Neelsen;
3.Thực hiện lấy, xử lý bệnh phẩm; nhuộm và đọc kết quả trên kính hiển vi.
49
PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM KIỂM TRA KHÔNG KHÍ, NƯỚC,
DỤNG CỤ VÀ MỨC ĐỘ VÔ KHUẨN PHÒNG THÍ NGHIỆM

- Về lý thuyết: Trình bày được phương pháp xét nghiệm kiểm tra không khí,
nước, dụng cụ y tế; kiểm tra vô khuẩn phòng xét nghiệm.
- Về thực hành: thực hiện được các kỹ thuật trên.
1. Phương pháp xét nghiệm kiểm tra không khí
1.1. Mục tiêu
- Phát hiện sự có mặt của các loài vi sinh vật gây bệnh trong không khí.
- Đánh giá tình trạng vệ sinh không khí trong các cơ sở y tế, các cơ sở sản xuất
thực phẩm…
- Đánh giá hiệu quả của các biện pháp khử khuẩn, làm sạch không khí đang áp dụng.
- Điều tra tình trạng ô nhiễm không khí do vi sinh vật trong một số trường hợp
đặc biệt.
1.2. Phương pháp để lắng tự nhiên (Phương pháp Koch)
Đây là phương pháp đơn giản, dễ áp dụng.
1.2.1.Chuẩn bị môi trường
Thường dùng 3 loại môi trường sau đây:
- Thạch dinh dưỡng để kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí.
- Thạch máu để kiểm tra các vi khuẩn tan máu (tụ cầu, liên cầu)
- Thạch Sabouraud để kiểm tra nấm mốc.
Mỗi lần kiểm tra không khí dùng dồng thời 3 loại môi trường trên.
1.2.2.Cách tiến hành
- Đặt các đĩa môi trường cách sàn nhà 20cm nếu xét nghiệm trong phòng hoặc
cách mặt đất 1m nếu xét nghiệm ngoài trời.
- Mờ nắp đĩa thạch để thời gian 5 phút (hoặc 10 phút, 15 phút…) ( nơi nghi ngờ
không khí bị ô nhiễm nhiều thì để trong khoảng thời gian ngắn; nơi nghi ngờ
không khí bị ô nhiễm ít thì để trong khoảng thời gian dài). Nếu kiểm tra không
50
khí buồng bệnh nhân trong bệnh viện thì để 10 phút. Nếu kiểm tra không khí ở
phòng mổ, phòng vô khuẩn thì có thể để 15 phút.
- Sau thời gian quy định, đậy nắp đĩa thạch và nuôi cấy trong tủ ấm 37 0C/24 giờ
để phát hiện các loại vi khuẩn; để 370C/5-7 ngày để phát hiện các loại nấm mốc.
Muốn kiểm tra không khí của bất kỳ cơ sở nào, nên đặt đĩa thạch ở nhiều nơi
khác nhau. Vị trí thường được chọ là đặt ở giữa phòng và 4 góc phòng; mỗi
điểm dặt 3 đĩa thạch đã nêu trên.
1.2.3.Đọc kết quả: Cần xác định những chỉ số sau
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí.
- Số lượng vi khuẩn tan máu.
- Số lượng nấm mốc.
- Tính ra số lượng vi khuẩn trong 1m3 không khí (chú ý vi khuẩn chỉ điểm vệ
sinh quan trọng là liên cầu tan máu, tụ cầu vàng):
Số lượng này được tính theo công thức của Omealianski như sau:
X = A x 100 x100/ S x k
X: Tổng số vi sinh vật trong 1m³ không khí
A: Tổng số khuẩn lạc mộc trên đĩa thạch
S: Diện tích đĩa thạch tính ra cm²
k : Thời gian mở đĩa thạch (theo hệ số): 5’= 1; 10’ = 2; 15’ = 3
100: Chúng ta đã lấy số khuẩn lạc thu được (A) chia cho diện tích của hộp thạch
(S) được tính ra số lượng vi khuẩn trên 1cm². Như vậy, để tính ra số lượng vi
khuẩn trên 100 cm² thì cần phải nhân lên 100 lần.
100: Việc nhân với hệ số 100 này là do Số lượng vi khuẩn thu được trên 100
cm² thạch nuôi cấy như trên tương đương số lượng vi khuẩn có trong 10 dm3
không khí; mà ta cần phải tính số lượng vi khuẩn có trong 1m3 không khí vì vậy
phải nhân lên 100 lần nữa.
Ví dụ: đếm trên đĩa Petri với diện tích 96cm² có 182 khuẩn lạc, hộp được
mở 10’. Tổng số vi sinh vật trong 1m³ không khí là:
X = 192 x 100 x 100/ 96 x 2 = 10.000 (tế bào vi khuẩn/1m3 không khí)
51
1.2.4. Tiêu chuẩn vi sinh vật trong không khí
Hiện nay, chúng ta chưa có một tiêu chuẩn quy định về số lượng vi sinh
vật trong không khí cho phép có ở những điều kiện khác nhau (ví dụ như cho
phòng mổ, phòng tiểu phẫu, phòng pha chế…).
về mặt nguyên tắc thì các phòng mổ hoặc các phòng đòi hỏi vô khuẩn cao
(phẫu thuật tim, não…) thì nhất thiết không được có sự hiện diện của bất cứ loài
vi sinh vật nào.
2. Phương pháp xét nghiệm kiểm tra nước
2.1. Chuẩn bị dụng cụ để lấy mẫu
• Lọ thủy tinh nút mài vô khuẩn thể tích 250ml.
• Đèn cồn, diêm.
• Phích lạnh
• Quang lấy mẫu.
2.2. Kỹ thuật lấy mẫu

2.2.1. Nước máy
Trước khi lấy mẫu phải đốt vòi bằng ngọn lửa đèn cồn, vặn vòi cho nước
chảy 3 – 5’. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy nút ngay.
2.2.2. Nước bề mặt (ao, hồ sông, suối): trước đó 48h không có mưa.
Lấy nước giữa dòng hoặc cách bờ 10 -20m. Với ao hồ rộng phải lấy ở 5 vị
trí, 1 mẫu ở giữa và 4 mẫu ở 4 góc, lấy ở độ sâu cách mặt nước 30cm. Dùng
quang dựng chai lấy mẫu cho xuống tới độ sâu được đánh dấu trên quang.
2.2.3. Ghi nhãn mẫu nước
• Nguồn nước.
• Ngày, giờ lấy mẫu: tốt nhất lấy từ 7-9h sáng.
• Địa điểm lấy mẫu.
• Nội dung yêu cầu.
• Mục đích xét nghiệm.
52
2.2.4. Cách bảo quản và thời gian vận chuyển
Mẫu nước phải được bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 4-8ºC và vận chuyển về
phòng xét nghiệm. Nếu mẫu nước không được bảo quản lạnh thì thời gian chậm
nhất để về xét nghiệm là 2 giờ sau khi lấy mẫu.
2.2.5. Các chỉ tiêu xét nghiệm vi sinh vật của mẫu nước
Theo WHO các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh nguồn nước gồm:
• Coliform: chỉ tiêu này cho biết tình trạng vệ sinh chung của một nguồn nước.
• Faecalcoliform: là vi khuẩn E.coli chịu nhiệt (44 - 45ºC). Đây là chỉ tiêu
tốt nhất để đánh giá vệ sinh nguồn nước.
• Faecal streptococci: sự có mặt của nó là một bằng chứng nguồn nước mới
bị ô nhiễm phân người.
• Clostridium perfringens: chỉ tiêu này chỉ có giá trị tốt trong việc đánh giá
chất lượng khử khuẩn nguồn nước.
• Pseudomonas.
2.3. Xác định tổng số Coliform bằng phương pháp nhiều ống (Most
Probable Number: MPN)
2.3.1. Vật liệu
• Pipét khắc độ loại 10ml, 5ml, 1ml.
• Que cấy, đèn cồn.
• Nước muối sinh lý.
• Canh thang lactose loãng.
• Canh thang Lactose đặc.
• Canh thang BGBL.
2.3.2. Tiến hành
Bước 1: Cấy vào canh thang lactose:
Chọn đậm độ mẫu nuôi cấy tùy theo nguồn nước sạch hay bẩn, đã xử lý
hay chưa sử lý.
Kỹ thuật cấy 7 ống: đối với nước đã được xử lý nên chọn cấy 7 ống. Không
cần pha loãng mẫu.
53
• 5 ống canh thang lactose đặc cấy mỗi ống 10ml nước xét nghiệm
nguyên chất.
• 1 ống canh thang lactose loãng cấy 1ml nước xét nghiệm.
• 1 ống canh thang lactose loãng cấy 0.1ml nước xét nghiệm.
Ủ ấm 37ºC/48h.
Kỹ thuật lấy nhiều ống: đối với nước chưa xử lý nên chọn phương pháp cáy
nhiều ống xếp thành 3 hàng. Hàng đầu 5 ống canh thang lactose đặc, các
hàng sau 5 ống canh thang lactose loãng.
• Pha loãng đậm độ nước xét nghiệm: tùy theo nước bẩn hay sạch để
pha loãng đậm độ 10ˉ¹, 10ˉ², 10ˉ³…
• Hàng 1 gồm 5 ống canh thang lactose đặc, cấy mỗi ống 10ml nước
xét nghiệm.
• Hàng 2 gồm 5 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1ml nước
xét nghiệm.
• Hàng 3 gồm 5 ống canh thang lacose loãng, cấy mỗi ống 0,1ml
nước xét nghiệm.
Nếu nước bẩn ta có thể pha loãng các với nồng độ loãng hơn. Ủ ấm
37ºC/48h.
Bước 2: Cấy chuyển vào môi trường BGBL:
Chọn các ống lên men lactose có sinh hơi cấy chuyển sang ống BGBL.
Ủ ấm 37ºC/48h.
2.3.3. Đọc kết quả
Chọn các ống len men lactose có sinh hơi trong canh thang BGBL. Tra
bảng MPN ta được chỉ số Coliform cần trong 100ml nước.
2.4. Xác định Faecalcoliform bằng phương pháp nhiều ống (MPN)
2.4.1. Vật liệu
• Pipét khắc độ loại 10ml, 5ml, 1ml.
• Que cấy, đèn cồn.
• Nước muối sinh lý.
• Canh thang lactose loãng.
54
• Canh thang Lactose đặc.
• Thạch EMB
2.4.2. Tiến hành
Bước 1: Pha loãng đậm độ nước xét nghiệm: tùy theo nước bẩn hay sạch
để pha loãng đậm độ 10ˉ¹, 10ˉ², 10ˉ³…
Bước 2: Nuôi cấy: Nếu nước đã xử lý ta có thể cấy 3 hàng ống:
• Hàng 1 gồm 5 ống canh thang lactose đặc, cấy mỗi ống 10ml nước
xét nghiệm.
• Hàng 2 gồm 5 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1ml nước
xét nghiệm.
• Hàng 3 gồm 5 ống canh thang lacose loãng, cấy mỗi ống 0,1ml
nước xét nghiệm. Ủ ấm 44ºC/48h.
Bước 3: Cấy chuyển lên môi trường EMB
Chọn các ống lên men lactose có sinh hơi ở từng hàng ống vào môi
ngfEBM. Mỗi ống cấy thành đường riêng biệt. Ủ ấm 37ºC/48h.
2.4.3. Đọc kết quả
Xác định số lượng ống có khuẩn lạc sinh ánh kim trên môi trường EMB ở
từng nồng độ ta sẽ có chỉ số MPN, tra bảng ta được số Faecalcoliform trong
100ml nước.
3. Phương pháp xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn ô nhiễm trên các mặt phẳng
(dụng cụ y tế, da vùng phẫu thuật của bệnh nhân, tay phẫu thuật viên…)
3.1. Cách lấy mẫu
Đặt dụng cụ vô trùng đục lỗ sẵn (kích thước lỗ: 1cmx1cm. hoặc 2 cm x2
cm) lên mặt đối tượng cần kiểm tra (ga, dao kéo, xe đẩy dụng cụ tiêm truyền
thay băng…); dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ướt bằng nước muối sinh lý
vô trùng quệt và lấy mẫu trên những diện tích đã có ở phần đục lỗ; hoặc quệt
vào những nơi cần kiểm tra vi khuẩn nhưng không đặt được tấm đục lỗ trên (như
dây truyền dịch, ống hút dịch,…).
55
3.2. Nuôi cấy
Mẫu nghiệm được nuôi cấy vào môi trường thạch máu; ghi vị trí lấy bệnh
phẩm, khoa phong…, ủ ấm 37ºC/24h và đọc kết quả. Đếm số lượng khuẩn lạc vi
khuẩn để tính ra số lượng vi khuẩn ô nhiễm trên 1 bề mặt kiểm tra.
Công thức tính: X = A x100/S
A: số lượng khuẩn lạc đếm được;
S; Diện tích đĩa thạch
4. Phương pháp xét nghiệm kiểm tra vô khuẩn phòng thí nghiệm
4.1 Mục đích
• Kiểm tra mức độ vô trùng ở chính phòng xét nghiệm nhằm đảm bảo tính
chính xác cho các xét nghiệm vi sinh, kiểm soát mầm bện tránh lây nhiễm
cho người tiếp xúc và môi trường xung quanh.
4.2. Kỹ thuật xét nghiệm kiểm tra vô khuẩn
- Kiểm tra chung: xét nghiệm đánh giá mức độ ô nhiễm vi khuẩn trong
không khí.
. Kỹ thuật: như xét nghiệm không khí đã trình bày ở trên
- Kiểm tra riêng: Kiểm tra vô trùng ở các dụng cụ, bề mặt
(bàn, box…): như kỹ thuật xét nghiệm đã được trình bày ở
mục 3.
-------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Trình bày phương pháp xét nghiệm kiểm tra không khí, nước, dụng cụ y
tế; kiểm tra vô khuẩn phòng xét nghiệm.
2. Thực hiện các kỹ thuật trên.
56
CHẨN ĐOÁN NHANH SƠ BỘ
VỚI TIÊU BẢN SOI TƯƠI, NHUỘM GRAM VÀ TEST SNIFF
1. Dụng cụ và phương tiện thực hiện

Ðể thực hiện các kỹ thuật trên cần chuẩn bị hóa chất, dụng cụ và phương
tiện.
1.1. Hoá chất
- NaCl 9%o
- KOH 10%
- Thuốc nhuộm Gram: dung dịch tím Gentian, dung dịch Lugol, cồn tuyệt
đối, dung dịch Fuchsin (hoặc dung dịch Safranin).
1.2. Dụng cụ
- Mỏ vịt
- Pince kẹp
- Găng tay
- Giấy thử pH bằng phương pháp so màu, thang màu 1 - 8 độ pH
- Tăm bông vô khuẩn: mỗi người 1 tăm bông
- Lam men
- Lam kính
- Ðèn cồn
- Kính hiển vi
2. Tiến hành xét nghiệm
2.1. Lấy bệnh phẩm
- Nếu nghi bệnh lậu dùng que tăm bông vô khuẩn lấy dịch ở lỗ ngoài cổ tử
cung, tuyến Skene (quanh niệu đạo), tuyến Bartolin...
- Dùng 2 que tăm bông vô khuẩn lấy khí hư/dịch âm đạo ở thành sau hoặc
thành bên âm đạo để tìm các tác nhân gây viêm âm đạo, 1 tăm bông dùng
để làm phản ứng Sniff (phản ứng mùi, phản ứng KOH), 1 tăm bông để soi
tươi và nhuộm Gram.
57
2.2. Ðo độ pH âm đạo
Dùng pince kẹp mẫu giấy quỳ đưa vào túi cùng âm đạo đến khi ướt đều
giấy, đưa ra so màu trên bảng màu mẫu, chú ý không được chạm vào cổ tử cung
vì ở vùng đó pH luôn luôn kiềm.
Ý nghĩa của độ pH khí hư/dịch âm đạo:
- pH 3,8 - 4,5: vi khuẩn chí âm đạo bình thường (có Lactobacillus), nhưng có
thể có nhiễm nấm.
- pH 4,8 - 5,5: loạn khuẩn âm đạo (chủng vi khuẩn chí bình thường giảm),
viêm âm đạo do Gardnerella, viêm âm đạo do Trichomonas, tình trạng sau
dùng kháng sinh (nếu không có hoặc chỉ có rất ít Lactobacillus), tăng bạch
cầu cùng làm tăng pH.
- pH > 6: viêm teo âm đạo (ở phụ nữ mãn kinh), vỡ ối trong thai kỳ, trước
tuổi dậy thì.
2.3 Test Sniff
Nhúng tăm bông bệnh phẩm vào 1,5 ml dịch KOH 10% - ngửi ngay trong 3
phút đầu.
. Hoặc thêm 1 giọt KOH 10% vào khí hư (trên đầu tăm bông hoặc trên lam
kính), nếu bốc mùi cá ươn: test Sniff dương tính (+).
2.4. Nhuộm Gram
Diện tích vùng bệnh phẩm: khoảng 1cm2; nhuộm Gram. Quan sát tiêu bản
trên kính hiển vi với vật kính dầu X100.
2.5. Soi tươi
Dàn bệnh phẩm với dung dịch NaCl 9%o:. Nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy
lammen. Quan sát dưới vật kính X 40.
3. Ðọc kết quả
Ðọc kết quả và đánh giá kết quả dựa vào các tiêu chuẩn sau:
3.1. Bạch cầu
Trên tiêu bản soi tươi, nếu trung bình mỗi vi trường thấy: không có bạch
cầu là âm tính (-), 1 - 5 bạch cầu là dương tính (+), 6 - 10 bạch cầu là dương tính
58
(++), >10 bạch cầu là dương tính (+++). Kết quả dương tính (++) trở lên là có
triệu chứng nhiễm khuẩn.
3.2. Candida albicans
Có thể phát hiện bằng phương pháp soi tươi hoặc nhuộm Gram.
- Soi tươi: Tế bào nấm hình tròn hay hình trứng, một số có chồi và giả sợi,
nếu trung bình mỗi vi trường vật kính x40 thấy: không có bào tử nấm là âm
tính (-), 1 - 2 bào tử nấm là dương tính (+), 3 - 5 bào tử nấm là dương tính
(++), > 5 bào tử nấm là dương tính (+++).
Kết quả dương tính (++) trở lên là bệnh.
- Nhuộm Gram: Candida là những thể hình tròn hay hình trứng, Gram
dương, bắt màu đậm. Giả sợi có thể thấy là những sợi Gram dương, dài, có
đốt, kích thước tương tự các bào tử nấm.
3.3. Trichomonas vaginalis
- Phát hiện Trichomonas bằng phương pháp soi tươi, khó phát hiện trên tiêu
bản nhuộm Gram. Trên tiêu bản soi tươi, Trichomonas vaginalis là những
trùng roi lớn (15(m), di động đặc biệt (vừa quay tròn vừa lùi).
Nếu trung bình trên mỗi vi trường vật kính x40 thấy: không có trùng roi
nào là âm tính (-), 1 - 2 trùng roi là dương tính (+), 3 - 5 trùng roi là dương tính
(++), > 5 trùng roi là dương tính (+++).
Vì số lượng thường không nhiều, nên nếu thấy có trùng roi là nhiễm bệnh.
Thường có kèm theo tăng bạch cầu.
3.4. Viêm âm đạo do Gardnerella vaginalis
- Tế bào dính: là các tế bào biểu mô âm đạo được phủ rất nhiều vi khuẩn
Gram âm nhỏ đến nỗi bờ của những tế bào này không thể nhìn rõ.
- Hoặc theo tiêu chí của Nugent: (chẩn đoán viêm âm đạo do Gardnerella
vaginalis chỉ dựa vào tiêu bản nhuộm Gram), có ba hình thái vi khuẩn khác
nhau cần được đánh giá số lượng là:
+ Lactobacillus;
+ Vi khuẩn có hình thái giống Gardnerella;.
+ Mobiluncus spp.
59
Ðánh giá số lượng vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram theo bảng điểm của
Nugent (Bảng 6.1).
Bảng 6.1. Ðiểm đánh giá số lượng vi khuẩn
trên tiêu bản nhuộm Gram theo Nugent
Hình thái vi Giống vi khuẩn Mobiluncus

Lactobacillus
khuẩn Gardnerelella spp.
Số lượng vi
khuẩn trên 0 <1 1- 5- >30 0 <1 1- 5- >30 0 <1- 5
một vi 4 30 4 30 4
trường vật
kính dầu
Ðiểm 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 0 1 2
- 0 - 3 điểm: khuẩn chí bình thường.

- 4 - 6 điểm: tình trạng vi khuẩn trung gian, nghĩa là không bình thường
nhưng cũng không phải là viêm âm đạo.
- 7 - 10 điểm: viêm âm đạo do Gardnerella rõ.
3.5. Các tác nhân khác
Tụ cầu, liên cầu, lậu cầu, trực khuẩn dạng coli...lậu.
60
NHUỘM ĐƠN VÀ NHUỘM GRAM

1. Làm được một tiêu bản vi khuẩn.
2. Tiến hành đúng các bước nhuộm tiêu bản theo kỹ thuật Gram.
3. Xác định đúng vi khuẩn bắt màu Gram (+) và Gram (-).
Nội dung
Nhuộm vi khuẩn giúp chúng ta quan sát được hình thể, kích thước, tính chất
bắt mầu và cách sắp xếp của chúng. Nhờ đó, người ta có thể phân loại được
vi khuẩn.
Các kỹ thuật nhuộm vi khuẩn được chia làm 2 loại:
+ Nhuộm đơn: Chỉ dùng một loại thuốc nhuộm
+ Nhuộm kép: Dùng từ hai loại thuốc nhuộm trở lên.
I. Kỹ thuật làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
Bất kỳ một kỹ thuật nhuộm nào, chuẩn bị một tiêu bản để nhuộm vi khuẩn
đều giống nhau, gồm 3 bước:
1. Dàn tiêu bản (Đồ phiến)
Chọn phiến kính khô sạch, không mốc, không xước.
• Từ môi trường lỏng
Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng canh khuẩn đặt lên giữa phiến kính,
sao cho vòng que cấy nằm sát mặt phiến kính, dàn theo đường xoắn ốc từ trong
ra ngoài, tạo nên một vùng liên tục chứa canh khuẩn có đường kính khoảng 1
cm (đồ phiến). Phải dàn đều, đủ mỏng, không sát mép phiến kính để việc quan
sát trên kính hiển vi được dễ dàng.
• Từ môi truờng đặc
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên trên một tiêu bản sạch. Dùng
que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc nghiền đều vào giọt nước muối sinh lý. Sau
đó lấy một vòng canh khuẩn từ tiêu bản này dàn sang một tiêu bản sạch khác
(Cách làm tương tự như trên).
61
2. Để khô
Sau khi dàn đồ phiến, cần để tiêu bản khô tự nhiên.
3. Cố định
Cố định tiêu bản có 3 tác dụng: + Giết chết vi khuẩn.
+ Gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính.
+ Giúp cho vi khuẩn bắt màu tốt hơn.
Có thể cố định bằng hoá chất hoặc bằng nhiệt. Thường sử dụng phương pháp
cố định bằng nhiệt: Lật úp mặt tiêu bản có dàn đồ phiến, đưa cắt ngang qua
ngọn lửa đèn cồn khoảng 3- 4 lần.
II. Một số kỹ thuật nhuộm:
1. Nhuộm đơn
Có thể dùng nhiều loại thuốc nhuộm kiềm để nhuộm đơn, như xanh
methylene, đỏ Fuchsin, tím Gientian. Trong thực hành, người ta thường dùng
xanh methylene vì nó ít cặn hơn so với các loại thuốc nhuộm khác.
1. 2. Kỹ thuật nhuộm
Sau khi tiêu bản đã được cố định, nhỏ xanh methylene phủ kín đồ phiến. Sau
một phút, đổ thuốc nhuộm đi, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ rồi để khô và soi
kính hiển vi (vật kính dầu).
1.3. Kết quả
Các vi khuẩn và tế bào đều có màu của thuốc nhuộm (trong trường hợp
này là màu xanh). Nhuộm đơn chỉ cho ta biết về hình thể, kích thước và cách
sắp xếp của vi khuẩn mà không cho phép phân biệt được tính chất bắt màu khác
nhau giữa các vi khuẩn có bản chất không giống nhau.
2. Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật cơ bản nhất trong vi khuẩn học.
Kỹ thuật này do Christian Gram đề xuất năm 1884. Bằng kỹ thuật nhuộm
Gram, vi khuẩn được chia thành 2 loại: Gram dương và Gram âm. Việc phân
loại này có ý nghĩa quan trọng trong vi khuẩn học và định hướng cho việc sử
dụng kháng sinh hợp lý.
62
+ Dung dịch tím Gentian.
+ Dung dịch Lugol.
+ Cồn 90 0.
+ Dung dịch đỏ Fuchsin.
2.2. Kỹ thuật nhuộm
Thực hiện từng bước theo thứ tự sau:
• Nhỏ dung dịch tím Gentian phủ kín đồ phiến, để 1 phút, sau đó rửa sạch tiêu
bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Nhỏ dung dịch Lugol phủ kín đồ phiến, để 30 giây, rửa tiêu bản dưới vòi
nước chảy nhẹ.
• Nhỏ vài giọt cồn lên đồ phiến, láng qua láng lại tiêu bản đến khi nào màu tím
trên đồ phiến vừa phai hết thì rửa sạch ngay tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Nhỏ dung dịch đỏ Fuchsin phủ kín đồ phiến, để 1 phút, rửa sạch tiêu bản dưới vòi
nước chảy nhẹ.
Để khô tiêu bản và soi dưới kính hiển vi quang học (vật kính dầu).
2.3. Nhận định kết quả
+ Các vi khuẩn bắt màu tím là vi khuẩn Gram dương.
+ Các vi khuẩn bắt màu đỏ là vi khuẩn Gram âm
-------------------------------------------------------------------------------------------------
1. Trình bày bộ dụng cụ để nhuộm gram,
2. Trình bày cách làm tiêu bản soi tươi, test sniff.
3. Trình bày các bước nhuộm gram từ bệnh phẩm.
4. Phân biệt được vi khuẩn bắt màu gram âm và gram dương.
63
KỸ PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1. Trình bày được các loại môi trường cơ bản trong xét nghiệm Vi Sinh
2. Phân biệt được môi trường tăng cơ bản và môi trường tăng sinh
3. Trình bày được môi trường xác định tính chất sinh vật hóa học của vi
khuẩn.
Để xét nghiệm chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh trong phòng thí
nghiệm, cấn phải sử dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy. Đây là một khâu
quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn. Nếu môi trường không đảm bảo
chất lượng sẽ cho kết quả sai trong chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh. Bên
cạnh đó việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy cách cũng là một
trong những khâu quan trọng trong công tác nuôi cấy vi khuẩn.
Có nhiều loại môi trường khác nhau dùng cho phân lập và định danh vi khuẩn và
thường được xếp thành ba loại chủ yếu:
1. Môi trường nuôi cấy cơ bản,
2. Môi trường tăng sinh vi khuẩn(có giàu chất dinh dưỡng),
3. Môi trường xác định tính chất sinh vật hóa học.
Mỗi loại môi trường sẽ được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi
cấy, phân lập và định danh vi sinh vật có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
Có thể pha chế môi trường từ hóa chất riêng lẻ hoặc từ bột khô đóng hộp. Tùy
loại môi trường cần hấp khử trùng( có loại môi trường không cần hấp khử trùng)
theo chỉ dẫn trên hộp môi trường. Cần ghi ngày mở hộp môi trường và kiểm tra
hạn sử dụng. Trước khi pha chế phải kiểm tra môi trường và hóa chất bảo đảm
tinh khiết, khô, không đổi màu, không vón cục, còn hạn sử dụng.
I. Môi trường nuôi cấy cơ bản
Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường đơn giản chứa chất cơ bản như CO2,
N và các chất khoáng giúp các vi khuẩn không yêu cầu các chất dinh dưỡng đặc
biệt thường được sử dụng để chuẩn bị các môi trường tăng sinh và cấy chuyển
các vi khuẩn gây bệnh.
64
1. Môi trường canh thang thường
- Công thức: Pepton 10g
Nacl 5g, Cao thịt 4g, Nước cất 1000ml
- Cách pha chế: Đun sôi hoàn toàn các thành phần điều chỉnh PH 7,4 – 7,6.
Đóng ống 16mm, mỗi ống 6ml, hấp 1210C/15 phút.
2. Môi trường thạch thường (thạch dinh dưỡng)
- Công thức: Pepton 10g, thach 20g
Nacl 5g, Cao thịt 4g, Nước cất 1000ml
Cách pha chế: Đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần điều chỉnh PH 7,4 –
7,6. Đóng ống 16mm, mỗi ống 6ml, hấp 1210C/15 phút.Để nghiêng ống
thạch cho thạch đông.
Nếu đổ đĩa sau khi hấp để nguội 45 – 50 0C đổ 20ml/ đĩa.
3. Môi trường pepton thường
Nacl 5g, Nước cất 1000ml
- Cách pha chế: Đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần điều chỉnh PH
7,4 – 7,6. Đóng ống 16mm, mỗi ống 6ml, hấp 1210C/15 phút.
4. Môi trường pepton kiềm
Nacl 10g, Nước cất 1000ml
Cách pha chế: Đun sôi hoàn toàn các thành phần điều chỉnh PH 8,5 - 9. Đóng
ống 16mm, mỗi ống 6ml, hấp 1210C/15 phút.
5. Môi trường selenit
- Công thức: Bột khô selenit 19g,bi selent 4g, nước cất 1000ml
- Đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần trong 5 phút, đóng ống 16mm
mỗi ống 5ml trong bốc vô khuẩn
6. Môi trường thạch mềm giữ chủng
- Công thức: Pepton 10g, Nacl 5g. cao thịt 3g, cao men 6g. thạch 6g, nước
cất 1000ml.
65
- Đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần Ph 7,6, đóng ống 12mm, mỗi ống
3 – 4ml.Hấp 1210C/ 15 phút.
II. Môi trường phân lập
1. Môi trường phân lập
Môi trường phân lập dùng để tách một chủng vi khuẩn ra khỏi những vi
khuẩn khác hoặc thu một chủng vi khuẩn thuần khiết.
1.1. Môi trường thạch máu
- Công thức:
Pepton 10g
NaCl 5g
Cao thịt 4g
Thạch 20g
Nước cất 1000ml
Máu thỏ hoặc máu cừu 50ml (Máu 5%)
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH
7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn
bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Nếu
môi trường màu ngả đen là máu đã chín. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.
1.2. Môi trường thạch Socola (Chocolate)

- Công thức:
Pepton 10g
NaCl 5g
Cao thịt 4g
Thạch 20g
Máu thỏ hoặc máu cừu 50ml (Máu 5%)
66
7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn
bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Cho vào đun cách thủy 80 0C/10 phút, chú
ý luôn lắc tròn bình thạch. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.
1.3. Môi trường thạch kiềm
- Công thức:
Pepton 10g
NaCl 5g
Cao thịt 4g
Thạch 20g
8,5-9. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C đổ đĩa 20ml/đĩa.
Môi trường thạch kiềm và môi trường MacConkey
67
1.2.4 Môi trường Chap man
- Công thức:
Thạch 1 lít (Xem phần 1.1.2)
thường 65g
NaCl 10g
Manit 3-5 ml
Dung dịch đỏ phenol 1%
7,0-7,2. Chỉnh màu bằng dung dịch đỏ phenol 1% (môi trường có màu đỏ da
cam). Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống thạch cho thạch đông, nếu đổ đĩa thì
để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.
1.5. Môi trường vận chuyển Cary-Blair

- Công thức:
Cary and Blair Transpot 12,6g
Medium 9ml
Canxi Clorua (CaCl2) 1000ml
1%
Nước cất
- Cách pha chế: Đun sôi cách thủy cho tan hết các thành phần và môi
trường trở nên trong (không đun sôi trực tiếp). Để nguội 500C thêm 9ml dung
dịch Canxi Clorua 1%. Điều chỉnh pH - 8,4. Đóng ống 16mm mỗi ống 8ml. Hấp
1000C/10 phút.
2. Môi trường xác định tính chất sinh hóa
Môi trường xác định là loại môi trường dùng để nghiên cứu các đặc tính
sinh vật hóa học để xác định các loại vi khuẩn gây bệnh.
68
2.1. Môi trường Ure - Indol
- Công thức:
L- 3g
Tryptophan 1g
KH2PO4 1g
K2HPO4 5g
NaCl 20g
Ure 10ml
Cồn 900 2ml
Dung dịch đỏ phenol 1% 1000ml
Nước cất
-7,2, thêm dung dịch đỏ phenol 1%. Đóng vào ống nghiệm 12mm, mỗi ống
1,5ml. Tyndal 2 ngày:
Ngày thứ nhất: 650C/1 giờ.
Ngày thứ hai: 650C/30 phút.
1.3.2 Môi trường LDC (Lysin Decacboxylaza) - Môi trường ODC

(Ornithin Decacboxylaza) - Môi trường ADC (Acginin Dehydrolaza )
- Công thức:
L. Lysine (hoặc L. Ornithine, hoặc L. 2,5g
Arginin) 1,5g
Cao men 0,5g
Glucose 0,5ml
Bromocresol purple (1,6g/100ml cồn) 500ml
Nước cất
-6,5, thêm chỉ thị màu Bromocresol purple tới khi có màu đỏ ánh tím ( màu mận
chín ). Đóng ống 12mm mỗi ống 1,5ml. Hấp 121oC/15 phút.
69
2.3. Môi trường Basikow
- Công thức: Có thể thay thế Na2HPO4 bằng cao thịt
Công thức 1 Công thức 2
Na2HPO4 6g Cao thịt 5g
NaCl 6,6g NaCl 5g
Pepton 12g Pepton 10g
Nước cất 1000ml Nước cất 1000ml
-7,2. Cho chỉ thị màu Bromthymol blue 1,5ml tới khi có màu xanh lá mạ. Đóng
ống 12mm mỗi ống 3ml cho thêm ống durhar. Hấp 121oC/15 phút.
III. Môi trường bột khô đóng hộp

Các môi trường này được làm từ các nguyên liệu và hoá chất tinh khiết
nên chất lượng môi trường đảm bảo, việc cân đong pha chế đơn giản tiện lợi
hơn. Tuỳ loại môi trường cần hấp khử trùng (có loại môi trường không cần hấp
khử trùng) theo chỉ dẫn trên hộp môi trường.
1.1. Môi trường SS (Salmonella - Shigella)
- Công thức:
Thạch SS 60g
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần trong 5-10
phút. Không hấp, để nguội 45- 500C, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2. Đổ đĩa 20ml/đĩa.
70
Môi trường thạch dinh dưỡng (NA), môi trường Selenit và môi trường
Salmonella-Shigella (SS)
2.2. Môi trường TCBS (Thiosulfate - Citrate Bile Salts)
- Công thức:
Thạch 88g
TCBS 1000ml
Nước cất
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần trong 5-10
phút. Không hấp, để nguội 45- 500C, điều chỉnh pH- 8,6. Đổ đĩa 20ml/đĩa.
2.3. Môi trường MacConkey (MăcConkây)
- Công thức:
Thạch 50g
MacCONKEY 1000ml
Nước cất
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh
pH- 7,1 ± 0,2. Hấp 121oC/15phút, để nguội 45- 500C. Đổ đĩa 20ml/đĩa.
71
2.4. Môi trường Endo
- Công thức:
Thạch 39g
ENDO 1000ml
Nước cất
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh
pH- 7,4 ± 0,2. Hấp 121oC/15phút, để nguội 45- 500C. Đổ đĩa 20ml/đĩa.
2.5. Môi trường Xitrat Simons

- Công thức:
Thạch Xitrat Simons - 22,5g
Cittrat 1000ml
Nước cất
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần. Điều chỉnh
pH 6,6± 0,2. Phân phối vào ống 12mm mỗi ống 3ml. Hấp 1210C/15 phút, để ống
môi trường nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2cm.
2.6. Môi trường Kligler (KIA)

- Công thức:
Thạch Kligler 55g
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần. Điều chỉnh
pH 7,2-7,4. Phân phối vào ống 12mm mỗi ống 3ml. Hấp 1210C/15 phút, để ống
môi trường nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2cm.
72
2.7. Môi trường mannit di động
- Công thức:
Thạch Mannit 22g
- Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, đóng ống
12mm, mỗi ống 3-4ml. Hấp 121oC/15 phút.
4. Trình bày được các loại môi trường cơ bản dùng trong xét nghiệm
vi sinh.
73
PHẢN ỨNG RPR VÀ TPHA ĐỂ CHẨN ĐOÁN GIANG MAI

Trình bày được nguyên lý và cách thẹc hiện các phản ứng RPR và TPHA.
1. Thực hiện thành thạo phản ứng định tính, bán định lượng.
2. Đọc kết quả của phản ứng và giải thích được kết quả của phản ứng.
Phản ứng phát hiện nhanh, định tính và bán định lượng kháng thể trong
huyết thanh hoặc trong plasma của người bị bệnh giang mai.
1. Dấu hiệu lâm sàng

Bệnh giang mai là một nhiễm khuẩn mãn tính tiến triển theo các giai
đoạn: I, II và III. Các giai đoạn này có những triệu chứng khác nhau, điển
hình là tạo ra những săng ở giai đoạn đầu, các nốt hồng ban giang mai và tiếp
theo là một giai đoạn dài không có hoạt tính và nó có thể gây ra các biến
chứng tim mạch và cuối cùng là giang mai thần kinh.
Bệnh gây ra do xoắn khuẩn giang mai, sự nhiễm khuẩn do sự tiếp xúc tình
dục với người bị bệnh và bệnh có thể được truyền qua đường truyền máu từ
máu bị nhiễm vi khuẩn giang mai.
Chẩn đoán bệnh giang mai bao gồm: Chẩn đoán trực tiếp xoắn khuẩn
giang mai trong dịch tiết của bề mặt vết loét (săng) bằng soi tươi trên kính
hiển vi nền đen chỉ áp dụng cho giang mai giai đoạn I và chẩn đoán huyết
thanh tìm kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân dùng cho giang mai giai
đoạn II và III. Có 2 loại phản ứng huyết thanh: phản ứng đặc hiệu và phản
ứng không đặc hiệu. Loại phản ứng không đặc hiệu dùng kháng nguyên
cardiolipin chiết suất từ tim bò, do đó đây là kháng nguyên không đặc hiệu
chỉ phát hiện được reagin (kháng thể tố) trong huyết thanh bệnh nhân. Loại
kháng thể đặc hiệu dùng kháng nguyên là xoắn khuẩn giang mai.
74
2. PHẢN ỨNG RPR (Rapid Plasma Reagin)
2.1. Nguyên tắc
RPR là phản ứng không đặc hiệu sử dụng những hạt charbon được hấp
thụ kháng nguyên cardiolipin (phosphatidyl – glycerol được triết xuất từ tim
bò) để phát hiện những kháng thể tố (reagin) có mặt trong huyết thanh hoặc
trong plasma của người bị bệnh giang mai.
Những mẫu nghiệm chứa kháng thể tố làm kết tủa các hạt charbon hình
thành những kết tủa màu đen trên nền trắng. Sự kết tủa này có thể đọc được
bằng mắt thường. Những mẫu nghiệm không phản ứng sẽ nhìn thấy một hình
ảnh không kết tủa và có hình ảnh hình thành những cặn lắng ở vùng trung
tâm của phản ứng.
2.2. Chú ý
Thao tác trên mẫu bệnh phải có găng tay.
2.3. Thành phần
Kháng nguyên RPR 2ml. Bìa làm phản ứng
Chứng dương 1ml
Chứng âm 1ml
2.4. Cách tiến hành
− Lấy hóa chất đểt ở nhiệt độ phòng trước khi sư dụng
− Sử dụng huyết thanh tươi hoặc plasma
Chú ý: Không sử các mẫu nghiệm bị: nhiễm khuẩn, tan máu, đục và lipid.
2.4.1. Kỹ thuật định tính
Gồm các bước sau:
Bước 1: Đặt 50μl mẫu nghiệm trong 1 vòng tròn của bìa.
Bước 2: Tán đều mẫu trên bề mặt của vòng tròn.
Bước 3: Lắc lọ kháng nguyên RPR để hòa đều huyền dịch kháng nguyên.
Bước 4: Gắn kim vào ống hút nhỏ giọt bằng nhựa và hút huyền dịch
kháng nguyên RPR một cách từ từ.
Bước 5: Lật ngược lọ nhỏ giọt và cho hơi ra hết khỏi kim.
Bước 6: Nhỏ một giọt kháng nguyên RPR lên trên mẫu nghiệm.
75
Bước 7: Đặt bìa vào máy lắc và cho quay 100v/phút trong 8 phút.
Bước 8: Đọc và phân tích kết quả bằng mắt ở nơi đủ sang.
Bước 9: Làm song song với chứng dương và chứng âm với mỗi ô thí
nghiệm
Bước 10: Đổ kháng nguyên không sử dụng từ lọ nhựa nhỏ giọt vào chai
thủy tinh.
Bước 11: Rửa sạch lọ và kim nhỏ giọt với nước cất và để khô trước khi sử
dụng lần sau.
2.4.2. Kỹ thuật bán định lượng

Gồm những bước sau:
Bước 1: Hòa loãng bậc 2 từ nồng độ không hòa loãng đến nồng độ 1/16
trong dung dịch nước muối sinh lý.
Bước 2: Đặt 50μl mỗi nồng độ vào 1 vòng tròn khác nhau trên bìa.
Bước 3: Tán đều mỗi độ hòa loãng trên bề mặt của vòng tròn.
Bước 4: Lắc lọ kháng nguyên RPR để hòa đều huyền dịch kháng nguyên.
Bước 5: Gắn kim vào ống hút nhỏ giọt bằng nhựa và hút huyền dịch
kháng nguyên RPR một cách từ từ.
Bước 6: Lật ngược lọ nhỏ giọt và cho hơi ra hết khỏi kim.
Bước 7: Nhỏ một giọt kháng nguyên RPR lên trên mẫu nghiệm.
Bước 8: Đặt bìa vào máy lắc và cho quay 100v/phút trong 8 phút.
Bước 9: Đọc và phân tích kết quả bằng mắt ở nơi đủ sang.
Bước 10: Làm song song với chứng dương và chứng âm với mỗi ô thí
nghiệm.
Hiệu giá của mẫu nghiệm được giải thích ở độ hòa loãng cuối cùng chỉ
xảy một sự kết tủa những hạt charbon.
2.5. Phân tích kết quả
− Phản ứng mạnh: Những đám hạt charbon lớn trên nền trong.
76
1. Trình bày nguyên lý và cách thực hiện các phản ứng RPR và
TPHA.
2. Thực hiện thành thạo phản ứng định tính, bán định lượng.
3. Đọc kết quả của phản ứng và giải thích được kết quả của phản ứng.
77
PHẢN ỨNG ASLO KINH ĐIỂN VÀ NHANH ĐỂ
CHUẨN ĐOÁN NHIỄM LIÊN CẦU KHUẨN
Mục tiêu học tập:

1. Trình bày được ý nghĩa vủa xét nghiệm tìm Also và các nguyên lý của
phản ứng Aslo kinh điển và phản ứng Aslo nhanh trong chẩn đoán
nhiễm liên cầu.
2. Thực hiện và đọc được phản ứng Aslo kinh điển, phản ứng nhanh để
chẩn đoán nhiễm lien cầu khuẩn trong bệnh viêm cầu thận cấp.
1. Đại cương
Liên cầu khuẩn sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có tính kháng nguyên.
Một trong những enzyme ngoại bào này là Streptolysin O, nó có khả năng
kích thích cơ thể tạo thành kháng thể Streptolysin O (anti-streptolysin O viết
tắt là Aslo). Người bị nhiễm liên cầu khuẩn tan máu  nhóm A có kháng thể
này. Hiệu giá kháng thể phụ thuộc mức lây nhiễm liên cầu khuẩn. Định hiệu
giá Aslo được sử dụng để chẩn đoán nguyên nhân bệnh thấp khớp cấp và
thấp tim, biến chứng này thường xuất hiện từ 2-3 tuần sau khi viêm họng do
viêm cầu khuẩn nhóm A.
Xác định ASLO có thể được thực hiện bằng phản ứng trung hòa hoặc
bằng phản ứng liên kết. Loại phản ứng trung hòa có thể thự hiện theo phương
pháp thể tích lớn trong ống nghiệm hoặc theo phương pháp vi lượng trên
phiến nhựa.
Phản ứng ngưng kết trên phiến kính đơn giản, dễ tiến hành và cho kết quả
nhanh chóng, phản ứng này có thể sử dụng khá tiện ở những phòng thí
nghiệm ít trang thiết bị.
2. Xác định Aslo bằng phản ứng ngưng kết
2.1. Nguyên lý
Các hạt chất dẻo được phủ với Streptolysin O. Khi trộn huyết thanh người
bệnh với các hạt chất dẻo có kháng nguyên này, nếu huyết thanh có chứa
78
anti-Streptolysin O sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết có thể nhìn thấy được
bằng mắt thường, kết quả có thể được đọc tring vòng 3 phút.
2.2. Vật liệu và dụng cụ cần thiết
2.2.1. Thành phần của kit: Cần đọc kỹ hướng dẫn cách pha của hãng.
− ASLO latex: huyền dịch hạt trơ latex gắn với Streptolysin O của liên
cầu khuẩn A
− Chứng dương ASLO: huyết thanh người có chứa ASLO > 200 IU/ml.
− Chứng âm ASLO: huyết thanh người có chứa ASLO < 200 IU/ml.
− Đệm muối glycine (20x), pH = 8.2 ± 0.1: Pha loãng dung dịch đệm
theo hướng dẫn
2.2.2. Các vật liệu và sinh phẩm được cung cấp
Bộ sinh phẩm của các hãng có sẵn gồm ASLO latex, chứng dương ASLO,
chứng âm ASLO, dung dịch đệm glycerine muối, phiến kính, pipet/que
khuấy
2.2.3. Dung cụ cần phải có thêm
Cần thêm đồng hồ phút, ống nghiệm và giá ống nghiệm, pipet tách huyết
thanh.
2.3. Bệnh phẩm và tiến hành phản ứng
2.3.1. Cách lấy và bảo quản bệnh phẩm
Lấy máu quay ly tâm để lấy huyết thanh tươi. Nếu phản ứng chưa được
làm ngay trong ngày thì huyết thanh phải được để ở 2 - 8ºC trước 48h sau khi
lấy máu. Trường hợp để lâu hơn phải làm đông đá. Không dùng huyết tương
để làm phản ứng, cũng không thực hiện phản ứng với các mẫu huyết thanh bị
tan huyết hay bị nhiễm khuẩn.
2.3.2. Tiến hành
− Kỹ thuật định tính:
+ Để bộ kit sinh phẩm và mẫu nghiệm ở nhiệt độ phòng trước khi
tiến hành.
+ Nhỏ 1 giọt chứng dương ASLO (50μl) lên vòng thứ nhất, chứng
âm ASLO (50μl) lên vòng thứ hai và huyết thanh không pha
79
loãng (50μl) vào vòng thứ ba trên phiến kính. Thực hiện tương
tự với những mẫu huyết thanh khác. Giữ lại pipet/que khuấy để
dùng trong bước trộn.
+ Nhỏ 1 giọt huyền dịch ASLO (lắc đều trước khi dùng) vào mỗi
ô phản ứng.
+ Trộn đều bằng que khuấy. Lắc nhẹ phiến kính trong 2 phút và
đọc kết quả bằng mắt thường.
− Kết quả:
Phản ứng âm tính khi hỗn dịch trên phiến kính đồng dạng không có ngưng
kết, đối chiếu với chứng âm.
Phản ứng dương tính khi có các hạt ngưng kết, đối chiếu với mẫu chứng
dương: Âm tính, Dương tính
− Kỹ thuật bán định lượng
+ Xếp tối thiểu 5 ống nghiệm, mỗi ống tương ứng với các độ pha
loãng huyết thanh theo tỷ lệ 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32… tiến hành
pha loãng huyết thanh với nước muối đệm theo( Bảng 7.1) ( chú
ý nước muối đệm phải pha loãng với nước cất 1/20 trước khi
dùng).
Bảng 7.1. Huyết thanh cần pha loãng
Ống Huyết thanh bệnh Dung dịch đệm (μl) Độ pha loãng (μl) UI/ml
nhân (μl)
1 100 100 1/2 400
2 100 từ ống 1 100 1/4 800
3 100 từ ống 2 100 1/8 1600
4 100 từ ống 3 100 1/16 3200
5 100 từ ống 4 100 1/32 6400
80
+ Nhỏ 1 giọt chứng dương, 1 giọt chứng âm vào huyết thanh đã
pha loãng lên các vòng trên phiến kính.
+ Lắc đều huyền dich ASLO latex và nhỏ 1 giọt vào mỗi vòng
phản ứng.
+ Trộn đều, lắc nhẹ trong vòng 2 phút và đọc ngay bằng mắt
thường
− Kiểm tra chất lượng
+ Cần phải có chứng dương và chứng âm trong mỗi lần thực hiện
phản ứng.
+ Phản ứng có giá trị khi chứng âm ASLO là huyền dịch sữa đồng
nhất, không có hạt, còn chứng dương ASLO có hạt ngưng kết
lớn.
− Đọc kết quả: Kết quả đọc ngay sau khi thực hiên phản ứng 2 phút, đọc
muộn hơn sẽ không đúng. Phản ứng dương tính khi có hạt ngưng kết,
ghi lại kết quả dương tính ở nồng độ huyết thanh pha loãng nhất. Nồng
độ ASLO trong huyết thanh được tính bằng nhân độ pha loãng huyết
thanh với nồng độ ASLO của chứng dương (200UI/ml) .
UI/ml của huyết thanh =200 x số lần pha loãng tương ứng.
3. Xác định kháng thể Aslo bằng phản ứng trung hòa
3.1. Nguyên lý
Enzyme Streptolysin O (SO) của liên cầu khuẩn A có khả năng làm tan
hồng cầu, khả năng này bị mất khi gặp kháng thể anti-streptolysin O do
kháng thể đã trung hòa enzyme SO.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Các sinh phẩm
− Bộ sinh phẩm kháng nguyên SO
− Huyết thanh chứng ASLO
− Dung dịch đệm ASLO
81
− Hồng cầu thỏ
3.2.2. Dụng cụ khác
− Bảng nhựa 96 lỗ có đáy chữ U
− Micropipet loại 25μl để phân phối các thành phần phản ứng.
− Máy ly tâm để ly tâm phiến nhựa phản ứng trước khi đọc kết quả.
− Gương để đọc kết quả.
− Bút ghi trên nhựa.
3.3. Thực hiện phản ứng
3.3.1. Chuẩn bị huyết thanh bệnh nhân
− Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng ở 1/25 với nước muối đệm, để
pha loãng lấy 0,1ml huyết thanh thêm 2,4ml dung dịch đệm, rồi xử lý
huyết thanh pha loãng này ở 56ºC/30 phút.
− Pha loãng huyết thanh để có các độ pha loãng 1/30 và 1/40 bằng cách
như sau:
+ 1/30 lấy 0.2ml dung dịch đệm thêm vào 1ml huyết thanh pha
loãng 1/25.
+ 1/40 lấy 0.3ml dung dịch đệm thêm vào 0.5ml huyết thanh pha
loãng 1/25.
Huyết thanh pha loãng này có thể được bảo quản 4ºC trong vòng 1 tuần.
3.3.2. Chuẩn bị kháng nguyên
Kháng nguyên Streptolysin O được cung cấp bởi các hãng, chỉ khi tiến
hành phản ứng mới pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, lắc đều và sử dụng
ngay trong khoảng 15 phút sau khi pha.
3.3.3. Chuẩn bị hồng cầu
Hồng cầu thường dùng là hồng cầu thỏ. Rửa hồng cầu với nước muối sinh
lý, sau rửa lại với dung dịch với dung dịch đệm ASLO. Hồng cầu đã rửa
xong pha dịch treo 5% trong dung dịch đệm bằng cách lấy 0.75ml hồng cầu
hòa với 14.25ml dung dịch đệm.
82
3.3.4. Tiến hành phản ứng
Phản ứng được tiến hành trên phiến nhựa 96 lỗ đáy chữ U
− Bước 1: dùng bút đánh giấu chiều ngang của phiến nhựa từ 1 – 12
(12cột) và đánh theo mẫu từ A, B, C…H (8 dãy) và chia phiến nhựa thành 8
vùng, mỗi vùng có số lượng các ô 3x4 như trong bảng, mỗi vùng sec dùng để
thử mỗi mẫu huyết thanh, như vậy phiến nhựa có thể dùng cho 7 mẫu huyết
thanh. Vùng 8 sẽ dùng để làm với huyết thanh chứng ASLO. Ở 2 lỗ cuối
cùng của vùng này dành để chứng kháng nguyên SO (lỗ 11H) và làm chứng
hồng cầu (lỗ 12H).
Bảng 7.2. Minh họa thực hiện phản ứng trên phiến nhựa
HT1 HT2 HT3 HT4

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160
B 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320
C 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640
D 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280
HT5 HT6 HT7 CHỨNG ASLO
E 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160 1:100 1:120 1:160
F 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320 1:200 1:240 1:320
G 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640 1:400 1:480 1:640
H 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280 1:800 1:960 1:1280
− Bước 2: Dùng micropet lấy 25μl dung dịch đệm cho vào mỗi lỗ trên
phiến nhựa, riêng lỗ 12H cho 50μl. Vỗ nhẹ bờ phiến nhựa vài lần
để dung dịch đệm phân bố đều vào đáy lỗ.
− Bước 3: Dùng micropet lấy 25μl của mỗi độ huyết thanh bệnh nhân
đã pha loãng (1/25, 1/30, 1/40) cho vào ba lỗ đầu tiên 1, 2, 3 dãy A.
Vùng 2 với lỗ 4, 5, 6 làm tương tự với huyết thanh bệnh nhân thứ 2.
Tiếp tục với các mẫu huyết thanh tiếp theo (cần phải thay đầu pipet
khi làm với các loại huyết thanh khác nhau).
83
Pha loãng hơn nữa huyết thanh trong các lỗ bắng cách lấy 25μl của dẫy A
cho vào các lỗ của dãy B (cột theo cột), trộn đều bằng hút micropipette lên –
xuống nhẹ nhàng, tiếp tục lấy 25μl của dẫy B cho vào dẫy C, rồi dãy D. Ở
dẫy D sau khi trộn đều lấy bỏ đi 25μl (cần thay đầu pipet khi chuyển từ cột 1
sang 2, 3…).
− Bước 4: Thêm vào mỗi ô 25μl dung dịch đệm.
− Bước 5: Thêm vào mỗi ô 25μl kháng nguyên Streptolysin O, riêng
lỗ H12 không cho. Vỗ nhẹ thành của phiến nhựa để trộn đều.
− Bước 6: Ủ ở 37ºC trong 30 phút.
− Bước 7: Thêm mỗi lỗ 25μl dịch treo hồng cầu, vỗ nhẹ thành phiến
nhựa để trộn đều.
− Bước 8: Ủ ở 37ºC trong 45 phút.
− Bước 9: Quay ly tâm phiến nhựa 1000v/1 phút trong vòng 2 – 3
phút.
− Bước 10: Đọc kết quả bằng gương và ghi lại kết quả.
− Đọc kết quả phần chứng:
+ Chứng hồng cầu: không tan máu (hồng cầu lắng xuống đáy
lỗ).
+ Chứng kháng nguyên: tan máu (hồng cầu tan hoàn toàn).
+ ASLO thường dương tính ở nồng độ thấp (khoảng 100 – 160
dơn vị).
− Đọc kết quả phản ứng:
+ Những lỗ không tan máu: dương tính
+ Những lỗ tan máu: âm tính
+ Hiệu giá kháng thể được tính ở lỗ có lượng huyết thanh pha
loãng nhất mà phản ứng dương tính. Hiệu giá kháng thể được
tính theo đơn vị Todd.
84
3.3.5. Nhận định kết quả
Khi có sự tăng cao hiệu giá kháng thể ASLO chứng tỏ rằng bệnh nhân bị
nhiễm liên cầu khuẩn A gần đây. Ở Việt Nam chưa có hắng số về giới hạn
bình thường về hiệu giá kháng thể ASLO, một số tài liệu trong nước cũng
như tổ chức cũng như của tổ chức Y tế thế giới khi huyết thanh người bệnh
có hiệu giá 250 đơn vị Todd thì được xem là bất thường.
---------------------------------------------------------------------------------------
1. Trình bày ý nghĩa vủa xét nghiệm tìm Also và các nguyên lý của phản ứng
Aslo kinh điển và phản ứng Aslo nhanh trong chẩn đoán nhiễm liên cầu.
2. Thực hiện và đọc được phản ứng Aslo kinh điển, phản ứng nhanh để chẩn
đoán nhiễm lien cầu khuẩn trong bệnh viêm cầu thận cấp.
85
KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ (KSĐ)

1. Trình bày định nghĩa kháng sinh đồ.
2. Nêu nguyên lý và mục đích của kháng sinh đồ theo kỹ thuật khoanh giấy
khuếch tán.
3. Tiến hành được kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán; biết cách đọc và nhận định
đúng kết quả kháng sinh đồ bằng kỹ thuật này.
Nội dung
I. Định nghĩa
KSĐ là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh (KS),
nhằm giúp thầy thuốc chọn được KS có hiệu lực dùng trong điều trị.
II. Kỹ thuật KSĐ: Có 2 kỹ thuật
+ Kỹ thuật KS khuếch tán trong thạch.
+ Kỹ thuật KS pha loãng trong thạch hoặc canh thang.
1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên môi trường thạch (disc
diffusion method):
• Nguyên lý:
KS được thấm vào những khoang giấy tròn với nồng độ nhất định và được
đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch. Từ khoanh giấy, KS khuếch tán dần ra
xung quanh, càng xa nơi đặt khoanh giấy, nồng độ KS càng thấp và ngược
lại, càng gần nơi đặt khoanh giấy nồng độ KS càng cao.
Nơi có KS, vi khuẩn không phát triển được gọi là vùng ức chế (inhibition
zone). Đường kính vùng ức chế lớn, thì chứng tỏ vi khuẩn nhạy cảm với KS
đó. Ngược lại, đường kính vùng ức chế nhỏ hoặc không có vùng ức chế
chứng tỏ vi khuẩn đề kháng KS này.
• Mục đích:
Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch thường được áp dụng để xác
định độ nhạy cảm của vi khuẩn với những KS khác nhau (kỹ thuật định tính),
86
từ đó chọn được kháng sinh có tác dụng (vi khuẩn nhạy cảm) dùng cho điều
trị.
• Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán:
- Vật liệu:
+ Vi khuẩn: vi khuẩn gây bệnh đã thuần nhất, được nuôi cấy qua đêm thành
những khuẩn lạc thuần chủng.
+ Môi trường: Sử dụng môi trường đã được chuẩn hoá, cho phép hầu hết các
vi khuẩn gây bệnh phát triển. Hiện nay, thường sử dụng môi trường Mueller-
Hinton, độ dày của thạch là 4 ± 0,5 mm và bằng nhau ở mọi vị trí.
+ Khoanh giấy KS: Mỗi khoanh giấy được tẩm một loại KS với hàm lượng
nhất định, bảo quản ở lạnh sâu.
+ Đĩa Petrie bằng thuỷ tinh trung tính hoặc chất dẻo, đáy phẳng.
+ Độ đục chuẩn McFarland 0,5.
+ Tăm bông vô trùng hoặc Pipett Pasteur vô trùng.
+ Que cấy vi khuẩn.
+ Kim tiêm hoặc panh đầu nhọn vô trùng.
+ Nước muối sinh lý vô trùng.
+ Đèn cồn.
+ Dung dịch sát khuẩn.
+ Tủ ấm.
- Tiến hành:
+ Pha hỗn dịch vi khuẩn đạt nồng độ 10 6 vi khuẩn/ml.
+ Cấy vi khuẩn: Mặt thạch nên được làm khô (15 phút trong tủ ấm) trước khi
cấy vi khuẩn. Dùng tăm bông vô trùng, thấm hỗn dịch vi khuẩn (bỏ bớt dịch
thừa bằng cách ép tăm bông vào thành ống nghiệm) ria đều lên khắp mặt
thạch, sau đó quay 1800 và ria lại.
+ Đặt khoanh giấy KS: Có thể dùng kim tiêm hoặc panh đầu nhọn vô trùng
đặt các khoanh giấy KS lên mặt thạch sao cho mép các khoanh giấy áp sát
mặt thạch (mỗi khoanh giấy cách thành đĩa >1 cm và các khoanh giấy cách
nhau >2 cm), để ở nhiệt độ phòng 20 phút.
87
+ ủ đĩa KSĐ ở 370C, qua đêm (18- 20 giờ).
- Đọc và nhận định kết quả:
Đo đường kính vùng ức chế từ phía sau mặt đĩa thạch bằng thước đo tính ra
mm.
So sánh đường kính vùng ức chế đo được với bảng “ Giới hạn đường kính
vùng ức chế “ cho từng loại KS để phân loại mức độ nhạy cảm của vi khuẩn
thành S (Susceptible= nhạy cảm); I (Intermediate= trung gian) và R
(Resistant= đề kháng).
Nguyên tắc lựa chọn kháng sinh điều trị bệnh nhân dựa trên kết quả KSĐ:
Chọn KS cho kết quả S để điều trị. Song trong các KS cho kết quả S, nên chọn
KS có phổ tác dụng hẹp, có tác dụng đặc hiệu lên vi khuẩn gây bệnh đã thử, dễ
sử dụng, ít có phản ứng không mong muốn và rẻ tiền để điều trị cho bệnh nhân.
Không nên dùng các KS đời mới, có hoạt phổ rộng cho nhiều loại vi khuẩn khác
nhau một cách rộng rãi, để ngăn ngừa sự gia tăng vi khuẩn kháng thuốc.
- Một số yếu tố có thể ảnh hưởng tới độ lớn vùng ức chế:
+ Độ dày của thạch.
+ Độ khô của mặt thạch.
+ Lượng vi khuẩn cấy vào môi truờng.
+ Khoanh giấy KS.
+ Thành phần môi trưòng.
+ Chất lượng thạch.
+ Lượng ion hoá trị 2 trong môi trường.
+ Độ pH của môi trường.
2. Kỹ thuật kháng sinh pha loãng (dilution method):
• Nguyên lý:
KS được hoà đều vào môi trường nên tại bất kỳ điểm nào, nồng độ KS cũng
như nhau. KS được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau (thường là pha
loãng theo cấp số nhân của 2, ví dụ: 2; 4; 8; 16; 32; 64; ...). Sau đó cấy vi
khuẩn cần được thử nghiệm, một lượng như nhau cho mỗi nồng độ KS.
Có thể dùng môi trường Mueller- Hinton lỏng hay đặc trong kỹ thuật này.
88
Nếu trong môi trường có KS, vi khuẩn vẫn phát triển thành khuẩn lạc (trên
môi trường đặc) hay làm đục đều môi trường (trên môi trường lỏng) thì
chứng tỏ chúng đề kháng với nồng độ KS đó.
• Mục đích:
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC= Minimal Inhibition Concentration)
của mỗi KS đối với vi khuẩn, để biết liều lượng thích hợp cần dùng cho điều
trị (định lượng).
• Tiến hành:
+ Pha loãng KS giảm dần theo bậc 2 vào môi trường, nồng độ đầu tiên là đặc
nhất, ví dụ: 128 g/ml, tiếp theo là 64 g/ml, ... và nồng độ thứ 9 là 0,5
g/ml.
+ Cấy một lượng vi khuẩn như nhau (10 6 vi khuẩn/ml) cho mỗi nồng độ KS.
+ ủ ấm 37 0C qua đêm.
• Đọc và nhận định kết quả:
Phát hiện sự phát triển của vi khuẩn, tìm nồng độ KS thấp nhất ức chế được
vi khuẩn phát triển, thì đó là MIC.
3. ứng dụng của KSĐ:
+ Giúp thầy thuốc chọn được KS có tác dụng nhất dùng trong điều trị.
+ Phát hiện dược tính KS của một chất.
+ Kiểm tra hiệu lực KS của những lô thuốc KS mới sản xuất.
89
Bảng giới hạn đường kính vùng ức chế
Bảng giới hạn đường kính vùng ức chế (mm) và Điểm gãy MIC của KS
đăng ký ở Thuỵ Điển dùng cho những vi khuẩn hiếu khí và dễ mọc.
Điểm gãy MIC
Hàm
Kháng Viết (g/ml) Giới hạn vùng ức chế (mm)
lượng
sinh tắt S I S I R
(g)
R
Amikacin AK 30 8   16 15 - 11  11
6
4
Ampicillin AM 10 2   22 21 - 11  11
1
6
Penicillin G PG 10 4   27 26 - 16  16
8
Cephamadol Cd 30 4   19 14 - 19  14
1
6
Cephalexin CL 30 4   23 22 - 17  17
1
6
Cefuroxime XM 30 4   26 25 - 20  20
1
6
90
Cefotaxime CT 30 4   24 23 - 20  20
X 1
6
Ceftriaxone CR 30 4   24 23 - 19  19
Os
1
6
Chloramphenic C 30 8   24  24
ol
8
Clindamycin CM 15 1   24 23 - 17  17
4
Doxycycline DC 30 1   24 23 - 19  19
4
Erythromycin EM 15  0,5   25 24 - 18  18
4
Gentamycin GM 30 4   18 17 - 15  15
1
6
Kanamycin KM 30 8   17 16 - 9 9
6
4
91
Nalidixic acid NA 30 8   22 21 - 14  14
3
2
Nitrofurantoin NI 100  32   18  18
3
2
Norfloxacin NO 10 1   22 21 - 11  11
1
6
Penicillin V PV 10  0,25   29 28 - 16  16
4
Tetracycline TC 30 1   28 27 - 22  22
4
Co-trimoxazol TM 1,2 8   22 21 - 16  16
 3
23, 2
8
Ciprofloxacin CIP 5 4   21 11-21  11
4
Rifampicin RI 2  20  20
Vancomycin VA 10  20  20
-------------------------------------------------------------------------------------------------
92
1. Định nghĩa kháng sinh đồ?
2. Trình bày nguyên lý và mục đích của kháng sinh đồ theo kỹ thuật khoanh
giấy khuếch tán.
3. Thực hiện kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán; cách đọc và nhận định đúng kết
quả kháng sinh đồ bằng kỹ thuật này.
93
TÀI LIỆU TRÍCH DẪN
1. Giáo trình Vi Sinh Y học - Nhà xuất bản Y học 2007, GS.TS Lê Huy
Chính chủ biên.
2. Giáo trình Kỹ thuật xét nghiệm Vi Sinh lâm sàng - Nhà xuất bản Y học
2012, TS.BS Phạm Hùng Vân chủ biên.
3. Giáo trình Vi Sinh Vật Y học - Nhà xuất bản Y học 2012, PGS.TS
Nguyễn Văn Dịp hiệu đính.
4. Giáo trình An toàn Sinh Học - Viện vệ sinh dịch tễ trùng ương 2014,
5. Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng - Bệnh viện Bạch Mai, PGS.TS Phạm Mai
Phương chủ biên.
6. Vi khuẩn và bệnh nhiễm trùng thường gặp – Nhà xuất bản Y học 2010,
PGS.TS Lưu Thị Kim Thanh chủ biên.
94
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vi sinh vật Y học, nhà xuất bản Y học năm 2010.
2. Vi khuẩn và bệnh nhiễm trùng thường gặp, nhà xuất bản Y học năm 2010.
3. An toàn sinh học phòng xét nghiệm, nhà xuất bản Y học năm 2014.
95

TL. Vi sinh-đã chuyển đổi

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

TL. Vi sinh-đã chuyển đổi

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

VAI TRÒ CỦA CÁC XÉT NGHIỆM

Mục tiêu học tập

1. Xét nghiệm vi sinh cơ bản

Mục tiêu học tập

A- VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN

B – NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN

Mục tiêu học tập

Mục tiêu học tập

Mục tiêu học tập

Câu hỏi lượng giá

Mục tiêu học tập

Mục tiêu học tập

1. Cách lấy và xử lí bệnh phẩm

Mục tiêu học tập

2.2. Kỹ thuật lấy mẫu

1. Dụng cụ và phương tiện thực hiện

Hình thái vi Giống vi khuẩn Mobiluncus

- 0 - 3 điểm: khuẩn chí bình thường.

Mục tiêu học tập

Mục tiêu học tập

1.2. Môi trường thạch Socola (Chocolate)

Môi trường thạch kiềm và môi trường MacConkey

1.5. Môi trường vận chuyển Cary-Blair

1.3.2 Môi trường LDC (Lysin Decacboxylaza) - Môi trường ODC

III. Môi trường bột khô đóng hộp

2.5. Môi trường Xitrat Simons

2.6. Môi trường Kligler (KIA)

Mục tiêu học tập

1. Dấu hiệu lâm sàng

2.4.2. Kỹ thuật bán định lượng

Mục tiêu học tập:

Bảng 7.1. Huyết thanh cần pha loãng

HT1 HT2 HT3 HT4

Mục tiêu học tập

You might also like