BÀI 12.

BỆNH PHẨM MÁU VÀ CẤY MÁU

NHÓM 1

Thành Viên:
Nguyễn Minh Khoa
Nguyễn Văn Lợi
Lê Thu Hà
Huỳnh Thị Minh Thy
Nguyễn Văn Tường
Nguyễn Đình Nam

2.1. Khảo sát trực tiếp bệnh phẩm trong vi sinh là gì? Liệt kê các kỹ thuật khảo sát trực
tiếp bệnh phẩm vi sinh và ý nghĩa của từng phương pháp?
Trả lời
- Làm tiêu bản nhuộm soi từ bệnh phẩm để tìm vi khuẩn, nấm dựa vào hình thể, tính chất bắt
màu, kích thước và cách sắp xếp; đánh giá các loại tế bào. Có nhiều loại nhuộm khác nhau để
phát hiện các vi khuẩn khác nhau, ví dụ như nhuộm Gram, nhuộm Ziehl-Neelsen, nhuộm
Giemsa, nhuộm Calcofluor white, v.v.
- Làm tiêu bản soi tươi từ bệnh phẩm để tìm ký sinh trùng, một số loại vi khuẩn, nấm dựa
vào hình thể, tính chất di động. Có thể sử dụng các chất tăng độ tương phản như lugol,
safranin, methylene blue, v.v. để dễ quan sát hơn.
- Xét nghiệm miễn dịch để tìm kháng nguyên hoặc kháng thể của vi khuẩn, virus trong bệnh
phẩm. Có thể sử dụng các phương pháp như latex agglutination, enzyme immunoassay,
immunofluorescence, v.v.
- Xét nghiệm phân tử để tìm gene, DNA hoặc RNA của vi khuẩn, virus trong bệnh phẩm. Có
thể sử dụng các phương pháp như polymerase chain reaction, nucleic acid hybridization,
nucleic acid sequencing, v.v.
+ Ý nghĩa của các phương pháp khảo sát trực tiếp bệnh phẩm vi sinh là:
- Có thể phát hiện nhanh chóng các vi sinh vật gây bệnh trong bệnh phẩm mà không cần nuôi
cấy.
- Có thể xác định loại hoặc nhóm các vi sinh vật gây bệnh dựa vào các đặc điểm hình thái,
sinh hóa, miễn dịch, phân tử.
- Có thể đánh giá tình trạng nhiễm trùng, viêm nhiễm, dị ứng, miễn dịch của bệnh nhân dựa
vào các loại tế bào, kháng nguyên, kháng thể có trong bệnh phẩm.

2.2. Hãy nêu các điều kiện cần thiết được sử dụng để nuôi cấy bệnh phẩm chứa vi
khuẩn?
Trả lời
- Chọn môi trường nuôi cấy phù hợp với loại vi khuẩn cần phân lập, có thể là môi trường cơ
bản, môi trường tăng sinh, môi trường chọn lọc, môi trường phân biệt, môi trường đặc hiệu.
- Chọn phương pháp cấy phù hợp với loại bệnh phẩm và môi trường nuôi cấy, có thể là cấy
chấm, cấy đường kính, cấy lăn, cấy đổ, cấy rãnh, cấy lớp.
- Chọn nhiệt độ, thời gian và khí trường phù hợp với loại vi khuẩn cần phân lập, có thể là
25°C, 5°C, 7°C, 42°C, 55°C; 18-24 giờ, 48 giờ, 72 giờ; không khí, CO2, kỵ khí.

2.3 Kể tên môi trường được sử dụng để phân lập, môi trường chuyên chở bệnh phẩm, 2
môi trường giúp tăng sinh vi khuẩn trong bệnh phẩm, 12 môi trường sử dụng trong thử
nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn.
Trả lời
Các môi trường được sử dụng để phân lập, chuyên chở, tăng sinh và định danh vi khuẩn là:
- Môi trường được sử dụng để phân lập vi khuẩn là môi trường có chứa các chất ức chế hoặc
chất chỉ thị để ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn không mong muốn và phân biệt các
vi khuẩn mong muốn. Ví dụ như: MacConkey agar, Eosin methylene blue agar, Mannitol salt
agar, Hektoen enteric agar, Xylose lysine deoxycholate agar, v.v.
- Môi trường được sử dụng để chuyên chở bệnh phẩm là môi trường có chứa các chất đệm và
muối để duy trì khả năng sống của vi khuẩn mà không làm thay đổi số lượng của chúng. Ví
dụ như: Amies media, Stuart’s media, Cary-Blair media, v.v.
- Môi trường được sử dụng để tăng sinh vi khuẩn trong bệnh phẩm là môi trường có chứa các
chất dinh dưỡng để hỗ trợ sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn. Ví dụ như: Enriched broth,
Selenite broth, Gram-negative broth, v.v.
- Môi trường được sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn là môi trường có
chứa các chất chỉ thị để phát hiện các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn như lên men đường,
sản xuất enzyme, sử dụng chất hữu cơ, v.v. Ví dụ như: Triple sugar iron agar, Urea agar,
Simmons citrate agar, Lysine iron agar, Indole test, Methyl red test, Voges-Proskauer test,
Catalase test, Oxidase test, Coagulase test, Nitrate reduction test, v.v.

Tình huống 1: Một bệnh nhân nghi ngờ nhiễm trùng huyết, bác sĩ chỉ định cấy máu.
a. Là kỹ thuật viên xét nghiệm em hãy ghi lại sơ đồ các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc
lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy máu cho bệnh nhân.
b. Trong trường hợp em không tiến hành lấy máu trực tiếp mà điều dưỡng sẽ lấy máu, hãy
hướng dẫn quy trình lấy máu.
c. Đối với mẫu máu khi tiến hành khảo sát trực tiếp mang ý nghĩa gì?
d. Kể tên các nhóm vi khuẩn có thể tìm thấy được trong mẫu máu?

Trả lời

a. Các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy
máu cho bệnh nhân là:
- Lấy máu bệnh nhân bằng kim tiêm một lần sử dụng, đưa vào chai cấy máu có chứa chất
dinh dưỡng và chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn bình thường trên da.
- Sát trùng nắp chai cấy máu bằng cồn, chọc kim qua nắp cao su, bơm máu vào chai, lắc đều
để máu trộn với dung dịch trong chai.
- Ghi nhãn chai cấy máu với tên, tuổi, giới tính, ngày giờ lấy máu và mã số bệnh nhân.
- Đưa chai cấy máu vào máy cấy máu tự động, thiết lập thời gian ủ và nhiệt độ phù hợp với
loại vi khuẩn nghi ngờ.
- Theo dõi quá trình ủ và đọc kết quả trên màn hình máy cấy máu. Nếu có sự thay đổi màu
sắc, độ trong suốt hoặc áp suất trong chai cấy máu, nghĩa là có sự phát triển của vi khuẩn.
- Lấy mẫu từ chai cấy máu, tiến hành nhuộm gram và khảo sát trực tiếp dưới kính hiển vi để
xác định hình dạng, cấu trúc và tính gram của vi khuẩn.
- Cấy chuyển mẫu từ chai cấy máu lên các môi trường cấy khác nhau để định danh loại vi
khuẩn cụ thể và làm xét nghiệm độ nhạy kháng sinh.
- Đọc kết quả cấy chuyển và xét nghiệm độ nhạy kháng sinh, so sánh với các tiêu chuẩn quốc
tế và đưa ra kết luận về loại vi khuẩn gây bệnh và kháng sinh phù hợp để điều trị.
- Viết báo cáo kết quả cấy máu và gửi cho bác sĩ điều trị.

b. Quy trình lấy máu để cấy máu như sau:

- Chuẩn bị dụng cụ lấy máu bao gồm: kim tiêm một lần sử dụng, bông gòn, cồn, dây garo,
chai cấy máu, găng tay y tế.
- Rửa tay và đeo găng tay, kiểm tra thông tin bệnh nhân và y lệnh cấy máu.
- Chọn vị trí lấy máu thích hợp trên cánh tay bệnh nhân, thường là tĩnh mạch ở khuỷu tay
hoặc cổ tay.
Buộc dây garo trên bắp tay bệnh nhân để làm nổi tĩnh mạch, nhờ bệnh nhân nắm chặt và mở
ra nhiều lần để tăng lưu lượng máu trong tĩnh mạch.
- Sát trùng vùng da cần lấy máu bằng bông gòn thấm cồn, chờ khô.
- Chọc kim vào tĩnh mạch theo góc 15 độ, đẩy ống nghiệm vào đầu kim để máu chảy vào
ống nghiệm. Lấy đủ lượng máu cần thiết, tháo ống nghiệm ra khỏi kim.
- Rút kim ra khỏi tĩnh mạch, dùng bông gòn ấn chặt vào vết chọc, nhờ bệnh nhân gập cánh
tay lại để ngừng chảy máu. Tháo dây garo ra khỏi bắp tay bệnh nhân.
- Lắc nhẹ ống nghiệm để máu trộn đều với chất chống đông trong ống nghiệm, tránh làm sủi
bọt hoặc vỡ hồng cầu.
- Ghi nhãn ống nghiệm với thông tin bệnh nhân và thời gian lấy máu, đóng gói cẩn thận và
gửi đi xét nghiệm.
c. Đối với mẫu máu khi tiến hành khảo sát trực tiếp mang ý nghĩa là:
- Giúp xác định có hay không sự hiện diện của vi khuẩn trong máu bệnh nhân, đánh giá mức
độ nhiễm trùng máu.
- Giúp xác định hình dạng, cấu trúc và tính gram của vi khuẩn, từ đó có thể dự đoán được
loại vi khuẩn gây bệnh và kháng sinh phù hợp để điều trị.
- Giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và điều trị, giảm nguy cơ biến chứng và tử vong do
nhiễm trùng máu.
d. Các nhóm vi khuẩn có thể tìm thấy được trong mẫu máu là:
- Các vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết thường gặp là: E.coli, Klebsiella, Serratia,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus, Streptococcus suis,
Streptococcus viridans, Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis.
- Các vi khuẩn gây viêm màng não thường gặp là: Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis.
- Các vi khuẩn gây viêm phổi thường gặp là: Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa.
- Viêm dạ dày: Helicobacter pylori.

Tình huống 2: Một bệnh nhân bị tiêu chảy nặng, bác sĩ chỉ định cấy phân tìm vi khuẩn gây
bệnh:
a. Là kỹ thuật viên xét nghiệm em hãy ghi lại sơ đồ các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc
lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy phân cho bệnh nhân.
b. Khi nhận được mẫu bệnh phẩm, người KTV đã tiến hành nhuộm gram khảo sát trực tiếp,
KTV này làm đúng hay sai?
c. Vì mẫu phân có chứa rất nhiều vi khuẩn sống thường trú tại đường tiêu hóa không gây
bệnh, vậy làm cách nào để phát hiện được vi khuẩn gây bệnh sau khi phân lập bệnh phẩm
trên môi trường?
d. Nếu các nhóm vi khuẩn có thể tìm thấy được trong mẫu phân và cách trả kết quả của từng
nhóm?
Trả lời
a. Các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy
phân cho bệnh nhân là:
- Lấy mẫu phân bệnh nhân bằng cách sử dụng que lấy mẫu một lần sử dụng, nhúng vào phân
và đưa vào ống chuyên chở có chứa dung dịch bảo quản.
- Ghi nhãn ống chuyên chở với tên, tuổi, giới tính, ngày giờ lấy mẫu và mã số bệnh nhân.
- Đưa ống chuyên chở vào tủ lạnh, chờ đến khi tiến hành cấy phân.
- Lấy ống chuyên chở ra khỏi tủ lạnh, lắc đều để phân trộn với dung dịch bảo quản.
- Cấy phân lên các môi trường cấy khác nhau để phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh,
có thể là môi trường MacConkey, Eosin methylene blue, Salmonella-Shigella,
Campylobacter, v.v.
- Ủ các môi trường cấy ở nhiệt độ và khí trường phù hợp với loại vi khuẩn nghi ngờ, có thể là
35°C, 37°C, 42°C; không khí, CO2, kỵ khí.
- Đọc kết quả cấy phân, quan sát các đặc điểm của các sự sinh trưởng trên các môi trường
cấy, như màu sắc, hình dạng, kích thước, đường kính, biến đổi môi trường, v.v.
- Chọn các sự sinh trưởng nghi ngờ là vi khuẩn gây bệnh, tiến hành nhuộm gram và khảo sát
trực tiếp dưới kính hiển vi để xác định hình dạng, cấu trúc và tính gram của vi khuẩn.
- Cấy chuyển các sự sinh trưởng nghi ngờ lên các môi trường cấy khác để định danh loại vi
khuẩn cụ thể và làm xét nghiệm độ nhạy kháng sinh.
- Đọc kết quả cấy chuyển và xét nghiệm độ nhạy kháng sinh, so sánh với các tiêu chuẩn quốc
tế và đưa ra kết luận về loại vi khuẩn gây bệnh và kháng sinh phù hợp để điều trị.
- Viết báo cáo kết quả cấy phân và gửi cho bác sĩ điều trị.
b. Khi nhận được mẫu bệnh phẩm, người KTV đã tiến hành nhuộm gram khảo sát trực
tiếp, KTV này làm sai. Lý do là:
- Mẫu phân có chứa rất nhiều vi khuẩn sống thường trú tại đường tiêu hóa không gây bệnh,
nên nhuộm gram khảo sát trực tiếp sẽ không có ý nghĩa trong việc phát hiện vi khuẩn gây
bệnh.
- Nhuộm gram khảo sát trực tiếp chỉ có thể xác định hình dạng, cấu trúc và tính gram của vi
khuẩn, không thể xác định loại vi khuẩn cụ thể gây bệnh.
- Nhuộm gram khảo sát trực tiếp có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như độ tươi của mẫu, độ
dày của tiêu bản, thời gian nhuộm, v.v. làm thay đổi kết quả nhuộm.
c. Để phát hiện được vi khuẩn gây bệnh sau khi phân lập bệnh phẩm trên môi trường,
có thể làm theo các cách sau:
- Sử dụng các môi trường cấy chọn lọc và phân biệt để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn
sống thường trú và phân biệt các vi khuẩn gây bệnh dựa vào các đặc điểm sinh hóa, miễn
dịch, phân tử.
- Sử dụng các môi trường cấy đặc hiệu để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh có yêu cầu đặc
biệt về nhiệt độ, khí trường, chất dinh dưỡng, v.v.
- Sử dụng các xét nghiệm sinh hóa, miễn dịch, phân tử để xác nhận loại vi khuẩn gây bệnh
dựa vào các phản ứng sinh hóa, kháng nguyên, gene, DNA, RNA, v.v.
d. Các nhóm vi khuẩn có thể tìm thấy được trong mẫu phân và cách trả kết quả của
từng nhóm là:
- Vi khuẩn gram dương: như Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Listeria monocytogenes, v.v. Cách trả kết quả là ghi rõ tên loài vi khuẩn, số lượng vi khuẩn,
độ nhạy kháng sinh, ví dụ: Clostridium difficile, 10^6 CFU/g, nhạy với metronidazole và
vancomycin.
- Vi khuẩn gram âm: như Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter
spp., Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, v.v. Cách trả kết quả là ghi rõ tên loài vi khuẩn,
số lượng vi khuẩn, độ nhạy kháng sinh, ví dụ: Salmonella typhi, 10^7 CFU/g, nhạy với
ciprofloxacin và ceftriaxone.
- Vi khuẩn khác: như Helicobacter pylori, Mycobacterium tuberculosis, v.v. Cách trả kết quả
là ghi rõ tên loài vi khuẩn, số lượng vi khuẩn, độ nhạy kháng sinh, ví dụ: Helicobacter pylori,
10^5 CFU/g, nhạy với amoxicillin và clarithromycin.

Tình huống 3. Một bệnh nhân nhi sốt, đau đầu có hiện tượng co giật, bác sĩ nghi ngờ viêm
màng não, bác sĩ chỉ định lấy mẫu dịch não tủy xét nghiệm vi sinh:
a. Là kỹ thuật viên xét nghiệm em hãy ghi lại sơ đồ các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc
lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy dịch não tủy cho bệnh nhân.
b. Với mẫu dịch não tủy việc khảo sát trực tiếp có ý nghĩa gì?
c. Nêu kỹ thuật và điều kiện cần thiết cho việc cấy phân lập mẫu dịch não túy?
d. Sau khi nuôi cấy nếu mẫu dịch não tủy không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh cần xử lý thế
nào?
e. Kể tên các loại vi khuẩn thường gặp nhất trong mẫu dịch não tủy.
Trả Lời
a. Các bước kỹ thuật cần thực hiện từ lúc lấy bệnh phẩm cho đến khi trả kết quả cấy
dịch não tủy cho bệnh nhân là:
- Lấy mẫu dịch não tủy bằng phương pháp chọc dò tủy sống với kỹ thuật vô trùng1 Hút
khoảng 1-10 ml dịch não tủy vào ống nghiệm vô trùng và đóng nắp kín
- Gửi mẫu dịch não tủy đến phòng xét nghiệm trong thời gian sớm nhất có thể. Nếu không
thể gửi ngay, có thể bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4°C trong vòng 24 giờ
- Xử lý mẫu dịch não tủy trước khi nuôi cấy. Nếu mẫu có thể bội nhiễm vi khuẩn, cần xử lý
bằng kháng sinh diệt khuẩn và nấm ở nồng độ thích hợp Nếu mẫu không có khả năng bội
nhiễm vi khuẩn, không cần xử lý kháng sinh
- Nuôi cấy mẫu dịch não tủy lên các môi trường thạch hoặc lỏng thích hợp, như môi trường
thạch máu 5%, môi trường thạch chocolate, môi trường thạch Sabouraud, môi trường lỏng
BHI, môi trường lỏng thioglycolate, môi trường lỏng Selenite Ủ ấm ở nhiệt độ 37°C, CO2
(5%) trong thời gian tối thiểu 48 giờ
- Quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên các môi trường nuôi cấy. Nếu có sự phát triển, tiến
hành nhận dạng vi khuẩn bằng các phương pháp nhuộm, sinh hóa, miễn dịch học, phân tử
hoặc tự động hóa
- Trả kết quả cấy dịch não tủy cho bác sĩ điều trị. Nếu có vi khuẩn gây bệnh, cần ghi rõ tên vi
khuẩn, số lượng, độ nhạy với các kháng sinh. Nếu không có vi khuẩn gây bệnh, cần ghi rõ
không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh
b. Việc khảo sát trực tiếp mẫu dịch não tủy có ý nghĩa là để phát hiện sớm các vi khuẩn gây
bệnh, đặc biệt là những loại vi khuẩn khó nuôi cấy hoặc có thể bị tiêu diệt bởi kháng sinh
Việc khảo sát trực tiếp có thể sử dụng các phương pháp nhuộm Gram, nhuộm nhanh axit,
nhuộm mực in Ấn Độ, miễn dịch huỳnh quang, PCR hoặc các xét nghiệm nhanh khác
c. Kỹ thuật và điều kiện cần thiết cho việc cấy phân lập mẫu dịch não tủy là:
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có các vi khuẩn muốn phân
lập. Ria các đường trên đĩa petri có chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên
tục, hãy đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện thao tác tiếp theo. Lật ngược
đĩa và ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp trong tủ ấm
- Dùng pipette vô trùng hút dịch dưới đáy ống. Nhỏ 2-3 giọt lên từng môi trường nuôi cấy.
Nhỏ 1-2 giọt lên lam kính để làm tiêu bản nhuộm Gram và AFP
- Soi trực tiếp tiêu bản nhuộm Gram và AFP để xác định hình dạng, cấu trúc, màu sắc và
phản ứng của vi khuẩn
d. Sau khi nuôi cấy nếu mẫu dịch não tủy không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh cần xử lý
thế nào?
- Nếu mẫu dịch não tủy không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh sau 48 giờ nuôi cấy, cần tiếp tục ủ
ấm thêm 24 giờ và quan sát lại
- Nếu sau 72 giờ nuôi cấy vẫn không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh, cần kiểm tra lại các bước
xử lý mẫu, nuôi cấy và nhận dạng vi khuẩn để loại trừ khả năng sai sót kỹ thuật
- Nếu không có sai sót kỹ thuật, cần xem xét các nguyên nhân khác có thể gây ra kết quả âm
tính, như: bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi lấy mẫu, mẫu dịch não tủy bị hao hụt
hoặc bị ô nhiễm, vi khuẩn gây bệnh khó nuôi cấy hoặc cần điều kiện đặc biệt, bệnh nhân bị
nhiễm trùng do nấm, virus hoặc ký sinh trùng
- Nếu có nghi ngờ về các nguyên nhân trên, cần thực hiện các xét nghiệm bổ sung, như: xét
nghiệm nhanh, PCR, nuôi cấy trong điều kiện đặc biệt, nhuộm nhanh axit, nhuộm mực in Ấn
Độ, miễn dịch huỳnh quang, xét nghiệm kháng nguyên, kháng thể hoặc các xét nghiệm khác
tùy theo mầm bệnh nghi ngờ
e. Các loại vi khuẩn thường gặp nhất trong mẫu dịch não tủy là:
- Haemophilus influenzae týp B (HiB): Vi khuẩn này thường gây viêm màng não ở trẻ em
và người lớn có các ổ nhiễm khuẩn gần màng não như viêm tai giữa, viêm tai xương chũm,
viêm xoang hoặc các bệnh như viêm phổi, đái tháo đường, suy giảm miễn dịch
- Streptococcus pneumoniae (phế cầu khuẩn): Vi khuẩn này là tác nhân thường gặp gây
viêm màng não ở người lớn. Bệnh nhân viêm màng não do Streptococcus pneumoniae
thường có các ổ nhiễm phế cầu gần sọ não hoặc ở các cơ quan khác như viêm tai giữa, viêm
tai xương chũm, viêm phổi, viêm xoang, viêm nội tâm mạc
- Neisseria meningitidis (não mô cầu khuẩn): Vi khuẩn này là tác nhân phổ biến gây viêm
màng não. Bệnh có thể lây lan từ người bệnh sang người lành do dịch tiết hô hấp thông qua
việc ho, hắt hơi. Trẻ em dưới 2 tuổi và người trẻ tuổi có nguy cơ mắc viêm màng não mô cầu
cao hơn hẳn so với các nhóm tuổi khác
- Đối với trẻ sơ sinh, vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ phổ biến là Escherichia coli,
Listeria monocytogenes, B.streptococcus