1

BÀI: QUAN SÁT HÌNH THỂ VI KHUẨN

Giới thiệu
Sau khi học xong bài giúp học viên nắm được các bước kỹ thuật nhuộm
gram, nhuộm kháng acid và xác định được hình thể của vi khuẩn trên các tiêu bản
nhuộm.
Mục tiêu:
1. Nhận dạng, mô tả đúng hình dạng vi khuẩn trên phết nhuộm Gram và phết
nhuộm kháng acid
2. Trả lời đúng kết quả nhuộm Gram và nhuộm kháng acid.
3. Rèn luyện tác phong thận trọng, tỉ mỉ, vệ sinh, an toàn và chính xác trong
quá trình thực tập
NỘI DUNG CHÍNH
1. Quan sát phết nhuộm Gram
Kỹ thuật làm tiêu bản
- Lame dùng để làm phết vi khuẩn phải sạch và khô.
- Dùng bút lông (bút chì sáp) vẽ một vòng tròn khu trú trên lame đường kính
khoảng 2 cm.
- Lật ngược lame lại, ghi mã số bệnh phẩm lên một đầu lame.
- Lấy vi khuẩn.
+ Từ bệnh phẩm:
 Bệnh phẩm được lấy bằng que tămpon: có thể lấy mẫu trực tiếp từ que tămpon
bằng cách lăn tròn nhẹ que tămpon trên lame hoặc có thể có thể làm huyền dịch
với 1 giọt nước muối sinh lý vô trùng nếu mẫu bệnh phẩm bị khô.
 Bệnh phẩm là phân: chọn chỗ có nhầy máu.
+ Từ môi trường nuôi cấy:
 Từ môi trường thạch đặc: lấy một vòng cấy nước muối sinh lý hoặc nước cất vô
trùng cho lên lame trước khi đặt vi khuẩn vào.
 2

 Từ môi trường lỏng: lấy một hay hai vòng cấy vi khuẩn cho lên lame tùy theo
độ đục của lứa cấy.
-Trải vi khuẩn lên lam: dùng vòng cấy trải đều vi khuẩn theo đường xoắn ốc từ
trong ra ngoài.
- Để tiêu bản khô tự nhiên
- Gắn chặt vi khuẩn trên lame bằng các hơ lame nhanh qua ngọn lửa đèn cồn từ 2-3
lần
( Chú ý: không hơ cố định lame quá lâu hay hơ lame quá nóng)
1.2 Kỹ thuật nhuộm Gram:
1. Phủ tím Gentian lên phết vi khuẩn để yên khoảng 30 giây, rửa nước.
2. Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn để yên khoảng 30 giây, rửa nước.
3. Tẩy màu bằng cồn 95 khoảng 5 giây, rửa nước.
4. Phủ đỏ Safranin lên phết vi khuẩn để yên khoảng 30 giây, rửa nước.
5. Thấm khô lame.
Đọc kết quả:
Quan sát tiêu bản nhuộm dưới kính hiển vi ở vật kính X100, xác định các tính
chất sau:
a. Hình dạng vi khuẩn:
-Nhóm cầu khuẩn: vi khuẩn hình tròn, bầu dục, hình hạt đậu hay quả thận
-Nhóm trực khuẩn: vi khuẩn có dạng hình que dài hay hình que ngắn
-Nhóm phẩy khuẩn: vi khuẩn có dạng hình que cong giống như dấu phẩy
b. Tính chất Gram : phân thành hai nhóm chính
-Nhóm Gram dương: vi khuẩn bắt màu tím
-Nhóm Gram âm: vi khuẩn bắt màu hồng
c. Cách sắp xếp của vi khuẩn:
 3

Vi khuẩn có cách sắp xếp đặc trưng khác nhau tùy theo từng loại vi khuẩn, xác
định đúng cách sắp xếp của vi khuẩn là yếu tố gợi ý để xác định vi khuẩn gây bệnh
trong mẫu bệnh phẩm đặc biệt là nhóm cầu khuẩn.
Một số hình ảnh vi khuẩn trên phết nhuộm

Hình 1.1. Cầu khuẩn Gram dương, sắp xếp đặc trưng thành chùm

Hình 1.2. Cầu khuẩn Gram dương sắp xếp chuỗi ngắn, chuỗi dài, đôi
 4

Hình 1.3. Cầu khuẩn Gram dương sắp xếp đôi, hoặc thành chuỗi ngắn

Hình 1.5. Trực khuẩn gram dương có 1 hoặc 2 đầu phình to, sắp xếp:hình chữ V,X

Hình 1.6. Trực khuẩn Gram âm , sắp xếp đám Hình 1.7. Trực khuẩn Gram dương, sắp xếp đơn

Hình 1.8. Phẩy khuẩn Gram âm , sắp xếp đơn Hình 1.9.Trực khuẩn Gram âm , hình que ngắn, sắp xếp đám
 5

- Lậu cầu (Neisseria gonorhoroae)

-Song cầu Gram âm. Sắp xếp thành đôi, giống như hạt café, 2 phần lõm hướng vào
nhau. Vi khuẩn nằm trong tế bào bạch cầu gọi là nội bào (khi bệnh nhân ở giai
đoạn bệnh cấp tính), vi khuẩn nằm ngoài tế bào bạch cầu gọi là ngoại bào (khi
bệnh nhân ở giai đoạn bệnh mãn tính)

Song cầu khuẩn Gram âm, nội bào

- Não mô cầu (Neisseria meningitidis :Tương tự lậu cầu

(a)nhuộm từ bệnh phẩm (b) Nhuộm từ lứa cấy

2. Hình dang vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm kháng acid:
Mục đích:
Phương pháp nhuộm kháng acid để tìm họ vi khuẩn Mycobacterium với hai loại vi
khuẩn đặc trưng là trực khuẩn lao (mycobacterium tuberculosi) và trực khuẩn
phong (M.leprae)
Kỹ thuật nhuộm Ziehl Neelsen
-Trong chẩn đoán bệnh lao bệnh phẩm thường được lấy là mẫu đàm, bệnh phong
thì lấy mẫu mô hoặc vùng da bị tổn thương.
- Kỹ thuật nhuộm:
 6

- Bước 1: Gắn vi khuẩn lên lame: giống làm phết nguộm Gram
( tiêu bản đường kính chuẩn : 1x2cm)
- Bước 2: Nhuộm nóng bằng Carbonfuchsin :
 Rót nhẹ Carbonfuchsin phủ lên lame.
 Dùng que gòn (cán bằng chất không cháy) hơ nóng phía dưới lame cho tới
khi thấy bốc khói (khoảng 10 giây và phải kéo que gòn ra ngoài mới thấy bốc
hơi lên được). Làm như thế 3 lần trong 5 phút.
Lưu ý: Khi hơ lame không để chất màu cạn đi, nếu cần thì rót thêm phẩm
nhuộm lên lame.
- Bước 3: Rửa nước: Sau khi rửa nước, lớp sáp (lipid) trong tế bào vi khuẩn sẽ
đông lại và giữ cho vi khuẩn không bị dung dịch cồn - acid tẩy màu.
- Bước 4: Tẩy màu bằng hỗn hợp cồn-acid cho tới khi thấy hết màu.
- Bước 5: Rửa nước.
- Bước 6: Nhuộm lại bằng xanh Methylen ( 1 phút ).
- Bước 7: Rửa nước - thấm khô lame - xem bằng vật kính dầu (100X).
Đọc kết quả
-Trực khuẩn kháng acid bắt màu đỏ nổi bật trên nền xanh, trực khuẩn dài, thon
thẳng hơi cong. Sắp xếp đôi, đơn, cụm nhỏ không đều

Trực khuẩn kháng acid

3. Học sinh quan sát các lam mẫu và ghi nhận xét vào bảng kết quả sau
BẢNG KẾT QUẢ:
NHẬN XÉT ( màu sắc, hình dạng, vị trí…)
Bài 2: QUAN SÁT VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH
 7

Giới thiệu
Sau khi học xong bài giúp học viên nắm được các kỹ thuật nuôi cấy, làm các thử
nghiệm sinh hóa, đọc kết quả và định danh nhóm cầu khuẩn gram dương, trực
khuẩn gram âm.
Mục tiêu bài học
1. Đọc kết quả nhuộm Gram và các tính chất sinh vật hóa học để định danh cầu
khuẩn gây bệnh.
2. Đọc kết quả nhuộm Gram và các tính chất sinh vật hóa học để định danh trực
khuẩn đường ruột gây bệnh.
3. Rèn luyện tác phong thận trọng, tỉ mỉ, chính xác, vậ sinh, an toàn trong quá
trình thực tập
Nội dung chính
1. Các nhóm vi khuẩn gây bệnh
1.1.Nhóm cầu khuẩn Gram dương:
Tụ Cầu (Staphylococci):
- Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
- Tụ cầu trắng Staphylococcus epidermidis và Staphylococcus saphrophyticus
Liên cầu (Streptococci):
- Tiêu huyết α hay Tiêu huyết γ: Steptococci viridans.
- Tiêu huyết β : Steptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus
faecium
Phế cầu (Pneumococci hay Streptococcus pneumoniae);
Nhóm cầu khuẩn Gram âm:
-Lậu cầu (Nesseria gonorrhoeae)
-Não mô cầu (N. meningitidis)
Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae): các giống vi khuẩn thường
gặp
 8

- Escherichia coli
- Shigella.spp
- Salmonella.spp
- Proteus.spp
- Họ khác
- Enterobacter.spp
- Klebsiella.spp
- Citrobacter.spp
- Yersinia.spp
- Trực khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis)
- Trực khuẩn phong (Mycobacterium leprae)
- Xoắn khuẩn giang mai (Treponema pallidum)
2. Tính chất sinh vật hóa học của một số cầu khuẩn gây bệnh thường gặp
(Cocci)
Tụ cầu (Staphylococci): chia làm 2 nhóm Coagulase (+) và Coagulase (-).
a.Trên phết nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram dương. Bắt màu tím. Hình cầu,
tròn, nhỏ đường kính 1μm. Sắp xếp riêng lẻ, đôi, chùm (cách sắp xếp chủ yếu là
hình chùm nho) không di động, không bào tử
b.Phản ứng định danh:
+Phản ứng Catalase (+)
+Phản ứng coagulase ( thử nghiệm đông huyết tương)
+Thử nghiệm Lên men hay không lên men đường Manitol trên môi trường
MSA
c.Các thử nghiệm sinh hóa:
*Thử nghiệm catalase:
- Lấy vài khúm vi khuẩn đặt trên lame, sau đó nhỏ H2O2 (3%) lên trên khúm vi
khuẩn.
- Đọc kết quả:
 Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức ngay sau khi H2O2 tiếp xúc với vi
khuẩn  thử nghiệm Catalase (+) Vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococci
 9

 Nếu không có hiện tượng sủi bọt thử nghiệm Catalase (-) Vi khuẩn
thử nghiệm là Streptococci

Hình 2.1.Thử nghiệm Catalase trên lame

*Thử nghiệm coagulase: Đây là thử nghiệm quan trọng nhất để phân biệt
Staphyloccocus aureus với các loại Staphylococci khác.
-Dùng vòng cấy lấy khúm vi khuẩn cần thử nghiệm cho vào ống nghiệm có
chứa 0,5ml huyết tương người, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Đem ủ cách
thủy 35oC/ 4 giờ.
- Đọc kết quả: sau 1- 4 giờ nếu có hiện tượng đông đặc huyết tương thử
nghiệm Coagulase (+).
Lưu ý: Nếu sau 4 giờ không quan sát hiện tượng đông đặc huyết tương phải ủ
lại ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ.

Thử nghiệm Coagulase (+)

Thử nghiệm Coagulase (-)

Hình 2.2. Thử nghiệm Coagulase

*Thử nghiệm lên men đường manitol:
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần thử nghiệm cấy zic-zac lên mặt
thạch nghiêng ống MSA.

- Ủ 35oC / 18-24 giờ.

-Đọc kết quả:
+ Có vi khuẩn mọc, ống môi trường MSA chuyể ẩn
 10

mọc và lên men đường mannitol (M (+))

+Có vi khuẩn mọc, ống môi trường MSA vẫn giữ nguyên màu đỏ ẩn
mọc và không lên men đường mannitol (M (-))
*Bảng tính chất sinh hóa nhóm Staphylococci
TÊN VI KHUẨN Catalase Coagulase Kháng Novobiocin

Staphylococcus aureus (+) (+) (-)

Staphylococcus epidermidis (-)  đường kính vòng
(+) (-) vô khuẩn > 16mm 
nhạy
S.saphrophyticus (+) đường kính vòng
(+) (-) vô khuẩn < 16mm 
kháng

Liên cầu (Streptococci)

- Trên phết nhuộm Gram: cầu khuẩn Gram dương, đường kính 0,8 - 1μm. Sắp
xếp thành chuỗi ngắn hay dài khác nhau tùy loại. Không di động, không bào tử.
Vài loại có nang bằng Hyaluronic acid.

Hình 2.3. Hình ảnh liên cầu trên KHV

- Phản ứng định danh:
 Trắc nghiệm catalase: âm tính. Dùng để phân biệt tụ cầu với liên cầu hay
phế cầu
 Dựa vào hiện tượng tiêu huyết trên thạch máu BA có hướng và chọn các
trắc nghiệm cần thiết tiếp theo
 11

Tiêu huyết không hoàn toàn, Tiêu huyết hoàn toàn, vùng
vùng tiêu huyết nhỏ, sáng tiêu huyết rộng, sáng
xanh

Không Tiêu huyết

 12

Hình 2.4. Hình ảnh tiêu huyết

 Trắc nghiệm Taxo A: định danh liên cầu tiêu huyết β nhóm A
(Streptococus pyogenes)
 Thử nghiệm CAMP test: định danh liên cầu tiêu huyết β nhóm B
(Streptococcus agalactiae)
 Trắc nghiệm Bile esculine và tăng trưởng trong canh cấy có 6,5% NaCl 
định danh Streptococcus nhóm D gồm Enterococci và Nonenterococci
 Hiếu khí, kị khí tùy nghi. Khó mọc trên môi trường thông thường. Chỉ mọc
trên môi trường BA (có máu tươi). Cho ra 3 kiểu tiêu huyết α, γ, β
Phế cầu (Pneumococci hay Streptococcus pneumoniae)
- Trên phết nhuộm Gram: Cầu khuẩn Gram dương bắt màu tím, hình mũi giáo,
sắp xếp đôi, đôi khi đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Cầu khuẩn nhỏ thon
dài. Không di động, không bào tử, gốc hung độc có nang. Nang hiện rất rõ khi ta
làm phết nhuộm từ chất tiết
- Phản ứng định danh:
 Thử nghiệm catalase (-)
 Trên môi trường BA cho tiêu huyết α
 Trắc nghiệm tan trong muối mật (+): phân biệt phế cầu với nhóm liên cầu
tiêu huyết α khác
 Trắc nghiệm Taxo P (+): phân biệt phế cầu với nhóm liên cầu tiêu huyết α
khác
BẢNG TRẮC NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH DANH STREPTOCOCCI
Taxo P
và tan
Tiêu Taxo CAMP Bile NaCl
Tên VK trong
huyết A test esculine 6,5%
muối
mật
Strep. pyogenes (group A) β + - - - -
Strep. agalactiae (group B) β - + - - -
 13

Enterococci (group D) Β,γ,α - - - + +

Strep. viridans α - - - - -
Strep. pneumoniae α - - + - -
Lậu cầu – Não mô cầu
- Trên phết nhuộm Gram: Song cầu Gram âm. Sắp xếp thành đôi, giống như
hạt café, 2 phần lõm hướng vào nhau. VK nằm trong tế bào bạch cầu gọi là nội
bào, nằm ngoài tế bào bạch cầu gọi là ngoại bào. Không bào tử, không di động.
Ở bệnh phẩm tinh dịch, quệt niêu đạo ở nam phát hiện có song cầu Gram âm
nội tế bào thì có thể kết luận bệnh nhân bị nhiễm lậu cầu ( N. gonorrhoeae), ở nữ
cần kết hợp thêm yếu tố dịch tễ học và nuôi cấy.
- Phản ứng định danh:
+Thử nghiệm catalase( +)
+Thử nghiệm lên men đường nhanh
Tên VK Glucose Maltose Sucrose Lactose
N. gonorrhoeae + - - -

N. meningitidis + + - -

Hình 2.5. Thử nghiệm lên men đường

3. Tính chất sinh vật hóa học của một số Trực khuẩn đường ruột gây bệnh
thường gặp (Bacilli)
- Escherichia coli
- Shigelle.spp
 14

- Salmonella.spp
- Proteus.spp
- Klebsiella.spp
- Citrobacter.spp
- Enterobacter.spp
- Yersiniasspp
-Trên tiêu bản nhuộm Gram:
Đặc tính chung của họ vi khuẩn này là : Trực khuẩn Gram âm, sắp xếp rải rác
hoặc đứng thành đôi, dài ngắn khác nhau, kích thước lớn nhỏ khác nha tùy loại.
-Môi trường nuôi cấy phân lập xác định vi khuẩn:
+Môi trường MC (Mac conkey agar), SS , EMB
+Trên môi trường MC, SS VK mọc rất tốt và thể hiện rõ tính chất của
chúng: lên men đường lactose hay không ( lên men đường lactose khúm khuẩn
màu hồng, không lên men đường lactose khúm khuẩn màu vàng hay trắng)
+ Trên môi trường SS: xem khúm khuẩn Lactose (+/-), sinh H2 S hay không
+ Trên môi trường EMB : xem khúm khuẩn Lactose (+/-) , sinh ánh kim hoặc
không sinh ánh kim.
BẢNG TÓM TẮT ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT
TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Tên VK Môi trường MC Môi trường EMB Môi trường SS
Nhóm lên men Lactose
E.coli Khúm lớn biên Khúm lớn biên Bị ức chế, mọc ít,
đều, màu đỏ đều, màu xám khúm từ hồng
gạch với vùng ánh kim khi với đến đỏ
đỏ bao quanh tâm đen nâu hay
tím
Klebsiella.spp Khúm lớn, mọc Khúm lớn, không Bị ức chế, mọc ít,
tràn, rất nhớt, đều tâm đỏ,viền nhớt, khúm từ
tâm đỏ nhạt, rất nhớt hồng đến đỏ
 15

Enterobacter.spp Khúm lớn bóng, Khúm lớn , sáng, Bị ức chế, mọc ít,
tâm đỏ hay nhớt, tâm hồng, khúm từ hồng đỏ
không màu nhớt viền nhạt hay không màu
hoặc không
Nhóm không lên men Lactose
Shigella.spp Khúm nhỏ trong, Khúm nhỏ màu rất Khúm nhỏ không
không màu, biên nhạt màu, trong biên
đều đều
Salmonella.spp Giống Shigella Giống Shigella Giống Shigella

Citrobacte.spp nhưng lớn hơn nhưng lớn hơn nhưng lớn hơn,
tâm đen Sinh
H2S
Proteus.spp Khúm nhỏ không Khúm nhỏ không Khúm nhỏ không
màu, mọc như màu, mọc như màu, mọc như
sóng tràn sóng tràn sóng tràn, tâm
đen Sinh H2S
- Phản ứng sinh hóa định danh:
+Phản ứng oxydase (-)
+Thử nghiệm trên các môi trường sinh hóa KIA, IM, Citrate, Urea, MR,
Môi trường KIA (Kligler’s iron agar)
- Môi trường KIA là môi trường đặc được điều chế theo thể nghiêng đứng.
- Môi trường này dùng để khảo sát sự lên men đường Glucose, Lactose và khả
năng sinh H2S, sinh Gas (khí CO và H2).
- Dùng kim cấy cắm sâu xuống đáy môi trường phần thạch đứng và sau đó
cấy ziczac ở phần thạch nghiêng.
- Đọc kết quả:
 Trường hợp Glucose (-), Lactose (-):
- Cả phần đứng và phần nghiêng đều có màu đỏ.
- Do vi khuẩn không lên men cả 2 loại đường nên không làm thay đổi pH
 16

môi trường do đó môi trường vẫn giữ màu như ban đầu.
 Trường hợp Glucose (+), Lactose (-):
- Phần đứng màu vàng, phần nghiêng đỏ.
 Trường hợp Glucose (+), Lactose (+):
- Phần đứng và nghiêng đều có màu vàng.
Sinh H2S:
- Khi có màu đen xuất hiện ở phần nối hai phần thạch nghiêng và sâu là do
vi khuẩn thủy phân Sodiumthiosulfate tạo thành khí H2S. Chất này phản ứng với

sắt đã bị pepton hóa trong môi trường để cho sulfate sắt màu đen.
- Tùy theo vi khuẩn có khả năng sinh H2S nhiều hai ít mà màu đen có thể
nhiều hay ít.
 Sinh Gas (khí CO, H2):
- Xuất hiện các bong bóng khí, hay nứt cột thạch, hay đẩy cột thạch do vi
khuẩn phân tích đường thành khí CO, H2

L(+) L(-) L (-)

L(-)
G(+) Glu (+) Glu(-)
Glu (+)
Gas(+) H2S(+) H2S(-)
Gas(+)
H2S(-) gas (-) gas (-)
H2S(-)
 18

Hình 2.6. Thử nghiệm trên môi trường KIA

Môi trường IM:

- Khả năng sinh Indol
Nhỏ lên bề mặt môi trường IM 3-5giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương
tính sẽ có màu đỏ trong vài phút và âm tính sẽ có màu vàng.
-Khả năng di động (Motility):
+Vi khuẩn di động: sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường cấy
hay mọc giống bụi cây xung quanh đường cấy.
+Vi khuẩn không di động: chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường kim cấy, môi
trường xung quanh trong.

(-) I (+)

H2S(+) H2S(-)

(+) M (-)
Hình 2.7. Thử nghiệm trên môi trường IM
Thử nghiệm citrate
-Kỹ thuật:
- Dùng kim cấy hay vòng cấy, cấy zizac lên bề mặt thạch nghiêng..
- Ủ 37oC/18-24h.
-Đọc kết quả:
Phản ứng dương: môi trường có màu xanh dương (có vi khuẩn mọc).
Phản ứng âm: môi trường có màu lá cây (không có vi khuẩn mọc).

(-) (+)
Hình 2.8.Thử nghiệm Citrate

Thử nghiệm urease (môi trường urea broth)

Dùng vòng cấy lấy khúm vi khuẩn cọ sát lên thành ống nghiệm phía trên mặt
canh cấy. Sau đó nghiêng ống để kéo hết sinh khối hòa lẫn vào môi trường.
-Đọc kết quả:
Phản ứng dương: màu tím
Phản ứng âm: màu hồng da cam hoặc tím nhạt

Hình 2.9. Thử nghiệm Ure

Thử nghiệm MR – VP (Methyl Red – Voges-Proskauer)
Thử nghiệm MR:
- Kỹ thuật: dùng vòng cấy lấy khúm vi khuẩn cọ sát lên thành ống nghiệm phía
trên mặt canh cấy. Sau đó nghiêng ống để kéo hết sinh khối hòa lẫn vào môi
trường.
-Đọc kết quả: Trong môi trường MR đã nuôi cấy vi khuẩn, nhỏ vào khoảng 5 giọt
dung dịch methyl red, phản ứng dương tính khi môi trường có màu đỏ, âm tính
là màu vàng.
Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer):
-Đọc kết quả: Phản ứng dương tính (màu đỏ sẽ xảy ra trong vòng 5 phút, màu
vàng sẽ là âm tính.
20
MR (-) MR (+) VP (-) VP (+)

HÌnh 2.10. Phản ứng Methyl red (MR) và phản ứng Voges-Proskauer (VP

BẢNG ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

KIA
Ind Motil Citr Ure M V
Tên VK Gluco Lact H2 Ga
ol yti ate a R P
se ose S s
E.coli + + - + + + - - + -
Klebsiella.spp + + - + +/- - + + - +
Enterobacter.s + + - + - + + - - +
pp
Shigella.spp + - - - +/- - - - + -
Salmonella.spp + - + + - + + - + -
Proteus.spp + - + +/- - + + + + -
Arizona.spp + +/- + + - + + - + -
Yersinias.pp + - - - - - - +/- + -
Citrobacter.sp + +/- +/- + - + + +/- + -
p
 KẾT QUẢ:
Hình vẽ quan Ghi nhận xét: Các phản ứng Tên vi khuẩn
sát được hình dạng, sinh hóa định
màu sắc, cách danh vi khuẩn
sắp xếp...

4. Các phương pháp kháng sinh đồ

Thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế
- Hướng dẫn thực hành kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Ban hành kèm theo
Quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
4.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ bằng phương pháp Kirby Bauer
Đây là một phương pháp đơn giản, phổ biến nhất vì dễ thực hiện hàng ngày ở phòng xét
nghiệm với nhiều quy mô khác nhau được thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế
4.2. Nguyên tắc Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm
được đánh giá dựa vào vùng ức chế tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm kháng sinh. Khi
đặt khoanh giấy kháng sinh trên bề mặt thạch, kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch;
càng xa khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng giảm. Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức
chế khi kháng sinh đạt đến một nồng độ nhất định. Dựa vào đường kính vùng ức chế và
điểm gãy trong tài liệu hướng dẫn phiên giải kết quả kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm có
thể phân chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I (intermediate - trung gian), R
(resistant - đề kháng) hoặc NS (non-susceptible - không nhạy cảm) [6].
4.3. Chuẩn bị
- Tủ ấm, máy trộn, lắc, đĩa thạch Mueller-Hinton, khoanh giấy kháng sinh, độ đục
chuẩn McFarland 0,5, nước muối 0,9% vô trùng, tăm bông (que gòn) vô trùng, đèn cồn,
que cấy, panh, ống nghiệm vô trùng
- Các ống chứa đĩa kháng sinh phải được lấy ra khỏi tủ lạnh 1-2 giờ trước khi sử dụng.
- Môi trường tiêu chuẩn là môi trường Muller Hinton agar (MHA). Môi trường MHA
sẽ được thêm các chất bổ sung khi có yêu cầu. Môi trường được đổ vào hộp petri
d=90mm hay 15mm với bề dày thạch là 4 0,5 mm. Trước khi dùng, phải lấy môi trường
ra khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt nhiệt độ phòng. Một số trường hợp cần lưu ý khi
thực hiện kháng sinh đồ trên một số loại vi khuẩn sau[6]: 10
+ S.pneumoniae, Streptococci: MHA bổ sung thêm 5% máu cừu đã làm mất fibrin +
N.gonorrhoeae: MTM hay có thể dùng CAXV
+ H.influenzae: dùng môi trường HTM
- Dung dịch chuẩn độ đục Huyền dịch vi khuẩn làm kháng sinh đồ phải đạt được dân
số vi khuẩn là 108CFU/ml (colony forming unit ) tương đương độ đục 0,5McF. Độ đục
chuẩn McFarland được sử dụng để hiệu chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn sao cho
huyền dịch vi khuẩn sau khi pha sẽ chứa một số lượng vi khuẩn nhất định tương đương
với độ đục chuẩn sử dụng. Độ đục chuẩn được pha chế từ BaCl2 và H2SO4 để được
BaSO4 kết tủa tạo nên độ đục của dung dịch chuẩn. Độ đục chuẩn McFarland 0,5 được
pha từ 0,05 ml BaCl2.2H2O 1,175% với 9,95 ml H2SO4 1%. Huyền dịch vi khuẩn có độ
đục tương đương với độ đục của McFarland 0,5 chứa khoảng 1- 2 x 108 CFU/ml đối với
E. coli ATCC 25922. Hay có thể sử dụng máy đo quang để xác định độ đục của huyền
dịch vi khuẩn.
 - Chủng vi khuẩn thử nghiệm: Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm phải thuần và đang ở
giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ) và nên từ môi trường không có chất
chọn lọc như cấy trên thạch thường, thạch máu…)[6].
3.2.1.3. Kỹ thuật tiến hành Pha huyền dịch vi khuẩn:
- Chọn 3-4 khúm vi khuẩn cần thử nghiệm trên môi trường nuôi cấy thuần khiết cấy
vào ống nghiệm chứa 2-5ml môi trƣờng TBS hoặc BHI hay NaCl 0,9% vô khuẩn.
Vortex cho đều.
- Đo độ đục bằng máy đo quang sao cho nồng độ đúng bằng 0,5 Mc Farland. Nếu
nồng độ không đạt nhỏ hơn 0,5 Mc Farland, có thể điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi
khuẩn với môi trường TBS hoặc BHI hay NaCl 0,9% vô khuẩn. Nếu nồng độ không đạt
lớn hơn 0,5 Mc Farland, có thể điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn bằng cách
thêm vi khuẩn. Sau đó đem đo lại nồng độ. Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi pha
huyền dịch [6] 11 Trải hộp thạch:
- Dùng tampon vô khuẩn nhúng vào huyền dịch vi khuẩn sau đó ép và xoay nhẹ que
tampon trên thành ống nghiệm.
- Trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách đánh nhẹ tampon lên khắp mặt thạch từ
trái sang phải, từ trên xuống dưới.
- Xoay hộp thach 60o , trải đều vi khuẩn khắp mặt thạch từ trái sang phải, từ trên
xuống dưới. Tiếp tục xoay hộp thạch 60o , trải đều vi khuẩn khắp mặt thạch từ trái sang
phải, từ trên xuống dưới để bảo đảm cho vi khuẩn trải đều khắp mặt thạch
- Cuối cùng kéo tampon theo vòng mặt rìa của hộp thạch[6]. Đặt đĩa kháng sinh:
- Để yên hộp thạch sau khi trải khoảng 3-5 phút cho mặt thạch khô.
- Khử trùng kẹp không mấu trên ngọn lửa đen cồn, để nguội rồi lấy 1 đĩa kháng sinh
đặt nhẹ lên mặt thạch.
- Dùng kẹp ép nhẹ đĩa kháng sinh xuống mặt thạch để đảm bảo chúng tiếp xúc phẳng
với mặt thạch.