Vietnam J. Agri. Sci. 2016, Vol. 14, No.

11: 1809-1816 Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 11: 1809-1816
www.vnua.edu.vn

NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG

VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM
Nguyễn Xuân Cảnh1*, Hồ Tú Cường2, Nguyễn Thị Định1, Phạm Thị Hiếu1

1
Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2
Viện Công nghệ Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Email*: nxcanh@vnua.edu.vn

Ngày gửi bài: 12.07.2016 Ngày chấp nhận: 20.11.2016

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có
khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Từ 96 chủng xạ khuẩn có nguồn gốc
khác nhau, bằng phương pháp khuếch tán thỏi thạch chúng tôi đã thu được 3 chủng có khả năng đối kháng với vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Trong số này, chủng 25.2 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với đường kính vòng kháng
khuẩn là 15 mm. Chủng 25.2 có khuẩn lạc màu trắng, nuôi từ 7 ngày trở đi thì có màu trắng viền xám, không sinh
sắc tố tan trên môi trường Gause - 1, sinh trưởng tốt ở ngưỡng nhiệt độ từ 30 - 45°C, pH trung tính và chịu được
nồng độ muối tương đối cao lên đến 6%. Chủng 25.2 có khả năng sử dụng nhiều nguồn đường và nitrogen khác
nhau. Phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy chủng 25.2 và chủng Streptomyces aureofaciens có độ tương đồng là
96%. Kết hợp các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa và phân tích sinh học phân tử đã xác định chủng xạ
khuẩn 25.2 thuộc vào loài Streptomyces aureofaciens.
Từ khóa: Streptomyces sp., Vibrio parahaemolyticus, xạ khuẩn, hoạt tính sinh học.

Characterization of An Actinomycete Strain with Bioactivity

against Vibrio parahaemolyticus Causing Disease on Shrimp

ABSTRACT

An experiment was conducted to screen and identify the actinomycete trains that are capable of antagonizing
Vibrio parahaemolyticus causing disease on shrimp. Among of 96 isolated strains, three strains were obtained as
capable of antagonizing Vibrio parahaemolyticus by agar diffusion plate method. The strain number 25.2 had
strongest activity with a diameter of 15 mm clear zone of bacteria. The 25.2 strain showed white colonies but white
colonies with grey borders after three and seven days of incubation, respectively. The strain did not produce soluble
pigments on Gause-1 medium but grew well at temperatures between 30 - 45°C and neutral pH, and was tolerant to
high salt concentration medium. The 25.2 strain was able to utilize several sources of carbon and nitrogen. Results of
16S rRNA sequence analysis showed that the strain 25.2 had a similarity of 96% compared with Streptomyces
aureofaciens. Based on morphological characteristics, culture, physiological and biochemical characteristics and
molecular biological analyses, the strain 25.2 was identified as Streptomyces aureofaciens.
Keywords: Streptomyces sp., Vibrio parahaemolyticus, Actinomycete, bioactivity.

vào năm 2009, đến năm 2010 đã được ghi nhận

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh hoại tử gan tụy do vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây ra đang gây thiệt hại
nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm (Donald et
al., 2012). Bệnh xảy ra đầu tiên ở Trung Quốc
ở Việt Nam và tiếp đó xảy ra ở nhiều nước khác
như Thái Lan, Malaysia… Để khống chế vi
khuẩn này, thời gian qua các trại sản xuất tôm
đã dùng nhiều kháng sinh như Tetracycline,
Oxytetracyline, Rifamycine và hóa chất như

1809
Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm
Iodin, KMnO4 trong xử lí ao nuôi. Hàng loạt hóa
chất được quảng cáo và phân phối cho các cơ sở
sản xuất tôm là có thể diệt được vi khuẩn gây
bệnh nhưng thực tế lại không hiệu quả, ngược
lại còn gây tồn dư một lượng hóa chất trong tôm
dẫn tới việc giảm năng suất và chất lượng của
tôm (FAO, 2013). Đứng trước thực trạng đó thì
việc tìm kiếm các giải pháp điều trị bệnh mới là
hết sức cấp bách đối với ngành nuôi tôm của
Việt Nam hiện nay và trong tương lai.
Xạ khuẩn (Actinomycetes) được biết đến là
một nhóm vi khuẩn đặc biệt. Chúng phân bố rất
rộng rãi và có vai trò quan trọng trong chu trình
tuần hoàn vật chất tự nhiên. Trong quá trình
sống xạ khuẩn tiết ra nhiều chất có hoạt tính
sinh học cao có khả năng kháng lại các loài vi
sinh vật khác nhau bao gồm cả nấm và vi
khuẩn. Trong số 23.000 hợp chất có hoạt tính
sinh học được sản xuất từ vi sinh vật, hơn
10.000 hợp chất được phân lập từ xạ khuẩn
(Watve et al., 2001). Trên 80% số hợp chất này
là các loại kháng sinh khác nhau. Các nhà
nghiên cứu chỉ ra rằng cứ 1.000 chủng xạ khuẩn
được phân lập một cách ngẫu nhiên thì khoảng
10 chủng sẽ sinh streptomycin và 4 chủng sẽ
sinh tetracycline. Chính vì vậy, xạ khuẩn là một
trong những nguồn sản xuất các chất có hoạt
tính sinh học đầy tiềm năng (Mitra et al., 2008).
Nghiên cứu này được thực hiện với mong muốn
phát hiện, xác định được những chủng xạ khuẩn
có hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus. Từ đó tìm kiếm các hoạt chất
mới, an toàn, hiệu quả và thân thiện với môi
trường để phục vụ nghề nuôi trồng thủy sản nói
chung và nuôi tôm nói riêng.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh trên tôm được cung cấp từ Viện Công
nghệ Môi trường Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Các chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiều
nguồn khác nhau được lưu trữ tại phòng thí
nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công
nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
1810
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có
khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus
Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi
trường Gause - 1 (Tinh bột tan 20 g/l; K2HPO4
0,5 g/l; MgSO4.7H2O 0,5 g/l; NaCl 0,5 g/l; KNO3
0,5 g/l; FeSO4 0,01 g/l; Agar 20 g/l; pH = 7 - 7,4)
ở 30°C trong 5 ngày. Các thỏi thạch chứa xạ
khuẩn đã nuôi cấy có đường kính 7 mm được đặt
vào đĩa môi trường MPA (cao thịt 5 g/l; pepton
10 g/l; NaCl 5 g/l; agar 20 g/l; pH 7 - 7,2) đã
được cấy trải đều vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus, ủ ở 4°C trong 1 giờ để hoạt
chất khuếch tán từ thỏi thạch ra môi trường.
Chuyển đĩa thạch này vào tủ nuôi ở 30°C và
quan sát kết quả sau 12 giờ nuôi cấy, đo đường
kính vòng vô khuẩn (nếu có).
Các chủng xạ khuẩn được xác định là có
hoạt tính tiếp tục được nuôi cấy trong môi
trường Gause - 1 lỏng trong 5 ngày, li tâm ở
7.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch. Dịch
này được pha loãng theo những tỷ lệ nhất định
(10, 100, 1.000 lần), nhỏ 100 µl dịch pha loãng
vào các giếng tạo ra trên đĩa môi trường TCBS
đã cấy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Kiểm
tra hoạt tính dịch nuôi cấy thông qua kích thước
vòng vô khuẩn như mô tả ở trên.
2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học
của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn (25.2)
Xác định hình thái, kích thước khuẩn lạc:
Chủng xạ khuẩn 25.2 được cấy trên môi trường
Gause - 1, nuôi ở 30ºC trong 5 ngày, quan sát
hình thái và màu sắc khuẩn lạc, mép khuẩn lạc
và đo kích thước của chúng.
Xác định hình thái chuỗi sinh bào tử và bề
mặt bào tử: Chủng xạ khuẩn 25.2 được cấy trên
môi trường Gause - 1 đã găm các phiến kính vào
thạch với góc nghiêng 45º so với bề mặt. Sau 3
ngày nuôi cấy ở 30ºC, rút các phiến kính có
khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn và quan sát
hình thái chuỗi sinh bào tử dưới kính hiển vi
quang học. Hình thái và bề mặt bào tử xạ khuẩn
được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét
(SEM).
 Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu
Kiểm tra khả năng sinh sắc tố melanin:
Nuôi chủng xạ khuẩn 25.2 trên môi trường ISP
- 6 (Peptone 10 g/l; cao nấm men 1 g/l; xitrat sắt
0,5 g/l; Agar 20 g/l; pH 7,0 - 7,2) ở nhiệt độ 300C.
Quan sát màu sắc môi trường trong 14 ngày,
nếu chủng xạ khuẩn sinh ra melanin thì màu
của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang
nâu hoặc đen.
Kiểm tra khả năng đồng hóa các nguồn
carbon: Nuôi chủng xạ khuẩn 25.2 trên môi
trường ISP - 9 ((NH4)2SO4 2,64 g/l; KH2PO4 2,38
g/l; K2HPO4.3H2O 5,65 g/l; MgSO4.7H2O 1 g/l;
dung dịch B 1,0 ml; Agar 20 g/l; pH 6,8 - 7,0) có
bổ sung 1% theo trọng lượng các nguồn đường
khác nhau bao gồm D - Glucose, D - Fructose,
D - manotol, Sucrose, Rhamnose, Inositol, L -
arabinose, Cellulose, D - Xylose, Raffinose. Khả
năng đồng hóa đường được đánh giá bởi khả
năng sống và phát triển của chủng xạ khuẩn
trên các môi trường.
Kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn ni tơ:
Chủng xạ khuẩn 25.2 được nuôi cấy trên môi
trường Starch Nitrate (Tinh bột 20 g/l; NaNO3 2
g/l; K2HPO4 1 g/l; MgSO4.7H2O 0,5 g/l; KCl 0,5
g/l; FeSO4.5H2O 0,01 g/l; pH 6.8 - 7) làm đối
chứng, các nguồn ni tơ bao gồm: Cao thịt bò,
KNO3, NH4Cl, Pepton, (NH4)2SO4, NH4NO3 được
thay thế cho NaNO3.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ
NaCl tới sinh trưởng và phát triển của chủng 25.2:
Chủng xạ khuẩn 25.2 được nuôi trên môi trường
Gause - 1 với các điều kiện nuôi cấy khác nhau bao
gồm; nhiệt độ (4, 20, 30, 40, 45, 50°C), pH (4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12) và nồng độ muối NaCl bổ sung vào
môi trường (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9%).
2.2.3. Định danh chủng xạ khuẩn 25.2
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và nuôi cấy:
Chủng xạ khuẩn 25.2 được nuôi cấy trên môi
trường sau đó xác định các đặc điểm như hình
thái khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty cơ chất,
khuẩn ty khí sinh, cuống sinh bào tử và bề mặt
bào tử trên môi trường nuôi cấy. So sánh các đặc
điểm này với các chủng xạ khuẩn đã biết trong
hệ thống phân loại quốc tế (ISP) (Shirling and
Gottlied, 1966).
Căn cứ vào phân tích trình tự 16S rRNA:
ADN từ xạ khuẩn chủng 25.2 được tách chiết
theo phương pháp mô tả bởi Marmur (1961).
Phản ứng PCR khuếch đại vùng bảo thủ của
16S rRNA với cặp mồi có trình tự: 5’ -
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’ và 5’ -
ACGGCTACCTTGTTACGACTT - 3’. Sản phẩm
PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% sau đó
gửi đi đọc trình tự tại công ty 1tsBASE
(Singapore). Mức độ tương đồng về trình tự gen
mã hóa 16S rRNA của chủng nghiên cứu được
so sánh với các chủng đã công bố trên genbank
sử dụng công cụ tra cứu Blast (http://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sử dụng phần mềm
MEGA6 để xây dựng cây xác định mối quan hệ
di truyền, lựa chọn phương pháp Maximum
Parsimony với độ tin cậy được tính bằng thuật
toán Bootstrap với 100 lần lặp lại. Dựa vào cây
phân loại và giá trị bootstrap để xác định mối
quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả
năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus
Khả năng đối kháng với các vi sinh vật khác
của xạ khuẩn được cho là bởi các hợp chất có
hoạt tính sinh học, đặc biệt là các loại chất
kháng sinh. Các chất này thường được xạ khuẩn
tiết ra môi trường trong quá trình nuôi cấy,
chính vì vậy chúng tôi đã sử dụng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch để tuyển chọn và
đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn của các
chủng xạ khuẩn. Môi trường Gause - 1 được sử
dụng để nuôi xạ khuẩn, hai loại môi trường
MPA và TCBS được sử dụng để nuôi cấy vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Qua quá trình
sàng lọc, 03 trong số 96 chủng xạ khuẩn nghiên
cứu được xác định có khả năng đối kháng với
Vibrio parahaemolyticus. Trong đó, chủng 25.2
có khả năng đối kháng mạnh với đường kính
vòng vô khuẩn là 15 mm (Hình 1 A). Trong
những năm gần đây, đã có một số công bố trên thế
giới về việc tìm ra các chủng xạ khuẩn có khả
năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus. So
sánh với những kết quả trước đây, chủng 25.2
1811
Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm

AA AB

10-1 10-2

100
10-3

Hình 1. Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

của chủng xạ khuẩn 25.2. Hoạt tính kháng vi khuẩn của một số chủng
xạ khuẩn phân lập (A) và Hoạt tính kháng vi khuẩn của dịch nuôi cấy
chủng xạ khuẩn 25.2 ở các độ pha loãng khác nhau (B)

trong nghiên cứu này có hoạt tính tương đối
mạnh (You et al., 2005; Selvakumar et al., 2010;
Ngo et al., 2011 ). Để đánh giá thêm về hoạt
tính của chủng 25.2 này tôi đã sử dụng các nồng
độ pha loãng khác nhau của dịch nuôi cấy và
môi trường TCBS (môi trường đặc hiệu cho
Vibrio parahaemolyticus) được sử dụng để nuôi
vi khuẩn. Kết quả cho thấy ở độ pha loãng 1.000
lần, tuy có giảm nhưng dịch nuôi cấy xạ khuẩn
vẫn còn hoạt tính kháng khuẩn (Hình 1 B). Kết
quả này cho thấy chủng xạ khuẩn 25.2 có tiềm
năng để phát triển ứng dụng, chính vì vậy
chúng tôi sử dụng chủng này trong các nghiên
cứu tiếp theo.3.2. Đặc điểm sinh học của chủng
xạ khuẩn 25.2.
3.2.1. Đặc điểm hình thái
Một trong những tiêu chí đầu tiên để
nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại xạ
khuẩn là căn cứ vào đặc điểm hình thái
(Miyadoh et al., 2016). Chủng xạ khuẩn 25.2
được nuôi trên môi trường Gause - 1 trong 7
ngày ở 30°C để quan sát các đặc điểm màu sắc,
kích thước, hình dạng của khuẩn lạc. Sau 3
ngày nuôi cấy, quan sát cho thấy khuẩn lạc
chủng 25.2 có dạng tròn đều, kích thước dao
động 0,3 - 0,6 mm, màu trắng. Màu sắc khuẩn
lạc có sự thay đổi sau các ngày nuôi cấy, đến
ngày thứ 5 xuất hiện viền xám xung quanh
khuẩn lạc, kích thước của viền này tăng dần
theo thời gian nuôi cấy.
Sau khi xác định các đặc điểm khuẩn lạc,
chúng tôi tiến hành các nghiên cứu xác định hình
dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và bề mặt
bào tử của chủng 25.2. Kết quả quan sát dưới
kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1.000 lần
cho thấy sau 48 h nuôi cấy chủng xạ khuẩn 25.2
bắt đầu hình thành bào tử. Các bào tử được sắp
xếp thành chuỗi dài, phân nhánh và xoắn lò xo.
Sau 60 h nuôi cấy các bào tử bắt đầu rời khỏi
chuỗi, phát tán vào môi trường. Để xác định
chính xác hơn hình thái của chủng xạ khuẩn 25.2
chúng tôi đã quan sát hình thái chuỗi sinh bào tử
và bề mặt bào tử dưới kính hiện vi điện tử quét
(SEM). Việc xử lý tiêu bản, quan sát và phân tích
hình ảnh được thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương. Ở độ phóng đại 8.000 lần, chuỗi sinh
bào tử của chủng 25.2 rất đặc trưng với dạng
xoắn lò xo màu trắng, mỗi chuỗi hình thành 10 -
30 bào tử (Hình 2 A). Bào tử chủng 25.2 có dạng
hình bầu dục, kích thước dao động từ 1,4 - 1,6 ×
6,5 - 7,5 µm. Bề mặt bào tử xù xì, có nhiều gai
ngắn (Hình 2 B).

1812
 Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu

A B

Hình 2. Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng 25.2
dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở độ phóng đại 8.000 lần (A) và 40.000 (B)

carbon từ nhiều nguồn đường khác nhau như

3.2.2. Khả năng hình thành sắc tố melanin
Melanin là chất do xạ khuẩn sinh ra trong
quá trình nuôi cấy trên môi trường ISP - 6, làm
màu môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt
sang màu nâu, đen. Theo chương trình phân
loại xạ khuẩn quốc tế (ISP) năm 1966, khả năng
hình thành melanin được xác định trên môi
trường ISP6 ở 30°C trong ít nhất 21 ngày, nếu
chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường
sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen (Shirling
và Gottlied, 1966).
Chủng 25.2 được nuôi cấy trên môi trường
ISP - 6 và quan sát sau 21 ngày nuôi cấy. Nhận
thấy màu của môi trường không chuyển sang
màu nâu đen, điều này chứng tỏ chủng 25.2
không có khả năng sinh sắc tố melanin.
Fructose, R - Hannose, L - arabinose, Raffinose,
D - xylose, Inositol, D - manitol, Cellulose,
Sucrose, trong đó tốt nhất là Sucrose và Inositol
(Bảng 1). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu
đã được công bố của Mohana và Radhakrishnan
(2014). Chủng 25.2 có khả năng sử dụng nguồn
ni tơ từ nhiều nguồn khác nhau là NH4NO3, cao
thịt bò, NH4Cl, pepton, (NH4)2SO4, KNO3 (Bảng
1). Trong đó, nguồn gen từ KNO3, cao thịt bò
giúp chủng xạ khuẩn 25.2 sinh trưởng tốt và ổn
định nhất.

3.2.3. Khả năng sử dụng các nguồn đường

và ni tơ của chủng 25.2
Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn carbon và
ni tơ của chủng 25.2 là một trong những căn cứ
để tiến hành phân loại xạ khuẩn theo hệ thống
ISP đồng thời cung cấp thông tin về dinh dưỡng
của chủng 25.2 cho quá trình lên men sau này.
Chủng 25.2 được nuôi cấy trên môi trường ISP -
9 có bổ sung các nguồn đường khác nhau và trên
môi trường Starch Nitrate với nguồn NaNO3
được thay thế bằng các nguồn ni tơ khác nhau Hình 3. Kết quả kiểm tra khả năng hình
như mô tả trong phần phương pháp. Kết quả thành melanin của chủng 25.2 khi nuôi cấy
cho thấy chủng 25.2 có khả năng sử dụng nguồn trên môi trường ISP - 6 sau 21 ngày

1813
Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm

Bảng 1. Khả năng sử dụng các nguồn carbon và nitro khác nhau của chủng 25.2
Khả năng phát triển của chủng Khả năng phát triển của chủng 25.2
Nguồn carbon Nguồn ni tơ
25.2 sau 5 ngày nuôi cấy sau 5 ngày nuôi cấy
Sucrose +++ NaNO3 ++
R - Hannose ++ KNO3 ++
Cellulose ++ Cao thịt bò ++
Fructose ++ NH4Cl -
L - arabinose ++ Pepton +
Raffinose ++ (NH4)2SO4 -
D - xylose + NH4NO3 -
Inositol +++
D - manitol ++

Chú thích: (+) Chủng 25.2 có thể phát triển; (++) Chủng 25.2 phát triển tốt; (+++) Chủng 25.2 phát triển rất tốt; ( - ) Chủng
25.2 không có khả năng phát triển

3.2.3. Khả năng thích nghi với một số điều
kiện môi trường của chủng 25.2
Mỗi vi sinh vật khác nhau sẽ thích nghi với
các điều kiện môi trường khác nhau, nó ảnh
hưởng đến quá trình trao đổi chất và sinh
trưởng của mỗi loài. Khảo sát các yếu tố môi
trường đến sự sinh trưởng và phát triển của
chủng xạ khuẩn 25.2 nhằm mục đích cung cấp
thông tin về điều kiện nuôi cấy phục vụ các
nghiên cứu sau này. Chủng xạ khuẩn 25.2 đã
được nuôi trên trên môi trường Gause - 1 ở các
nhiệt độ, pH và các nồng độ muối khác nhau.
Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng
25.2 sau 5 ngày nuôi cấy đã được kiểm tra, kết
quả được tổng hợp trong bảng 1. Kết quả cho
thấy chủng xạ khuẩn 25.2 có khả năng thích
ứng tương đối cao với các điều kiện thử nghiệm.
Tuy nhiên chủng này có khả năng phát triển tốt
trong điều kiện nhiệt độ từ 30 - 45°C, thích hợp
với môi trường trung tính hoặc hơi kiềm với
khoảng pH từ 6 - 9 và có khả năng chịu được
nồng độ NaCl lên đến 6%. (Bảng 2)
Trong nghiên cứu này, chủng 25.2 sinh
trưởng được đến nồng độ muối là 6% nên xếp
vào nhóm chịu muối trung bình, tuy nhiên phát
triển mạnh ở nồng độ 1 - 3%. Các kết quả về
điều kiện nuôi cấy này tương đối giống với kết
quả nghiên cứu đã được công bố của Mohana và
Radhakrishnan (2014).
3.3. Định danh chủng xạ khuẩn 25.2
Để định danh chủng xạ khuẩn trong nghiên
cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp sinh
học phân tử dựa trên độ tương đồng của đoạn
gen 16S rARN của chủng này với các chủng xạ
khuẩn đã công bô trên ngân hàng gen. ADN của
xạ khuẩn đã được tiến hành tách chiết theo
phương pháp của Marmur (1961). Cặp mồi 27F
và 1492R để khuếch đại đoạn gen 16S rARN của
chủng 25.2 đã được sử dụng, kết quả điện di thu
được 1 băng ADN duy nhất có kích thước
khoảng 1500 bp phù hợp với kích thước lý
thuyết có thể đạt được khi nhân bằng đoạn mồi
này (Hình 4).

Bảng 2. Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trưởng

đến sự phát triển của chủng xạ khuẩn 25.2
Yếu tố Khoảng tối ưu Khoảng chịu đựng
o
Nhiệt độ ( C) 30 - 45 20 - 45
NaCl (%) 1-3 1-6
pH 6-9 4 - 12

1814
 Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu

Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình
tự tại công ty 1st BASE (Singapore). Sau khi
nhận được trình tự, tiến hành so sánh trình tự
thu được với các trình tự khác trên ngân hàng
gen nhờ công cụ blast, xây dựng cây phân loại
cho chủng 25.2 bằng phần mềm MEGA6. Kết
quả được thể hiện ở hình 5.
Dựa vào cây phân loại này có thể thấy
chủng xạ khuẩn 25.2 nằm cùng nhánh với
chủng Streptomyces aureofaciens IMET43577
với giá trị bootstrap là 79. Bên cạnh đó, kết
quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ
tương đồng của 16S rARN của chủng xạ khuẩn
25.2 và Streptomyces aureofaciens IMET43577
là 96%. Xét về mặt giá trị tin cậy và mức độ
tương đồng thì hai chủng này giống nhau.
Ngoài ra các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hóa đã nghiên cứu, tôi nhận thấy chủng xạ
khuẩn nghiên cứu 25.2 có nhiều đặc điểm giống
với chủng Streptomyces aureofaciens
IMET43577 trên ngân hàng gen (Shirling and
Gottlied, 1968).

Hình 5. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rARN của chủng xạ khuẩn 25.2

1815
Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm
Chính vì vậy, kết hợp các đặc điểm sinh học
và phương pháp sinh học phân tử, chúng tôi đưa
ra kết luận chủng 25.2 có quan hệ họ hàng gần
gũi với loài Streptomyces aureofaciens và chúng
tôi đặt tên cho chủng này là Streptomyces
aureofaciens 25.2.
4. KẾT LUẬN
Đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có
khả năng đối kháng lại vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh trên tôm, trong đó
chủng 25.2 có hoạt tính mạnh nhất.
Đã nghiên cứu các đặc điểm sinh học của
chủng xạ khuẩn 25.2 bao gồm đặc điểm về hình
thái, nuôi cấy, sinh lý và sinh hóa.
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử kết
hợp với các khóa phân loại truyền thống để định
danh chủng xạ khuẩn 25.2, kết quả cho thấy
chủng xạ khuẩn này có quan hệ họ hàng gần gũi
với loài Streptomyces aureofaciens.
LỜI CÁM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi ngân sách cho
Khoa học và Công nghệ của Học viện Nông nghiệp
Việt Nam trong đề tài mã số T2016 - 12 - 49.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Donald V. L., Redman R. M., Pantoja C. R., Noble B.
L., Tran L. (2012). Early mortality syndrome
affects shrimp in Asia. Global Aquaculture
Advocate Magazine.
FAO (2013). Report of the Fao/mard technical
workshop on early mortality syndrome (EMS) or
acute hepatopancreatic necrosis syndrome
(AHPNS) of cultured shrimp (under
TCP/VIE/3304).
Marmur J. (1961). A Procedure for the Isolation of
Deoxyribo - nucleic Acid from Micro - Organism.
Journal of Molecular Biology, 3(2): 208 - 218.
1816
Miyadoh S., Tsuchizaki N., Ishikawa J., Hotta K.
(2016). Digital Atlas of Actinomycete. The Society
for Actinomycetes Japan, Asakura Co.
Mitra, A., S.C. Santra and J. Mukharjee (2008).
Distribution of actinomycetes, the antagonistic
behavior and the Physio - chemical characteristic
of the worlds lagest tidal mangrove forest. Applied
Microbial Biotechnology, 80: 685 - 695.
Mohana, S., and M. Radhakrishnan (2014).
Streptomyces sp MA7 isolated from mangrove
rhizosphere sediment effective against Gram
negative bacterial pathogens. International Journal
of PharmTech Research (0974 - 4290), 6(4): 1259 -
1264.
Ngo T. T. C., Nguyen X. H., Le T. N. T., Masaru M.,
and Ikuo M. (2011). Identification and
Characterization of Actinomycetes Antagonistic to
Pathogenic Vibrio spp. Isolated from Shirmp
Culture Pond Sediments in Thua Thien Hue - Viet
Nam. Journal - Faculty of Agriculture, Kyushu
University, 56(1): 15 - 22.
Selvakumar D., Arun K., Suguna S., Kumar D.,
Dhevendaran K. (2010). Bioactive potential
of Streptomyces against fish and shellfish
pathogens. Iranian Journal of Microbiology, 2(3):
157 - 164.
Shirling, E.B. and Gottlieb D. (1966). Methods for
characterization of Streptomyces species.
International Journal of Systematic Bacteriology,
16: 313 - 340.
Shirling, E.B. and Gottlieb D. (1968). Cooperative
description of type cultures of streptomyces III.
International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology, 18: 279 - 392.
Watve M. G., Tickoo R., Jog M. M., Bhole B. D.
(2001). How many antibiotics are produced by the
genus Streptomyces? Archives of Microbiology,
176(5): 386 - 390.
You J. L., L. X. Cao, G. F. Liu, S. N. Zhou, H. M.
Tan, Y. C. Lin. (2005). Isolation and
characterization of actinomycetes antagonistic to
pathogenic Vibrio spp. from nearshore marine
sediment. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 21(5): 679 - 682.