Sàng lọc và xác định các chủng nấm men từ

trái cây và rau: Tiềm năng kiểm soát sinh

học sau thu hoạch bệnh thán thư hại ớt.
Tổng quát:
Nấm men đối kháng với Colletotrichum capsici được phân lập từ trái cây
và rau củ của Thái Lan. Bốn chất đối kháng (R13, R6, ER1 và L2) đã được
phát hiện rằng ức chế sự phát triển của C. capsici với hiệu quả kiểm soát sinh
học lần lượt là 93,3%, 83,1%, 76,6% và 66,4%. Nhận dạng bởi trình tự vùng
26S rDNA và ITS cùng với các đặc điểm sinh lý và hình thái, cho thấy chúng
là Pichia guilliermondii, Candida musae, Issatchenkia orientalis, và Candida
quercitrusa, theo thứ tự hiệu quả của chúng. P. guilliermondii chủng R13 cho
thấy hiệu quả trong việc giảm tỷ lệ bệnh trên những trái ớt bị nhiễm C. capsici
xuống còn 6,5%. Tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn được quan sát thấy ở mức thấp hơn
Nhiệt độ bảo quản. Ứng dụng của P. guilliermondii để bảo quản quả ớt hiệu
quả hơn so với cách bảo quản thông thường với nước khử trùng bằng clo.
1.Giới thiệu
Chiến lược chung của kiểm soát sinh học là sử dụng một sinh vật sống để
kiểm soát một sinh vật khác (Druvefors, 2004). Các tác nhân kiểm soát có thể
là vi sinh vật đối kháng hoặc thậm chí các hợp chất có nguồn gốc thực vật và
động vật tự nhiên (Pal và Người làm vườn, 2006). Gần đây, kiểm soát sinh học
đã được phát triển như một giải pháp thay thế cho thuốc diệt nấm tổng hợp điều
trị và thành công đáng kể đã đạt được sau sử dụng vi sinh vật đối kháng để
kiểm soát cả bệnh trước thu hoạch và sau thu hoạch (Janisiewicz và Korsten,
2002). Một loạt các chất đối kháng vi sinh vật đã được được báo cáo để kiểm
soát một số mầm bệnh khác nhau trên các trái cây và rau quả (Fravel, 2005;
Mari và Guizzardi, 1998).
Trong số các sinh vật đối kháng này, nấm men tự nhiên đã có hiệu quả
như tác nhân kiểm soát sinh học (Irtw-ange, 2006; Qing và Shiping, 2000).
Men có nhiều các thuộc tính làm cho chúng hữu ích cho các mục đích kiểm
soát. Các loại nấm men thường không tạo ra bào tử hoặc độc tố nấm mốc gây
dị ứng như nhiều loại nấm sợi sinh ra hoặc các chất chuyển hóa kháng sinh có
khả năng được tạo ra bởi các chất đối kháng vi khuẩn (Droby và Chalutz,
1994). Men thường có dinh dưỡng đơn giản yêu cầu và có thể bám trên bề mặt
khô trong thời gian dài khoảng thời gian, cũng như chịu được nhiều loại thuốc
trừ sâu được sử dụng trong môi trường sau thu hoạch (El-Tarabily và Sivasi-
thamparam, 2006; Wilson và Wisniewski, 1989). Ngoài ra, nấm men có thể
phát triển nhanh chóng trên các chất nền ít tốn kém trong máy lên men và do
đó dễ sản xuất với số lượng lớn (Druvefors, 2004). Các nghiên cứu trước đây
và các chế độ được đề xuất hoạt động của nấm men kiểm soát sinh học cho
thấy ít khả năng xảy ra bất kỳ nguy cơ nào đối với người tiêu dùng (Arras và
Arru, 1997; Arras et al., 1999). Hơn nữa, các tế bào nấm men chứa một lượng
lớn vitamin, khoáng chất và các axit amin thiết yếu và ở đó là một số báo cáo
về tác dụng có lợi của men trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (Hussein et
al., 1996).
Bệnh thán thư do Colletotrichum capsici gây ra là một bệnh chính của các
loại rau nhiệt đới như ớt (Capsicum annuum L. var. acuminatum Fingerh.)
(Hadden và Black, 1989; Pakdeevaraporn et al, 2005). Bệnh này xuất hiện dưới
dạng thối trái chín và chết héo (Mehrotra và Aggarwal, 2003). Quả chín dễ bị
thối rữa hơn vì nó gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho trái cây trưởng thành trên
đồng ruộng cũng như trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Bên ngoài đầu
tiên dấu hiệu của nhiễm trùng là sự xuất hiện của một đốm tròn nhỏ, màu đen,
thường được xác định rõ ràng hoặc đôi khi lan tỏa. Bệnh khô cành thường xuất
hiện sau mưa hoặc sau một thời gian dài kỳ sương. Cuộc tấn công bắt đầu từ
ngày càng tăng điểm của nụ hoa, ngọn bị ảnh hưởng cành khô héo và chuyển
sang màu nâu. Cây bị nhiễm bệnh ít quả có chất lượng thấp. Trong điều kiện
thuận lợi cho bệnh phát triển có tới 50% số quả có thể bị hư hỏng (Smith và
Crasson, 1959). Tiêu biểu, các triệu chứng đầu tiên xuất hiện trên trái cây
trưởng thành nhỏ, các vết bệnh bị ngấm nước, trũng và nở ra nhanh chóng. Các
tổn thương có thể tăng lên đến 2–3 cm đường kính trên lớn trái cây. C. capsici
tạo bào tử ở loài bado tử đính và kích thước của bào tử là 17–18 × 3–4  µm.
Giác bám từ bào tử nẩy mầm sau đó xâm nhập vào tế bào biểu bì quả ớt. Sự
phát triển của sợi nấm bên trong các mô của vật chủ tạo ra một chất độc có thể
điều chỉnh nhiệt độ gây ra thương tích, đặc biệt là thành phần nguyên sinh chất
của các mô vật chủ (Narain và Das, 1970).
Nhu cầu về ớt trên thế giới đang tăng lên mỗi năm (Tổ chức Nông lương
Hoa Kỳ Quốc gia, 2004) và ớt chất lượng tốt, tức là không có xuất hiện bệnh
hoặc độc tố nấm, là những điều kiện tiên quyết cho xuất nhập khẩu (Viện Hồ
tiêu Chile, 2004). Tuy nhiên, phòng trừ bệnh thán thư trên ớt trái cây vẫn chủ
yếu dựa vào việc sử dụng các loại thuốc trừ bệnh tổng hợp. Điều này có thể dẫn
đến các mầm bệnh kháng thuốc diệt nấm như xảy ra trong thuốc diệt nấm đồng
và dithiocarbamates (Parry, 1990). Ngoài ra, còn có vấn đề ô nhiễm thuốc diệt
nấm trong thực phẩm và môi trường. Do đó, ngày càng có nhu cầu kiểm soát
thay thế các chiến lược. Một số nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng thành
công chất đối kháng nấm men để kiểm soát mầm bệnh thực vật trên trái cây
(Lurie et al., 1995; Wilson et el., 1993).
Mục tiêu của chúng tôi là điều tra khả năng sử dụng các tác nhân kiểm
soát sinh học nấm men vô hại đối với bệnh thán thư ớt để giảm việc sử dụng
các tác nhân hóa học có thể gây hại cho con người và môi trường. Trong này
nghiên cứu, các chủng nấm men biểu sinh từ trái cây và rau quả đã được cô lập
và xác định. Khả năng kiểm soát của họ bệnh thán thư do C. capsici đã được
điều tra. Tác nhân kiểm soát sinh học nấm men hiệu quả nhất là được sử dụng
để chống lại C. capsici khi nhiễm vào trái ớt với kết quả dương tính cần được
điều tra thêm để bảo quản sau thu hoạch.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Nấm gây bệnh thán thư cho ớt
Colletotrichum capsici DOAC 1511 thu được từ Phòng thí nghiệm
Mycological của Bộ Nông nghiệp (DOA), Thái Lan. Mầm bệnh nấm được duy
trì trên môi trường nuôi cấy từ bột khoai tây và đường dextrose (PDA) nghiêng
về 4 °C.
2.2 Nguồn trái cây và rau quả
Nguồn phân lập nấm men là 11 loài trái cây nhiệt đới và thực vật, tức là
chuối (Musa sapientum L.), xoài (Mangifera indica L.), nhãn (Dimocarpus
longan Lour.), dứa (Ananus comosus Merr.), chôm chôm (Nephelium
lappaceum L.), hồng táo (Eugenia javanica Lamk.), hồng xiêm (Achras sapota
L.), ớt chim (Capsicum frutescens. L.), ớt (C. annuum L. var. Acuminatum
Fingerh.), ớt ngọt (C. annuum L. var. rossum), cà tím (Solanum melongena L.),
và chổi đĩa (Solanum torvum Swartz) được thu hoạch từ những cánh đồng
không được xử lý ở tỉnh Singhburi, miền trung của Thái Lan. Quả ớt đỏ
(C.annuum L. var. acuminatum Fingerh.), chưa được được xử lý bằng bất kỳ
loại thuốc diệt nấm nào được sử dụng để kiểm soát sinh học khảo nghiệm.
2.3 Mức độ thiệt hại do bệnh thán thư gây nên
Mức độ gây hại của bệnh thán thư trên ớt trái gây ra bởi C. capsici đã
được nghiên cứu bằng cách sử dụng 30 quả ớt bị thương quả (một vết thương
trên mỗi quả) được cấy C. capsici tại nồng độ 5 × 102 , 5 × 103 , 5 × 104 , 5 ×
105 , và 5 × 106 bào tử ml-1 . Trái cây đối chứng được xử lý vô trùng nước cất.
Tất cả các trái ớt được đặt trên 17 × 11 × 4 cm khay nhựa được bọc bằng ống
bọc polyethylene mật độ cao. Nước vô trùng được sử dụng để duy trì độ ẩm
cao (95% độ ẩm tương đối (RH)) của các khay trái cây. Các khay đã được bảo
quản trong tủ thông gió (Memmert, type UM 600, Schwabach, Đức) trong
bóng tối ở 28 °C. Đường kính tổn thương (chiều dài trung bình của tổn thương
theo trục x và trục y) được đo 5 ngày sau khi cấy. Các thí nghiệm đã lặp lại ba
lần và mỗi lần điều trị được tiến hành trong ba lần gồm 30 cây ớt đối chứng và
thí nghiệm bị thương trái cây.
2.4. Phân lập nấm men
Nấm men biểu sinh đã được phân lập từ bề mặt của trái cây và rau theo
phương pháp của Assis và Mari-ano (1999). Mười gam mẫu được treo trong
100 ml nước cất vô trùng và lắc mạnh để vài phút. Các pha loãng nối tiếp của
huyền phù mẫu nấm men được làm trong nước cất vô trùng. Một phần của 0,1
ml mỗi độ pha loãng được mạ trên thạch chiết xuất mạch nha nấm men (YM
thạch) được điều chỉnh đến pH 3,5 bằng axit tartaric vô trùng và các đĩa nuôi
cấy được ủ ở 28 °C trong 48 giờ. Tất cả các khuẩn lạc nấm men được kiểm tra
dưới kính hiển vi (Accu-max XSZ-107) và 225 khuẩn lạc từ trái cây và rau quả
được chọn trên cơ sở các đặc điểm hình ảnh khác nhau của chúng. Các dòng
nấm men phân lập được lặp lại trên thạch YM để thu được các nền văn hóa tinh
khiết và chúng được duy trì trên nguyên liệu nuôi cấy môi trường chất dinh
dưỡng (NYDA) chứa 8 g l -1 canh dinh dưỡng, 5 g l -1 chiết xuất men, 10 g l-2
glucose, và 20 g l-1 thạch . Các mẫu cấy được lưu trữ ở 4 °C cho đến khi xa hơn
nghiên cứu về hoạt động đối kháng.
2.5. Sàng lọc các chất đối kháng nấm men
Sàng lọc các chất đối kháng nấm men chống lại C. capsici là được tiến
hành theo hai bước. Thứ nhất, 225 khuẩn lạc nấm men được phân lập từ các
mẫu rau quả là vạch trên môi trường nuôi cấy từ bột khoai tây và đường
dextrose (PDA) có chứa C. capsici ở 5 × 104 bào tử ml-1 . Các mẫu cấy được ủ
ở 28 °C trong 5 ngày. Sau đó, nấm men phân lập kháng lại sự xâm nhập của sợi
nấm (54 khuẩn lạc) đã được chọn để kiểm tra tốt theo phương pháp của (He et
al, 2003). Nấm men phân lập được nuôi cấy trong canh trường men dextrose
dinh dưỡng (NYDB: NYDA không có thạch) trên máy lắc quay trong 48 giờ.
Men tế bào được thu thập bằng cách ly tâm ở 3000 vòng / phút cho 20 phút và
rửa hai lần bằng nước cất vô trùng (DIW) và tiếp tục lại trong DIW. Để kiểm
tra các hoạt động đối kháng của chúng, huyền phù tế bào nấm men đã được rửa
sạch (20 µl trong số 5 × 109 ô ml-1 ) đã được tiêm vào một cái giếng (đường
kính 6 mm) ở trung tâm của một đĩa có chứa PDA cộng với 15% ớt nước ép và
giữ trong 1-2 giờ để cho phép huyền phù tế bào xâm nhập vào giếng. Sau đó 20
µl trong số 5 × 104 bào tử ml-1 trong số C. capsici (nồng độ tối ưu được tìm
thấy từ thí nghiệm trong Phần 2.3) đã được áp dụng cho giếng. Tất cả các tấm
được ủ ở 28 °C trong bóng tối. Sự phát triển của nấm được quan sát cho từng
mảng và đường kính của các khuẩn lạc nấm (chiều dài đường kính trung bình
theo trục x và trục y) là đo 5 ngày sau khi ủ. Mỗi lần điều trị (chất phân lập) đã
được thực hiện trong ba lần và mỗi thử nghiệm là tiến hành ba lần. Nấm men
phân lập hoàn toàn ức chế sự phát triển của nấm được gọi là chất đối kháng
nấm men đã được sử dụng cho các nghiên cứu sâu hơn.
2.6. Xác định chất đối kháng nấm men bằng trình tự rDNA sự so sánh
Việc xác định các loại nấm men đối kháng được thực hiện bằng cách sử
dụng kỹ thuật so sánh trình tự rDNA như được mô tả bởi White et al. (1990) và
Mitchell et al. (1992). Các phản ứng hỗn hợp chứa các mồi cụ thể cho vùng
D1/D2 của đơn vị con lớn, 26S rDNA, là NL-1 (5’-GCATA
TCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) và NL-4 (5’-GGT
CCGTGTTTCAAGACGG-3’ ). Ngoài ra, đoạn mồi của vùng ITS (Vùng
khoảng cách được phiên mã bên trong), ITS1 (5’-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TC
CTCCGCTTATTGATATG-3’), cũng được sử dụng để khuếch đại gen 5.8S
can thiệp để đạt được sự phân ly cao giá trị (Kurtzman, 1992; Martorell và et
al., 2005; Suh và Blackwell, 2004). Các gen 26S và 5,8S đã được khuếch đại
bằng kỹ thuật PCR, mang lại khoảng 600 bp trong mỗi đoạn DNA. Số lượng 10
µl sản phẩm khuếch đại được phân tách theo phương pháp điện di trên 0,8% (w
/ v) agarose gel trong đệm Tris–borate–EDTA (TBE) ở điện áp không đổi 100
V trong 35 phút. Các dải được nhuộm bằng lớp xen kẽ và được chụp ảnh dưới
lớp phủ bóng Đèn UV. Sau đó, các sản phẩm được tinh chế bằng cách sử dụng
QIA-quick (QIAGEN, Đức). Trình tự đã được thực hiện bằng cách sử dụng
Automate DNA Sequencer (3100-Avant Genetic Máy phân tích). Các trình tự
được căn chỉnh và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI qua Internet bằng chuỗi sinh
học (NCBI BLAST: Bethesda, MD, Hoa Kỳ) (Altschul và et al., 1997).
2.7. Đặc điểm hình thái và sinh lý
Đặc điểm hình thái của các chất đối kháng nấm men là được kiểm tra
bằng cách quan sát các mẫu tế bào và khuẩn lạc theo đối với các phương pháp
được mô tả bởi Kurtzman và Fell (1998). Tế bào nấm men từ các dòng phân
lập khác nhau được nuôi cấy trong chất lỏng môi trường (canh thang chiết xuất
mạch nha 5%) trong 2-3 ngày ở 25 °C. Các tế bào nấm men thu được sau đó
được quan sát để tìm hình dạng và bào tử, tức là chúng tồn tại đơn lẻ, ghép đôi
hay tập hợp lại thành từng cục lớn. Chiều dài và chiều rộng trung bình 20 tế
bào từ mỗi dòng phân lập được đo. Hình thái khuẩn lạc của mỗi dòng nấm men
được phân lập được kiểm tra trong các mẫu cấy được nuôi trong môi trường
đặc (thạch chiết xuất mạch nha 5%) ở 25 °C. Các đặc điểm của việc cấy nấm
men trên đĩa, tức là màu sắc, kết cấu được ghi lại từ 3-7 ngày sau khi ủ. Sinh lý
học đặc điểm của chất đối kháng nấm men được xác định bởi phát hiện khả
năng của chúng để lên men một số loại đường bán kỵ khí và đồng hóa nhiều
loại hợp chất cacbon như nguồn cacbon chính trong điều kiện hiếu khí. Những
bài kiểm tra này được lặp lại ba lần cho mỗi chủng. Kết quả trên các đặc điểm
hình thái và sinh lý đã được sử dụng trong xác nhận xác định nấm men bằng
rDNA kỹ thuật giải trình tự.
2.8. Thử nghiệm kiểm soát sinh học bằng thử nghiệm trong các tế bào còn
sống
Việc sàng lọc các phân lập nấm men để có hiệu quả kiểm soát sinh học là
cũng được thực hiện bằng cách sử dụng các thử nghiệm trong các tế bào còn
sống (Dan và et al., 2003). Ớt trái cây (không có vết thương hoặc sẹo trên bề
mặt) chưa được điều trị trường đã được chọn cho các thử nghiệm. Chúng được
khử trùng bề mặt bằng 0,5% NaCl trong 5 phút và sau đó rửa sạch bằng nước
máy. Sau khi làm khô bằng không khí, quả ớt được xử lý với 70% etanol. Mỗi
quả bị thương bằng cách sử dụng một con sâu đục trái vô trùng (đường kính 6
mm và sâu 1 mm), một quả vết thương mỗi quả.
Bốn chủng nấm men phân lập có khả năng kiểm soát sinh học cao hiệu
quả, được lựa chọn dựa trên dữ liệu từ các thử nghiệm trong ống nghiệm, được
nuôi cấy ở NYDB. Các tế bào được thu thập bởi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng /
phút trong 20 phút. Tế bào nấm men đã rửa hai lần với DIW và tiếp tục lại
trong DIW. Sau đó 20 µl huyền phù tế bào của mỗi chủng nấm men ở nồng độ
5 × 109 tế bào ml-1 được áp dụng cho vết thương 30 ớt trái khử trùng bề mặt.
Sau 1-2 giờ để men tế bào thâm nhập vào vết thương, 20 µl C. capsici nồng độ
5 × 104 bào tử ml-1 đã được thêm vào vết thương. Trái ớt được cho vào khay
nhựa nhiệt dẻo và được bảo quản trong tủ thông gió (95% RH) trong bóng tối ở
28 °C. Phần trăm tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh, như được
chỉ ra bởi vết thương tăng lên đường kính (đường kính vết bệnh) được ghi lại 5
ngày sau khi bảo quản. Khả năng giảm tỷ lệ mắc bệnh của các loại nấm men
này các chủng đã được so sánh. Để kiểm soát, trái ớt bị thương chỉ được cấy C.
capsici. Có ba lần lặp lại 30 trái ớt bị thương cho mỗi lần điều trị. Toàn bộ thí
nghiệm đã được tiến hành ba lần.
2.9. Ảnh hưởng của nồng độ và bảo quản tế bào nấm men nhiệt độ về hiệu
quả kiểm soát sinh học
Ba mươi trái ớt bị thương được sử dụng cho mỗi thí nghiệm về hiệu quả
kiểm soát sinh học ở các nồng độ khác nhau của bốn chủng nấm men đối
kháng. Các vết thương đã được cấy với 20 µl mỗi dòng nấm men đối kháng
phân lập ở nồng độ 5 × 106 , 5 × 107 , 5 × 108 , và 5 × 109 tế bào ml-1 được đếm
bằng máy đo huyết cầu. Sau làm khô không khí trong 1-2 giờ, 20 µl C. capsici
ở nồng độ trong tổng số 5 × 104 , 5 × 105 và 5 × 106 bào tử ml-1 đã được thêm
vào từng vết thương. Những trái ớt được đặt trên khay nhựa được bọc bằng
nhựa nhiệt dẻo (95% RH) và được bảo quản trong tủ thông gió trong bóng tối ở
28 °C trong 5 ngày trước việc đo lường tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm
trọng.
Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến hiệu quả kiểm soát sinh
học, 30 quả ớt bị thương đã được cấy với 20 µl của 5 × 108 tế bào ml-1 huyền
phù tế bào nấm men. Sau 1–2 giờ, 20 µl trong số 5 × 104 bào tử ml-1 C. capsici
là áp dụng như mô tả ở trên. Tỷ lệ bệnh đã được ghi nhận 5 ngày sau khi ủ ở
18, 23, 28 và 33 °C.
Là đối chứng dương tính và âm tính đối với 0 và 100% nhiễm trùng trong
tất cả các xét nghiệm trong các tế bào còn sống, 20 µl nước cất vô trùng và
huyền phù bào tử của C. capsici (20 µl của 5 × 104 , 5 × 105 , và 5 × 106 bào tử
ml-1 ) đã được thêm vào vết thương. Mỗi lần điều trị được thực hiện trong ba
lần 30 những trái ớt bị thương và toàn bộ thí nghiệm đã lặp lại ba lần. Dữ liệu
được chuyển thành phần trăm hiệu quả kiểm soát sinh học (BC) và tỷ lệ mắc
bệnh (DI) theo công thức:% BC = [(T A) / T] × 100, trong đó T là số vết
thương bị nhiễm trùng được cấy vào C. capsici, và A là số vết thương bị nhiễm
trùng được cấy (các) chất đối kháng và mầm bệnh. Các tỷ lệ mắc bệnh,% DI =
(A / T) × 100.
2.10. Kiểm soát dịch bệnh sau thu hoạch
Những trái ớt còn nguyên vẹn (không nhìn thấy vết thương hoặc vết sẹo
trên bề mặt) từ những vườn chưa được xử lý đã được rửa sạch bằng nước máy.
Họ đã được kiểm tra để bảo quản bởi bốn đối kháng chủng nấm men so với xử
lý nước và xử lý hóa chất. Mỗi nhóm 30 mẫu trái cây được phun kỹ với 300 ml
5 × 108 tế bào ml-1 trong số từng huyền phù tế bào nấm men trong nước cất. Hai
nhóm còn lại được phun lần lượt với 300 ml nước cất và nước clo (200 ppm
clo). Trái cây được làm khô bằng không khí và được đặt trên khay nhựa bọc
với nhựa nhiệt dẻo. Tất cả các mẫu được giữ trong tủ ấm ở 28 °C trong 1-2 giờ
sau đó được bảo quản ở 10 °C (95% RH) trong bóng tối. Tỷ lệ mắc bệnh ở mỗi
nhóm được ghi lại ở các khoảng thời gian khác nhau, tức là 15, 30 và 45 ngày.
Mỗi lần điều trị được thực hiện trong ba lần đối với 30 trái ớt bị thương và toàn
bộ thí nghiệm đã được tiến hành ba lần.
2.11. Phân tích thống kê
Phân tích dữ liệu về tỷ lệ mắc bệnh, hiệu quả kiểm soát sinh học của nấm
men và đường kính tổn thương được thực hiện bằng cách sử dụng quy trình mô
hình tuyến tính (GLM) của phần mềm SPSS (phiên bản 10.0 dành cho
Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Ít nhất kiểm tra sự khác biệt có ý
nghĩa (LSD) ở P <0,05 được sử dụng cho có nghĩa là tách biệt.
3. Kết quả
3.1. Sàng lọc các chất đối kháng nấm men
Một thí nghiệm sơ bộ cho thấy C. capsici ở nồng độ từ 5 × 102 đến 5 ×
104 bào tử ml-1 gây ra đường kính tổn thương từ 6,7 - 15,8 mm. Nồng độ bào tử
trên 5 × 104 bào tử ml-1 không tạo ra sự gia tăng đáng kể về đường kính vết
bệnh (dữ liệu không được hiển thị). Như vậy nồng độ nấm của 5 × 104 bào tử
ml-1 đã được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
Sàng lọc sơ cấp 225 mẫu cấy nấm men được phân lập từ 11 các loài trái
cây và rau quả bằng khả năng chống lại sự xâm nhập của nấm trên kỹ thuật
nuôi cấy đĩa dẫn đến chỉ có 54 phân lập dương tính. Tất cả các phân lập này
đều thu được từ 11 loài với nhau. Sàng lọc thứ cấp của những phân lập cho
hiệu quả kiểm soát sinh học chống lại sự phát triển của C. capsici sử dụng thử
nghiệm giếng (Phần 2.5) cho thấy chỉ có bốn nấm men các chủng có hiệu quả
trong việc ức chế sự phát triển của C. capsici, tức là, không có sợi nấm phát
triển trên các tấm PDA như được quan sát dưới đây kính hiển vi (dữ liệu không
được hiển thị). Trong bốn loại men này các chủng, hai được phân lập từ chôm
chôm, đây là được chỉ định R13 và R6 và hai chủng khác từ màu đỏ cà tím và
nhãn, ER1 và L2, tương ứng. Này bốn chủng nấm men đã được kiểm tra thêm
để xác nhận tiềm năng của chúng trong việc kiểm soát bệnh thán thư hại ớt do
C. capsici.
3.2. Xác định các chất đối kháng nấm men
*Bảng 1 Tỷ lệ phần trăm nhận dạng giữa các đoạn DNA được tính toán
bằng chương trình BLAST và các trình tự được so sánh với trình tự từ NCBI
cơ sở dữ liệu.
Vùng của gen rDNA được sử dụng để xác định.*
Các chủng nấm men R13, R6, ER1 và L2 với khả năng kiểm soát sự phát triển
của C. capsici trong các thử nghiệm in vitro đã được tìm thấy khác nhau về đặc
điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào như trong Bảng 1. Mỗi chủng được phân
tích 26S (Vùng D1 / D2). Phân tích trình tự của đơn vị con lớn (26S) gen DNA
ribosome của các chủng nấm men R6, ER1, và L2 cho thấy sự đồng nhất cao
với những con của Candida musae, Issatchenkia orientalis và Candida
quercitrusa, tức là 97%, 99% và 99%, tương ứng (Bảng 1). Tuy nhiên, việc xác
định R13 bằng phân tích tiểu đơn vị lớn 26S rDNA cho thấy 99% đồng nhất
với P. guilliermondii, Candida fukuyamaensis, và Candida xestobii (không có
trong Bảng 1). Vì vậy, tiểu đơn vị nhỏ của rDNA 5,8S (vùng TSI1 / TSI4)
được tiếp tục sử dụng để nhận dạng hiệu quả hơn (Kurtzman, Năm 1992;
Martorell và et al, 2005). Kết quả cho thấy 98% sự đồng nhất của R13 với P.
guilliermondii (Bảng 1). Kết quả của đặc điểm sinh lý của các chủng nấm men
theo các thử nghiệm lên men và đồng hóa (Bảng 2) đồng ý với dữ liệu của phân
tích rDNA (Bảng 1). Các mô hình khác nhau của quá trình lên men và đồng
hóa carbon của R13, R6, ER1 và L2 như trong Bảng 2 chỉ ra rằng R13 có thể
sử dụng nhiều nguồn carbon hơn những nguồn khác, trong khi ER1 được sử
dụng rất ít nguồn carbon trong hệ thống này.
3.3. So sánh hiệu quả kiểm soát sinh học in vivo của bốn chủng nấm men
đối kháng
Hiệu quả kiểm soát sinh học của bốn loại nấm men đối kháng các chủng
đã được xác nhận bằng cách sử dụng thử nghiệm trong các tế bào còn sống,
hoặc bằng đã chứng minh khả năng giảm tỷ lệ bệnh trên cây ớt trái cây. Kết
quả trong Bảng 3 cho thấy chủng R13 có hiệu quả kiểm soát sinh học cao nhất
là 93,3%, hoặc tỷ lệ mắc bệnh chỉ 6,7%. Các chủng nấm men R6, ER1 và L2
cho thấy hiệu quả kiểm soát sinh học tương ứng là 83,1%, 76,6% và 66,4%.
Hơn nữa, bốn chất đối kháng nấm men có hiệu quả đáng kể (P <0,05) trong
việc giảm đường kính của tổn thương do C. capsici, tức là từ 15,4 mm ở C.
capsici nhiễm trùng đến 6,7, 7,8, 9,1 và 10,3 mm khi điều trị bằng R13, R6,
ER1 và L2 tương ứng (Bảng 3).
3.4. Ảnh hưởng của nồng độ nấm men đối kháng đến bệnh điều khiển
 Kết quả thử nghiệm các nồng độ khác nhau của bốn các chủng nấm men
chống lại C. capsici ở các nồng độ khác nhau cho thấy rằng chủng nấm men
R13 có hiệu quả hơn ba chủng khác (R6, ER1 và L2) trong việc giảm bệnh tỷ
lệ mắc ở tất cả các nồng độ được kiểm tra (Hình 1). Khi nhiễm 5 × 106 bào tử
ml-1 của C. capsici, tỷ lệ bệnh đã giảm từ 23,3% xuống 10,5% theo nồng độ của
tế bào R13 tăng từ 5 × 106 lên 5 × 108 tế bào ml-1. Tuy nhiên, các chủng R6,
ER1 và L2 đã giảm tỷ lệ mắc bệnh xuống các mức độ thấp hơn, tức là từ 25,8%
xuống 15,6%, 28,2% xuống .Lần lượt là 17,9% và 33,5% đến 22,5%. Nhóm
kiểm soát chỉ với C. capsici (5 × 104–5 × 106 bào tử ml-1 ) sự nhiễm trùng cho
thấy tỷ lệ mắc bệnh là 100% (dữ liệu không được hiển thị). Ở nồng độ C.
capsici thấp hơn là 5 × 105 và 5 × 104 bào tử ml-1 , tỷ lệ mắc bệnh giảm từ 20%
lên 6,7% và 13,3% lên 6,5% khi R13 tăng từ 5 × 106 đến 5 × 108 ô ml-1 (Hình.
1A). Tuy nhiên, việc tăng nồng độ của chủng nấm men R13 từ 5 × 108 đến 5 ×
109 tế bào ml-1 không làm giảm nhiều hơn tỷ lệ mắc bệnh do 5 × 106–5 × 109
bào tử ml-1 của C.capsici. Các phát hiện tương tự cũng được quan sát thấy ở
các chủng nấm men R6, ER1 và L2 mặc dù mức độ giảm bệnh nhỏ hơn (Hình
1B – D).
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến việc kiểm soát bệnh bằng nấm men đối
kháng
Chủng nấm men R13 vượt trội đáng kể so với chủng khác ba chủng nấm
men để giảm tỷ lệ mắc bệnh ở tất cả nhiệt độ (18–33 °C) được thử nghiệm
trong khoảng thời gian 5 ngày (Hình 2). Tác dụng đối kháng của bốn chủng
nấm men có liên quan tỷ lệ nghịch với nhiệt độ bảo quản. Kiểm soát sinh học
hiệu quả hơn ở 18 °C so với ở 23, 28 và 33 °C. Tỷ lệ mắc bệnh ở R13 điều trị
là 1,1%, 3,3%, 6,7% và 10,0% ở 18, 23, 28, và 33 °C, tương ứng. Ở 33 °C, tỷ
lệ mắc bệnh ở nghiệm thức R13 thấp hơn khoảng 2, 4 và 5 lần so với của các
nghiệm thức R6, ER1 và L2. Kiểm soát chỉ với cấy C.capsici cho thấy tỷ lệ
bệnh là 100% ở nhiệt độ lưu trữ 18–33 °C (dữ liệu không được hiển thị).
3.6. Kiểm soát bệnh sau thu hoạch bằng thuốc kháng nấm men
*Bảng 2 +, Phản ứng dương tính; , phản ứng tiêu cực; v, phản ứng biến
đổi; s, phản ứng tích cực nhưng chậm; / s, phản ứng tiêu cực hoặc tích cực
nhưng chậm; l, phản ứng tiềm ẩn (nhanh chóng phát triển một phản ứng tích
cực sau một giai đoạn trễ); / l, phản ứng tiêu cực hoặc tiềm ẩn; NL, kết quả thử
nghiệm không được liệt kê bởi Kurtzman và Fell (1998).*
* Bảng 3: a% Tỷ lệ bệnh = (A / T) × 100 và% Hiệu quả kiểm soát sinh
học = [(T A) / T] × 100, trong đó T là số vết thương bị nhiễm bệnh của quả ớt
được cấy chỉ với Colletotrichum capsici (đối chứng), và A là số vết thương bị
nhiễm bệnh của quả ớt được cấy cả thuốc đối kháng nấm men và C. capsici.
Các kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của ba thí nghiệm độc
lập ± sai số tiêu chuẩn. Giá trị của mỗi cột được theo sau bởi một chữ cái khác
nhau cho biết khác biệt có ý nghĩa (P <0,05) theo thử nghiệm LSD.
b Đường kính tổn thương là chiều dài trung bình của tổn thương theo trục x và
trục y*
Tỷ lệ bệnh trên quả ớt được phun tế bào R13 ít hơn đáng kể so với những
người được điều trị bằng ba các chủng nấm men ở tất cả các thời điểm bảo
quản (15, 30 và 45 ngày) được kiểm tra (Bảng 4). Mặc dù tỷ lệ mắc bệnh tăng
dần theo thời gian bảo quản ở tất cả các nghiệm thức, nhưng nghiệm thức R13
có hiệu quả hơn so với xử lý nước khử trùng bằng clo ở 30 và 45 ngày lưu trữ.
Tỷ lệ bệnh trên quả ớt được phun huyền dịch tế bào R13 và nước clo là 13,3%
và 16,7%, 16,7% và 20,0% ở 30 và 45 ngày lưu trữ, tương ứng (Bảng 4). Trong
tất cả các trường hợp, tỷ lệ mắc bệnh sau khi điều trị bằng men và hóa chất ít
hơn đáng kể so với khi rửa bằng chỉ nước cất.
*Fig. 1 Ảnh hưởng của nồng độ men đến giảm tỷ lệ bệnh (thán thư) trên
quả ớt. Ba mươi trái cây bị thương được cấy với 20 µl của chất đối kháng nấm
men: Pichia guilliermondii R13 (A), Candida musae R6 (B), Issatchenkia
orientalis ER1 (C), và Candida quercitrusa L2 (D) ở nồng độ trong tổng số 5 ×
106 , 5 × 107 , 5 × 108 và 5 × 109 ô ml-1 . Sau khi làm khô bằng không khí, quả
được cấy 20 µl Colletotrichum capsici ở các nồng độ khác nhau: 5 × 106 bào tử
ml-1 , 5 × 105 bào tử ml-1 , và 5 × 104 bào tử ml-1 . Dữ liệu được ghi lại 5 ngày
sau khi lưu trữ ở 28 °C. Các thanh đại diện cho phương tiện của ba thí nghiệm
độc lập ± sai số tiêu chuẩn. Các chữ cái trên đầu mỗi thanh cho biết kết quả của
xét nghiệm LSD (P <0,05). Giá trị được chia sẻ các chữ cái trong cùng một đồ
thị không khác nhau đáng kể. Việc kiểm soát chỉ với nhiễm C. capsici thì tỷ lệ
mắc bệnh là 100%).
4. Thảo luận
Nghiên cứu này chứng minh rằng bốn loại nấm men biểu sinh (chủng P.
guilliermondii R13, chủng C. musae R6, I. orientalis chủng ER1 và chủng C.
quercitrusa L2) được phân lập từ rau quả làm giảm tỷ lệ bệnh trên quả ớt do C.
capsici gây ra ở các mức độ khác nhau. P. guilliermondii chủng R13 có hiệu
quả kiểm soát sinh học cao nhất, cả hai trong các tế bào còn sống và trong các
môi môi trường nhân tạo (Hình 1 và 2; Bảng 3). Hoạt động đối kháng của bốn
chủng nấm men phụ thuộc vào năm, ban đầu nồng độ và mức độ tập trung của
bệnh (Hình 1 và 2). Tỷ lệ bệnh trên những trái ớt bị nhiễm C. capsici có thể
giảm xuống còn 6,5% bởi chủng nấm men R13, trong khi ba chủng còn lại làm
giảm tỷ lệ mắc bệnh xuống một mức độ thấp hơn (Hình 1A – D). Trong tất cả
bốn chủng nấm men, thấp hơn tỷ lệ mắc bệnh được quan sát ở nhiệt độ bảo
quản thấp nhất được thử nghiệm (Hình 2). Điều này không có gì đáng ngạc
nhiên vì phạm vi nhiệt độ có lợi nhất cho C. capsici bào tử đính sự nảy mầm và
sự phát triển của bệnh đã được chứng minh là ở 28–33 °C (Misra và Mahmood,
1960). Sau khi thu hoạch, trái ớt nên được giữ ở nhiệt độ thấp hơn để giữ được
các phẩm chất như màu sắc, kết cấu, độ tỷ lệ mắc bệnh (Agblor và Waterer,
2001). Vì lý do này, phạm vi nhiệt độ thấp hơn 18–20 °C đã được sử dụng
trong một số nghiên cứu về hiệu quả của các chủng nấm men khác nhau (Arras
and et al., 1999; Droby and et al., 1997; Lima and et al., 1999). Xem thêm về
văn bản nguồn này. Nhập văn bản nguồn để có thông tin dịch thuật bổ sung.
Chủng nấm men hiệu quả nhất R13 này đã được xác định thành công là
P. guilliermondii bằng cách sử dụng tiểu đơn vị nhỏ hơn, 5,8S rDNA (ITS1 /
ITS4), nhưng không phải bằng 26S rDNA (D1 / D2). Tuy nhiên, đơn vị phân
loại 26S rDNA (D1 / D2) này của P. guilliermondii và các đơn vị phân loại liên
quan có thể không giúp phân biệt loài do có khả năng mạnh mẽ rằng rDNA
D1 / D2 trình tự và các đặc điểm khác có thể quá bảo thủ để mô tả các loài
trong dòng (Suh và Blackwell, 2004). Martorelland et al., (2005) đã gợi ý rằng
việc không mã hóa các vùng đệm được phiên mã bên trong (ITS) biểu hiện lớn
hơn sự khác biệt giữa các đặc hiệu so với gen rRNA 26S (Cai and et al., Năm
1996; Kurtzman, 1992), do đó cho phép phân biệt của các loài có quan hệ họ
hàng gần.
*(Fig.2) Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ bệnh đến tỷ lệ bệnh Bệnh thán thư
(thán thư) trên quả ớt. Ba mươi quả bị thương là được cấy với 20 µl chất đối
kháng nấm men: Pichia guilliermondii R13 (d), Candida musae R6,
Issatchenkia orientalis ER1 (m) và Candida quercitrusa L2 (j) ở nồng độ 5 ×
108 tế bào ml-1 . Sau khi làm khô bằng không khí, những trái cây được cấy với
20 µl Colletotrichum capsici tại nồng độ 5 × 104 bào tử ml-1 , và sau đó được ủ
ở 18, 23, 28, và 33 °C. Dữ liệu được ghi lại 5 ngày sau khi ủ. Thanh đại diện
sai số chuẩn của giá trị trung bình của các thí nghiệm ba lần. Kiểm soát chỉ với
Nhiễm C. capsici dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh 100% ở mọi nhiệt độ thử nghiệm.*
Một số loại nấm men đối kháng trước đây đã được phân lập từ trái cây và rau
quả và được sử dụng hiệu quả như tác nhân kiểm soát sinh học. Issatchenkia
orientalis chủng 16C2 và 2C2 phân lập từ quả nho (Vitis vinifera L. cv.
Negroamaro) có hiệu quả trong việc giảm sự xâm chiếm của Aspergillus
carbonarius (Bainer) Thom. và Aspergillus niger Tiegh. trên quả nho (Bleve
and et al., 2006). C. musae phân lập 18 có đã được chứng minh là có hiệu quả
kiểm soát sinh học đối với Botrytis cinerea Pers.: Fr. nhiễm trùng ở dâu tây
(Fragaria x ananassa Duch. cv. Sweet Charlie) (El-Neshawy và Shetaia,
2003). Một số chủng P. guilliermondii ở các nồng độ tương tự như những gì
được sử dụng trong nghiên cứu này trước đây là được chứng minh là có hiệu
quả kiểm soát sinh học chống lại sự lây nhiễm của các loại nấm khác nhau trên
trái cây họ cam quýt, trái nho, táo, lê, bàn nho và dâu tây (Arras and et al.,
1999; Droby and et al., Năm 1997; Lima and et al., 1999). Tuy nhiên, không có
báo cáo về việc sử dụng P. guilliermondii để kiểm soát C. capsici trên ớt trái
cây. Nghiên cứu này đưa ra bằng chứng đầu tiên cho thấy chủng P.
guilliermondii R13 có thể làm giảm tỷ lệ mắc bệnh do C. capsici thấp tới 6,5%
(Hình 1 và Bảng 3) trong các điều kiện tương tự như các cuộc điều tra khác
(Arras và cộng sự, 1999; Droby và cộng sự, 1997; Lima and et al., 1999).
Strain R13 giúp ích để trì hoãn sự thối rữa sau thu hoạch của những trái ớt còn
nguyên vẹn. Tỷ lệ bệnh trên trái ớt được xử lý R13 là khoảng hai lần thấp hơn
so với những người không được điều trị (Bảng 4). Cai khac các chủng nấm
men, tức là R6, ER1 và L2 mặc dù có thể trì hoãn phân rã sau thu hoạch, nhưng
ở mức độ thấp hơn. Kết quả gợi ý rằng chủng P. guilliermondii R13 có tiềm
năng cao trở thành tác nhân kiểm soát sinh học trong việc kiểm soát sau thu
hoạch chống lại Nhiễm C. capsici trên quả ớt.
Pichia guilliermondii đã được chứng minh là không gây bệnh như đã thử
nghiệm trên chuột lang và lợn Thụy Sĩ lai chuột (Arras and et al., 1999, 2002).
Sản xuất quy mô lớn P. guilliermondii đã được thực hiện một cách hiệu quả
bằng cách sử dụng quá trình lên men bằng vật liệu phế thải công nghiệp rẻ tiền
(Janisiewicz và Korsten, 2002). Các loại men kết quả đã duy trì hoạt động đối
kháng chống lại sự nảy mầm của bào tử Penicillium digitatum (Pers: Fr.) Sacc.
Nó cũng hiệu quả ức chế sự thối rữa của một số giống cây có múi, cả hai đều bị
thương và không bị thương. Mức độ ngăn ngừa bệnh sau thu hoạch của nấm
men có thể so sánh với một loại sáp được sử dụng phổ biến có chứa hàm lượng
hóa chất diệt nấm thấp. Trong ngoài ra, kết hợp men với 200 ppm
thiabendazole (TBZ) dẫn đến giảm tỷ lệ phân rã thành mức tương đương với
mức đối xử thương mại đối với 2000 ppm TBZ. Hiệu quả của chủng P.
guilliermondii US-7 được duy trì trong điều kiện nhà đóng gói tại một nồng độ
tế bào thấp tới 107 tế bào ml-1 , hoặc bằng cách tưới đẫm nước hoặc phun
(Droby and et al., 1993). Những kết quả này gợi ý khả năng sử dụng chủng P.
guilliermondii R13 như một chất kiểm soát sinh học thương mại để ngăn chặn
bệnh thán thư do C. capsici.
Quả ớt sau thu hoạch thường được bảo quản bằng cách rửa hoặc phun
bằng nước clo ở 75-400 ppm clo và được bảo quản ở nhiệt độ thấp (7–10 °C)
trước khi vận chuyển (Smith and et al., 1998; Suslow, 1997). Tuy nhiên,
nghiên cứu hiện tại cho thấy P. guilliermondii chủng R13 có hiệu quả hơn
trong việc bảo quản trái ớt so với nước được khử trùng bằng clo (200 ppm clo)
ở 10 °C trong khoảng thời gian 30 và 45 ngày (Bảng 4). Điều này cho thấy
rằng chủng P. guilliermondii R13 nên thay nước đã khử trùng bằng clo để xử
lý. Các chuẩn bị nước clo từ khí clo được sử dụng như vậy hoặc clo sinh ra từ
muối hypoclorit có thể có hại cho người lao động (Da¨net, 2005). Hơn nữa, sử
dụng clo trong trái cây và rau quả bị cấm ở một số các nước do phản ứng của
nó với chất hữu cơ dẫn đến hình thành các hợp chất clo: một số các dẫn xuất đã
được chứng minh là có thể gây ung thư (Camelo, Năm 2004; Carlsen, 2004).
Sự tích lũy các chất này cũng gây ô nhiễm môi trường (Link et al., 1994;
Smith, 2001; Stringer và Johnston, 2002). Này những phát hiện cung cấp một
động lực mạnh mẽ để phát triển chủng nấm men R13 thay thế để kiểm soát
bệnh thán thư do C. capsici trên quả ớt sau thu hoạch. Tuy nhiên, cần nhiều
nghiên cứu hơn bao gồm các thử nghiệm thực địa đã thực hiện.
*Bảng 4: a Các kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của ba
thí nghiệm độc lập ± sai số tiêu chuẩn. Giá trị của mỗi cột được theo sau bởi
một chữ cái khác nhau cho biết khác biệt có ý nghĩa (P <0,05) theo thử nghiệm
LSD. Giá trị của thư chia sẻ không khác biệt có ý nghĩa (P <0,05).*
Phương thức tác động của P. guilliermondii chống lại sự lây nhiễm P.
digitatum và B. cinerea trên trái cây đã được đề xuất cạnh tranh về chất dinh
dưỡng và sự bài tiết của các enzym phân giải mã tế bào (Droby và cộng sự,
1989, 1990; Mari và Guizzardi, 1998; Wisniewski and et al., 1990). Những
kiểm soát các cơ chế được chấp nhận để sử dụng trong kiểm soát sinh học nấm
mốc trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi vì chúng không liên quan đến việc
tiết ra chất kháng sinh có nguy cơ gây hại. Sơ bộ kết quả cho thấy tác dụng
tương tự của R13 đối với các chủng P. guilliermondii khác. Do đó, kết quả của
chúng tôi sẽ khuyến khích việc sử dụng của P. guilliermondii trên quy mô lớn
để kiểm soát sinh học đối với ớt sau thu hoạch.