I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIN ---------------------

Trn Thy Hng

PHN LP, NGHIN CU C IM SINH HC CA MT S CHNG VI SINH VT C KH NNG TO MNG SINH VT (BIOFILM) VIT NAM

LUN VN THC S KHOA HC

H Ni 2011

I HC QUC GIA H NI TRNG I HC KHOA HC T NHIN ---------------------

Trn Thy Hng

PHN LP, NGHIN CU C IM SINH HC CA MT S CHNG VI SINH VT C KH NNG TO MNG SINH VT (BIOFILM) PHN LP VIT NAM

Chuyn ngnh: Sinh hc thc nghim M s: 60 42 30

LUN VN THC S KHOA HC

NGI HNG DN KHOA HC: TS. NGUYN QUANG HUY

H Ni - 2011

Phn lp, nghin cu c im sinh hc ca mt s chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt (biofilm) phn lp Vit Nam
1. t vn
Mng sinh vt l tp hp cc qun x vi sinh vt bm dnh v pht trin trn b mt cc mi trng khc nhau thng qua mng li cht ngoi bo do chnh chng to ra v l mt hin tng ph bin trong t nhin. Cc vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt ng vai tr quan trng trong cc chu trnh dinh dng cng nh trong x l nhim mi trng. Thm vo , s to thnh mng sinh vt ca cc chng vi sinh vt cn gp phn kim sot s xm nhim ca cc tc nhn gy hi cy trng, lm gim s n mn kim loi v s ph hy nhng hp kim khc.

2. Nguyn liu v phng php

Cc vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt c phn lp t mu nc thi cc khu vc lng ngh H Ni v Hng Yn theo phng php nui cy lm giu. Cc chng vi sinh vt phn lp c th nghim hot tnh to thnh mng sinh vt nh phng php nhum tm kt tinh. Cc chng c kh nng to mng sinh vt c nui cy trong mi trng khong ti thiu c b sung ngun cacbon, nit khc nhau v nui cy trong mi trng LB lng cc iu kin nhit , pH khc nhau kho st nh hng ca cc yu t mi trng ln s to thnh mng sinh vt ca cc chng phn lp. Cc chng phn lp c th nghim kh nng to cht hot ng b mt thng qua ch s nh tng ha E24. Cc chng c kh nng to mng c nghin cu kh nng khng khun theo phng php ca De Angelis v cng s. ng thi cc chng ny c nui cy trn cc b mt vt liu mi trng khc nhau quan st cc dng mng. Cui cng, chng ti tin hnh phn tch c im hnh thi v phn loi cc chng c hot tnh biofilm mnh nht bng phng php nhum Gram v phn tch gen 16S rDNA.

3. Kt qu v tho lun
3.1 Phn lp, tuyn chn cc chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt 3.1.1 Phn lp vi sinh vt T mu nc thi cc khu vc nhim lng ngh H Ni v Hng Yn, chng ti phn lp c 75 chng vi sinh vt, trong 23 chng vi sinh vt thu c t mu nc thi khu vc lng ngh min Li Trch; 25 chng vi sinh vt thu c t mu nc thi nh my sn xut bia v 27 chng vi sinh vt phn lp c t mu nc thi lng bn Ph . Trong , cc chng vi sinh vt phn lp c ch yu t khu vc nc thi tng gia v tng y. iu ny ph hp vi gii thch v kh nng bm dnh ca cc chng vi sinh vt cc phn nc ny. y l khu vc t c s bin ng v xo trn v dng chy; ng thi cng l ni tp trung nhiu ngun dinh dng thun li cho s tng trng v pht trin ca vi sinh vt.

Hnh 1. Khun lc mt s chng vi sinh vt phn lp trn mi trng thch

3.1.2 Kh nng pht trin v to mng sinh vt ca cc chng phn lp nh gi s pht trin v to mng sinh vt ca cc chng vi sinh vt phn lp t ngun nc thi lng ngh min Li Trch, chng ti nhn thy: Trong mi trng nui cy iu kin tnh, kh nng hp th nh sng bc sng 620 nm (OD620) c trng cho mt t bo sng tri ni gim thp, trong khi kh nng hp th nh sng bc sng 570 nm (OD570) c trng cho mt t bo trong cu trc mng sinh vt tng ln ng k. Trong s , c 2 chng vi sinh vt to mng tt nht m chng ti la chn thc hin cc th nghim tip theo l M1.10 v U1.3. Kt qu nh gi tng t c chng ti thc hin vi cc chng vi sinh vt phn lp t ngun nc thi nh my sn xut bia - Vin Cng nghip Thc phm v lng ngh bn Ph . i vi mu nc thi nh my sn xut bia, chng ti thu c kh nhiu chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt tt; trong 3 chng c hot tnh to mng tt nht c chng ti la chn s dng trong cc th nghim tip theo l A3.3, M3.8 v U3.7. Kt qu th nghim cho thy trong 3 khu vc ly mu th mu nc thi t lng ngh bn Ph chng ti phn lp c nhiu chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt nht v cc chng ny cng c hot tnh to mng cao nht. Trong s , chng ti la chn c 3 chng c kh nng to mng sinh vt tt nht s dng trong cc nghin cu tip theo l M4.3, M4.9 v M4.10. 3.2 Cc yu t nh hng n s to mng sinh vt ca cc chng phn lp 3.2.1 nh hng ca nhit Kt qu kho st nh hng ca nhit n s to thnh mng sinh vt cho thy: Cc chng vi sinh vt c nghin cu hu ht biu hin hot tnh to mng sinh vt mnh nht nhit 37oC. Tuy nhin, 50oC mt s chng nh M1.10, U1.3, M3.8, M4.9 vn c hot tnh to mng sinh vt tng i tt.

Cc kt qu thu c ny cng kh ph hp vi cc kt qu t nghin cu ca Nguyn Quang Huy v cng s. iu ny cho thy rng nhit 37oC thch hp cho nhiu chng vi khun phn lp trong mi trng nhim Vit Nam pht trin v to mng sinh vt. 3.2.2 nh hng ca pH mi trng Kt qu nghin cu cho thy gi tr pH ph hp nht cho s tng trng v to mng sinh vt ca cc chng phn lp l pH7 - pH7,5. Cc kt qu thu c ca chng ti cng ph hp vi cc kt qu ca mt s tc gi trn th gii. Kt qu nghin cu ca Oliveira v cng s cho thy chng vi khun Pseudomonas fluorescens to mng sinh vt ti u mi trng nui cy pH7 [64] cn chng Stenotrophomonas maltophilia to mng sinh vt ti u mi trng pH7,3. Kt qu nghin cu cn cho thy chng M4.9, M4.3 vn to mng sinh vt tt nht tng ng trong mi trng pH8, pH8,5 c chng ti nhn nh l chng vi khun a kim. 3.2.3 nh hng ca ngun cacbon Kt qu thu c bng 2 chng ti nhn nh chng M1.10 thch hp vi vic s dng ngun cacbon l ng galactose, chng M4.10 s dng tt nht ngun cacbon l ng glucose v chng M4.3 s dng ng mannose ti u nht. Cc kt qu ny ph hp vi nh gi ca cc tc gi trong nc nh Nguyn Quang Huy v cng s hay tc gi nc ngoi nh Haggag. Tuy nhin kh nng to mng sinh vt ca cc chng ny trong kt qu nghin cu l khng cao i vi tng loi ng ring bit. Trong s 8 chng vi sinh vt c la chn nghin cu, chng ti nhn thy 4 chng c hot tnh to mng sinh vt cao nht l M3.8, M4.9, U1.3, U3.7; v c 4 chng ny u c kh nng s dng tt c cc loi ng cho s to thnh mng sinh vt vi cc mc khc nhau. 3.2.4 nh hng ca ngun nit Kt qu nghin cu cho thy mt s chng nh U1.3, M3.8, M4.9, M4.10 to mng sinh vt tng i tt vi ngun nit t mui (NH4)2SO4. Kt qu ny tng i ph hp vi nghin cu ca Lee v cng s cho thy chng Aureobasidium pullulans to mng sinh vt tt vi ngun nit t mui (NH4)2SO4. Bn cnh , kt qu nghin cu cng cho thy cao nm men l ngun dinh dng thch hp cho s to thnh mng sinh vt ca nhiu chng phn lp. T kt qu ny chng ti la chn c 4 chng vi sinh vt ln lt k hiu l U1.3, U3.7, M3.8, M4.9 to thnh mng sinh vt tt nht vi nhiu ngun nit khc nhau c b sung vo mi trng nui cy. 3.2.5 nh hng ca gi th 3.2.5.1 Kh nng to mng sinh vt trn b mt cc gi th khc nhau

Kt qu nghin cu cho thy c 4 chng U1.3, U3.7, M3.8, M4.9 u c kh nng to cc dng mng sinh vt trn b mt cc gi th khc nhau nh: Dng mng ni (floating biofilm) c to thnh trn b mt dch mi trng, phn tip xc vi khng kh to thnh mt lp vng ni, mu trng (hnh 2). Hay dng mng bm dnh trn b mt rn m c th y l trn ng eppendorf nha to thnh mt lp mng mu tm bao xung quanh thnh ng (hnh 3).

Hnh 2. Mng ni ca 4 chng vi sinh vt sau 5 ngy nui cy

M3.8

M4.9

U1.3

U3.7

Hnh 3. Mng sinh vt trn b mt nha

3.2.5.2 Cu trc mng sinh vt quan st bng knh hin vi in t qut Quan st cu trc khng gian ba chiu ca mng sinh vt di knh hin vi in t qut (hnh 4) chng ti nhn thy mng sinh vt ca c 4 chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 u c to thnh bi cc vi khun lc, bao quanh l mng li cht ngoi bo.

M3.8

M4.9

U1.3

U3.7

Hnh 4. Cu trc mng sinh vt ca cc chng phn lp ( 1000)

3.3 Mt s c tnh sinh hc v phn loi cc chng vi sinh vt phn lp 3.3.1 Kh nng to cht hot ng b mt Nhm mc ch nh gi kh nng to cht hot ng b mt ca cc chng vi sinh vt phn lp, chng ti tin hnh nghin cu kh nng nh tng ha du n ca chng v thu c kt qu nh hnh 5.

Hnh 5. Kh nng nh tng ha du n ca cc chng vi sinh vt

Kt qu thu c: 4 chng c kh nng nh tng ha du mnh nht l: K hiu chng Ch s nh ha (%) U1.3 74,19 A3.3 80,58 M3.8 80,77 U3.7 67,33

Kt qu nh tng ha du n cho thy mt s chng vi sinh vt c hot tnh hnh thnh mng sinh vt mnh ng thi cng c kh nng to thnh cht hot ng b mt. Cht hot ng b mt sinh hc do vi sinh vt to ra l cht c thnh phn cu trc a dng vi b mt rt hot ng. Bi vy, c mt mi lin h gia s hnh thnh mng sinh vt v kh nng to cht hot ng b mt. Nhiu nghin cu ch ra rng cc phn t cht hot ng b mt c th to iu kin thun li cho s gn kt v pht trin ca cc vi sinh vt trn mt b mt. Bi chng lm gim sc cng b mt v nh tng cng kh nng lan rng v bm dnh ca vi sinh vt, hnh thnh dng mng ni hay dng mng bm dnh vi b mt rn. 3.3.2 Kh nng khng khun
Bng 1: Hot tnh khng khun ca cc chng vi khun nghin cu Hot tnh khng khun (ng knh vng khng khun: mm) E. coli M3.8 M4.9 U1.3 U3.7 7 8 7 3 Vibrio parahaemolyticus 9 10 9 2 Samonella typhi 2 2 2 7 Ralstonia solanacaerum 3 2 3 7 Staphylococcus aureus 2 2 3 8

K hiu chng

Kt qu bng 1 cho thy cc chng M3.8, M4.9, U1.3 c hot tnh khng mnh i vi E. coli v Vibrio parahaemolyticus cn U3.7 c hot tnh mnh i vi 3 chng Samonella typhi, Ralstonia solanacaerum v Staphylococcus aureus. 3.3.3 c im hnh thi phn loi cc chng phn lp c kh nng to thnh mng sinh vt mnh M3.8, M4.9, U1.3, U3.7, chng ti tin hnh quan st hnh dng khun lc v nhum Gram cc chng, kt qu bc u cho thy cc t bo vi khun c dng hnh que ngn, nm ring r nhau, khng xp thnh chui v u thuc nhm vi khun Gram dng (hnh 6).

K hiu

Hnh thi khun lc

Kt qu nhum Gram

M3.8

M4.9

U1.3

U3.7

Hnh 6. Hnh thi t bo cc chng vi khun trong mng sinh vt

3.3.4 Phn loi cc chng vi sinh vt phn lp da trn gen 16S rDNA xc nh phn loi chnh xc ca cc chng vi khun phn lp M3.8, M4.9, U1.3 v U3.7, chng ti tin hnh gii trnh t gen 16S rDNA ca chng. Kt qu hnh 7 cho thy trnh t gen 16S rDNA ca chng M3.8 tng ng 99,9% vi on 16S ca chng Bacillus licheniformis_X68416; tng ng 99,5% vi
9

on 16S ca chng Bacillus aerius_AJ831843. Trnh t gen 16S rDNA ca chng M4.9 tng ng 100% vi on 16S ca chng Bacillus licheniformis_X68416; tng ng 99,6% vi on trnh t 16S ca chng Bacillus aerius_AJ831843.
0.01 26 Bacillus mojavensis_AB021191 61 Bacillus malacitensis_AY603656 59 Bacillus axarquiensis_AY603657 79 Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970 23 Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061 69 Bacillus vallismortis_AB021198 98 100 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 Bacillus nematotocita_AY820954 59 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus sonorensis_AF302118 77 100 M4.9 72 Bacillus licheniformis_X68416 80 M3.8 100 54 Bacillus aerius_AJ831843 100 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus aerophilus_AJ831844 100 Bacillus altitudinis_AJ831842 100 Bacillus pumilus_AY876289 99 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus isabeliae_AM503357 100 100 Bacillus idriensis_AY904033 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus cibi_AY550276 Staphylococcus aureus_X68417

85

Hnh 7. V tr phn loi ca cc chng M3.8, M4.9 vi cc loi c quan h h hng da vo trnh t gen 16S rDNA

Kt qu hnh 8 cho thy trnh t gen 16S rDNA ca chng U1.3 tng ng 99,9% vi on 16S ca chng vi khun Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970 v tng ng 99,8% vi chng Bacillus subtilis_AB042061. Trnh t gen 16S rDNA ca chng U3.7 tng ng 99,8% vi on trnh t 16S ca vi khun Bacillus

10

velezensis_AY603658 nematotocita_AY820954.

tng

ng

99,5%

vi

chng

Bacillus

0.01 54 Bacillus subtilis_AB042061 79 U1.3 Bacillus subtilis subsp spizizenii_ AF074970 Bacillus mojavensis_AB021191 67 Bacillus malacitensis_AY603656 59 72 78 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 99 70 Bacillus nematotocita_AY820954 79 U3.7 82 Bacillus velezensis_AY603658 98 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus licheniformis_X68416 100 Bacillus aerius_AJ831843 99 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus aerophilus_AJ831844 100 Bacillus altitudinis_AJ831842 99 Bacillus pumilus_AY876289 100 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus cibi_AY550276 Staphylococcus aureus_X68417

77

66

100

Hnh 8. V tr phn loi ca chng U1.3 v U3.7 vi cc loi c quan h h hng da vo trnh t gen 16S rDNA

Chi Bacillus c nh gi a phn gm cc chng vi khun khng gy bnh, c kh nng to mng sinh vt cao v ng dng trong nhiu lnh vc. S to thnh mng sinh vt chng Bacillus subtilis ng vai tr quan trng ng dng trong nhiu lnh vc: cng nghip, nng nghip, thc phm, ha m phm. Bng cch to ra hp cht surfactin trong qu trnh to mng sinh vt, B. subtilis gip cc cy trng c kh nng khng li mt s vi khun gy bnh nh Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Kh nng to gramicidin ca chng Bacillus brevis 18-3 c tc dng lm gim ng k tc n mn kim loi bng cch c ch c hai chng vi khun D. orientis v L. discophora SP-6. Mt khc, kh nng to cht hot ng b mt ca cc chng vi sinh vt trong qu trnh to mng cng lm tng mc nh tng ha v to bt trong ch bin thc phm v to nh ha cho cc sn phm m phm. ng thi,

11

c tnh ny cng m ra trin vng mi trong vic ch to cht hot ng b mt sinh hc hot tnh cao t ngun vi sinh vt ng dng cho cng nghip du kh x l cc s c trn du.

4. Kt lun v kin ngh

Kt lun 1. T mu 75 chng vi sinh vt phn lp c t nc thi cc lng ngh Vit Nam, chng ti la chn c 8 chng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 v M4.10 c hot tnh to mng sinh vt cao hn cc chng cn li. 2. Tm chng vi khun phn lp c kh nng sinh trng v to mng sinh vt tt nht 37 C v pH t 7 - 7,5. Trong s cc chng ny, bn chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 c kh nng sinh trng v to mng sinh vt tt nht trong mi trng khong c bn c b sung cc ngun cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) v trong mi trng khong c s c b sung cc ngun nit ((NH4)2SO4, cao nm men) khc nhau. 3. Cc chng M3.8, M4.9 v U1.3 c hot tnh khng mnh i vi E. coli v Vibrio parahaemolyticus, vi ng knh vng khng khun ln lt l 7 mm v 9 mm; 8 mm v 10 mm; 7 mm v 9 mm; trong khi chng U3.7 c hot tnh khng mnh i vi 3 chng Staphylococcus aureus, Samonella typhi v Ralstonia solanacaerum vi ng knh vng khng khun ln lt l 7 mm, 7 mm v 8 mm. 4. Nhng phn tch v c im hnh thi v phn tch gen 16S rDNA ca 4 chng cho php chng ti nhn nh 4 chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 l vi khun Gram dng thuc chi Bacillus. Trong , chng M3.8, M4.9 gn vi loi Bacillus licheniformis; chng U1.3 gn vi loi Bacillus subtilis cn chng U3.7 gn vi loi Bacillus velezensis. Kin ngh Tip tc nghin cu su hn v kh nng to thnh cht hot ng b mt v c tnh khng khun ca bn chng vi khun phn lp M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 ng dng trong cng ngh x l nc thi v trong phng chng dch hi gy bnh trn cy trng. Tm hiu thnh phn protein v vai tr ca s iu ha biu hin gen trong qu trnh to thnh mng sinh vt ca bn chng vi khun phn lp.
o

12