NHUỘM GRAM –

KHÁNG SINH ĐỒ

BS. LÊ THỊ DIỄM

1
 MỤC TIÊU
1) Nhuộm Gram (Gram stain/Gram staining/Gram's method):
Thực hiện được kỹ thuật. Lý giải được kết quả.

2) Kháng sinh đồ: Thực hiện kỹ thuật định tính và đo được sự

nhạy cảm kháng sinh.

3) Chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn, quán triệt tầm quan
trọng của việc rửa tay

2
 QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VI SINH
Chẩn đoán vi sinh
1. Nhuộm Gram
2. Cấy vi khuẩn
3. Định danh bằng các phản ứng
sinh hóa

Bệnh phẩm

Kháng sinh đồ 3
4
 TIỆT TRÙNG QUE CẤY
• Que cấy tiệt trùng trước và sau khi
sử dụng.
• Cách thực hiện:
– Đưa que cấy vào ngọn lửa và
để vòng tròn đầu kim loại chìm
trong nửa trên ngọn lửa;
– Khi vòng tròn nóng đỏ thì đẩy
từ từ lên phía trên để tiệt trùng
phần thân que cấy.
– Để nguội que cấy
 Sử dụng đèn cồn
 Nhiệt độ của đèn cồn 260 – 480oC;
 Vị trí nóng nhất: 2 /3 ngọn lửa (kể
từ dưới lên);
 Lưu ý khi dùng đèn cồn.
 Không cho cồn quá 2/3;
 Không nghiêng hai đèn cồn để châm
lửa cho nhau;
 Tắt đèn bằng cách dùng nắp đậy,
không dùng miệng thổi để tắt đèn 5
 Petri

• Môi trường/medium: agar/broth

6
7
 MỤC TIÊU 1: NHUỘM GRAM

1. NGUYÊN TẮC
2. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ
3. KỸ THUẬT NHUỘM
• Chuẩn bị phết lam
• Quy trình Nhuộm Gram
• Đọc kết quả
4. MỘT SỐ LƯU Ý

8
 GRAM STAINING/ GRAM STAIN
• Phân biệt và phân loại Vi khuẩn thành 2 nhóm GRAM DƯƠNG
VÀ GRAM ÂM dựa trên đặc điểm VÁCH TẾ BÀO vi khuẩn.
– Hình thể của vi khuẩn.
– Tính chất bắt màu của vi khuẩn.
– Cách xắp xếp của vi khuẩn.
– Kích thước của vi khuẩn.
• Một số kỹ thuật nhuộm khác: nhuộm đơn, nhuộm AFB (Ziehl –
Neelsen) nhuộm nóng – nhuộm lạnh, nhuộm huỳnh quang,
nhuộm bạc,….

9
NGUYÊN TẮC

10
11
 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ
Dụng cụ Thuốc nhuộm
▪ Que cấy ▪ DD tím tinh thể Crystal violet/
▪ Đèn cồn/ đèn Bunsen Gentian violet
▪ Lame/ lame - slide ▪ DD iodine/ dd lugol
▪ Bút chì mỡ ▪ Cồn 95% hay hỗn hợp cồn-acetone
▪ Nước cất ( tỉ lệ 3:1)
▪ Chai nhỏ giọt đựng nước muối sinh ▪ DD safranin O 0.5% hay dd carbol
lí/ nước cất fuchsin ( pha loãng 1/10)
▪ Đồng hồ phút

Và MẪU CẦN NHUỘM GRAM

12
https://www.youtube.com/watch?v=4QlimbyuK0M
 CHUẨN BỊ TIÊU BẢN
• Đánh dấu ký hiệu bệnh phẩm ở đầu trái lame, cùng bên
với mặt phết lam
• Đánh dấu khoảng làm tiêu bản đối với bệnh phẩm lỏng:
đường kính khoảng 2cm
• Phết mẫu bệnh phẩm lên lame

13
❑ Môi trường đặc: dùng que cấy chạm
nhẹ bề mặt 1 khúm khuẩn tinh khiết
riêng lẻ → làm huyền dịch với nước cất
→ trải mỏng và phân tán đều
❑ Môi trường lỏng: lấy 1 -2 vòng cấy
• Để khô trong không khí
• Cố định hơi nóng đèn cồn (heat fix).

14
 CÁC BƯỚC NHUỘM

Khi mất màu tím

30-60s 30s – 60s 30s, lưu ý 60s với vk kị khí)
15
THẤM KHÔ

16
 QUAN SÁT DƯỚI KÍNH HIỂN VI
• Kính hiển vi điện tử, vật kính x100, có dầu

Mô tả: hình dạng, cách bắt màu Gram, cách sắp xếp, cấu tạo đặt biệt
nếu có…..
KHÔNG ghi tên khoa học của vi khuẩn vào kết quả khảo sát kính hiển vi
17
 Ví dụ
1. Mẫu bệnh phẩm (specimen): CẤY MÁU (BLOOD CULTURE)
2. Soi nhuộm (smear): Cầu khuẩn Gram dương đứng thành chuỗi, thành cặp.
(Gram-positive cocci arrange in chains and pairs)
3. Định danh (identification): Streptococcus mitis –phương pháp định danh MALDI-TOF
4. Kháng sinh đồ (AST): minh họa

S. aureus 18
 MỘT SỐ LƯU Ý

Gram (+) → Gram (-): Gram (-) → Gram (+):

• Nhuộm với lứa cấy già • Phết quá dày

• Dd gắn màu iodine bị hỏng: nâu → • Heat fix khi phiến phết chưa khô tự nhiên
vàng/không màu • Tẩy màu quá nhanh
• Tẩy màu quá lâu

19
 Nội dung báo cáo mục tiêu 1:
• Tại buổi TH1:
– Mỗi nhóm SV chọn 2 lam tiêu bản quan sát dưới KHV, mô tả và
đưa ra kết luận.

20
 MỤC TIÊU 2: KHÁNG SINH ĐỒ - AST
Antibiotic susceptibility testing/ Antibiotic sensitivity testing

• PP định tính: Phương

pháp khuếch tán kháng
sinh trong đĩa thạch
• PP định lượng (MIC -
minimun inhibitory
concentration): hệ thống
KSĐ tự động, vi pha
loãng, E-TEST
(Epsilometer test)
21
PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN KHÁNG SINH TRONG THẠCH

• Phương pháp Kirby Bauer - Disk diffusion antibiotic sensitivity testing

• Nguyên tắc: thuốc kháng sinh trong đĩa giấy khuếch tán ra xung quanh,
ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Càng xa tâm đĩa nồng độ thuốc
giảm dần.

• Đường kính vùng vi khuẩn bị chặn diễn đạt tính cảm ứng của vi khuẩn
đối với kháng sinh.

• Không có vùng bị chặn → vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh.

22
23
Kỹ thuật kháng sinh đồ
• Chuẩn bị
– Đĩa kháng sinh
– Môi trường
– Độ ẩm
– Dung dịch chuẩn độ đục
– Vi khuẩn thử nghiệm

24
 Kỹ thuật kháng sinh đồ

Dùng tampon vô khuẩn tẩm canh cấy vi khuẩn, ép hết

nước bằng cách đè lên thành ống nghiệm.

25
 Kỹ thuật kháng sinh đồ

• Dàn vi khuẩn lên mặt thạch

• Để đảm bảo vi khuẩn dàn đều từ trái sang phải,
từ trên xuống dưới, xoay hộp thạch 600 tiếp tục
dàn đều, lặp lại 2 lần tương tự. Bước cuối là kéo
tampon vòng quanh rìa hộp thạch.
• Chờ mặt thạch khô (10 - 15 phút)

26
• Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn, các đĩa
kháng sinh cách mép hộp: 15-20mm; cách nhau: 20-24mm
• Lưu ý: đặt nhẹ nhàng bề mặt đĩa tiếp xúc phẳng với mặt
thạch, đã đặt đĩa kháng sinh thì không lấy lên lại.
• Để úp hộp kháng sinh lại và đặt vào ủ cấy ở nhiệt độ và khí
trường thích hợp.
27
Đọc kết quả

28
• Không có vòng vô khuẩn: vk mọc tràn đến mép đĩa
KS → Kháng KS (Resistant).
• Có vòng vô khuẩn → đo đường kính vòng vô khuẩn
(mm) → so sánh với vòng vô khuẩn chuẩn của từng
loại kháng sinh – tác nhân theo CLSI. → Trung gian(
Intermediate)/ Nhạy( Susceptible) 29
 MIC: MINIMUM INHIBITION CONCENTRATION:
MBC: MINIMUM BACTERICIDAL CONCENTRATION:

MIC:
MINIMUM
MBC: MINIMUM INHIBITION
BACTERICIDAL CONCENTRATI
CONCENTRATION: ON:
Nồng độ diệt khuẩn tối nồng độ tối thiểu
thiểu ức chế sự mọc
của vi khuẩn
quan sát bằng
mắt thường
30
 PP VI PHA LOÃNG
• Sp thương mại BMD Thermo Fisher

31
E-test

32
 Hệ thống KSĐ tự động
Loại Card/Vitek2 Thời gian trả
kết quả
GN – trực khuẩn Gram âm 10 giờ
GP – trực khuẩn Gram dương và trực 8 giờ • Vitek 2 Compact
khuẩn
BCL – trực khuẩn bào tử Gram dương 14 giờ
YST – sinh vật giống nấm men 18 giờ
ANC – vi khuẩn kỵ khí 6 giờ
CBC – Corynebacterium spp và các chi 8 giờ
liên quan • BD Phoenix M50
33
 Nguyên tắc: theo dõi sự phát triển vi khuẩn trong các giếng của thẻ bảng,
dùng thiết bị quang học đo sự suy giảm cường độ ánh sáng đi qua các giếng.

34
 Nội dung báo cáo mục tiêu 2:
GHI NHẬN VÀO BÁO CÁO
• Tên khoa học của loại VK thử nghiệm
• Tên kháng sinh đặt trên mặt thạch
• Tại buổi TH2:
– Đo đường kính vô khuẩn (mm)
– Tham chiếu kết quả với CLSI M100
(http://em100.edaptivedocs.net/dashboard.aspx)
– Kết luận

35
 MỤC TIÊU 3
• Chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn, quán triệt tầm
quan trọng của việc rửa tay

36
37
 Nội dung báo cáo
• Buổi TH2: ghi nhận số lượng, tính chất khúm khuẩn trong
– Hộp thạch cấy môi trường
– Hộp thạch cấy tay, trước – sau rửa tay

38
 TÓM LẠI
• Nguyên tắc nhuộm Gram, kỹ thuật và ý nghĩa các hóa
chất
• Lí giải được kết quả nhuộm Gram
• Kỹ thuật làm kháng sinh đồ và lý giải kết quả làm kháng
sinh đồ
• Hiểu được tầm quan trọng của rửa tay vô khuẩn

39
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Các phương pháp nhuộm, Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh y học,
Đại học Y Dược Tp.HCM
2. Chapter 7, Textbook of Diagnostic Microbiology, 5th Edition
3. Part II, General Principles in Clinical Microbiology, Bailey &
Scott’s Diagnostic Microbiology, 13th Edition
4. https://www.youtube.com/watch?v=4QlimbyuK0M

40
THANK YOU

41