Họ và tên: Vũ Thị Liên

Lớp: D11-06
MSV: 1157200139

ĐỀ CƯƠNG KIỂM NGHIỆM 2

1) Cấu tạo cơ bản của máy quang phổ tử ngoại khả kiến
Cấu tạo máy quang phổ:
 Nguồn sáng
 Bộ phận đơn sắc hóa
 Buồng chứa mẫu và cốc đo
 Bộ phận thu nhận và xử lý tín hiệu
a) Nguồn sáng: Đặc điểm của nguồn sáng lý tưởng:
 Cường độ sáng hầu như không thay đổi và đủ mạnh ở mọi bước sóng trong
vùng tử ngoại khả kiến
 Độ nhiễu thấp
 Nguồn sáng cho vùng tử ngoại: đèn deuteri hoặc hydro
 Nguồn sáng cho vùng khả kiến: đèn tungsten
Cần dùng ổn áp để ổn định cường độ sáng của đèn nguồn
b) Bộ phận đơn sắc hóa:
 Cấu tạo:
o Khe vào
o Kính chuẩn trục
o Thiết bị tán sắc: lăng kính hoặc cách tử
 Lăng kính: giá thành rẻ, dễ chế tạo
 Cách tử: kinh phí chế tạo cao, giá thành đắt
Ưu điểm so với lăng kính:
+ Độ phân giải tốt hơn
+ Cho sự tán sắc tuyến tính
+ Độ rộng của giải phố là hằng tính
+ Cơ chế chọn bước sóng đơn giản
o Mặt phẳng hội tụ
o Khe ra
 Vai trò: tạo ra tia sáng gồm các bức xạ có độ đơn sắc cao và cường độ thích
hợp
 c) Buồng chứa mẫu và cốc đo:
 Mẫu phân tích được chứa trong các cốc đo (cuvet)
 Chất liệu làm cốc đo: thủy tinh, thạch anh, nhựa (poly acrylic)
 Cốc đo thông thường có chiều dài quang trình là 1cm.
 Cuvet thạch anh: dùng đo ở vùng tử ngoại và khả kiến (200-700nm)
 Cuvet thủy tinh & plastic: chỉ đo ở vùng khả kiến.
d) Bộ phận thu nhận và xử lý tín hiệu
 Một số loại detector phổ biến
 Detector tế bào quang
 Detector ống nhân quang
 Detector dãy diod, silicon diod.
 Vai trò: xác nhận tín hiệu, chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện

2) Mục đích và cách hiệu chuẩn máy quang phổ

a) Mục đích:
 Xác định độ ổn định, độ đúng, độ chính xác của máy, kiểm tra tình trạng
hoạt động của máy.
 Phát hiện ra những khiếm khuyết của thiết bị.
 Cung cấp các dữ liệu cho người bảo trì để xác định những hỏng hóc của
thiết bị nhằm hỗ trợ trong sửa chữa.
b) Cách hiệu chuẩn máy quang phổ (6 chỉ tiêu) :
 Kiểm tra độ dài sóng:
 Kiểm tra thang độ dài sóng bằng cách sử dụng cực đại hấp thụ của dung
dịch holmi perclorat. Vạch phổ của đèn nguồn hydro hoặc đèn deuterium
và các vạch phổ của đèn hơi thủy ngân
 Giới hạn sai lệch cho phép là ± 1nm ở vùng tử ngoại và ± 3nm ở vùng khả
kiến.
 Kiểm tra độ hấp thụ:
 Kiểm tra độ hấp thụ của dung dịch kali dicromat ở các độ dài sóng chỉ ra
ở bảng sau. Trong bảng mỗi độ dài sóng có 1 giá trị chính xác của độ hấp
thụ riêng A(1%,1cm) và các giới hạn cho phép

Độ dài sóng A(1%, 1cm) Giới hạn cho

(nm) phép
235 124,5 122,9-126,2
257 144,0 142,4-145,7
313 48,6 47,0-50,3
350 106,0 104,9-109,2
  Giới hạn ánh sáng lạc:
 Ánh sáng lạc là ánh sáng không đi vào mẫu thử mà đi thẳng vào detector.
 Ánh sáng lạc có thể được phát hiện ở độ dài sóng đã cho bằng kính lọc thích
hợp, hoặc dung dịch hóa chất thích hợp.
+ VD: độ hấp thụ của dung dịch Kali clorid 1,2% (TT) trong 1 cốc đo quang
trình dài 1cm phải lớn hơn 2,0 ở độ dài sóng 200nm khi so sánh với nước cất.
 Độ phân giải (cho phân tích định tính):
 Khi có quy định trong chuyên luận, tiến hành kiểm tra độ phân giải của máy
như sau: Ghi phổ dung dịch toluene 0,02% ( tt/tt ) trong hexan (TT).
 Giá trị tối thiểu của tỷ số giữa độ hấp thụ ở cực đại 269 nm và độ hấp thụ ở
cực tiểu 266nm được quy định trong chuyên luận riêng (thường là 1,5).
 Độ rộng khe phổ ( cho phân tích định lượng ):
 Để tránh sai số gây ra bởi độ rông khe phổ ,khi sử dụng 1 máy có độ rộng khe
phổ thay đổi ở độ dài sóng đã chọn thì độ rộng khe phổ phải nhỏ so với nửa
độ rộng của băng hấp thụ.
 Nhưng độ rộng này phải đủ lớn để thu được giá trị cao của cường độ ánh sáng
tới I0 và việc thu hẹp độ rộng khe phổ sau đó phải không làm cho độ hấp thụ
đọc được tăng lên.
 Cốc đo (cóng đo)
 Dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005 cm. Khi đã được nạp đầy
đủ cùng 1 dung môi, các cốc đo có ý định sử dụng để chứa dung dịch mẫu thử
và để chứa dung dịch mẫu trắng phải có độ truyền quang như nhau. Nếu tiêu
chuẩn này không được đáp ứng thì cần có sự hiệu chỉnh thích hợp.
 Các cốc đo cần được làm sạch và thao tác thận trọng.

3) Nêu được nguyên nhân và cách giải quyết vấn đề gặp phải trong quá trình sử
dụng máy quang phổ
a) Giá trị độ hấp thụ cao bất thường và không trở về không khi bấm auto
zero
  Nguyên nhân: 1 trong 2 hoặc cả 2 đèn cháy chưa mở
 Khắc phục: mở đèn lên hoặc thay thế đèn nếu cháy
b) Nhiễu đường nền lớn bất thường
Nguyên nhân Khắc phục
Detector kém chạy Gọi nhân viên bảo trì
Đèn nguồn hỏng hoặc hết hạn Thay đèn nguồn
Điện thế cung cấp cho thiết bị quá Dùng ổn áp
thấp
Yếu tố bên ngoài Đặt thiết bị xa các trường điện từ và
nguồn rung lắc
Thiết bị không nối đất Nối đất cho thiết bị
Độ rộng khe sáng nhỏ Tăng độ rộng khe sáng
c) Độ hấp thụ giảm
 Dung môi bay hơi → dùng cốc đo có nắp, đo nhanh
 Xuất hiện bọt khí trong cốc đo → làm đầy cốc đo bằng pipet
d) Độ hấp thụ thay đổi đáng kể giữa các lần đo
 Dùng nhiều cốc đo có độ thấu quang khác nhau → dùng 1 cốc đo cho
các mẫu khác nhau
 Không định hàng cốc đo → sử dụng cốc đo với cùng 1 mặt quay về phía
ánh sáng

4) Nêu được nguyên tắc thử và cách đánh giá của phép kiểm nghiệm theo phương
pháp sinh học
a) Nguyên tắc:
 So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của mẫu thử với mẫu
chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm
b) Đánh giá kết quả:
 Thời gian kéo dài
 Kết quả phụ thuộc nhiều yếu tố ( vi sinh vật, thao tác, điều kiện thí
nghiệm )
 Kết quả được đánh giá bằng thống kê ( thường thì số lượng mẫu n ≥ 6 và
sai số thử nghiệm e ≤ 5% )

5) Nêu được những đặc điểm cơ bản về hình thái, tính chất nuôi cấy của vi khuẩn,
nấm mốc, nấm men
a) Đặc điểm cơ bản về hình thái
 Vi khuẩn:
  Có thể chỉ có 1 tế bào ( chưa có nhân thật ), hình dạng và kích
thước thay đổi theo từng loại ( dài 1-10µm, chiều ngang 0,2 –
10µm )
 Gồm 6 loại: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn,
xoắn khuẩn, xoắn thể
 Gồm 4 pha: pha lag, pha logarit, pha ổn định, pha suy vong
 Đặc điểm của khuẩn lạc vi khuẩn:
o Kích thước nhỏ hơn so với khuẩn lạc vi nấm
o Bề mặt thường ướt, có thể trơn bóng hoặc nhăn nheo
 Nấm men:
 Thường để chỉ nhóm vi nấm có cấu tạo đơn bào và sinh sôi nảy
nở bằng phương pháp nảy chổi
 Hình thái thay đổi phụ thuộc vào loại nấm men, điều kiện nuôi
cấy, tuổi của ống giống → hình thái đa dạng
 Khuẩn lạc gồm nhiều cá thể phát triển từ cơ thể mẹ tạo thành 1
khối, kích thước lớn hơn khuẩn lạc vi khuẩn , bề mặt trơn hoặc
nhẵn, không có sợi
 Nấm mốc ( nấm sợi )
 Cấu tạo dạng sợi ( có vách ngăn hoặc không ), sống hoại sinh,
sinh sản bằng bào tử
 Khuẩn lạc có thể có màu, bề mặt có thể mượt, dạng hạt, sợi hoặc
xốp
 Sinh sản bằng bào tử vô tính hoặc hữu tính. Nấm mốc thường gây
ra các biến đổi về màu sắc, mùi vị, thay đổi chất lượng thuốc
b) Tính chất nuôi cấy:
 Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sự phát triển của VSV:
 Nhiệt độ phát triển: 15-45℃
 Nhiệt độ bị tiêu diệt:
o Tế bào sinh dưỡng: 60℃ /30’
o Bào tử: 120℃ /30’
 Độ ẩm
 Ánh sáng: ánh sáng có thể tiêu diệt vsv 260nm
 Môi trường nuôi cấy VSV:
 Là những chất dinh dưỡng thích hợp, cung cấp các chất cần thiết
cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
 Cần đảm bảo: đủ dinh dưỡng, pH phù hợp và vô trùng
 Gồm 3 loại: tự nhiên, tổng hợp, bán tổng hợp

6) Cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy VSV

 Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ hóa chất:
  Dụng cụ pha chế môi trường tốt nhất là bằng men hoặc thủy tinh.
 Các dụng cụ phải rưa sạch hoặc tiệt trùng nóng trước khi sử dụng.
 Nguyên liệu pha chế môi trường phải đảm bảo chất lượng, hóa
chất phải tinh khiết. nếu là các dạng bột hoặc tinh thể phải khô,
không đổi màu, không chảy nước.
 Bước 2: Cân đong nguyên liệu

 Các nguyên liệu phải được cân đong chính xác, nhất là những hóa
chất, nguyên tố vi lượng có thể gây ức chế vi khuẩn (muối mật,
sắt,..) phải được cân bằng cân phân tích.
 Bước 3: Hòa tan nguyên liệu
 Thường dùng nước cất hoặc nước khử khoáng để pha môi trường.
 các hóa chất được hòa tan nóng hoặc lạnh tùy theo tính chất của
chúng.
 Môi trường không có thạch nên hòa tan lạnh hoặc nóng nhẹ.
 Môi trường có thạch cần đun cho thạch tan hoàn toàn sau đó mới
cho các thành phần khác vào.
 Bước 4: Điều chỉnh pH

 Khi điều chỉnh pH của môi trường nên thực hiện ở nhiệt độ 45-50
độ C để pH ít bị thay đổi sau khi tiệt trùng
 .Các dung dịch NaOH 1N và HCl 1N thường được sử dụng để
điều chỉnh pH. Sau khi điều chỉnh pH, cần bổ sung nước cho đủ
thể tích quy định.
 Bước 5: Làm trong môi trường

 Các môi trường lỏng (bao gồm các chất hòa tan) phải trong để dễ
quan sát sự phất triển của VSV.
 Sau khi hòa tan các chất, nếu môi trường đục cần phải lọc qua vải
gạc hoặc giấy.
 Bước 6: Đóng ống tiệt trùng

 Môi trường được cho vào ống nghiệm bình nón hoặc bình cầu,
tùy theo yêu cầu thí nghiệm. Khi đóng ống, không được để cho
môi trường dính vào miệng ống hoặc bình.
 Môi trường cần phải được tiệt trùng ngay sau khi đóng gói. Nếu
để lâu tạp khuẩn sẽ làm hỏng môi trường.
 Các môi trường thông thường được tiệt trùng 1100C/30 phút hoặc
1200C/ 20 phút.
 Môi trường có các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt, cần tiệt trùng ở
nhiệt độ thấp bằng phương pháp Tyndall, Pasteur hoặc dùng lọc
vi khuẩn
  Môi trường được lấy ra khỏi nồi hấp ngay sau khi tiệt trùng xong,
nếu để lâu trong nồi hấp môi trường bị chuyển màu và giảm chất
lượng

7) phương pháp tiệt trùng ( đối tượng, thiết bị, điều kiện tiệt trùng)
Các phương pháp tiệt trùng
 Là quá trình làm cho một vật hoặc một SP không còn VSV sống được. Được
thực hiện = pp vật lý, hóa học
 Lựa chọn pp tiệt tùng phụ thuộc vào tính chất lý hóa & độ bền vững của MT
Tiệt trùng bằng nhiệt khô
 Dùng để tiệt trùng các dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt: bông, gạc, dụng cụ
thủy tinh…
 Điều kiện tiệt trùng: 180°C/30 phút hoặc 170°C/1h, hoặc 160°C/2h
 Các dụng cụ thủy tinh để đóng MT phải được tiệt trùng khô trước khi dùng
Tiệt trùng bằng hơi nước:
 thường được dùng để tiệt trùng MT nuôi cấy & các dụng cụ phẫu thuật
 MT thường được tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121°C/15 phút
 Các MT dễ bị hỏng bởi nhiệt độ: đường, sữa , bia, máu… → cần tiệt trùng ở
nhiệt độ thấp, bằng các pp sau:
+ Tiệt trùng gián đoạn ( pp Tyndall ) : MT được hấp 3 – 4 lần ở nhiệt độ ≤
100°C/30 – 40phút, cách nhau 24h. Giữa 2 lần hấp, cho MT vào ủ ở 28 –
32°C/24h cho bào tử nảy mầm. Các bào tử sống sót nảy mầm → sẽ bị tiêu diệt
ở lần hấp tiếp theo
+ Khử trùng nhiệt độ thấp ( pp Pasteur ): Đun cách thủy .MT 60°C/30p,
hoặc 73°C/15p → làm lạnh đột ngột dưới 10°C. PP này không diệt được
bào tử
PP lọc :
 được dùng để tiệt trùng các chất dễ bị phá hủy bởi nhiệt
 Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22μm.
 Phần chảy qua phễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng.
  Thiệt bị lọc & màng lọc phải được tiệt trùng trước khi dùng
PP dùng tia bức xạ
 Tia UV được dùng nhiều nhất để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy VSV
 Đèn tử ngoại được chiếu trực tiếp, thẳng góc với nơi làm thí nghiệm & liều
lượng chiếu phải đủ với diện tích buồng
 Tia UV ít có tác dụng diệt nấm => khi khử trùng buồng pha chế cần phối hợp
thêm với pp dùng hóa chất để khử nấm

8) Nguyên tắc chung trong thử nội độc tố và các pp thử

a) Nguyên tắc: Dựa trên tính chất phản ứng giữa nội độc tố và thuốc thử lysat
(phân giải từ tế bào dạng amip )
b) Các phương pháp được sử dụng:
 Phương pháp tạo gel dựa trên sự tạo thành gel khi cho thuốc thử vào dung dịch
có chứa nội độc tố.
 Phương pháp đo độ đục, dựa vào sự thay đổi độ đục của thuốc thử lysat khi tạo
gel.
 Phương pháp đo màu dựa trên sự thay đổi màu của phức hợp màu- peptid.

9) Yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phép thử và cách kiểm tra ảnh hưởng của các
yếu tố này đến kết quả phép thử nội độc tố
 Độ nhạy cảm thuốc thử lysat → Kiểm tra độ nhạy cảm của lysat.
 Thành phần của mẫu thử làm tăng hoặc ức chế quá trình tạo gel → Kiểm tra các
yếu tố ảnh hưởng.
 Điều kiện thử ( thiết bị, hóa chất, dung môi, …) → Tiến hành song song mẫu đối
chứng âm tính.

10) Cách tiến hành, đánh giá, yêu cầu kiểm tra độ nhạy của thuốc thử lysat trong
thử nội độc tố
 Tiến hành:
 Chuẩn bị dd nội độc tố chuẩn: it nhất 4 nồng độ tương đương 2λ, λ, λ/2,
λ/4; mỗi nồng độ 4 ống.
 Chuẩn bị thuốc thử: pha theo hướng dẫn trên nhãn lysat
 Trộn 1 thể tích thuốc với đồng lượng dd chuẩn (thường là 0,1ml) cho mỗi
ống
 Ủ các ống ở đk khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử lysat (thường là
37±10C trong 60±2 min)
  Đánh giá:
 Phản ứng dương tính nếu gel tạo thành không bị chảy ra khi nhẹ nhàng dốc
ngược ống nghiệm (180° )
 Phản ứng âm tính khi k tạo thành gel or gel k đủ chắc, rất dễ bị rã khi dốc
ngược ống nghiệm
 Độ nhạy = trung bình nhân nồng độ điểm dừng = antilog (Σe/f)
 Trong đó Σe là tổng các logarit nồng độ điểm dừng của mỗi dãy đã thử, f là
số dãy chuẩn nội độc tố đã thử
 Yêu cầu:
 Phép thử không có giá trị nếu bất kì ống của dd chuẩn nội độc tố có nồng
độ thấp nhất (0,25λ) cho phản ứng dương tính
 0,5 λ ≤ độ nhạy xác định được ≤ 2,0 λ

11) Cách tiến hành, đánh giá, yêu cầu kiểm tra yếu tố ảnh hưởng trong phép
thử nội độc tố
 Tiến hành: Chuẩn bị dd A, B, C, D theo bảng bên dưới:

Dung NĐ nội độc tố Dung Hệ số NĐ nội độc tố Số ống

dịch được thêm vào môi pha sau khi pha nghiệm
mỗi dd loãng loãng

A 0/ dd thử - - - 4
B 2 λ / dd thử Dung 1 2λ 4
dịch thử 2 1λ 4
4 0,5 λ 4
8 0,25 λ 4
C 2λ / nước BET Nước 1 2λ 2
BET 2 1λ 2
4 0,5 λ 2
8 0,25 λ 2
D 0/ nước BET - - - 2
Dung dịch thử có độ pha loãng < MVD
Trong đó:
 Dung dịch A (dung dịch thử): mẫu thử pha ở dộ pha loãng ≤
MVD
 Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha
trong dung dịch thử
 Dung dịch C (đối chứng dương tính): chuẩn nội độc tố pha trong
nước BET
 Dung dịch D (đối chứng âm tính): nước BET

+ Chuẩn bị thuốc thử: pha theo hướng dẫn trên nhãn lysat
+ Trộn 1 thể tích thuốc với đồng lượng dd chuẩn (thường là 0,1ml) cho mỗi
ống
 + Ủ các ống ở đk khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử lysat (thường là
37±10C trong 60±2 min)
 Đánh giá:
 Phản ứng dương tính nếu gel tạo thành không bị chảy ra khi nhẹ nhàng
dốc ngược ống nghiệm (180o)
 Phản ứng âm tính khi không tạo thành gel or gel không đủ chắc, rất dễ bị
rã khi dốc ngược ống nghiệm
 Độ nhạy = trung bình nhân nồng độ điểm dừng = antilog(Σe/f)
 Trong đó Σe là tổng các logarit nồng độ điểm dừng của mỗi dãy đã thử, f
là số dãy chuẩn nội độc tố đã thử
 Kết luận đạt khi đạt các yêu cầu phép thử
 Yêu cầu:
 Phép thử có giá trị khi dd A và D cho phản ứng âm tính và kết quả dd C
khẳng định đúng độ nhạy của thuôc thử
 0,5 λ < độ nhạy tính theo dd B < 2,0 λ

12) Cách tiến hành, đánh giá, yêu cầu phép thử giới hạn nội độc tố theo phương
pháp tạo gel
 Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch A, B, C và D theo bảng sau, mỗi dung dịch
2 ống. Các điều kiện thử nghiệm như nhiệt độ, thời gian ủ và đánh giá kết
quả tương tự như trong phần Kiểm tra độ nhạy của lysat.
Dung dịch Nồng độ nội độc tố được Số ống nghiệm
thêm vào mỗi dung dịch
A 0/dung dịch thử 2
B 2λ /dung dịch thử 2
C 2λ /nước BET 2
D 0/nước BET 2
Trong đó:
 Dung dịch A (dung dịch thử): mẫu thử pha ở dộ pha loãng ≤
MVD
 Dung dịch B (đối chứng dương tính có mẫu thử): nội độc tố pha
trong dung dịch thử
 Dung dịch C (đối chứng dương tính): chuẩn nội độc tố pha trong
nước BET
 Dung dịch D (đối chứng âm tính): nước BET
+ Chuẩn bị thuốc thử: pha theo hướng dẫn trên nhãn lysat
+ Trộn 1 thể tích thuốc với đồng lượng dd chuẩn (thường là 0,1ml) cho mỗi
ống
+ Ủ các ống ở đk khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử lysat (thường là
37±10C trong 60±2 min)
 Đánh giá kết quả:
 Phép thử có giá trị nếu cả 2 ống của dung dịch B và C đều cho kết
quả dương tính và dung dịch D âm tính.
  Mẫu thử đạt yêu cầu nếu kết quả âm tính ở cả hai ống nghiệm của
dung dịch A.
 Mẫu thử không đạt yêu cầu nếu kết quả dương tính trên cả 2 ống
nghiệm của dung dịch A và khi độ pha loãng = MVD.
 Nếu 2 ống của dung dịch A cho kết quả khác nhau, một ống
dương tính và một ống âm tính thì làm lại phép thử. Mẫu thử đạt
yêu cầu nếu ở lần thử thứ hai cả hai ống đều cho kết quả âm tính.
 Yêu cầu:
 nội độc tố có mặt trong mẫu thử không vượt quá giới hạn cho
phép ( quy định chuyên luận riêng )

13) Điều kiện tiến hành thử chất gây sốt (động vật, khu vực lưu giữ, dụng cụ, bơm
kim tiêm, hộp giữ thỏ, nhiệt kế
a) Động vật
 Dùng thỏ trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng không dưới 1,5
kg, nuôi dưỡng băng thức ãn không có chứa kháng sinh và thỏ không có dấu
hiệu giảm cân trong quá trinh thử nghiệm. Không dùng để thử nghiệm nếu:
 Thỏ mới được dùng thử chất gây sốt có kêt quả âm tính trong vòng 3
ngày trước đó, hoặc
 Thỏ đã được dùng thử chất gây sốt có kết quả dương tính trong vòng 3
tuần.
b) Khu vực lưu trữ động vật
 Thỏ được nuôi giữ riêng từng con trong khu vực yên tĩnh, có nhiệt độ ổn
định. Cho thỏ nhịn ăn từ đêm trước khi thử cho đến khi thử xong, không
cho uống nước trong quá trình thử. Tiến hành phép thử trong phòng yên
tĩnh, không có tiếng ồn, nhiệt độ phòng chênh lệch không quá 3°C so với
khu vực nuôi giứ, hoặc thỏ phải được lưu giữ ở điều kiện phòng thí nghiệm
trong khoảng ít nhất 18h trước khi thử nghiệm.
c) Dụng cụ, bơm và kim tiêm
 Tất cả các dụng cụ, bơm và kim tiêm phải được rửa sạch và tráng nước cất,
sấy ờ nhiệt độ 250°C trong 30 phút hoặc 200°C trong 1h.
d) Hộp, giá giữ thỏ
 Các hộp, giá giữ thỏ cho trường hợp đo nhiệt độ bằng thiết bị điện được
thiết kế để giữ ở cổ con vật nhưng không được chật quá, phần cơ thể còn lại
được thoải mái để thỏ có the ngồi ở tư thế bình thường. Không giữ thỏ bằng
các loại kẹp hoặc giá có thê gây đau hoặc khó chịu cho con vật. Thỏ phải
được cho vào hộp hoộc giá ít nhất 1 h trước khi thử và giữ ở đó trong suốt
quá trình thử nghiệm
e) Nhiệt kế
 Nhiệt kế hoặc thiết bị điện dùng để ghi nhiệt độ có độ chính xác 0,1°C và
được đưa vào trực tràng của thỏ với độ sâu 5cm. Độ sâu của nhiệt kế trong
 trực tràng phải giống nhau giữa các thỏ. Nếu dùng thiêt bị điện, đầu đo nhiệt
độ phải được đặt trong trực tràng trong suốt quá trình thử.

14) Tiến hành thử nghiệm và cách đánh giá đối với phép thử chất gây sốt
a) Thử nghiệm sơ bộ
 Chỉ nên tiến hành thử sơ bộ với những thỏ lần đầu tiên được dùng để thừ
chất gây sốt.
 Trong vòng 1 đến 3 ngày trước khi kiểm tra mẫu thừ, tiêm tĩnh mạch tai 10
ml/kg thỏ dung dịch natri clorid 0,9 % không có chât gây sốt, đã làm ấm
đến khoảng 38,5°C trước khi tiêm. Ghi nhiệt độ thỏ, bắt đầu ít nhất 90 phút
trước khi tiêm và tiếp lục trong 3h sau khi tiêm. Không dùng những thỏ có
nhiệt độ thay đổi quá 0,6°C. vào thử nghiệm chính thức.
b) Thử nghiệm chính thức
 Mồi mẫu được thử trèn một nhóm 3 thỏ.
 Chuẩn bị và tiêm mẫu thử. Mẫu thử có thể được hòa tan trong một dung
môi không có chất gâv sốt, dung dịch natri clorid 0,9 % hoặc một chất
lỏng được qui định trong chuyên luận riêng. Làm ấm dung dịch thử lên
khoảng 38.5°C trước khi tiêm. Tiêm chậm dung dịch thử vào tĩnh mạch
tai thỏ trong khoảng thời gian không quá 4 phút, trừ khi có chi dẫn gì
khác trong chuyên luận riêng. Lượng mẫu thử được tiêm sẽ thay đổi tùy
theo chế phẩm cần kiểm tra và được qui định trong chuyên luận riêng.
Thể tích tiêm trong khoảng 0,5 ml/kg cân nặng đến 10 ml/kg cân nặng
thỏ.
 Theo dõi nhiệt độ và xác định đáp ứng
 Ghi nhiệt độ thỏ 30 phút một lần, ít nhất 90 phút trước khi tiêm
và tiếp tục 3h sau khi tiêm. Theo dõi nhiệt độ trước khi tiêm,
không dùng vảo thừ nghiệm nếu:
 Thỏ có chênh lệch nhiệt độ > 0,2 °c giữa 2 lần ghi liên tiếp, hoặc
 Thỏ có nhiệt độ ban đầu cao hơn 39,8 °c hoặc thấp hơn 38°C,
hoặc
 Nhiệt độ ban đầu của 3 thỏ trong cùng nhóm khác nhau quá 1°C.
 “Nhiệt độ ban đầu" cùa mỗi thỏ là trung bình cua 2 giá trị nhiệt
độ ghi được cách nhau 30 phút, xác định trong khoảng 40 phút
ngay trước khi tiêm dung dịch thử.
 “Nhiệt độ tối đa” cửa mỗi thỏ là nhiệt độ cao nhất ghi được cho
thỏ đó trong vòng 3h sau khi tiêm. Chênh lệch giữa “nhiệt độ ban
đầu” và “nhiệt độ tối đa” được gọi là đáp ứng. Khỉ chênh lệch là
âm, kết quà được coi là đáp ứng bằng 0
c) Đánh giá kết quả
  Đầu tiên thử trên một nhóm 3 thỏ, tùy thuộc vào kết quả thu được, thử
thêm lần lượt từng nhóm 3 thỏ khác cho đến khi tổng cộng 4 nhóm, nếu
cần. Nếu tổng đáp ứng cùa nhóm đầu tiên không vượt quá số ghi trong cột
(2) của bảng dưới đây, thì mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu tồng đáp ứng vượt
quá số ghi trong cột (2) nhưng không vượt quá số ghi trong cột (3) thì lặp
lại phép thử trên nhóm khác như đã nêu ờ trên. Nếu tổng các đáp ứng lớn
hơn số ghi trong cột (3) thì mẫu thử không đạt yêu cầu

Số thỏ Mẫu thử đạt nếu tổng đáp ứng Mẩu thử không đạt nếu tồng đáp
không vượt quá ứng không vượt quá

(1) (2) (3)

3 1.15°C 2.65°C
6 2.80°C 4.30°C
9 4.45°C 5.95°C
12 6.60°C 6.60°C
Những thỏ có nhiệt độ tăng cao quá 1,2°C thì loại và không bao giờ dùng lại cho phép
thử chất gây sốt.

15) Nguyên tắc, tiến hành và cách đánh giá phép thử độc tính bất thường
a) Nguyên tắc:
 Độc tính bất thường của thuốc được xác định bằng cách theo dõi số chuột
chết trong thời gian 48 h sau khi cho chuột một liêu thuôc qua đường dùng
theo qui định
b) Động vật thí nghiệm:
 Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, cân nặng 18g đến 22g, chưa dùng vào thí
nghiệm, nếu là chuột cái phải không có thai hoặc đang cho con bú, được
chăn nuôi trong điều kiện bình thường
c) Chuẩn bị dung dịch thử
 Nếu không có hướng dẫn gi khác, chuân bị dung dịch thư bằng cách hòa
tan mẫu thử trong dung dịch natri clond 0,9 % hoặc nước cất tiêm (nếu thử
theo đường tiêm) hoặc phân tan đều mẫu thử trong nước cất (nếu thử theo
đường uông) đê thu được dung dịch hoặc hỗn dịch có chửa lượng chất cần
thử phù hợp với mức liều qui định trong chuyên luận riêng.
d) Tiến hành thử: Dùng 5 chuột, cho mỗi con 0,5 ml dung dịch thử băng một
trong những đường dùng sau
 Tiêm tĩnh mạch: Tiêm vào tĩnh mạch đuôi của mỗi chuột với tốc độ hằng
định trong 15s đến 30s.
  Tiêm trong màng bụng: Tiêm qua lóp da bụng vào thẳng hốc bụng chuột.
 Tiêm dưới da: Tiêm dưới da vào một chô ở lưng hoặc bụng.
 Uống: Cho uống bàng một kim cong đầu tù hoặc một dụng cụ khác thích
hợp, phải đảm bảo đưa thuôc vào trong thực quản hoặc dạ dày.
e) Đánh giá kết quả
 Nếu không có hướng dẫn gì khác thì quan sát chuột 48 h sau khi dùng
thuốc.
 Nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu.
 Nếu có chuột chết, làm lại thử nghiệm với 10 chuột khác, dùng chuột có
cân nặng (19 ± 1) g. Sau 48 h, nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử
đạt yêu cầu.

16) PP thử giới hạn nhiễm khuẩn

Có 3 pp:
 Phương pháp màng lọc
 Phương pháp đĩa thạch
 Phương pháp MPN( Most probabla Number)

17) Nguyên nhân gây ảnh hưởng đến kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn, cách kiểm
tra ảnh hưởng của các nguyên nhân đó
 Chất lượng môi trường không đảm bảo → Kiểm tra chất lượng môi trường
 Phương pháp đếm không phù hợp khi có mặt mẫu thử (do mẫu thử có chất ức
chế vsv ) → kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử
 Do điều kiện thử nghiệm không đảm bảo gây tạp nhiễm → Tiến hành mẫu
chứng âm tính song song với mẫu thử.

18) Mục đích, tiến hành và đánh giá thử nghiệm kiểm tra chất lượng môi trường
trong thử giới hạn nhiễm khuẩn
a) Mục đích: Đảm bảo điều kiện môi trường cho sự phát triển của vsv nếu chúng
có mẫu thử và vô khuẩn
b) Tiến hành
 5 loại vsv được sử dụng để ktra chất lượng môi trường:
 Staphylococcus aureus
 Pseudomonas aeruginosa
 Bacillus subtilis
 Candida albicans
 Aspergillus niger
 Kiểm tra riêng rẽ đối với từng loại vi sinh vật
 Cấy riêng rẽ vào môi trường cần kiểm tra một lượng nhỏ vi sinh vật
(không quá 100 CFU)
  Cấy vào môi trường đã đạt chất lượngmột lượng nhỏ vi sinh vật (không
quá 100 CPU)
 Ủ ở đk 30oC đến 35oC để đếm tổng số vsv hiếu khí và ở 20oC đến
25oC để đếm tổng số vi nấm.
 Thời gian ủ ko qúa 3 ngày với vk và ko qúa 5 ngày với vi nấm
 Tiến hành song song mẫu chứng âm tính
c) đánh giá
 Thử nghiệm chỉ có ý nghĩa khi mẫu chứng âm tính không có VSV phát
triển
 Đỗi với môi trưởng thạch, số lượng vi sinh vật phát triển trên môi
trường kiểm tra không được khác quá 2 lần so với số lượng tính được
của hỗn dịch chủng VSV đã được tiêu chuẩn hóa hoặc so với số VSV
phát triển trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng
 Đối với môi trường lỏng, sự phát triên của vi sinh vật trên lô môi trường
mới được so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã
đạt yêu cầu chất lượng.

19) Mục đích, tiến hành và đánh giá thử nghiệm kiểm tra sự phù hợp của phương
pháp đếm khi có mặt mẫu thử
a) Mục đích:
 Đảm bảo các thành phần trong mẫu thử không ảnh hưởng đến sự phát triển của
VSV
 Kiểm tra sự phục hồi của 5 VSV kể trên khi có mặt mẫu thử
b) Cách tiến hành
 Tiến hành riêng rẽ đối với từng vsv trong số 5 loại chủng vsv kể trên.
 Chuẩn bị dịch cấy.
 Đối với mỗi loại vsv ktra tiến hành với ít nhất 2 đĩa Petri và tính kq
trung bình. Dùng 15-20ml môi trg cho đĩa petri đường kính 9cm, nếu
đường kính petri lớn hơn cần tang thể tích mt cho phù hợp:
 Phương pháp cấy trộn: lấy vào mỗi petri 1ml dịch cấy vào đĩa petri,
thêm mt thích hợp có nhiệt độ không quá 45℃
 Phương pháp cấy trải bề mặt:đổ mt vào đĩa petri, làm khô đĩa, trải lên bề
mặt mt lượng dịch cấy không quá 0,1ml
 Ủ ở điều kiện 30℃ -35℃ để đếm tổng số vsv hiếu khí và ở 20 ℃ đến 25
℃ để đếm tổng số vi nấm
 Thời gian ủ không quá 3 ngày với vi khuẩn và không quá 5 ngày với vi
nấm
c) Đánh giá kết quả
 Giá trị trung bình đếm được của các sinh vật thử phải không được khác
qúa 2 lần so với kết quả của ống chứng
 Nếu không đạt cần thay đổi phương pháp xử lý mẫu thử cho phù hợp
20) Tiến hành và đánh giá thử nghiệm xác định tổng số VSV
a) Tiến hành
 Tiến hành trong điều kiện đảm bảo để tránh sự tạp nhiễm, mt sử dụng đạt yêu
cầu chất lượng và pp đếm phù hợp khi có mặt mẫu thử
 Chuẩn bị mẫu thử: Nếu ko có chỉ dẫn riêng, hoà tan hoặc pha loãng 10g/10ml
mẫu thử (thường pha 10 lần) bằng các dd pha loãng thích hợp (đệm natri
clorid-pepton, đệm phosphat pH 7,2, isopropyl myristat) hoặc thêm các chất
diện hoạt ko có tính ức chế VSV như polysorbat 80. Có thể pha loãng nhiều lần
để được nồng độ pha loãng thích hợp.
 Chuẩn bị chứng âm tính: làm như chuẩn bị mẫu thử nhưng thay thế mẫu thử
bằng dung dịch pha loãng
 Sử dụng môi trường thạch casein đậu tương để đếm tổng số VSV hiếu khí và
môi trường thạch Sabouraud – dextrose để đếm tổng số nấm
 Tiến hành với ít nhất 2 đĩa petri cho mỗi loại mt ở mỗi nồng độ pha loãng.
Dùng 15-20ml MT cho đĩa petri đường kính 9cm, nếu đk petri lớn hơn cần tăng
thể tích mt cho phù hợp.
 PP cấy trộn: Lấy vào mỗi petri 1ml dịch cấy vào đĩa petri , thêm Mt thích hợp
có nhiệt độ ko quá 45C
 pp cấy trải bề mặt: Đổ mt vào đĩa petri, làm khô đĩa. Trải lên bề mặt mt lượng
dịch cấy ko quá 0,1ml
 Ủ ở điều kiện 30-35C trong 3-5 ngày với môi trường thạch casein đậu tương
để đếm tổng số VSV hiếu khí và ở 20-25C trong 5-7 ngày môi trường thạch
Saubourd-dextrose để đếm tổng số vi nấm
b) Đánh giá:
 Kết quả chỉ có ý nghĩa khi mẫu chứng âm tính không có sự phát triển của VSV
 Chọn các đĩa ở 1 nồng độ pha loãng nhất định mà: có số khuẩn lạc cao nhất và
nhỏ hơn 250( đếm tổng VSV) hoặc nhỏ hơn 50 (đếm tổng nấm) để đánh giá
 Tính giá trị trung bình đối với mỗi loại môi trường và số CFU trong 1g/1ml
mẫu thử.
 Tổng số VSV hiếu khí và tổng số nấm của mẫu thử không được vượt quá giới
hạn cho phép
21) Trình bày quy định chung của phép thử vô khuẩn
 Phép thử này được áp dụng nhằm phát hiện sự có mặt của Vi khuẩn, nấm trong
các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo dược điển cần phải vô khuẩn
 Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn, các dụng cụ hóa
chất và điều kiện không được gây tạp nhiễm VSV
 Môi trường và nhiệt độ ủ
Môi trường VSV phù hợp Nhiệt độ ủ
Môi trường thioglycolat VSV hiếu khí, kị khí 30-35℃
lỏng
Môi trường casein đậu VSV hiếu khí, vi nấm 20 -25℃
tương lỏng

22) Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phép thử vô khuẩn và cách kiểm tra.
 Chất lượng môi trường → kiểm tra chất lượng môi trường
 Thành phần của mẫu thử có tính ức chế vsv → kiểm tra sự phù hợp của
phương pháp
 Ảnh hưởng của điều kiện thử → tiến hành song song chứng âm tính.

23) Trình bày cách tiến hành và đánh giá thử nghiệm: kiểm tra chất lượng môi
trường trong phép thử vô khuẩn
Thử độc lập trước hoặc kiểm tra song song với mẫu thử đối với mỗi lô kiểm tra mới
a) kiểm tra độ vô khuẩn:
 tiến hành: lấy vài ống ( bình ) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt
độ 30℃ đến 35℃ trong 14 ngày đối với môi trường thioglycolat lỏng; ủ
ở nhiệt độ 20℃ đến 25℃ trong 14 ngày với môi trường casein đậu
tương lỏng
 đánh giá: kết luận đạt nếu không có VSV phát triển
b) kiểm tra khả năng dinh dưỡng:
 tiến hành kiểm tra khả năng dinh dưỡng đối với mỗi lô môi trường được
pha chế sẵn hoặc môi trường được pha chế từ môi trường khô nhiều
thành phần hoặc được pha chế từ các thành phần riêng lẻ. Sử dụng các
chủng vi sinh vật phù hợp theo quy định
 cấy riêng rẽ vào môi trường thạch thioglycolat lỏng 1 lượng nhỏ
( không quá 100 CFU ) các vi khuẩn: Clotridium sporogenes,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa
 cấy riêng rẽ vào môi trường thạch casein đậu tương lỏng 1 lượng
nhỏ ( không quá 100 CFU ) các VSV: Bacillus subtilis, Candida
albicans, Aspergillus brasiliensis
  ủ không quá 3 ngày với vi khuẩn và không quá 5 ngày với vi nấm.
Cần đảm bảo chủng vi sinh vật đem cấy vào môi trường không
được cấy truyền quá 5 lần từ chủng gốc ban đầu
 đánh giá: môi trường đạt chất lượng nếu sau thời gian ủ, vi sinh vật đều
mọc tốt

24) Trình bày cách tiến hành và đánh giá của thử nghiệm kiểm tra sự phù hợp của
phương pháp trong phép thử vô khuẩn
a) tiến hành:
 tiến hành riêng rẽ với từng loại trong 6 loại VSV kể trên
 ống thử: sau khi tiêm mẫu thử vào môi trường, thêm vào 1 lượng nhỏ
( không quá 100 CFU ) các VSV tương ứng
 ống chứng dương: thêm vào môi trường 1 lượng nhỏ ( không quá 100
CFU ) các VSV tương ứng
 ủ các ống ở điều kiện quy định chung trong không quá 5 ngày
→ cần tối thiểu 14 ống ( bình ) mt cho thử nghiệm này
b) đánh giá:
 nếu sự phát triển của VSV trong ống thử tốt, rõ ràng giống với sự phát
triển trong ống đối chứng dương, mẫu thử không chứa chất ức chế VSV
hoặc khả năng ức chế của mẫu thử đã được loại bỏ bởi điều kiện thí
nghiệm, lúc này có thể áp dụng quy trình thử vô khuẩn trên mẫu thử mà
không cần bất cứ sự điều chỉnh nào
 ngược lại: nếu sau thời gian ủ, sự phát triển của vi sinh vật trong ống thử
không rõ ràng như sự phát triển của vi sinh vật trong ống đối chứng
dương, có nghĩa là mẫu thử chứa chất ức chế vi sinh vật và khả năng ức
chế vi sinh vật của mẫu thử không bị loại bỏ bởi điều kiện thí nghiệm.
Lúc này cần thay đổi điều kiện thử nghiệm để loại bỏ tác dụng của chất
ức chế và tiến hành kiểm tra lại sự phù hợp của phương pháp

25) trình bày cách tiến hành và đánh giá thử nghiệm thử vô khuẩn theo phương
pháp nuôi cấy trực tiếp
a) Yêu cầu:
 Không quan sát thấy sự phát triển của vi sinh vật trong các môi trường,
mẫu thử đạt chỉ tiêu vô khuẩn
b) Tiến hành:
 Thêm trực tiếp lượng mẫu thử theo quy định vào từng loại môi trường,
chú ý thể tích mẫu thử không được vượt quá 10% thể tích của môi
trường, trừ khi có chỉ dẫn khác
 Nếu mẫu thử có hoạt tính kháng khuẩn, cần trung hòa hoạt tính này bằng
chất trung hòa trước khi tiến hành thử vô khuẩn hoặc pha loãng mẫu thử
trong một thể tích môi trường nuôi cấy đủ lớn
 Khi thể tích mẫu thử lớn có thể cần phải sử dụng môi trường đặc ( cần
phải tính đến mức độ pha loãng của mẫu thử khi xác định độ đặc của
 môi trường nuôi cấy). Nếu có thể, nên chuyển trực tiếp môi trường đặc
vào mẫu thử
 Nếu mẫu thử là dạng dầu mỡ, kem, cục, dụng cụ hoặc có chứa chất ức
chế VSV thì cần xử lý trước khi thêm vào môi trường
 Ủ mt đã cấy mẫu thử ở điều kiện thích hợp trong không dưới 14 ngày.
Định kỳ quan sát sự phát triển của VSV trong quá trình ủ
c) đánh giá:
 Định kỳ trong suốt quá trình ủ và khi kết luận, kiểm tra môi trường bằng
mắt thường xem có sự phát triển của VSV hay không
 Nếu bản chất của mẫu thử làm đục môi trường khiến khó quan sát thì
sau 14 ngày ủ, cấy truyền một lượng nhỏ ( mỗi ống không quá 1 ml)
sang loạt môi trường mới cùng loại và ủ tiếp cả 2 môi trường mới và cũ
trong không dưới 4 ngày
 Nếu không quan sát thấy sự phát triển của VSV trong các môi trường,
mẫu thử đạt chỉ tiêu vô khuẩn
 Nếu quan sát thấy sự phát triển của VSV trong các môi trường, mẫu thử
không đạt chỉ tiêu vô khuẩn, trừ trường hợp chỉ ra rõ ràng rằng thử
nghiệm không có giá trị do các nguyên nhân không liên quan gì đến mẫu
thử
 Thử nghiệm được coi là không có giá trị khi:
 Các số liệu về kiểm soát VSV của khu vực thử vô khuẩn không
đạt
 Khi rà soát lại quá trình thử vô khuẩn phát hiện thấy có sai sót
 Có sự phát triển của VSV trong ống đối chứng âm tính
 Sau khi phân lập và định danh VSV thu được trong ống MT, sự
phát triển của VSV này rõ ràng là do sai sót liên quan đến vật liệu
hoặc kỹ thuật được áp dụng cho mẫu thử
 Nếu thử nghiệm không có giá trị, tiến hành thử vô khuẩn lại với số
lượng mẫu giống như ban đầu
 Nếu không quan sát thấy sự phát triển của VSV trong các môi trường ở
lần thử lặp lại, mẫu thử đạt chỉ tiêu vô khuẩn
 Nếu quan sát thấy sự phát triển của VSV trong các môi trường ở lần thử
lặp lại, mẫu thử không đạt chỉ tiêu vô khuẩn

26) Nguyên tắc, tiến hành và đánh giá trong xác định hoạt lực kháng sinh bằng
phương pháp khuếch tán.
a) Nguyên tắc:
 So sánh khả năng ức chế sự phát triển của VSV nhạy cảm của kháng sinh
thử và kháng sinh chuẩn.
 Kháng sinh chuẩn được sử dụng trong thử nghiệm được xác định hoạt tính
một cách chính xác dựa trên chất chuẩn quốc tế
b) Tiến hành:
 Cấy vsv vào MT
  Làm lỏng môi trường và cấy một lượng phù hợp chủng vi sinh vật nhạy
cảm với kháng sinh thử vào môi trường ở nhiệt độ thích hợp.
 Rót ngay môi trường đã cấy chủng vi sinh vật vào đĩa petri để thu được
lớp môi trường có bề dày đồng nhất từ 2 mm đến 5 mm.
 Bảo quản đĩa MT sao bề mặt MT khô và vi sinh vật không phát triển hoặc
bị chết trước khi sử dụng.
 Pha các dung dịch kiểm tra
 Dùng dung môi và dung dịch đệm theo qui định để pha các dung dịch
kháng sinh thử và dung dịch kháng sinh chuẩn
 Sử dụng ít nhất 3 nồng độ kháng sinh chuẩn và 3 nồng độ kháng sinh thử
có hoạt lực tương đương nhau.
 Nồng độ các dung dịch kháng sinh nên theo cấp số nhân có cùng công
bội.
 Đưa kháng sinh vào môi trường
 Nhỏ dung dịch kháng sinh vào các ống trụ vô khuẩn được làm bằng sứ,
thép không gỉ hay vật liệu phù hợp khác hoặc nhỏ vào các lỗ đã đục
trong môi trường thạch hoặc sử dụng giấy hấp phụ vô khuẩn có tiêu
chuẩn phù hợp.
 Thể tích kháng sinh nhỏ vào các ống trụ hoặc vào các lỗ thạch phải
giống nhau.
 Vị trí các dung dịch trong đĩa được sắp xếp theo mô hình thống kê phù
hợp hoặc sắp xếp các dung dịch chuẩn thử một cách luân phiên (đĩa
nhỏ).
 Điều kiện ủ:
 Giữ các đĩa ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 ℃ từ 1h đến 4 h để kháng sinh
khuếch tán vào môi trường thạch.
 Ủ các đĩa thạch ở điều kiện nhiệt độ phù hợp trong 18h.
c) Đánh giá:
 Đo đường kính vòng vô khuẩn với độ chính xác tối thiểu là 0,1 mm hoặc
đo diện tích vòng vô khuẩn với độ chính xác tương đương và tính toán
hoạt lực bằng phương pháp thống kê thích hợp.
 Nên tiến hành lặp lại nhiều mẫu với mỗi nồng độ để đảm bảo độ chính
xác theo qui định
 27) Mục tiêu và tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định của thuốc
a) Mục tiêu:

stt Mục tiêu Phương pháp nghiên cứu Giai đoạn áp dụng
1 Xây dựng công thưc,kỹ thuật pha Thử nghiện cấp tốc Phát triển sản phẩm
chế và bao bì
2 Xác định tuổi thọ và điều kiện bảo Thử cấp tốc và dài hạn Phát triển sản phẩm và hồ sơ
quản đăng ký
3 Khẳng định bằng thực nghiệm và Thử dài hạn Lập hồ sơ đăng ký
tuổi thọ của thuốc
4 Thẩm định độ ổn định liên quan đến Thử cấp tốc và dài hạn Thuốc lưu hành trên thị
công thức và quy trình sản xuất trường

b) Tiêu chuẩn đánh giá: có 5 tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định của thuốc
 Độ ổn định hóa học: Các tính chất học(thành phần định tính và định lượng)
của hoạt chất có mặt trong phế phẩm nằm trong 1 giới hạn cho phép tiêu chuẩn
chất lượng.
 Độ ổn định vật lý:
 Các đặc điểm vật lý của nguyên liệu làm thuốc như:màu sắc, trạng thái
tinh thể,độ tan, điểm chảy.. không thay đổi
 Các đặc điểm của chế phẩm như: màu sắc, độ cứng, độ rã, độ hòa tan
dao động trong khoảng giới hạn cho phép của tiêu chuẩn chất lượng.
 Độ ổn định vi sinh:
 Độ vô trùng hoặc giới hạn nhiễm khuẩn của chế phẩm phải đáp ứng yêu
cầu tiêu chuẩn. nếu chế phẩm có chất kháng khuẩn thì hàm lượng không
vượt quá giới hạn cho phép
 Độ ổn định điều trị: Tác dụng điều trị của chế phẩm không thay đổ
 Độ ổn định độc tính:
 Độc tính của chế phẩm không được tăng lên trong quá trình bảo quản và
lưu hành trên thị trường

28, 29. Giải thích được nguyên tắc xác định độ ổn định và cách tính tuổi thọ
của thuốc? Mô tả điều kiện thử độ ổn định dài hạn và cấp tốc

o Xác định độ ổn định của thuốc (lấy mẫu, pp thử cấp tốc, pp thử dài
dạn)
 Giải thích nguyên tắc lấy mẫu: Phải xem xét các yếu tố
 Tính chất và đặc điểm dược chất trong chế phẩm
 Vùng khí hậu cho thuốc lưu hành
 Tài liệu đã công bố liên quan đến độ ổn định cảu thuốc cần nghiên cứu
=> quyết định số mẫu thử, thời gian và tần suất thủ nghiệm.
a.. Lấy mẫu
 Thông thường:
 Với dược chất tương đối ổn định, cần lấy 2 mẫu ở 2 lô sản xuất khác nhau.
 Nếu dược chất kém bền hoặc có ít tài liệu đã công bố, cần lấy 3 mẫu ở 3 lô
khác nhau.
 Quy mô công nghiệp, cần lấy mẫu ở các lô đc tiến hành theo chương trình đã
địnhtrước:
+ Với công thức ổn định, cứ 2 năm lấy mẫu trên 1 lô.
+ Với công thức ko ổn định, cứ 1 năm lấy mẫu trên 1 lô.
+ Đối với công thức nghiên cứu xong độ ổn định, thường cứ 3 - 5 năm
kiểm tra độ ổn định 1 lần.
 Phương pháp thử cấp tốc
 Điều kiện thử cho vùng II & vùng IV

Vùng Nhiệt độ Độ ẩm (%) Thời gian thử (tháng)

(oC)
II 40 ± 2 75 ± 5 3
IV 40 ± 2 75 ± 5 6

 Với các chế phẩm có hoạt chất kém bền, hoặc có ít tài liệu nghiên cứu đc
công bố, thời gian thử kéo dài hơn 3 tháng so với quy định.
 Có thể lựa chọn nhiệt độ cao hơn trong thời gian ngắn hơn, VD 45 - 50 oC
trong 3 tháng với độ ẩm 75%.
 Nếu trong quá trình nghiên cứu, chế phẩm có những thay đổi quan trọng thì
cần thực hiện các phép thử nghiệm bổ sung ở điều kiện ôn hòa hơn. Những
dấu hiệu chứng tỏ có sự thay đổi quan trọng là:
o Giảm hàm lượng hoạt chất từ 5% trở lên so với trị số ban đầu.
o Có sản phẩm phân hủy với lượng cao hơn trị số cho phép.
o pH nằm ngoài giới hạn quy định.
o Tốc độ hòa tan của 12 viên nén hoặc viên nang thấp hơn giá trị tiêu
chuẩn.
o Thay đổi đặc tính vật lý của thuốc như: biến màu, tách pha, khó rã…
  Thường đc tiến hành trong buồng vi khí hậu có thể kiểm soát đc nhiệt độ (±
2oC) & độ ẩm (± 5%).
 1 số sản phẩm ko thích hợp với thử nghiệm cấp tốc: chế phẩm sinh học,
thuốc đạn, thuốc trứng…
 Phương pháp thử dài hạn
 Điều kiện thực nghiệm trong phương pháp thử dài hạn phải gần với điều kiện
bảo quản thực tế của thuốc, tức là vùng khí hậu của thuốc dự kiến được
lưuhành

Thông số khí hậu tính toán Điều kiện bảo quản

Vùng
Nhiệt NĐT Độ m bar* Nhiệt Độ
độ ẩm** độ ẩm**
1 20,0 20,0 42 9,9 21 45
2 21,5 22,0 52 13,5 25 60
3 26,4 27,9 35 11,9 30 35
4 26,7 27,4 76 26,6 30 70

Trong đó: * Áp suất hơi nước riêng phần trong khí quyển
** Độ ẩm tương đối (%)
 Thời gian kiểm tra hàm lượng trong mẫu:
o năm đầu ở 3 thời điểm 0, 6, 12 tháng. Từ năm 2 trở đi 1 lần/năm
o Với công thức rất ổn định chỉ cần kiểm tra 2 lần: lần đầu sau 1 năm, lần
thứ 2 ở cuối hạn dùng.
o Với chế phẩm kém ổn định, số lần kiểm tra nhiều hơn:
 Năm thứ nhất: 3 lần/ tháng
 Năm thứ 2: 6 tháng/ lần
 Từ năm thứ 3: 12 tháng/ lần.
 Đối với chế phẩm có yêu cầu bảo quản đặc biệt nhứ: chế phẩm vaccin,
hormon, thuốc có hoạt chất rất ko ổn định… cần chọn điều kiện thích hợp
 Kết quả thực nghiệm đc chấp nhận nếu:
o Ko có sự thay đổi các tính chất vật lý, hóa học, sinh học.
o Chế phẩm vẫn đáp ứng đúng yêu cầu của tiêu chuẩn.
 Phương pháp thử dài hạn mất nhiều thời gian, nhưng cho kết quả tin cậy,
giúp người nghiên cứu khẳng định tuổi thọ đã dự báo theo phép thử cấp
tốc.
2. Cách tính tuổi thọ: ( chắc chỉ liên quan đến tính toán thôi không
chắc lắm)
 Dựa vào nghiên cứu để xác định được thuốc phân hủy theo dược động học
bậc mấy. Thông thường có 3 bậc động hóa học

Bậc PƯ Phương trình Tích phân phương

trình
0 −dC Ct=C0 -kt
v= =k
dt

1 dC Ln(Ct)= ln(C0)- kt
= -k.C
dt
2 −dC 1/Ct = 1/C0 + kt
v= = kC2
dt

 Ngoài ra hằng số k trong phương trình còn phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi
nhiệt độ tăng lên 10ºC hằng số tốc độ k tăng lên xấp xỉ 2 lần.
 Phương trình theo định luật Arherius: Lnk = C1- C2/T