Vi sinh đại cương

• Cách tính điểm

– Điểm chuyên cần: 10%
– Điểm bài tập nhóm: 10%
– Kiểm tra giữa kỳ: 30%
– Thi kết thúc HP: 50%
 Chương 1. Đối tượng và lịch sử ngành
vi sinh học
• Đối tượng
– Vi sinh vật học (Microbiology, Microbiologie).
• Là ngành học về vsv.
• Là ngành sinh học rộng, mang tính khoa học cơ bản và ứng
dụng.
• Vi sinh học hiện đại nghiên cứu chuyên sâu từng nhóm vsv
– Nấm học (Mycology)
– Vi khuẩn học (Bacteriology)
– Virus học (Virology)
– Tảo học (Algology)
• Chuyên ngành nghiên cứu các tính chất riêng biệt của vsv
– Tế bào học, phân loại học, sinh lý học, sinh hóa học
– Di truyền học…
 • Chuyên ngành ứng dụng
– Vi sinh học thực phẩm
– Vi sinh học bệnh cây
– Vi sinh học dầu lửa
– Vi sinh học y học
– Vi sinh học đất……
– Vi sinh vật (Microorganism)
• Là những sinh vật rất nhỏ, cấu tạo đơn bào hoặc đa bào nhưng
rất kém phân hóa
• Hệ thống phân loại tổng quát
– Nhóm sơ hạch (Prokaryotic): vi khuẩn, xạ khuẩn, mycoplasma, tảo
lam,…
– Nhóm chân hạch (Eukaryotic): nấm, thanh tảo, nguyên sinh động vật
– Nhóm virus: không được xem là sinh vật
» Không có khả năng sinh sản và dd độc lập
» Có tính chất giống như hóa chất: kết tinh thành tinh thể, thẩm
thấu qua lớp aga
• Lịch sử phát triển
– Giai đoạn phát hiện vi sinh vật
• Antoni Van Leeuvenhoek, Hà Lan, 1632-1723
– Kính hiển vi với độ phóng đại < 300 lần (1684)
– Phát hiện của Leeuvenhook về những bí mật của thế giới tự nhiên, 1695
• Nhà phân loại học Carl Linne, 1707-1778
– Trong quyển “Hệ thống tự nhiên” cho rằng VSV thuộc 1 giống gọi là
“CHAOS” là sự hỗn loạn.
• Cuối thế kỷ 18
– Phát hiện ngày càng phong phú
– Lôi cuốn nhiều nhà bác học
– VSV liên hệ chặt chẽ với đời sống con người
– 1789 Edward Jenner áp dụng thành công vac-xin phòng bệnh đậu mùa
– Giai đoạn vi sinh học thực nghiệm với Pasteur
• Louis Pasteur, Pháp, 1822-1895, khai sinh ngành VSH thực
nghiệm.
• Thí nghiệm với bình cổ cong (giữa những năm 1800) VSV
không thể tự sinh (chấm dứt tranh thuận về thuyết tự sinh)
 • Pasteur có công rất lớn về thực nghiệm trong các lĩnh vực:
– Chế biến thực phẩm:
» PP tiệt trùng rượu vang, đun 60˚C và ghép mí kín
» PP khử trùng sữa, thực phẩm,….
– Bệnh cây:
» Phát hiện và điều trị được bệnh tằm gai, bệnh lây truyền
– Chăn nuôi:
» CM bệnh than ở cừu là do vi khuẩn và lan truyền. Tìm ra vaccin
ngừa bệnh
» Tìm ra vaccin ngừa bệnh tu huyết trùng gà, bệnh heo bị đóng dấu
– Y học:
» Tìm ra vaccin ngừa bệnh chó dại, 1885 cứu 1 em bé thoát chết
– Giai đoạn sau Pasteur và VSH hiện đại
• Robert Koch (1843-1910), bác sĩ, nhà sinh học người Đức
– Phát triển PP nghiên cứu VSV  Quy tắc Koch  CM VSV là tác nhân
gây bệnh truyền nhiễm.
– 24/3/1882: Công bố KQ khám phá vi trùng bệnh lao (Mycobacterium
tuberculosis)
– 1887: Là người đầu tiên dùng kỹ thuật nuôi VK trong môi trường đặc
• Julius Richard Petri (1852-1921), Đức, học trò của Koch
– Chế ra đĩa Petri
– Nêu ra các biện pháp nhuộm màu vi sinh vật
• Vinogradxki S. I. (1856-1953), Nga và Beijerinck M. W. (1851-
1931), Hà Lan. Phát hiện ngành vi sinh học đất
• Ivanopxki, 1892 và Beijerinck, 1896 phát hiện ra virus, chứng
minh loại VSV nhỏ hơn vi khuẩn. Là nguyên nhân gây bệnh
đốm cây thuốc lá.
• Hiện nay, nghiên cứu sâu về:
– Bản chất sự sống của VSV ở mức phân tử và dưới mức phân tử
– Kỹ thuật cấy mô và tháo lắp gen ở VSV
– Ứng dụng kỹ thuật trên để điều trị bệnh ở người, gia súc và cây trồng
 Chương 2. Phương tiện và thủ thuật
dùng trong vi sinh học
• Phương tiện
– Kính hiển vi quang học
• Kính hiển vi thường
– Gồm nhiều thấu kính quang học
– 2 hệ thống thấu kính: vật kính và thị kính
» Vật kính gồm nhiều thấu kính
» Phóng đại vật lên từ vài trăm tới khoảng 2500 lần
– Hệ thống chiếu sáng (hệ thống quang học)
» Gương phẳng hoặc gương lõm
» Kết hợp nhiều thấu kính  chùm tia hội tụ
» Sử dụng ánh sáng thường có bước sóng 400-700nm
– Nhược điểm:
» Không quan sát được hình dạng nổi bên ngoài của vật
– Kính phóng đại 2 ống ngắm hay kính hiển vi nổi
• Dùng tia sáng phản chiếu của vật để quan sát vật
• Quan sát hình ảnh nổi bên ngoài của vật
• Độ phóng đại nhỏ, không quá 200 lần
– Kính hiển vi đáy đen
• Gồm kính hiển vi thường và bộ hội tụ tia sáng đặc biệt
• Bộ hội tụ được che ở phần giữa
• Chỉ cho tia sáng chiếu xiên vào vật
• Quan sát được bên ngoài vật do tia bức xạ
– Kính hiển vi tương phản
• Công dụng như KHV đáy đen, nhưng quan sát vật rỏ hơn
• KHV thường và 2 bộ phận đặc biệt
– Vòng mở tia sáng ở bộ phận điều chỉnh lưu lượng ánh sáng
– Đĩa tạo tương phản hay tạo lệch pha ở vật kính
– Kính hiển vi điện tử
• Nguyên tắc:
– Sử dụng nguồn bắn điện tử ở một hiệu điện thế cao (30-150 kV)
– Tạo ra các điện tử có độ dài sóng rất ngắn (0,5 nm hoặc ngắn hơn)
– Các điện tử này có thể bị lệch đường đi do từ trường
– Độ phân giải:
» Là khả năng phân biệt các điểm không gian
» Giới hạn bởi bước sóng ánh sáng khả kiến và chỉ số khẩu độ
λ
𝑑=
2𝑁𝐴
λ: Bước sóng ánh sáng
NA: thông số khẩu độ, đối với không khí (NA=0,95)
• Kính hiển vi xuyên thẳng (Transmission Electron Microscopy,
TEM)
– Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn
– Sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua vật rắn
mỏng
– Sử dụng thấu kính từ để tạo ảnh có độ phóng đại lớn (hàng triệu lần)
– Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, trên film quang học, hay ghi
nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số
– Cấu tạo và nguyên lý hoạt động KHV xuyên thẳng
• Hệ bơm chân không siêu cao
• Súng phóng điện tử
– Sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử
» Điện tử được phát ra từ một catốt được đốt nóng
» Tuổi thọ không cao
» Độ đơn sắc của chùm điện tử thường kém
» Rẻ tiền và không đòi hỏi chân không siêu cao
– Sử dụng súng phát xạ trường
» Điện tử phát ra từ catốt nhờ một điện thế lớn
» Có tuổi thọ rất cao
» Cường độ chùm điện tử lớn và độ đơn sắc rất cao
» Rất đắt tiền và đòi hỏi môi trường chân không siêu cao
• Các hệ thấu kính và lăng kính
– Thấu kính từ = nam châm điện
– Hệ kính hội tụ và tạo chùm tia song song
– Vật kính
 – Thấu kính nhiễu xạ
– Thấu kính Lorentz
– Thấu kính phóng đại: Là hệ thấu kính sau vật kính
– Ngoài ra, trong TEM còn có các hệ lăng kính có tác dụng bẻ đường đi
của điện tử để lật ảnh hoặc điều khiển việc ghi nhận điện tử trong các
phép phân tích khác nhau
• Các khẩu độ
– Khẩu độ hội tụ
» Dùng cùng với hệ thấu kính hội tụ
» Điều khiển sự hội tụ của chùm tia điện tử
» Thay đổi kích thước và góc hội tụ của chùm tia
– Khẩu độ vật
» Được đặt phía bên dưới vật
» Thay đổi độ tương phản của ảnh
» Lựa chọn chùm tia ở các góc lệch khác nhau
– Khẩu độ lựa chọn vùng
» Được dùng để lựa chọn diện tích vùng mẫu vật sẽ ghi ảnh
» Được dùng khi sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ điện tử lựa chọn vùng
 – Bộ phận ghi nhận ảnh
• Là các thiết bị chuyển đổi tín hiệu
• Hoạt động dựa trên nguyên lý ghi nhận sự tương tác của điện tử
với chất rắn
• Màng huỳnh quang và phim quang học
• CCD Camera
– Xử lý mẫu
• TEM bắt đầu ghi nhận được ảnh với các mẫu có chiều dày dưới
500 nm, hình tốt khi dày dưới 150 nm.
• Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron
Microscopy, SEM).
– Chụp ảnh của bề mặt mẫu vật bằng 1 chùm điện tử
– Nguyên lý hoạt động:
• Phát chùm điện tử trong SEM giống TEM,
• Thế tăng tốc chỉ từ 10 – 50 kV
• Có độ phân giải thấp hơn TEM
• Máy ly tâm
– Để lắng hoặc phân tách các vật thể có KL khác nhau
trong dung dịch.
– Bộ ly tâm quay tay
• Cấu tạo đơn giản
• Quay bằng tay
• Vận tốc thấp: 700 – 1500 vòng/phút
• Dùng để lắng tuyến trùng, bào tử nấm và vi khuẩn
– Máy ly tâm thông thường
• Quay bằng động cơ điện
• Tốc độ tối đa khoảng 16000 vòng/phút, thường là 3000 rpm
• Thường sử dụng trong các phòng nghiên cứu vi sinh
– Máy siêu ly tâm
• Có vận tốc quay rất nhanh, có thể đạt 100.000 rpm
• Ở tốc độ trên 25.000 rpm, cần có bộ phận tạo chân không.
• Trang bị thêm hệ thống làm lạnh ở Tº cố định
• Các thủ thuật căn bản áp dụng trong vi sinh học
– Nhuộm màu
• Phần lớn các cấu tạo bên trong của vsv có chiết suất gần bằng
nhau  nhuộm màu khi quan sát.
• Nhuộm toàn TB hay 1 số phần cần thiết
• Màu acid:
– Ion mang màu là anion
– Ion này kết hợp với 1 base cho ra 1 muối màu
– Ăn màu với thành phần của tế bào chất
• Màu base:
– Ion mang màu là cation
– Ion này kết hợp với 1 acid cho ra 1 muối màu
– Ăn màu với thành phần của nhân tế bào
• Nhuộm màu đơn:
– Nhuôm một lần duy nhất bằng một số dd màu: methylene blue, crystal
violet, basic fuchsin…
 – Đối với vi khuẩn, thường dùng dung dịch Loeffler’s methylene blue
» Dung dịch A: methylen blue - 0,3 g
Ethyl alcohol - 30 ml
» Dung dịch B: KOH (0,01%) - 100 ml
» Trộn 2 dung dịch này lại  dung dịch Loeffler’s methylene blue
– Đối với nấm thường dùng dd Lactophenol cotton blue
Phenol (tinh thể) 20 g
Acid lactic 20 g
Gycerol 40 g
Nước cất 20 ml
Cotton blue (methyl blue) 0,05 g
• Nhuộm Gram
– Phân biệt VK Gram+ và VK Gram-.
– Do sự khác biệt trong cấu tạo vách TB của 2 loại vi khuẩn
» Vk Gram+ có vách dày, giữ màu tím crystal violet và iod chặt
» Vk Gram- có vách mỏng và gồm nhiều lớp phức tạp, không giữ màu
tím
– Quy trình nhuôm màu Gram

Cố định mẫu

Nhuộm crystal violet (30 s)

Rửa sạch màu

Nhuộm dd lugol iodine (30 s)

Rửa bằng cồn 95% (20 s – 1 m)

Nhuộm với màu đỏ eosin,

safranin, lục brillant green, nâu
Bismarck brown
– Khử trùng
• Tạo môi trường và các dụng cụ nuôi cấy vô khuẩn
– Tiệt trùng (sterilization):
» Tiêu diệt tất cả vsv trên và trong dụng cụ cần thanh trùng
» Dùng nhiệt
» Dùng hơi: formol, ethylen oxide
» Các dung dịch hóa chất: HgCl2, Sodium hypocloride (NaClO)
» Dùng các tia cự tím, tia gamma
» Dùng PP ly tâm, lọc
– Tẩy độc (disinfection)
» Chỉ tiêu diệt hoặc tách vsv có thể gây độc
» Ví dụ: thanh trùng sữa tươi, nước trái cây …
» PP này ít làm ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của thực phẩm
– Kiềm hãm (microbistasis)
» Không tiêu diệt vsv ngay
» Giữ vsv trong tình trạng bất động, không sinh sản
» Làm khô, nhiệt độ lạnh, chất kháng sinh…
• Phương pháp
– Phương pháp dùng nhiệt
» Nhiệt khô:
• Đối với các dụng cụ chịu nhiệt
• 150 – 180˚C trong 1 giờ
• 120˚C trong 4 giờ
» Nhiệt ướt:
• Hơi nước sôi ở áp suất thường.
• Dùng đối với virus và một số vi khuẩn nhậy cảm
• Thời gian tối thiểu là 1 giờ
• Hơi nước sôi ở áp suất cao (1 atm)
• Thời gian 20 phút (autoclave)
• Tiêu diệt vi khuẩn, nấm mốc
• Phường pháp Tyndal
– Phương pháp dùng hóa chất
» Các halogen
• CaCl2: dùng ở nồng độ 0,5 – 5%, do tác động của Cl. Thường
dùng khử độc nước dùng trong thành phố
• Iodine: thường dùng trong y tế để khử trùng vết thương (2%)
 » Các kim loại nặng
• HgCl2: 1/1000 hoặc 1/5000, dùng khử độc mặt ngoài mẫu vật
khi nuôi cấy
• Sulfat bạc: 1%, thuốc nhỏ mắt
• Sulfat đồng: diệt rong xanh trong hồ nước, diệt nấm trong
nông nghiệp
• Kim loại nặng rất bền trong thiên nhiên và trong thực phẩm
» Các chất khác
• Phenol: sát khuẩn rất tốt, thường dùng trong y khoa
• Cồn: ethyl hay isopropyl. Dùng rửa tay, thanh trùng vết
thương
• Xà phòng: rửa tay, dụng cụ
• Formol: sát trùng mạnh, kể cả bào tử vi khuẩn. Có thể dùng
hơi hoặc dung dịch
– Phương pháp sử dụng tia sáng:
» Tia cực tím (ultraviolet, UV)
» Tia âm cực (cathode ray)
» Sóng siêu âm, Xung ánh sáng…
– Phương pháp lọc
• Ly tâm
– Loại vi khuẩn trong dung dịch: 6000 rpm, 20 phút có thể
loại được tất cả vi khuẩn, virus vẫn còn lơ lửng
– Thu thập hay cô đọng vsv trong 1 huyền phù
– Tinh ròng vi sinh vật